Summary
ここでは、増加したサンプリング周波数を可能にし、開腹術を行うと比較した場合、外科的合併症の可能性を低減マカクにおける肝臓及び腸間膜リンパ節（MLN）の連続サンプリング用の低侵襲腹腔鏡技術が記載されています。
Abstract
腸間膜リンパ節（MLN）および肝臓はそれらを免疫学的にユニークな作り、胃腸（GI）管からの微生物および微生物産物にさらされています。胃腸管および関連MLNは、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）感染の初期のウイルス複製のサイトであり、MLNでも長期の抗レトロウイルス療法（ART）の後に潜伏感染細胞を抱く可能性の高い重要な貯留サイトです。肝臓は、レンチウイルスに対する免疫応答に重要な役割を果たすことが示されており、循環からのウイルスのクリアランスに重要な役割を果たしていると思われました。非ヒト霊長類（NHP）HIVおよび後天性免疫不全症候群（AIDS）のためのモデルは密接にHIV感染し、このモデルにおけるウイルス複製のプライマリサイトと関連する免疫応答のシリアル縦サンプリングのこれらの側面を模倣するが、感染における重要なイベントを解明するのに役立ちます、病因、およびこれらのイベントのさまざまな介入戦略の影響。 CURR肝臓及びMLNをサンプリングするENT公表の技術が一緒に同じ動物でシリアル形式でこれらの重要な場所を調査する能力を制限する大手術および/または剖検を伴います。我々は以前MLNの収集のための腹腔鏡技術を記載しています。ここでは、MLNの収集のために必要な同じ2つのポートの位置によって肝臓およびMLNのシリアル縦サンプリングのための低侵襲腹腔鏡技術を説明します。追加の切開が必要とされないように、同じ2つのポートの使用は、動物への影響を最小限に抑えます。この技術は、主要な開腹手術に比べて増加したサンプリング周波数で使用すると、手術合併症の可能性を低減し、結果の解釈を複雑にし得る局所的および全身性炎症反応を関連付けることができます。この手順は、動物福祉を向上させながら、NHPモデルを含む研究を促進する可能性を秘めています。
Introduction
胃腸（GI）管は、身体の最大の粘膜表面であり、食物に由来する抗原、病原体、及び一般microbiome 1、2と呼ば内共生細菌群集の無数に露出しています。腸間膜リンパ節（MLN）は、胃腸管を並べると、これらの多様な抗原に対する炎症性または寛容原性応答を促進するための免疫機能の主な部位です。 MLNの物理的な構成は、全身応答3を誘発することなく、ローカルに抗原に応答することができ、区画システムを作成します。同様に、循環に戻るので、粘膜固有層に胃腸管から転し、血流4を入力している微生物や微生物産物にさらされる前に、門脈を介して肝臓への胃腸管の排水溝からの血液。肝臓は、二次リンパ器官Aとして機能しますNDは転位微生物5,6を除去するための特殊なマクロファージを含む免疫細胞の多数を、有しています。このように、MLNおよび肝臓は、消化管からの共生や病原性細菌にさらされ、一次免疫器官であるだけでなく、他のソースからの抗原の環境、免疫学的観点から、それらはユニークで重要な作り。
MLNは、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）または病原性サル免疫不全ウイルス（SIV）感染のウイルス学的および免疫学的効果の評価のために重要な部位であり、そしておそらく直腸内攻撃後のSIVの早期普及に関与しています。腸管関連リンパ組織は、近代的な抗レトロウイルス療法（ART）7によるウイルス血症の効果的な制御にもかかわらず、持続的なHIV複製の主要部位であることが知られています。 SIV感染モデルにおいて、MLNは潜伏ウイルスおよび月の重要なリザーバーであることが示されています一次リザーバ8、9です。肝臓は、急性SIV感染マカク10中の肝臓におけるSIV特異的CD8 + T細胞の蓄積によって証明されるように、レンチウイルス感染症にも重要です。さらに、それは循環11からウイルスをクリアするための責任の主要な器官です。
HIVおよびSIV感染が変更されたGIの微生物叢に関連付けられている、GI上皮の完全性を破壊し、そして周囲と循環12、13に結腸から微生物および微生物産物のトランスロケーションを増加させました。これらのプロセスは、ローカルおよび全身の免疫活性化に関連し、そしてHIV感染者14に罹患率と死亡率が増加しています。 SIV感染では、転細菌は、マイクの蓄積に対し、MLN 15で観察されています肝臓でrobial製品は、炎症および臓器16に損傷をもたらすことが示されています。このように、HIVとSIV感染症のコンテキストで、MLNおよび肝臓はGI常駐菌によって駆動炎症プロセスを理解するために非常に有益することができます。
ここでは、MLNおよび非ヒト霊長類（NHPS）で肝臓の連続サンプリングのための低侵襲腹腔鏡技術を提示します。私たちは、それぞれの手術の間で160日で、各動物を2回サンプリングし、2匹の健康な女性アカゲザル（RMS）でこの技術の成功したパフォーマンスを発揮します。我々は2つの時点の間で非常に一貫性のあるデータを評価し、フローサイトメトリーを用いて各臓器内のキー白血球やリンパ球の集団を比較し、証明するために、これらのサンプルを使用するために行きます。
Protocol
動物は、国際（AAALACi）認定施設、すべての動物手順は、ワシントン大学の施設内動物管理使用委員会（IACUC）によって承認されたプロトコルに従って実施した実験動物管理の評価と認定のために飼育し、協会に世話し、ワシントン国立霊長類研究センター。
1.手術の準備、麻酔および鎮痛
- 鎮静および誘導
- 10mg / kgのケタミン及び（一方のシリンジ中で合わせ）0.015ミリグラム/ kgのデクスメデトミジンの筋肉注射と落ち着いマカク。ケージから除去する前に撤退反射の不在を確認してください。
- 動物に挿管し、イソフルラン用いて全身麻酔の平面内で動物を維持する（1.0から2.5パーセント）、および100％酸素を。 、マカク17内挿管し、全身麻酔に関する更なる情報については、参考文献を参照してくださいREF "> 18、19。
- 麻酔のサポートおよび監視
- 末梢静脈カテーテルを挿入し、麻酔および手術全体を5mL / kg /時の速度で（例えば、乳酸リンゲル溶液として）静脈等張性流体を提供します。角膜の乾燥を防ぐために、無菌の眼潤滑剤を適用します。
- そのようなブプレノルフィンの持続放出製剤（0.2ミリグラム/ kgで、皮下）として、鎮痛を提供します。
注：NSAIDは、（例えばメロキシカム又はケトプロフェンなど）、実験プロトコルは、NSAIDの投与を可能にすることを条件とする、麻酔回復中に提供されてもよく、その動物は、正常血圧および麻酔中よく水和あります。 - 麻酔および手術全体に麻酔深度（ 例えば 、顎トーン）、心拍数、呼吸数、EKG、血圧、脈拍酸素、呼気終末CO 2、及び体温を監視します。
注：腹部が吹き込まれた場合、動物はhypoventilateことがあります。呼吸速度が低下、または終末呼気CO 2レベルが45 mmHgの上にある場合、機械的換気を提供します。 - 手術後、デクスメデトミジン反転にアチパメゾール（0.15ミリグラム/キログラム、筋肉内）を投与します。
- 外科の準備
- 手順20の間に可視化し、腸の操作を補助するために、大腸内の糞便の量を減らすために、複数の温水浣腸を行います。
- 手術野から毛を除去するために数40ブレードで使用バリカン。恥骨に、左から右の脇腹に沿岸尾根から剃ります。
- 無菌クロルヘキシジンアルコール又はポビドンヨードアルコールスクラブ交互のような適切な防腐剤を使用して、手術野を調製。
- 途中背側と右横臥位との間の角度で、その背中に手術台の上に動物を配置します。伸長位置にロープで手足を縛ります。最終chlorhexiを提供動物は手術室に移動し、手術のために配置された後に食事やアルコールの準備。
2.手術
注：小動物における腹腔鏡の更なる情報については、参照21参照。
- 腹腔鏡器具の準備
- 滅菌有窓ドレープで動物を羽織ります。
- 非滅菌アシスタントの助けを借りて、無菌カメラドレープとデジタルカメラをラップし、タワーにケーブルを接続します。カメラヘッドに硬性鏡を取り付けます。
- 硬性鏡に無菌光ケーブルを接続し、光源にケーブルを接続します。ホワイトは、製造元の指示に従ってカメラのバランスをとります。
- 吹きに滅菌ガス注入チューブを取り付けます。
- 腹腔鏡下のエントリ
- ＃15メスを使用して、腹筋、アプリの深さに、皮膚を通して〜5ミリメートルの刺し切開を作りますroximately 1 - 臍の左から2 cmです。
- 非利き手を使用して、穿刺切開部位に腹壁頭蓋を持ち上げます。利き手では、切開角度で先端の頭側をベレス針の先端を配置します。
注：ベレス針の侵入角度は、動物の身体の状態によって異なります。例えば、脂肪動物において、ベレス針が腹壁にほぼ垂直に挿入する必要があります。薄い動物では、ベレス針は、内臓との接触の危険性を低減するために頭側角度を付けるべきです。- ベレス針の軸（ハブではない）を保持し、しっかりと腹腔内に腹壁を貫通する針を押します。明確には「クリック」と鋭い先端が腹膜を貫通し、ベレス針の鈍い先端を腹腔内に前進ばねとして抵抗の低下が感じられるだろう。
注：針が目に適切に合格した場合2センチメートル - それは高度で1を撤回しているときに電子腹腔は、少し抵抗があるでしょう。
- ベレス針の軸（ハブではない）を保持し、しっかりと腹腔内に腹壁を貫通する針を押します。明確には「クリック」と鋭い先端が腹膜を貫通し、ベレス針の鈍い先端を腹腔内に前進ばねとして抵抗の低下が感じられるだろう。
- 針にCO 2気腹チューブを接続し、コックを開きます。腹を作成するために、これ以上10-12以下mmHgのに腹部を加圧します。
注：それは対称的に拡大しており、肋骨縁の正常鋭い輪郭の損失がある場合、腹部は、理想的な通気を達成しました。圧力は、内臓を接触させるリスクなしカニューレ/トロカールを挿入するための十分なスペースを提供する必要があります。
- カニューレの配置
- 最後の肋骨〜4センチメートル尾 - 腹筋〜2の左側頭部、腹部の皮膚を通って＃15手術用メスの刃を持つ7ミリメートル切開 - 腹部が完全に吹き込まれると、〜5を作ります。
- caudomedially 60度 - それ〜45皮膚切開や角度によって5ミリメートルトロカール・カニューレアセンブリを置きます。 1〜2センチメートルの深さに腹腔内に侵入。 SCRE1.5の深さ - （1センチメートルさらに〜0.5）3 - cmであり、トロカールを除去カニューレを回転させることによって腹部にねじ込まカニューレwです。
- ベレス針から気腹チューブを外し、コックをオフにして、針を取り除きます。カニューレに気腹チューブを接続していない以上10以下で気腹を維持するためにコックを開く - 12 mmHgで。
- カニューレを通って、腹腔内に硬性鏡を挿入します。
- カメラの可視化の下では、ベレス針挿入に使用前の皮膚切開で腹筋や腹膜を通じて＃15手術用メスの刃を持つ小さな切開を作り続けます。カメラは、血管を避け、出血を最小限に抑えるために切開部の腹側を可視化するために使用されます。
注：筋肉と腹膜を通して切開部は、腸間膜（~0.5センチ）のプローブと具象の侵入を容易にするのに十分な大きさであることを確認してください。大きな切開はmesentをexteriorizeするために必要とされ得ます過度の腸間膜脂肪と動物でERY。 - 頭の上に30° -約15に上昇足でトレンデレンブルグの位置21で動物を置き。これはオプションであるが、より頭側位置に移動する小腸管などの結腸の腸間膜リンパ節への容易なアクセスを可能にすることができます。
- 腸間膜リンパ節生検
- カメラ可視化の下で、ステップ2.3.5で行わ腹部切開を通して固体プローブを挿入します。
- 大網と腸との間にプローブを置き、静かに下地腸間膜の可視化を可能にするために、腸オフ大網を掃引する掃引運動を使用します。尾側から頭側腹部に掃引運動をそのまま使用します。それは、術野の外にあるので、網は、右頭側腹部に配置することができます。
- 左または右腹壁に向けて下行結腸を移動するためのプローブを使用してください。これは、tのより良い可視化を可能にします彼は、腸間膜リンパ節の検索を支援するために腸間膜。
- コロンと腸間膜船に沿って腸間膜リンパ節の位置を特定するために腸間膜を掃引するプローブを使用します。
注：コロンの腸間膜の国境に沿って実行して大腸のノードは、左疝痛のノードは、血管の分岐点近くで発見することができ、下腸間膜ノードは、下腸間膜血管に沿って見つけることができます。腸間膜リンパ節は、希薄動物において容易に見ることができます。腸間膜脂肪に埋もれたとき、彼らはしばしば、その上腸間膜にわずかに隆起、輝く外観を貸すだろうし、その後、腸間膜脂肪を取り巻く、より多くの灰色がかった褐色の色であってもよいです。さらに、腸間膜リンパ節はリンパ管および腸間膜血管系に沿って存在する傾向があります。 - リンパ節が識別されると、プローブを除去し、腹腔内にメリーランドラチェット鉗子を挿入します。隣接するターゲットノードを腸間膜を把握するために鉗子を使用してください。 INCIに向け腸間膜を引いてシオン、およびカニューレからスコープを削除します。
- サフの電源を切り、腸間膜の具象を容易にするために、腹部を減圧するために開いたカニューレコックを残します。切開部を通って体の外腸間膜を引き出します。体外に出したら、切開部を介してアクセスを確保するために、湾曲蚊の止血や親指鉗子で腸間膜を把握します。
- より強固なリンパ節及び/又はgrayer色またはリンパ節の結節性外観の直接可視化のために触診によって体外腸間膜内リンパ節（単数または複数）を同定します。
- 湾曲した止血剤を使用して、ノード近く腸間膜における - （5ミリメートル〜3）識別されると、小さな開口部を作ります。曲がった止血剤で鈍的切開を使用して腸間膜への無料添付。必要に応じて4-0非吸収性モノフィラメント縫合糸で血管系を連結。リンパ節を取り除くためにメスで鋭い解剖を使用してください。媒体上ロズウェルパーク記念研究所（RPMI）1640ノードを配置氷。
- 出血のために体外に腸間膜を調べます。出血が注目されている場合は、止血剤または結紮糸（4-0非吸収性モノフィラメント縫合糸）を用いて血管を閉塞することにより、又は焼灼を使用することによって、適切な止血を提供します。腸間膜をリリースし、10に腹部をバック送気 - 腸間膜を腹腔に戻ることができるように、12 mmHgで。
- 繰り返して、追加のリンパ節生検を取得するために2.4.8を通じて2.4.1を繰り返します。
- 肝生検
- 水平位置にテーブルを返します。
- 以前に（ステップ2.3.5で切開）リンパ節生検を収集するために使用切開部を通して腹部にねじ込まカニューレを配置します。トロカール挿入することなく、カニューレの配置を可能にするために - （7ミリメートル〜5）切開部の大きさが十分であることを確認します。頭蓋腹腔に向かってこのカニューレを介して硬性鏡を挿入し、頭蓋腹部および肝臓を視覚化します。
- カメラの可視化の下では、生検Fを挿入以前に左頭蓋腹部（ステップ2.3.1で行われた切開部）に配置されたカニューレを通してorceps。
- 肝生検を得た肝臓に対向顎の可動部で選択肝臓ローブマージン下生検鉗子を置き、鉗子を開いて、マージンは、オープンジョーの中に落ちることを可能にします。何大網は肝生検鉗子の間ではないことを確認してください。鉗子の位置を調整し、所望の試料領域にわたって器具を閉じます。
- 止血を確保するために30秒 - 約20のための圧力を維持します。鉗子を閉じた状態で、優しくカニューレを通して鉗子を引き上げることにより、試料を取り出します。これは、優しく、肝臓からの生検を引き裂くだろう。氷の上でRPMI 1640培地中で肝生検を置きます。
注：肝生検の大きさは約5mmの生検鉗子を使用して5ミリメートル×2ミリメートル×2mmです。
- 止血を確保するために30秒 - 約20のための圧力を維持します。鉗子を閉じた状態で、優しくカニューレを通して鉗子を引き上げることにより、試料を取り出します。これは、優しく、肝臓からの生検を引き裂くだろう。氷の上でRPMI 1640培地中で肝生検を置きます。
- カメラの可視化を使用して出血のための生検部位を調べます。出血が観察されている場合は、生理食塩水moisteneを配置カニューレを通して滅菌綿棒をD、および生検部位に圧力を適用します。また、止血を支援するために滅菌ゲルフォームでの生検サイトをパック。
- 繰り返して、追加の肝生検を取得するために2.5.5を通じて2.5.3を繰り返します。
注：ここでは、手順に従って動物あたり3回の生検を採取し、全ての下流の分析のために十分です。
- 外科的縫合
- 出血のため腹腔を調べます。
注：これは、これまでに発生していません。過剰な出血が注目されている場合は、出血の部位を決定し、滅菌綿棒またはゲルフォームを用いて圧力を介して適切な止血を提供します。 - サフをオフにして、カニューレのコックを開きます。完全に腹膜腔を減圧するために腹部に優しく手で圧力を適用します。カニューレを外します。
- サイトごとに1〜2シンプルな結節縫合で腹壁切開のそれぞれを閉じます。 4-0吸収性縫合糸を推奨します。
- 地元の鎮痛のための先行皮膚閉鎖に各切開部で0.1〜0.3のccブピバカインを配置することにより、スプラッシュブロックを実行します。
- サイトごとに2埋め中断縫合糸（4-0吸収性縫合糸を推奨） - 1で皮膚を閉じます。組織接着剤を適用することができます。
- 出血のため腹腔を調べます。
3.肝生検処理とリンパ球の分析
- 好ましいRNAストレージソリューションに、凍結保存用チューブに肝臓組織の数片（大きさ約0.5mm×0.5ミリメートル×0.5ミリメートル）を保存し、将来の分子および組織学的のために10％ホルマリン分析。
- 1Xペニシリン/ストレプトマイシンを補充した50mlのRPMI 1640培地、市販のコラゲナーゼ溶液の40 / mlの、及び蓋付きの滅菌250mLのプラスチックカップに4 / mlのDNアーゼ中に残存する肝生検を置きます。 37°Cで1時間磁気撹拌棒と撹拌プレートを用いて激しく撹拌しました。
- 均等に消化された組織を注ぐことにより、配布します。 GR2つの70μmのフィルター上に（ステップ3.1.1からの）消化された組織をindが滅菌5mLの注射器の端を使用して、単一細胞懸濁液中に2本の50 mLコニカルチューブに収まります。 10％ウシ胎児血清を補充したRPMI 1640培地及び1Xペニシリン/ストレプトマイシン（R10）で50 mLに両方のチューブの容積をもたらします。
- 4℃で6分間、840×gで細胞を遠心分離。上清をデカントします。 5mLのR10で両方の管から細胞を懸濁一本の50mLのコニカルチューブに組み合わせることにより、単一の50 mLコニカルチューブに細胞を濃縮します。 R10を用いて50mLの体積をもたらします。携帯収量を決定するために、血球計数器を用いて細胞を数えます。
- 4℃で6分間、840×gで細胞を遠心分離。 1mLのR10で細胞を再懸濁し、2つの5 mLの丸底ポリスチレンチューブに均等に分配し、各チューブに> 500,000細胞のターゲティング、R10で4 mLに各チューブの容積をもたらします。
- 4℃で6分間、840×gで細胞を遠心分離。 Sをデカントupernatant及び4mLのリン酸緩衝生理食塩水（PBS）中に細胞ペレットを再懸濁します。 4℃で6分間、840×gで遠心分離。
- 上清をデカントし、穏やかにボルテックスによりPBS100μlに細胞を再懸濁。修正可能な死細胞染色の1.5μLを追加します。 5分間室温でインキュベートします。
- CD45-PerCPを（クローンD058-1283）、CD3-PE-CF594（クローンSP34-2）、CD20-PE-Cyanin5（クローン2H7）、CD4-BV605（：製造者が推奨する力価の次希釈されていない表面染色抗体を追加クローンOKT4）、CD8-BV570（クローンRPA-T8）、およびCD14-BV785（クローンM5E2）。 20分間4℃でインキュベートします。
- 4℃で6分間、840×gで4 mLのPBSと遠心分離を追加。上清をデカントし、PBS中1％パラホルムアルデヒドの250μL中に細胞を再懸濁。
注意：パラホルムアルデヒドは有毒です。適切な個人保護具を着用します。 - 参照22で説明したようにフローサイトメーターを用いて細胞集団を分析します。
Representative Results
これらの器官における腹腔鏡下で収集したMLNの処理のための詳細な方法だけでなく、携帯利回り、および白血球周波数は以前に13に報告されています。 図1は、この腹腔鏡技術を使用して、2つの健康な女性のRMから160日間離れた2つの時点で採取MLNを比較細胞収率および生存率データおよび肝臓生検を示します。我々はそれぞれ、33.5×10 6の平均得られた6.74×10 6細胞を、MLNからの細胞収率は、肝臓（P = 0.0021）からよりも有意に高いことがわかりました。フローサイトメトリーによる死細胞染色および分析は、両方の臓器から単離された細胞の> 90％が生存可能であることを示しました。
フローサイトメトリーを使用して、我々はMLNおよび肝臓中の白血球やリンパ球の豊かさを評価し、比較しました。肝臓のための代表的なゲーティングスキームに示されています
図1.総細胞収率（上部）および連続収集MLNおよび肝臓生検からの細胞生存率（下）。 MLNは、肝臓がやったよりも有意に高い細胞収率を示しました。しかし、両方の試料型は、下流分析のために十分な細胞を提供しました。フローcytomで測定し、細胞の生存率、etrically固定可能死細胞アミン染色を使用して、両方の試料型は、典型的には、組織の解離後に> 90％の細胞生存率をもたらしたことを示しました。エラーバーはサンプル間の標準偏差を表します。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2.代表的フローサイトメトリー・ゲーティング戦略。まず、凝集細胞を固定可能な死細胞アミン染色を用いて染色した後にのみ、生細胞の選択に続いて、除外されました。次に、CD45 +白血球は、CD3 + T細胞の選択に続いて、選択されました。 CD3 +集団から、CD4 +およびCD8 + T細胞を分析しました。 CD3から-人口、CD14 +およびCD20 +細胞を分析しました。ティ sのゲーティング戦略もMLNのために使用されました。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
MLNおよび長手方向に二匹の肝臓から図3.フローサイトメトリープロット。 MLNおよび肝臓試料を両方の動物を160日間離れて採取しました。 （A）。 MLN CD45 +細胞（白血球）。 （B）肝CD45 +細胞（白血球）。 （C）MLN + CD3 +細胞（T細胞）。 （D）肝CD3 +細胞（T細胞）。両方の動物について、MLNは、肝臓に比べてCD45 +およびCD3 +細胞のより高い割合を示しました。時間を越え、これらの集団の頻度は、両方の動物のために類似していました。S / ftp_upload / 55617 / 55617fig3large.jpg」ターゲット= 『_空白』>この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図CD45 +細胞（左）および23回の個々のサンプリングの様々な白血球およびリンパ球亜集団（右）の4周波数。肝臓は各臓器の固有の機能を示す、CD14 +白血球の有意に高い頻度を示したMLNSは、CD45 +、CD3 +、およびCD4 +細胞の有意に高い頻度を示しました。エラーバーはサンプル間の標準偏差を表します。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
Discussion
ここでは、本研究では説明しませんこれらおよび他の動物に、100％の成功率を持っていたシリアルMLNの収集及び肝生検のための低侵襲技術を実証します。さらに、時間にわたって同じ動物でのこの技術の使用は、有害事象と関連付けられていません。実際、SIV、サル/ヒト免疫不全ウイルス（SHIV）、又はZikaウイルス（未発表データ）で感染させた動物の他のコホートにおけるこの技術の使用から生じる合併症はなかったです。同様に、この手術はしても、以前に、主要な腹部の手術を受けた動物および血小板減少症の動物（未発表データ）に成功しました。我々は、これらのサンプルは、追加の切開の必要性を回避する肝臓へのMLNから切り替えたときのカメラの位置を逆にして同じ2つのポートを介して収集することができることを実証しました。 MLNのコレクションに影響を与える要因には、以前に13に報告されています。
完了するために45分間二~0.5センチ切開部を介して達成される - 全体の手順は、典型的には30を取ります。肥満動物では、より大きな切開を作るために必要があるかもしれない - を通じてMLNを取得するために（〜1〜1.5センチ）と完了するために追加の時間を必要とするかもしれません。豊富な腸間膜脂肪と動物は、多くの場合、dと豊富な経験を必要とします周囲の脂肪からifferentiate MLN。 MLNは、多くの場合、腸間膜血管系に沿って発見され、血管中の分岐点に近いより一般的であるように思われています。この技術の重要な側面は、それが腸間膜に腹部切開を通して体外にするのに十分な可動性を有するように選択MLNを必要とすることです。結果として、この技術は、腸間膜の根元に近いMLNを収集するために使用することができません。倍率に、時間にカメラでMLNを識別すること、およびMLNに近接して把持することが体外にされると、ノードの位置を特定し、識別を支援することができ容易です。
トレンデレンブルグの位置の使用は、常にMLNの収集のために必要とされないこと、およびMLNは簡単にトレンデレンブルグの位置を使用せずに取り出すことができるならば、それは頭側シフトから臓器を防ぐことができますよう、肝生検を容易にすることができます。時には、トレンデレンブルグの位置に配置した後、肝臓は、横隔膜や必見に対してシフトアップされますそっと前生検コレクションに元の位置に戻し操作します。 MLN収集のためのポートの配置が左にあるとして、彼らは、カニューレに近いとして、肝生検は通常、左横および左内側肝葉から取得されます。
MLN収集し、肝生検は、下流分析の様々な十分な細胞収量を提供し、収集された細胞の高い生存率を示しました。ここでは、細胞は白血球やリンパ球集団のフローサイトメトリー分析のために染色し、これらの二つの重要な免疫器官の間の主な違いは明らかにしました。例えば、MLNが高度炎症性管理のため、ならびにCD4 + Tの重要性に収集および適応免疫応答を広めるための中心点としてMLNの重要性のために、肝臓に比べてCD4 + T細胞について富化し、そして環境への寛容原性応答は、食事摂取量とGI-常駐微生物由来の抗原S = "外部参照"> 24。しかし、肝臓は大幅MLNに比べてCD14 +白血球のために富んでいました。 CD14は、単球およびマクロファージ上で主に発現し、細菌性リポ多糖（LPS）25のための受容体複合体の重要な構成要素です。実際、可溶性CD14の増加した血漿中濃度は、微生物転及びHIV病原性SIV感染26で免疫活性化と関連しています。 MLNと比較するとこのように、肝臓におけるCD14 +白血球の高い周波数は、おそらく、この器官におけるより大きな細菌負荷に起因します。
ここでは、任意の有害転帰に至っていない腹腔鏡エントリの2つだけ小さな切開を使用してシリアルMLNの収集及び肝生検のための迅速かつ低侵襲性の外科技術を実証します。これらのサンプルは、ナンプラーを取るキー免疫学、ウイルス学、微生物学的およびプロセスを評価するために便利なルートを提供します全身性免疫とは別のユニークであるMLNおよび肝臓、中のCe。同様に、肝生検はしばしば重大な肝障害16を誘導するために組み合わせるHIV / SIV、薬物療法、および転微生物の影響の長期評価のために重要です。 MLNおよび肝臓がGI微生物叢にさらされた免疫器官であるため、また、時間を越えこれらの器官で免疫力を評価する能力はmicrobiomeは、宿主の免疫恒常性の維持に果たす役割を理解するための優れたプラットフォームを提供します。まとめると、肝臓及びMLNの評価は、ワクチンや治療効能、SIVウイルスリザーバーのクリアランス、および一般的な粘膜免疫の関係で非常に重要です。低侵襲的アプローチを介してこれらのサンプルを収集する能力は、現在公開された技術および動物の生理にあまり影響で存在するよりも、手順に関連する炎症の少ないリスクがあることを意味します。 FUでトゥーレ、我々は中に重要な役割を果たすことが示されている免疫系の別の重要かつ明確な部分のサンプリングを可能にするために同じ2つのポートの位置によって脾臓のコレクションをMLNの収集と肝臓を結合する可能性を評価します疾患モデルの数。
Disclosures
著者は何の競合する金融利益を宣言していません。
Acknowledgments
この作品は、NIH助成金番号P51OD010425によってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Artficial Tears Lubricant Ophthalmic Ointment | Patterson Veterinary | 97-890-8152 | |
| Priority Care Chlorhexidine 2% Scrub | Patterson Veterinary | 07-842-6153 | |
| Vedco Alcohol, Isopropyl 70% | Patterson Veterinary | 07-869-6434 | |
| Vedco Vetadine Scrub | Patterson Veterinary | 07-869-6772 | |
| Hospira Lactated Ringer's 250 mL | Patterson Veterinary | 07-800-9325 | |
| Adolescent Laparotomy Surgical Drape | Medline | DYNJP3004 | |
| Access 40 L Insufflator | Dyonics | 7205832 | |
| 300XL Xenon Light Source | Dyonics | 7206084 | |
| 460P 3 – CCD Digital Camera with Head | Dyonics | 72200086 | |
| Universal Camera Drape, 7” x 96” | Endoscopy Support Services | ESS-6920 | |
| Universal Light Guide, 7.5 Ft | Endoscopy Support Services | US.OU225 | |
| Insufflator Tubing | Endoscopy Support Services | TM-102 | |
| Multipurpose Rigid Scope, 2.7 mm x 187.5 mm, 0 degree | Endoscopy Support Services | B30-0007-00 | |
| Exam and Protective Sheath for 2.7 mm x 187.5 mm scope with one fixed stopcock | Endoscopy Support Services | B10-0025-00 | |
| Rigid scope, 5 mm x 300 mm | Endoscopy Support Services | B30-0071-00 | |
| Veress Needle, 2 mm x 80 mm | Endoscopy Support Services | 8302.08 | |
| Solid Probe with Markings, 5 mm x 320 mm | Endoscopy Support Services | 8383.661 | |
| Maryland Grasping and Dissecting Forceps with Double Action Ratchet Handle, 3.5 mm x 240 mm | Endoscopy Support Services | 8390.2054 | |
| Biopsy Forceps, 3.5 mm x 310 mm | R. Wolf | 8391.4063 | |
| Plastic Threaded Cannula with Insufflator Port, 3.5 mm x 60 mm | Endoscopy Support Services | 8903.072 | |
| Plastic Threaded Cannula with Insufflator Port, 5.5 mm x 60 mm | Endoscopy Support Services | 8919.333 | |
| Blunt Tip Trocar | Endoscopy Support Services | 8903.101 | |
| Pyramidal Tip Trocar | Endoscopy Support Services | 8903.121 | |
| CO2 | Airgas | CD USPE | |
| RPMI 1640 | Fisher Scientific | SH30027FS | with L-Glutamine |
| RNAlater Stabilization Solution | ThermoFisher Scientific | AM7021 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma Aldrich | P4333 | |
| Liberase TM Research Grade | Sigma Aldrich | 5401119001 | Commercially available colleganse solution |
| Dnase I from bovine pancrease | Sigma Aldrich | D5025 | |
| 70 µm cell strainers | Morganville Scientific | CSS0200 | |
| 5 mL Syringe | BD | 309646 | |
| 50 mL Conical Centrifuge Tubes | ThermoFisher Scientific | 339652 | |
| Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | SH3007003 | |
| 5 mL Round-Bottom polystyrene tubes | Fisher Scientific | 14-959A | |
| PBS | Fisher Scientific | SH3025601 | |
| LIVE/DEAD Aqua Fixable Dead Cell Stain Kit | ThermoFisher Scientific | L34957 | Amine dead cell stain |
| CD45-PerCP (clone D058-1283) | BD Biosciences | 558411 | |
| PE-CF594 Mouse anti-Hu CD3 (clone SP34-2) | BD Biosciences | 562406 | |
| BV605 Mouse Anti-Hu CD4 (clone OKT4) | Biolegend | 317438 | |
| APC-H7 Mouse anti-Hu CD8 (clone SK1) | BD Biosciences | 560179 | |
| PE-Cy5 Mouse Anti-Hu CD20 (clone 2H7) | BD Biosciences | 555624 | |
| BV786 Mouse Anti-Hu CD14 (clone M5E2) | BD Biosciences | 563698 | |
| 16% PARAFORMALDEHYDE AQ SOLUTN | Fisher Scientific | 50-980-487 | |
| LSR II Flow Cytometer | BD | NA |
References
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