Este manuscrito introduz um método robusto de fabricar micropoços côncavos, sem a necessidade de instalações complexas de alto custo. Usando a força magnética, esferas de aço e uma matriz do através de-furo, várias centenas de micropoços formaram-se em um substrato de polidimetilsiloxano (PDMS) 3 x 3 cm.
Uma cultura de esferoide é uma ferramenta útil para compreender o comportamento celular em que proporciona um na vivo-como ambiente tridimensional. Vários métodos de produção de esferoide como superfícies não adesivas, frascos de girador, gotas de suspensão e micropoços têm sido utilizados em estudos de interação célula a célula, ativação imune, drogas, triagem, haste diferenciação celular e geração de organoides. Entre esses métodos, os poços da microplaca com uma geometria tridimensional côncavo ganhou a atenção de cientistas e engenheiros, dados suas vantagens de geração de esferoide de tamanho uniforme e a facilidade com que as respostas de esferoides individuais podem ser monitorado. Apesar de cost-effective métodos tais como o uso de membranas flexíveis e litografia de gelo têm sido propostos, estas técnicas incorrer em graves inconvenientes tais como dificuldade em controlar os tamanhos padrão, realização de altas proporções e produção de áreas maiores de micropoços. Para superar estes problemas, propomos um método robusto para fabricar micropoços côncavos, sem a necessidade de instalações complexas de alto custo. Este método utiliza uma matriz de através de-furo 30×30, aço de cem micrômetro-ordem vários grânulos e a força magnética para fabricar 900 micropoços em um substrato de polidimetilsiloxano (PDMS) 3 x 3 cm. Para demonstrar a aplicabilidade do nosso método para aplicações biológicas de células, nós cultivadas as células-tronco adiposas por 3 dias e produzido com sucesso usando a nossa plataforma de microplacas de esferoides. Além disso, realizamos uma simulação magnetostatic para investigar o mecanismo, pelo qual força magnética foi usada para aprisionar os grânulos aço os através de buracos. Acreditamos que o método de fabricação de microplacas proposto poderia ser aplicado para muitos estudos baseados em esferoide celulares como triagem de drogas, regeneração de tecidos, diferenciação de células-tronco e metástases.
As células cultivadas em forma de esferoide são mais semelhantes ao tecido real no corpo que uma cultura planar bidimensional1. Dada esta vantagem, o uso de esferoides tem sido adotado para melhorar o estudo da interação de célula para célula2,3, ativação imune4,5e de diferenciação6de despistagem de drogas. Além disso, incorporando vários tipos de células de esferoides recentemente foram aplicados ao organoids (perto de-fisiológicos tridimensional (3D) tecido), que são muito úteis para o estudo de desenvolvimento e doença humana7. Vários métodos têm sido utilizados para produzir esferoides. O método mais simples envolve a utilização de uma superfície não-adesivas, tais que as células agregam-se com os outros e esferoides de formulário. Um prato de Petri pode ser tratada com albumina de soro bovino, pluronic F-127 ou um polímero hidrofóbico (por exemplo, metacrilato de 2-hydroxyethl de poli) tornar-se sua superfície não adesivas,89. O método de girador-balão é outro meio conhecido de produzir grandes quantidades de esferoides10,11. Neste método, as células são mantidas em suspensão por mexendo para impedi-los de tornar-se ligado ao substrato. Em vez disso, o flutuante células agregado de esferoides de formulário. O método de superfície não-adesivas e o girador balão método podem produzir grandes quantidades de esferoides. No entanto, eles estão sujeitos a limitações, incluindo dificuldades em controlar o tamanho de esferoide, bem como o acompanhamento e monitoramento de cada esferoide. Como um remédio para esses problemas, um outro método de produção de esferoide, ou seja, a suspensão drop método pode ser empregado12. Isto envolve depositando gotas de suspensão de células na parte inferior da tampa de um prato de cultura. Estas gotas são geralmente 15 a 30 µ l de tamanho e contêm cerca de 300 a 3000 células13. Quando a tampa é invertida, as gotas são mantidas no lugar pela tensão superficial. O ambiente de microgravidade em cada gota concentra as células, que então formam esferoides único em uma interface líquido-ar livre. Os benefícios do enforcamento método drop são que oferece uma distribuição de tamanho bem controlados, enquanto é fácil de rastrear e monitorar cada esferoide, em relação os métodos de balão de superfície e spinner não adesivas. No entanto, esse método incorre em uma desvantagem em que a produção em massa de esferoides e o próprio processo de produção é excessivamente do trabalho intensivo.
Uma matriz de microplacas é um flat placa com muitos poços de tamanho micro, cada um com um diâmetro que varia de 100 a 1000 µm. O princípio de produção de esferoide quando usando micropoços é semelhante do método de superfície não-adesivas. Os benefícios incluem o fato de que os poços da microplaca fornecem espaços entre os poços da microplaca para separar as células ou esferoides, tal que é fácil de controlar o tamanho de esferoide, enquanto também facilitando a monitorar cada único esferoide. Com um grande número de poços da microplaca, produção de alto rendimento esferoide também é possível. Outra vantagem do micropoços é a opção para poços de formulário de diferentes formas (hexahedral, cilíndrico, trigonal prismáticos) dependendo fins experimentais originais dos usuários. Geralmente, no entanto, uma forma tridimensional (3D) côncava (ou hemisférica) é considerada como sendo o mais adequado para a produção de esferoides único tamanho uniforme. Portanto, a utilidade de micropoços côncavos tem sido relatada para muitos estudos de biologia celular tais como aqueles examinando a casos de diferenciação de células-tronco embrionárias14, a secreção de insulina das células da ilhota clusters de15, o atividade enzimática de hepatócitos16e a resistência de droga de tumor esferoides17.
Infelizmente, a fabricação de micropoços frequentemente requer instalações especializadas micropatterning; métodos baseados em fotolitos convencionais requerem exposição e instalações em desenvolvimento enquanto métodos reativos baseados em íon-gravura precisam de equipamento de plasma e de feixes de iões. Esse equipamento é caro, que, juntamente com o processo de fabricação complicada, apresenta uma alta barreira à entrada para os biólogos que não têm acesso a microtecnologia. Para superar estes problemas, outros métodos de baixo custo tais como gelo litografia18 (usando as gotas de água congelada) e o método de membrana flexível14 (usando uma membrana, substrato do através de-furo e vácuo) têm sido sugeridos. No entanto, esses métodos também incorrer em graves inconvenientes tais como sendo difícil controlar os tamanhos padrão, a obtenção de elevadas proporções e a produção dos poços da microplaca área maior.
Para superar as questões acima, propomos um método de fabricação do romance de microplacas côncavo utilizando um substrato do através de-furo, esferas de aço e uma matriz de ímã. Usando esse método, centenas de micropoços esféricos côncavos podem ser fabricadas, aproveitando o mecanismo de força magnética-assistida de travamento automático grânulos metálicos (Figura 1). O processo de fabricação envolve o uso de muito poucas facilidades caros e complicados e não exige muitas habilidades avançadas. Como tal, pessoas mesmo não qualificadas podem facilmente realizar este método de fabricação. Para demonstrar o método proposto, humanos adiposo-derivado de células-tronco foram cultivadas aos micropoços côncavos para produzir esferoides.
O grande desafio deste método de fabricação foi a fixação segura dos grânulos da matriz do através de-furo na placa de alumínio. Para resolver este desafio, força magnética sob a forma de uma matriz de 30 x 30 imã foi usada para corrigir os grânulos firmemente, como mostrado nas figuras 6 e 7. A densidade do fluxo magnético da matriz de ímã, que tem a polaridade oposta, é mais forte no centro de cada superfície do ímã. Porque a força da força magnética depende da de…
The authors have nothing to disclose.
Esta pesquisa foi apoiada pelo programa de pesquisa de ciência básica através da nacional Research Foundation de Coreia (NRF) financiado pelo Ministério da ciência, TIC e futuro planejamento (NRF-2014R1A1A2057527 e 2016R1D1A1B03934418-NRF).
CNC rotary engraver | Roland DGA | EGX-350 | |
Micro drill bit | HAM Präzision | 30-1301 TA | Φ 0.55 and 0.75 mm |
Sulfuric acid 98% | Daejung | 7683-4100 | For cleaning aluminum plate. Dilute with distilled water with 15% solution |
Neodymium magnet | Supermagnete | W-01-N | 1 x 1 x 1 mm |
Bearing ball | Agami Modeling | SUJ2 | Φ 600 μm steel bead |
Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dowcorning | Sylgard 184 | |
Pluronic F-127 | Sigma Aldrich | p2443 | Dilute with phosphate buffered saline to 4% (w/v) solution |
Dulbecco's modified eaggle's medium (DMEM) | ATCC | 30-2002 | |
Dulbecco's phosphate buffered saline (D-PBS) | ATCC | 30-2200 | |
Fetal bovine serum | ATCC | 30-2020 | |
Adipose-derived mesenchymal stem cells | ATCC | ATCC PCS-500-011 |