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Biochemistry

Isolierung von Zwischenfilamentproteinen aus mehreren Mausgeweben zur Untersuchung von altern-assoziierten posttranslationalen Modifikationen

Published: May 18, 2017 doi: 10.3791/55655
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Cell Biology and Physiology, School of Medicine, University of North Carolina at Chapel Hill

Summary

In diesem Verfahren stellen wir biochemische Verfahren zur schnellen und effizienten Isolierung von Zwischenfilament (IF) Proteinen aus mehreren Mausgeweben vor. Isolierte IFs können verwendet werden, um Veränderungen in posttranslationalen Modifikationen durch Massenspektrometrie und andere biochemische Assays zu untersuchen.

Abstract

Zwischenfilamente (IFs) bilden zusammen mit Aktinfilamenten und Mikrotubuli das Zytoskelett - ein kritisches Strukturelement jeder Zelle. Normal funktionierende IFs liefern Zellen mit mechanischer und Belastungsstabilität, während ein dysfunktionelles IF-Zytoskelett die zelluläre Gesundheit beeinträchtigt und mit vielen menschlichen Krankheiten assoziiert wurde. Posttranslationale Modifikationen (PTMs) kritisieren die IF-Dynamik kritisch als Reaktion auf physiologische Veränderungen und unter Stressbedingungen. Daher kann die Fähigkeit, Änderungen in der PTM-Signatur von IFs zu überwachen, zu einem besseren funktionalen Verständnis und letztlich Konditionierung des IF-Systems als Stress-Responder bei zellulären Verletzungen beitragen. Allerdings ist die große Anzahl von IF-Proteinen, die von über 70 einzelnen Genen codiert und gewebeabhängig ausgedrückt werden, eine große Herausforderung, die relative Bedeutung verschiedener PTMs zu lokalisieren. Zu diesem Zweck werden Methoden, die die Überwachung von PTMs auf IF-Proteinen ermöglichenAuf einer organismusweiten Ebene, anstatt für isolierte Familienmitglieder, kann den Forschungsfortschritt in diesem Bereich beschleunigen. Hier präsentieren wir biochemische Methoden zur Isolierung der gesamten, detergenzlöslichen und detergenzresistenten Fraktion von IF-Proteinen aus 9 verschiedenen Mausgeweben (Gehirn, Herz, Lunge, Leber, Dünndarm, Dickdarm, Bauchspeicheldrüse, Niere und Milz). Wir zeigen weiterhin ein optimiertes Protokoll zur schnellen Isolierung von IF-Proteinen unter Verwendung von Lysing-Matrix und automatisierter Homogenisierung verschiedener Mausgewebe. Das automatisierte Protokoll ist nützlich für die Profilierung von IFs in Experimenten mit hohem Probenvolumen (wie bei Krankheitsmodellen mit mehreren Tieren und experimentellen Gruppen). Die resultierenden Proben können für verschiedene nachgeschaltete Analysen verwendet werden, einschließlich massenspektrometrischer PTM-Profilierung. Unter Verwendung dieser Methoden liefern wir neue Daten, um zu zeigen, dass IF-Proteine ​​in verschiedenen Mausgeweben (Gehirn und Leber) parallele Veränderungen in Bezug auf ihre Expres unterliegenUnd PTMs während des Alterns.

Introduction

IFs sind eine Familie von Proteinen, die beim Menschen von 73 Genen kodiert und in sechs Haupttypen kategorisiert sind: Die Typen I-IV sind zytoplasmatisch ( zB Epithel- und Haarkeratine (K), Myozyten desmin, Neurofilamente, gliales fibrilläres saures Protein (GFAP), und andere); Typ V sind die nuklearen Lamine; Und Typ VI sind IFs in der Augenlinse 1 . In Bezug auf ihre molekulare organisation haben IF-Proteine ​​drei gemeinsame Domänen: eine hochkonservierte Coiled-Coil-"Stab" -Domäne und globuläre "Head" und "tail" Domains. Wenn Protein-Tetramere zusammengesetzt werden, um kurze Filamentvorläufer zu bilden, die letztlich in reife Filamente eingebaut werden, die dynamische zytoskeletale und nukleoskeletale Strukturen, die an mechanischem Schutz 2 , Stress-Sensing 3 , 4 , Regulierung der Transkription 5 und Wachstum und anderen kritischen zellulären Funktionen beteiligt sind,"> 1 , 6 , 7 .

Die funktionelle Bedeutung des IF-Systems wird durch die Existenz vieler menschlicher Erkrankungen hervorgerufen, die durch Missense-Mutationen in IF-Genen verursacht werden, einschließlich Neuropathien, Myopathien, Hautzerstörungsstörungen, metabolische Dysfunktionen und vorzeitige Alterungssyndrome 8 . Einige IF-Gen-Mutationen verursachen nicht, sondern prädisponieren ihre Träger zur Krankheitsprogression, wie die einfachen epithelialen Keratine in der Lebererkrankung 9 . Letzteres ist auf die kritischen Stress-Schutzfunktionen von IFs in Epithelien zurückzuführen. IFs gehören im Allgemeinen zu den am häufigsten vorkommenden zellulären Proteinen unter basalen Bedingungen, sind aber bei verschiedenen Belastungsarten weiter stark induziert 10 . Zum Beispiel haben neuere Studien, die proteomweite Veränderungen im Nematoden C. elegans untersuchten, gezeigt, dass mehrere IFs hoch hochreguliert und anfällig für Aggregat sindWährend der organisatorischen Alterung 11 , 12 . Da die Aufrechterhaltung einer geeigneten IF-Struktur für die zelluläre Resistenz gegenüber verschiedenen Formen von Stress 10 wesentlich ist, kann die IF-Aggregation auch bei der Alterung zum funktionellen Rückgang beitragen. Allerdings fehlt es an organismalen Studien, die mehrere Säugetier-IF-Proteine ​​über verschiedene Gewebe untersuchen, die sich einer Belastung unterziehen.

IFs sind hochdynamische Strukturen, die sich an zellulare Anforderungen anpassen. Keratine werden beispielsweise einem biosyntheseunabhängigen Zyklus zwischen löslichem (nicht filamentösem) und unlöslichem (filamentösen) Protein-Pool 13 unterzogen. Unter normalen physiologischen Bedingungen kann etwa 5% der gesamte K8 / K18-Pool in reinigungsmittelfreiem Puffer extrahiert werden, im Vergleich zu etwa 20%, der im nichtionischen Detergens Nonidet P-40 solubilisiert werden kann, das biochemisch mit Triton- X100 14 , 15 Während der Mitose gibt es eine bemerkenswerte Erhöhung der Löslichkeit von einfachem Epithel K8 und K18 14 , was bei epidermalen Keratinen weniger offensichtlich ist, aber deutlicher in Vimentin und anderen Typ III IF-Proteinen 15 , 16 ist . Die Löslichkeitseigenschaften von IF-Proteinen werden durch Phosphorylierung, eine Schlüssel-posttranslationale Modifikation (PTM) für die Fadenumlagerung und Löslichkeit 17 , 18 , 19 , 20 , geregelt. Die meisten IFs unterliegen einer umfangreichen Regulierung durch eine Reihe von PTMs an konservierten Standorten, was zu funktionalen Veränderungen führt.

Der Zweck dieser Methode ist es, Ermittler einzuführen, die neu im IF-Feld sind, um biochemische Extraktion und analytische Methoden für die Untersuchung von IF-Proteinen über mehrere Maus-Gewebe. SpezifischWir konzentrieren uns auf die Isolierung von IF-Proteinen unter Verwendung einer Hochsalz-Extraktionsmethode und Bewertung von Veränderungen in PTMs durch Massenspektrometrie und durch PTM-Targeting-Antikörper. Diese Methoden bauen auf den zuvor veröffentlichten Prozeduren 21 auf , umfassen jedoch Modifikationen zum Extrahieren verschiedener IF-Protein-Typen, um einen gemeinsamen Mechanismus für die Regulierung über die IF-Familie aufzudecken. Beispielsweise reguliert die K8-Acetylierung an einem spezifischen Lysinrest die Filamentorganisation, während die Hyperacetylierung die K8-Unlöslichkeit und die Aggregatbildung 22 fördert. Jüngste globale Proteom-Profiling-Studien haben zusätzlich gezeigt, dass die meisten gewebespezifischen IF-Proteine ​​auch Ziele für die Acetylierung sind und dass die meisten IF-Acetylierungsstellen auf die hoch konservierte Stab-Domäne beschränkt sind. Dies unterstreicht die Notwendigkeit von Methoden, die für die globale Profilierung des IF-Systems geeignet sind. Wir führen auch eine schnelle Methode zur Isolierung von IF-Proteinen aus mehreren Geweben mit automatisierter Homogenisierung in opti einGemischte lysing matrix Die resultierenden Präparate eignen sich für die nachgeschaltete PTM-Analyse über Massenspektrometrie und andere Methoden.

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Protocol

Das Protokoll wird gemäß dem Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) an der University of North Carolina genehmigt und durchgeführt.

1. Vorbereitungen

  1. Triton-X-Puffer (1% Triton X-100, 5 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) vorbereiten, Volumen in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), pH 7,4) aufbringen. Um 500 ml zu ergeben: 5 ml Triton X-100 und 500 mM EDTA in 490 ml PBS, pH 7,4, umrühren. Triton-X-Pufferlösung bei 4 ° C aufbewahren.
  2. Vorbereitung des Salzsalzes (10 mM Tris-HCl, pH 7,6, 140 mM NaCl, 1,5 M KCl, 5 mM EDTA, 0,5% Triton X-100, Volumen in doppelt destilliertem (dd) H 2 O). Zur Herstellung von 500 ml: Rühren Sie 10 ml 0,5 M Tris-HCl (pH 7,6), 14 ml 5 M NaCl, 55,9 g KCl, 5 ml 0,5 M EDTA und 2,5 ml Triton X-100, um das Volumen auf 500 einzustellen Ml mit doppelt destilliertem Wasser). Hochsalzpufferlösung bei 4 ° C aufbewahren.
  3. Vor der Verwendung, ergänzen Sie eine entsprechende Menge an Triton-X und High Salt Buffer (
  4. Vorbereitung von 5 mM EDTA in 1x PBS, pH 7,4. Um 500 ml zu ergeben: 5 ml 0,5 M EDTA in 495 ml von 1x PBS, pH 7,4, umrühren.
  5. Isoliere verschiedene Mausorgane (Gehirn, Herz, Lunge, Leber, Bauchspeicheldrüse, Dickdarm, Darm, Niere, Milz) unter Verwendung genehmigter Protokolle, die Veterinärrichtlinien und institutionellen Standards entsprechen 23 . Das Gewebsammelverfahren sollte nicht mehr als 5 min dauern, um die RNA- und Proteinintegrität von Protease-reichen Geweben zu bewahren ( z. B. Pankreas sollte zuerst verarbeitet werden).
  6. Schneiden Sie eine kleine Menge an Gewebe (~ 5-20 mg) und legen Sie in RNA-Speicherlösung, für die anschließende RNA-Extraktion, die cDNA-Synthese und die quantitative Echtzeit-PCR-Analyse für die IF-Genexpression. Platzieren Sie RNA-Speicher-Lösungsrohre mit Gewebe bei 4 ° C über Nacht und folgen Sie dem Hersteller-Protokoll für weitere sTorage und isolationsschritte
  7. Den Rest des Gewebes in kleinere Fragmente ( z. B. 0,5 cm) schneiden und in Kryovial stellen. Snap-Freeze und Lagerung von Durchstechflaschen bei -80 ° C oder flüssigem Stickstoff für längerfristige Lagerung.

2. IF Genexpressionsanalyse

  1. Extrahieren Sie RNA aus Geweben, die in dem RNA-Speicherlösungsreagenz konserviert sind. Verwenden Sie eine geeignete / bevorzugte RNA-Extraktionsmethode gemäß dem Protokoll des Herstellers.
  2. Quantifizierung der RNA-Konzentration und Verwendung von 2 μg RNA zur Erzeugung von cDNA unter Verwendung eines geeigneten Reverse Transkriptionskits gemäß Herstellerprotokoll.
  3. Die Verwendung der erzeugten cDNA- und Maus-IF-Gen-spezifischen Primer stellte qPCR-Reaktionen auf, darunter drei technische Replikate jeder Probe sowie eine Blindkontrolle gemäß dem Protokoll des Herstellers.
  4. Quantifizierung der IF-Genexpression als Faltenveränderung, die verschiedene Bedingungen vergleicht ( z. B. junges gegen Altgewebe).

3. P.Reparation von Gesamt-Gewebe-Lysaten für Immunoblot

  1. Homogenisieren Sie 25 mg Gewebe in 1 ml 2x nicht reduzierendem SDS-Probenpuffer. Weichen Bromphenolblau-Farbstoff aus dem Probenpuffer, wenn ein kolorimetrischer Protein-Assay durchgeführt werden soll, um die Proteinkonzentration zu quantifizieren.
  2. Füge 5% (v / v) 2-Mercaptoethanol (2-ME) hinzu, um reduzierte Proben zu machen. Zu 200 & mgr; l der nicht-reduzierenden Proben werden 10 & mgr; l 2-ME gegeben.
  3. Bestimmen Sie die Proteinkonzentration unter Verwendung von Detergenz- und Reduktionsmittel-kompatiblen Protein-Assay. Wenn der Farbstoff bereits in dem Probenpuffer enthalten ist, kann die Proteinmenge nach dem Laufen eines Gels über eine Anzahl von Techniken, einschließlich des Coomassie-basierten Flecks 24 , geschätzt werden.
  4. Vortex alle Proben und Hitze bei 95 ° C für 5 min.
  5. Führen Sie Western-Blotting unter reduzierenden und nicht reduzierenden Bedingungen. Belichtungsmembran kurz (<1 min), um monomere Spezies zu zeigen, und länger (> 1 min), um hochmolekulare komplexe Komplexe zu enthüllenNg IF-Proteine. Bei der Überwachung der Aggregation, untersucht die gesamte Gel / Membran (einschließlich der Böden der Gel-Wells).
  6. Führen Sie ein paralleles Gel und Fleck mit einem Protein Fleck als Ladesteuerung 24 . Bei Krankheitsmodellen oder Verletzungsversuchen sollte der gesamte Proteinfleck als Ladungskontrolle verwendet werden, im Gegensatz zu Immunoblots für "Housekeeping" Proteine ​​( zB Actin, GAPDH), da diese sich unter verschiedenen Stressbedingungen ändern.

4. Herstellung von Detergenz-löslichen und hochsalzigen Extrakten von tissenspezifischen IFs

  1. Füge 1 ml eiskaltes Triton X-100 Puffer in einen Glasröhrchen-Homogenisator und lege ihn auf Eis.
  2. Entfernen Sie ein kleines Stück Gewebe (~ 25 mg) aus der Flüssigkeits-Stickstoff-Lagerung und legen Sie direkt in den Glas-Homogenisator. Verwenden Sie eine Polytetrafluorethylen-Pistille zu homogenisieren (50 Schläge) und vermeiden, um Blasen. Halten Sie den Homogenisator und lysieren Sie jederzeit kalt.
  3. Übertragen Sie Lysat auf ein 1,5 ml-GemischZentrifugenröhrchen auf Eis zentrifugieren und bei 20.000 xg für 10 min in einer vorgekühlten Zentrifuge (4 ° C) zentrifugieren.
  4. Sammle die überstehende Fraktion in ein separates Röhrchen. Dies ist die Triton-X-lösliche Fraktion, die für die Immunpräzipitation (ip) und die Analyse des Detergens-löslichen Pools von IF-Proteinen verwendet werden kann. Beachten Sie, dass die Schritte 4.1-4.4 wiederholt werden können, um einen saubereren IF-Extrakt aus Hirngewebe zu erreichen.
  5. Füge 1 ml starker Salzpuffer zum Gewebepellet hinzu, transferiere auf einen sauberen Homogenisator und springe 100 Hübe. Übertragen Sie das Homogenat wieder in das Mikrozentrifugenröhrchen und legen Sie das Röhrchen für 1 h auf einen rotierenden Schüttler im kalten Raum.
  6. Die Homogenate bei 20.000 xg für 20 min bei 4 ° C zentrifugieren. Den Überstand verwerfen.
  7. Füge 1 ml eiskaltes PBS / EDTA-Puffer zum Pellet hinzu und homogenisiere das Pellet (20 Hübe) in einem sauberen Homogenisator als Endreinigungsschritt *. Überführung in ein neues Röhrchen und Zentrifugieren bei 20.000 xg für 10 min bei 4 ° C, um das IF-Protein-Reicher Hochsalz-Extrakt (HSE).
    * Gegebenenfalls vortexen statt der Homogenisierung bei diesem Schritt.
  8. Den Überstand verwerfen und die Pellets in 300 μl nicht reduzierendem SDS-Probenpuffer auflösen, der vorgewärmt wurde. Das Pellet zunächst durch Pipettieren und Vortexen auflösen und dann die Proben 5 min bei 95 ° C erhitzen.
  9. Vortex und Pipette nach Bedarf, um sicherzustellen, dass das Pellet aufgelöst wird. Es kann einige Minuten dauern, bis die Pellets vollständig aufgelöst sind.
  10. Alle Proben bei -20 ° C bis zur Analyse aufbewahren.

5. Automatisierte Gewebe-Lyse für IF-Proteinextraktion in Hochvolumen-Experimenten

  1. Zur RNA-Extraktion platzieren Sie Lysepuffer (600 μl Puffer pro 25 mg Gewebe) in ein Röhrchen, das die Lysierungsmatrix D enthält (verwendet kleine Keramikkugeln) und pulsiert für 25 s im Gewebelyser zweimal. Trennen Sie das Lysat aus der Matrix durch Zentrifugation bei 20.000 xg und fahren Sie mit dem nächsten Schritt in Isolation fort.
  2. Zur Proteinextraktion platzieren Sie TritAuf X-100 (oder SDS-Probenpuffer bei der Herstellung von Gesamtlysat) in einem Lysierröhrchen mit Lysing-Matrix SS (verwenden Sie eine einzelne Edelstahlperle). Nach dem Testen mehrerer Matrizen wurde dies ausgewählt, weil es IF-Proteinextrakte produziert, die in ähnlicher Qualität wie die herkömmliche Douncing-Methode sind. Beachten Sie, dass die automatisierte Methode nicht optimal für Bauchspeicheldrüse und Milz ist, und das Standard-Homogenisierungsprotokoll sollte für diese Gewebe verwendet werden.
  3. Um mit der Vorbereitung des Hochsalz-Extraktes fortzufahren, entfernen Sie den Edelstahl-Wulst aus dem Röhrchen mit einem Magneten und zentrifugieren die Röhrchen bei 20.000 xg für 10 min bei 4 ° C.
  4. Fahren Sie mit Schritt 4.4 (oben) des manuellen Protokolls fort.
  5. Alle Proben bei -20 ° C bis zur Analyse aufbewahren.

6. Immun-Anreicherung von posttranslational modifizierten IF-Proteinen

  1. Vorbereitung PBST-Puffer (0,02% Tween-20 in PBS). Um 50 ml zu ergeben, werden 10 & mgr; l Tween-20 bis 50 ml PBS, pH 7,4, zugegeben.
  2. PTM-Antikörper vorbereitenLösung (1-10 μg Antikörper in 200 μl PBST). Im Allgemeinen sind 3 μg Antikörper / Reaktion eine gute Ausgangsbedingung, die bei Bedarf weiter optimiert werden kann.
  3. Für jede Reaktion werden 50 μl magnetische Perlen in ein Mikrozentrifugenröhrchen gegeben, auf den Magneten gelegt und die Wulstaufbewahrungslösung angesaugt.
  4. Konjugieren Sie die Perlen zum Immunpräzipitations-Antikörper durch erneutes Suspendieren in der Antikörperlösung und inkubieren auf Rotator (End-over-End, um das Mischen von kleinen Volumina zu gewährleisten) bei Raumtemperatur für 20 min.
  5. Legen Sie die Röhrchen auf Magnet und aspirieren Antikörper-Lösung.
  6. Spülen Sie die Antikörper-konjugierten Perlen einmal in 200 μl PBST und entfernen Sie Waschpuffer.
  7. Füge 0,6-1 ml des Gewebslysats zu den Perlen hinzu, mischen durch sanftes Pipettieren und inkubiere für 3 h auf Rotator in einem kalten Raum.
  8. Legen Sie die Röhrchen auf den Magneten, entfernen Sie Lysat und waschen Sie die Perlen fünfmal mit 200 μl PBST. Nach dem letzten Waschschritt sammle die Perlen in 100 _6; L von PBS (kein Tween-20) und Transfer zu einem sauberen neuen Röhrchen. Legen Sie den Schlauch auf den Magneten.
  9. Absaugen des PBS und Zugabe von 100 & mgr; l nicht reduzierendem Probenpuffer. 50 μl entfernen und 2-ME (5%) dazugeben, reduzierende Proben zu machen. Die Proben auf 95 ° C für 5 min erhitzen.
  10. Trennen Sie die IP-Fraktion von den Perlen auf den Magneten und sammeln Sie sie in eine neue Röhre.
  11. Proben bei -20 ° C bis zur Analyse aufbewahren.

7. Herstellung von IF-Proteinproben für die Massenspektrometrie-Analyse

  1. Planen Sie eine Beratung mit einem Proteomik-Experten vor der Einleitung einer Studie, da es erhebliche Zeit und Kosten in der Massenspektrometrie-Analyse beteiligt ist.
  2. Besondere Vorsichtsmaßnahmen treffen, um eine Kontamination zu vermeiden. Behandle alle Gele mit sauberen Handschuhen und inkubiere in sauberen Behältern, nur mit ddH 2 O gewaschen (Seife vermeiden).
  3. Führen Sie 20-50 μl der HSE-Probe (aus den Abschnitten 4 und 5) auf einem SDS-PAGE-Gel gemäß Standardbedingungen aus. Fleck mit einem Proteinfleck für 1 h. Spülen Sie mehrmals und entfärben Sie in ddH 2 O über Nacht. Die IF-Proteinbanden sollten nach dem Entfärben leicht sichtbar sein.
  4. Legen Sie das Gel zwischen Plastikfolienschützer, scannen Sie und markieren Sie die Bänder, die herausgeschnitten werden und zur Analyse gesendet werden.
  5. Verbrauchen Sie die IF-Proteinbänder mit einem neuen, sauberen Rasiermesser.
  6. Legen Sie die Gelbänder in saubere Mikrozentrifugenröhrchen und übertragen Sie sie in eine Massenspektrometrie.

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Representative Results

Eine neue Schnellmethode für die hochsalzbasierte Extraktion von IF-Proteinen aus mehreren Mausgeweben mittels Lysing-Matrix.

Die traditionelle Methode 25 , 26 der Isolierung der Masse der Zwischenfilamentproteinfraktion aus Epithelgewebe wurde hier modifiziert, um 9 verschiedene Organe und ein schnelleres Verfahren für die Gewebslyse einzuschließen. Während für die herkömmliche Methode 3 manuelle Homogenisierungsschritte erforderlich sind, hat das modifizierte Verfahren nur einen manuellen Homogenisierungsschritt, der die Prozedur um mehrere Stunden verkürzt, insbesondere bei der Verarbeitung von mehr als 6 Proben. Fig. 1A zeigt ein typisches Ergebnis von HSEs von 9 Mausgeweben, während die Tabelle der erwarteten Proteine ​​im Gewebe und das Molekulargewicht jedes Proteins in Fig. 1B gezeigt ist

Leber K8 und K18 sind stark hochreguliert und unterliegen einer erhöhten Phosphorylierung und Lysin-Acetylierung in Lebern aus alten Mäusen.

Abbildung 2 zeigt typische Ergebnisse aus mehreren der in diesem Protokoll beschriebenen Analysen. Panel A zeigt die Expressionsanalyse der beiden großen IF-Gene in der Leber, Keratin 8 ( KRT8 )Und Keratin 18 ( KRT18 ), die die IF-Proteine ​​K8 bzw. K18 kodieren. Epitheliale Keratine werden unter verschiedenen Stressbedingungen stark hochreguliert. In dem dargestellten Ergebnis tritt dies während des Alterns auf, da KRT8 in den Lebern von 24 m alten Mäusen im Vergleich zu 3 m alten Mäusen signifikant hochreguliert wird. Die Ergebnisse auf Proteinebene sind auffälliger, wie durch den dramatischen Anstieg des K8-Monomers sowie hochmolekulare Komplexe in den alten (24 m) Lebern beobachtet wird. Coomassie-basierte Proteinfärbung dient hier als Ladesteuerung, um eine gleichmäßige Beladung von Protein über Proben sicherzustellen. Beachten Sie, dass bei totalen Gewebe-Lysaten ist es einfach, Protein auf einem Gel zu überladen, wie es in diesem Fall ist. Das Laden eines kleineren Volumens oder das Verdünnen der Probe in Natriumdodecylsulfat (SDS) -Puffer wird dieses Problem lindern (insbesondere wenn es viskos und schwer zu pipettieren erscheint). Panel C stellt ein typisches Ergebnis aus einer Leber dar. Hochsalz-Extrakt, erhalten mit dem automatisierten Protokoll, demDie starke Anreicherung der Keratine 8 und 18 auf dem Gel aufzutreiben. Die roten Linien abgrenzen die Fläche, die ausgeschnitten und für die Massenspektrometrie-Analyse eingereicht wurde. In Panel D zeigen die Ergebnisse der Massenspektrumanalyse der Proben in Panel C, dass K8 und K18 in der alten Leber mehrere Phosphorylierungs- und Acetylierungsstellen aufweisen, die in der jungen Leber nicht vorhanden sind.

GFAP ist stark hochreguliert und Lysin im Gehirn von alten Mäusen acetyliert.

Abbildung 3 zeigt, dass die Methoden, die verwendet werden, um IFs aus Epithel zu extrahieren, auch auf nicht-epithelialem Gewebe verwendet werden können. Darüber hinaus zeigen die Ergebnisse ein allgemeines Muster für die alterungsabhängige Hochregulierung von IF-Genen und Proteinen. Das qPCR-Ergebnis in Abbildung 2A zeigt eine 5-fache Induktion von GFAP- mRNA im Gehirn von 24 m alten Mäusen im Vergleich zu 3 m alten Mäusen. Fig. 2BZeigt die in der Triton X-100-Fraktion vorhandenen Gesamtproteine ​​und die IF-angereicherte HSE. Beachten Sie die Erhöhung der Bandintensität bei 50 kDa, markiert durch den Pfeil (entsprechend GFAP) im alten Gehirn. Die Western-Blot-Analyse in Abbildung 2C zeigt weiterhin die Hochregulierung von GFAP und eine signifikante Präsenz von GFAP-Monomer und potentiellem Hochmolekülkomplex in der Triton X-100-Fraktion (beide durch Pfeile markiert). Die Western-Blot-Analyse der gleichen Proben mit einem Pan-Acetyl-Lysin-Antikörper zeigt, dass der Antikörper eine Bande bei ~ 50 kDa im HSE des alten Maus-Gehirns und bei ~ 250 kDa in der Triton X-100-Fraktion erkennt (Abbildung 2D ). Die Immunanreicherung von acetylierten Proteinen aus den Triton X-100-Fraktionen zeigt eine erhöhte Anwesenheit von GFAP-Protein in dem aus dem alten Gehirn erhaltenen Lysat. Es werden reduzierende und nicht reduzierende Bedingungen gezeigt, um GFAP-Monomer und hochmolekulare Komplexe zu markieren. Massenspektrometrieanalyse (ähnlich Fig. 1

Abbildung 1
Abbildung 1: Automatisierte Lyse und Extraktion von IF-Proteinen aus mehreren Mausgeweben. ( A ) Coomassie-basierte Gelfärbung von HSEs aus den bezeichneten Mausgeweben. Die gezeigten Gewebe wurden von der gleichen erwachsenen (3 m alten) männlichen CBA-Maus erhalten. Die Proben wurden wie in Abschnitt 5 beschrieben verarbeitet. Gehirn : Beachten Sie, dass NFL, NFM und NFH stark phosphoryliert sind 27 und wandern langsamer als erwartet bei 70, 145 bzw. 200 kDa. Herz : Zusätzlich zu der 53 kDa-Bande, die dem desmin und vimentin entspricht) enthalten Herzproben auch eine ~ 42 kDa-Bande, die höchstwahrscheinlich Actin repräsentiert, was bekannt ist, dass sie mit dem Desmin 28 zu reinigen ist. LArge-Darm: Die Identität der prominenten Banden über 25 kDa, die mit K8 / K18 coextrahiert sind, ist nicht bekannt, aber diese Banden sind nicht vorhanden, wenn die Gewebe nach dem traditionellen Dounce-Homogenisator-Verfahren verarbeitet werden. Pankreas und Milz : Beachten Sie, dass die automatisierte Homogenisierung nicht für die Isolierung von Keratinen aus Pankreas und Vimentin aus Milz geeignet ist, vermutlich wegen der Empfindlichkeit des Lysats auf die leichte Erhöhung der Temperatur während des Pulses im Gewebelyser. ( B ) Tabelle, die die wichtigsten IF-Protein-Typen in den verschiedenen Geweben und ihre vorhergesagte Molekulargewicht als Referenz für Panel A. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2: MoleculAr und biochemischen Unterschiede in Leber Keratinen von jungen und alten Mäusen. ( A ) Die Analyse von KRT8- und KRT8- mRNA nach Standardverfahren (Protokoll 1) zeigt eine signifikante Induktion im KRT8- Transkript in den Lebern aus alten Mäusen. N = 6 für jede Bedingung (3 männliche und 3 weibliche CBA-Mäuse wurden pro Gruppe verwendet). ** p <0,01; Einweg-ANOVA. ( B ) Insgesamt wurden Leberlysate von 3 jungen (3 Monate alten) und 3 alten (24 Monate alten) männlichen CBA-Mäusen unter Verwendung von Protokoll 2 erhalten, und die Proben wurden unter nicht reduzierenden Bedingungen analysiert. TS1-Antikörper wurde verwendet, um für die K8-Expression zu untersuchen, und Coomassie-basierter Proteinfärbung wurde als Ladesteuerung verwendet. ( C ) Hochsalz-Extrakte aus jungen und alten Mauslebern, entsprechend den Mäusen Nr. 1 und # 4 jeweils aus Tafel B. Die beiden Pfeile zeigen auf K8 und K18 auf dem Gel und die rote Box zeigt den Teil des Gels an Ausgeschnitten und zur Massenspektrometrieanalyse eingereicht. ( D Klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur anzuzeigen .

Abbildung 3
Abbildung 3: Molekulare und biochemische Unterschiede in GFAP aus dem Gehirn junger und alter Mäuse. ( A ) Die Analyse der GFAP- mRNA nach Standardverfahren (Protokoll 1) zeigt eine signifikante Induktion im Gehirn von alten Mäusen. N = 6 für jede Bedingung (3 männliche und 3 weibliche CBA-Mäuse wurden pro Gruppe verwendet). ** p <0,01; Einweg-ANOVA. ( B ) Coomassie-basierte Proteinfärbung von Triton X-100 und HSE-Fraktionen aus Hirngewebe junger (3 Monate alter) und alter (24 Monate alter) Maus. Beachten Sie die Erhöhung der ~ 50 kDa GFAP Band in HSE aus dem alten Gehirn (Pfeil). ( C ) GFAP-Immunoblot (Maus-Monoklonal-GA5-Klon) der gleichen Proben wie Panel B. ( D ) Acetyl-Lysin-Immunoblot (Kaninchen polyklonal, Abcam ab80178) der gleichen Proben wie in Panel B. ( E ) GFAP-Blot nach Immunpräzipitation mit Acetyl- Lysin-Antikörper. Die Proben wurden unter nicht-reduzierenden (NR) und reduzierenden (R) Bedingungen analysiert und Pfeile zeigen, um die Anwesenheit von GFAP im Immunopräzipitat aus dem alten Gehirn zu erhöhen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Discussion

Methoden, die die biochemische Charakterisierung von IF-Proteinen ermöglichen, können nützlich sein, um zahlreiche pathophysiologische Phänomene in Säugetiersystemen zu verstehen, da IF-Proteine ​​sowohl Marker als auch Modulatoren von Zell- und Gewebedressen sind 29 . Das Prinzip der aktuellen Methode basiert auf den in den 1970er und 1980er Jahren entwickelten Initialverfahren zur Isolierung, Trennung und Rekonstituierung von IF-Proteinen aus Zellen und Geweben, die in der Regel niedrige und hochsalzliche Lösungen und Triton-X100-Detergenz 25 , 30 , 31 , 32 einsetzen , 33 , 34 , 35 . Für historische Einblicke in die Studien, die die biochemische Isolierung von IF-Proteinen unterstützten, finden Sie in den letzten Rezensionen 36 , 37 . Die aktuelle MethodeBasiert auf neueren Protokollen, die für die Untersuchung einfacher epithelialer Keratine entwickelt wurden. Der Vorteil des Verfahrens ist, dass es als ein erster Schritt dienen kann, um Ermittler zu ermöglichen, die neu im IF-Feld sind, um IF-Proteine ​​effektiv von den meisten Säugetiergeweben zu isolieren. Es stellt einen visuellen Leitfaden für verwandte Verfahren dar, die von den Ermittlern auf dem Gebiet weit verbreitet sind, um die IF-Protein-Regulation 21 , 38 zu untersuchen.

Diese Technik kann verwendet werden, um die Regulierung und Funktion von IFs in Stresskommunikationsmechanismen zwischen Säugetiergeweben 39 , 40 zu untersuchen. Es wird immer wieder anerkannt, dass Stress in einem Gewebe das Funktionieren anderer Gewebe beeinflussen kann, beispielsweise unter Bedingungen von Ernährungsstress 41 , Proteinfehlfaltung 42 , metabolischer Stress 43 und othEr ändert sich. Die meisten Arbeiten, die derzeit in diesem Bereich durchgeführt werden, sind in Drosophila- und C. elegans- Modellen, während Studien über weit verbreitete Stressreaktionen in Säugetiersystemen fehlen. Als der Hauptregler des zellulären Stresses 10 kann das IF-System Hinweise auf organismene Stressreaktionen freisetzen, die wichtige Erkrankungen haben können. Als solches kann das aktuelle Protokoll verwendet werden, um globale pathophysiologische Mechanismen in verschiedenen Mausmodellen von Stress, Verletzungen und Krankheiten zu untersuchen.

Eine Einschränkung der derzeitigen Technik ist, dass die hohen Salz-Extrakte als "rohe" IF-Präparate gelten, da sie auch andere IF-assoziierte Proteine ​​wie Plectin zum Beispiel 44 enthalten. Wie bereits erwähnt, können HSEs in 8 M Harnstoffpuffer denaturiert werden, um hochreine IF-Proteine ​​zu erhalten, die in der vitro-Wiederzusammensetzung in Phosphatpuffer 44 in der Lage sind. Nach zwei solchen Zyklen vonDemontage und Wiedermontage, die Stöchiometrie von IF-Proteinen (isoliert aus HeLa-Zellen) blieb die gleiche, während die Harnstoff-Behandlung entfernt Plectin 44 . Während der Desmin-Reinigung kann Actin durch Solubilisierung des HSE in Essigsäure 45 entfernt werden . Ob zusätzliche Reinigungsschritte einbezogen werden sollen, hängt vom Ziel des Experiments ab. Wenn beispielsweise das Ziel besteht, den Montagezustand zu charakterisieren und in vitro rekonstituierte IFs zu erzeugen, ist der Harnstoffschritt erforderlich, um hochreine IF-Proteine ​​zu erhalten. Auf der anderen Seite, wenn es darum geht, kontextabhängige Assoziationen zwischen IFs und anderen zellulären Proteinen zu identifizieren, dann können die "Rohpräparate" verwendet werden. Interagierende Proteine ​​können durch Massenspektrometrie identifiziert werden, indem entweder In-Gel-Digest für hohe Abundanz-Targets, die durch Gel-Flecken sichtbar sind, oder in-Lösung-Digest für niedrige Abundanz-Targets identifiziert werden können. Frühere Studien mit Immunpräzipitation von Detergenz-löslichen IFs und HSEsEnthaltende IF-Proteine ​​identifiziert eine funktionell wichtige spezifische Wechselwirkung zwischen den Keratinen 8/18 und dem Hitzeschockprotein 70 (Hsp70), das nach der Hitzestressung 46 , dem Adaptorprotein 14-3-3 nach der Phosphorylierung 47 und der K8 / K18-Raf-1-Kinase potenziert wird Unter normalen physiologischen Bedingungen 48 unter anderem. Das aktuelle Protokoll kann ähnliche Studien an anderen IF-Proteinen ermöglichen.

Die Verwendung der Lysing-Matrix ist eine Schlüsselmodifikation aus früheren Methoden und sollte eine schnelle Extraktion von IFs aus mehreren Geweben ermöglichen, mit Ausnahme von Bauchspeicheldrüse und Milz. Die Automatisierung der Anfangsschritte eignet sich besonders für hochvolumige Mausexperimente. Zum Beispiel erfordert die Isolierung von IF-Proteinen aus 3 verschiedenen Geweben von 10 Mäusen pro Zustand ( z. B. normale und irgendeine Form von systemischem Stress oder Krankheit) die Verarbeitung von 60 einzelnen Geweben. Mit der traditionellen manuellen MethodeMuss in Chargen getan werden und kann mehrere Tage dauern. Mit der automatisierten Methode mit Lysing Matrix kann die Prozedur jedoch in wenigen Stunden durchgeführt werden. Kritische Schritte des Verfahrens sind: Sicherstellen, dass die Probe während des gesamten Verfahrens kalt bleibt; Inkubation in hohem Salzpuffer für 1 h (Schritt 4.5); Mit heißem Puffer und umfangreichem Vortexen, um eine vollständige Resuspension des Pellets vor der Analyse zu gewährleisten (Schritt 4.8); Und unter Berücksichtigung aller Vorkehrungen, um eine Kontamination von Proben zu vermeiden, die durch Massenspektrometrie analysiert werden sollen (Schritt 7.2).

Der wesentliche Nachteil der massenspektrometriebasierten Identifizierung von PTM-Standorten ist, dass es für bestimmte PTMs sehr gut funktioniert - Phosphorylierung und Lysin-Acetylierung sind vorrangige Beispiele - aber andere wie Sumoylierung sind viel schwieriger 49 . Trotzdem ist die Proteomik ein mächtiges Werkzeug für das Studium der Proteinregulation in normalen und kranken Geweben. Agnetti et al. Kompiliert ein umfassendes upTo-date-Übersicht über modernste Proteom-Techniken, die derzeit im Einsatz sind, um verschiedene PTMs im Rahmen von Gewebe-exprimierten Proteinen zu untersuchen 50 . Der Zweck der aktuellen Methode ist es, Proben zu erzeugen, die für verschiedene Arten von Analysen angewendet werden können. Beispielsweise kann in vitro die Sumoylierung an immunpräzipitierten IF-Proteinen durchgeführt werden, und die Gesamt-Sumoylierung kann auf isolierten IFs in HSE-Präparaten unter Verwendung von sumo-spezifischen Antikörpern 18 , 21 beurteilt werden . Daher ist die Anwendung dieses Verfahrens nicht darauf beschränkt, Proben nur für die Massenspektrometrieanalyse zu erzeugen, sondern kann verwendet werden, um mehrere IF-Eigenschaften unter Verwendung einer Vielzahl von nachgeschalteten Techniken zu untersuchen.

Wenn Proteine ​​weitgehend durch zahlreiche PTMs an konservierten Stellen reguliert werden, was zu einer veränderten Löslichkeit, Filamentzusammensetzung und Proteinwechselwirkungen führt 17 . Die jüngsten technologischen Fortschritte haben vorgestelltEr unglaubliche Größe, Komplexität und Krankheit Bedeutung der posttranslationalen Modifikationen (PTMs) auf zellulären Proteinen 51 , 52 , 53 . Die Verbesserung der Erkennungsmethoden für gemeinsame PTMs, wie die Phosphorylierung 54 und die Acetylierung 51 , haben umfangreiche Datenkataloge ergeben, aber das Verständnis ihrer biologischen Bedeutung - das Knacken des "PTM-Codes" - ist eine große Herausforderung 55 , 56 . Eine Möglichkeit, die funktionalen Rollen und die relative Bedeutung jedes PTM zu beurteilen, ist zu bestimmen, wie gut es über mehrere Mitglieder der IF-Proteinfamilie konserviert ist. Beispielsweise zeigte die Identifizierung einer neuartigen Phospho-Tyrosinstelle an K8, dass diese Stelle in einem QYE-Motiv enthalten ist, das im Wesentlichen alle zytoplasmatischen IF-Proteine ​​gefunden wurde und kritisch für die Regulierung der IF-Proteinlöslichkeit und Filament dy istNamics 57 Wichtig ist, dass die Mutation des konservierten Tyrosinrestes auf GFAP zu einer negativ geladenen "phosphomimischen" Asparaginsäure (Y242D) die Alexander-Krankheit 58 verursacht. Die hier gezeigten repräsentativen Daten zeigen, wie zwei unterschiedliche gewebespezifische IF-Protein-Typen (K8 und GFAP) ein ähnliches Muster der Hochregulation und erhöhte Acetylierung während des Alterns erfahren, was ein Effekt des veränderten Metabolismus 22 , 51 sein kann . Dieses Beispiel veranschaulicht die Nützlichkeit des Verfahrens beim Verständnis der Funktion von IF-Proteinen auf einer globalen physiologischen Skala.

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Disclosures

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde von den NIH-Stipendien NIH R01 DK110355, DK093776 [NTS], DK102450 [NTS] und P30 DK034987 [an UNC-Chapel Hill] unterstützt. Die Autoren danken Deekshita Ramanarayanan für Unterstützung bei qPCR und Western-Blot-Experimenten.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dynabeads Protein G ThermoFisher Scientific 10009 immunoprecipitation beads
PBS ThermoFisher Scientific 10010049 for buffers
Purelink RNA mini kit ThermoFisher Scientific 12183018 RNA extraction from tissue
Purelink DNAse set ThermoFisher Scientific 12185010A on column DNA digestion
Dynamag-2 ThermoFisher Scientific 12321D magnet for use with dynabeads
GelCode Blue Stain Reagent ThermoFisher Scientific 24592 mass spectrometry-compatible gel stain
Pierce ECL Western Blotting Substrate ThermoFisher Scientific 32106 for use in western blot
High Capacity cDNA reverse transcription kit ThermoFisher Scientific 4368813 for use in gene expression analysis
Proflex 3 x 32-well PCR System ThermoFisher Scientific 4484073 PCR system
PVDF transfer membrane  ThermoFisher Scientific 88520 for western blot
Power Up SYBR master mix ThermoFisher Scientific A25778 for qPCR analysis
RNAlater ThermoFisher Scientific AM7020 solution for tissue storage prior to RNA isolation
Novex 4-20% Tris Glycine Gel ThermoFisher Scientific XP04205BOX Precast protein gel
Anti-Keratin 8 antibody (TS1) ThermoFisher Scientific MA514428 for western blot detection of K8
Anti-Vimentin ThermoFisher Scientific MA511883 for western blot detection of vimentin
Tris Glycine Transfer Buffer (25x) ThermoFisher Scientific LC3675 for wet transfer of protein gels
2x SDS Sample Buffer ThermoFisher Scientific LC2676 for preparing protein gel samples
Tris Glycine SDS Running Buffer (10x) ThermoFisher Scientific LC26755 for running protein gels
Lysing beads - Matrix D MP Biomedicals 116913100 Lysis beads and matrix tubes for tissue disruption and RNA extraction
Lysing beads - Matrix SS MP Biomedicals 116921100 Lysis beads and matrix tubes for tissue disruption and protein extraction
NanoDrop Lite Spectrophotometer ThermoFisher Scientific ND-LITE measurement of protein and nucleic acid
Precellys 24 homogenizer Bertin Instruments EQ03119 Automated tissue homogenizer

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Isolierung von Zwischenfilamentproteinen aus mehreren Mausgeweben zur Untersuchung von altern-assoziierten posttranslationalen Modifikationen
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Battaglia, R. A., Kabiraj, P., Willcockson, H. H., Lian, M., Snider, N. T. Isolation of Intermediate Filament Proteins from Multiple Mouse Tissues to Study Aging-associated Post-translational Modifications. J. Vis. Exp. (123), e55655, doi:10.3791/55655 (2017).

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