Summary
우리는 여기에 설명 친화력 네 일반적으로 사용되는 바이오 센서 플랫폼을 사용하여 반응 속도를 결합 항체 - 항원의 측정을위한 프로토콜.
Abstract
라벨이없는 광 바이오 센서는 생체 분자 상호 작용의 특성에 대한 신약 개발에 강력한 도구입니다. 이 연구에서 우리는 결합 친화와 인간의 proprotein convertase의 서브 틸리 켁신 유형 (9)에 대한 열 높은 친화력 단일 클론 항체 (단클론 항체) (PCSK9)의 역학을 평가하기 위해 우리의 실험실에서 네 일상적으로 사용되는 바이오 센서 플랫폼의 사용을 설명합니다. 비아 코어 T100 및 ProteOn XPR36 모두 노포 표면 플라스 몬 공명 (SPR) 기술에서 유도되는 반면, 전자는 즉석에서 6 × 6 십자 통해 병렬 후자 선물 반면 36 반응 반점, 직렬 흐름 구성 형태로 연결된 네 개의 플로우 셀을 갖고 미세 유체 채널 구성. 비스 MX96은 공간 방향에서 검출을 제공하는 추가의 촬상 기능은 SPR 센서 기술을 기반으로 동작한다. 연속 흐름 Microspotter (CFM)와 결합이 검출 기술은 전자에 의해 크게 처리량을 확대동시에 반응 96 개 스포츠 다중 어레이 인쇄 및 감지 nabling. 대조적으로 옥텟 RED384는 광섬유 프로브 간섭 패턴을 검출하는 바이오 센서의 역할과 BioLayer 간섭계 (BLI) 광학 원리에 기반은 팁 표면에서 상호 결합에 바꾼다. 표면 플라즈몬 공명 기반 플랫폼과는 달리, BLI 시스템은 연속 흐름 유체에 의존하지 않는다; 그들은 오비탈 교반 중에 384- 웰 마이크로 플레이트의 분석 용액에 침지하면서 대신, 센서 팁 판독을 수집한다.
이러한 바이오 센서 플랫폼은 각각 자신의 장점과 단점이 있습니다. 1 분자 상호 작용 모델 : 상기 설명한 프로토콜은 단순한 1 맞 항체 - 항원 동력학을 특성화하기 위해 동일한 분석 포맷과 동일한 고품질의 시약을 사용하여 실험을 보여 질 운동 데이터를 제공하기 위해 이러한 기기 능력의 직접적인 비교를 제공한다 .
Protocol
1. 단백질 및 항체
- 이전 17 바와 같은 형태 9 (PCSK9) 켁신 인간의 proprotein convertase의 서브 틸리 십 마우스 유래 항 PCSK9 모노클로 날 항체 생산 및 정제.
- 순차적 UPLC 시스템 (19)을 사용하여 분석적 크기 배제 (SEC) 컬럼에 샘플 각 10 μg의 주입에 의해 정제 된 생성물의 순도를 평가한다.
바이아 코어 T100 2. 운동 측정
- 장비 및 시약 제조
- 15 분 동안 실온에서 CM5 센서 칩 평형.
- 200 mM의 1- 에틸 -3- (3- 디메틸 아미노 프로필) 카 보디이 미드 히드로 클로라이드 (EDC), 실온에서의 50 mM N- 히드 록시 숙신이 미드 (NHS)의 두 200 μL 씩 두 200 μL 분취 량을 해동.
- HBS-EP (1X)의 1-L 병을 준비한다 (10 mM의 HEPES [pH가 7.4, 150 mM의 NaCl을 3 mM의 EDTA를 0.005 % V / V의 폴리 소르 베이트 P20)는 디 버퍼로 실행물에 10 배 HBS-EP + 주식 솔루션을 합착.
- 0.063 μg의 10 mM의 아세트산 나트륨 (PH 4.5), 500, 각 항체 시료 30 μL에 ㎍ / ㎖의에 단백질 A / G 1 ㎖를 준비 /를 실행 HBS-EP 버퍼 용액. 얼음에 인간의 PCSK9의 냉동 병을 녹여.
- 제어 소프트웨어에서 클릭 "도구 | 꺼내기 칩", 칼집과 가까이에 센서 칩을 배치합니다. 구획 온도 C ° 분석 온도 C와 "10"° "25"를 입력 | "설정 온도 도구"를 클릭합니다.
- 표면 고정화
- "| / 열기 새 마법사 템플릿 파일"과 왼쪽 패널의 목록에서 "고정화"를 선택 제어 소프트웨어에서 클릭합니다.
- 고정화 설정 창을 입력 "새"를 클릭합니다. 칩 유형으로 "CM5"를 선택하고, 사이클마다 '1'플로우 셀을 선택한다.
- 다음 ACTIVA 각 "고정 흐름 전지 1/2/3/4"의 체크 박스를 선택합니다옵션을 테. 모든 흐름 셀의 방법으로와 "아민" "고정 된 수준의 목표"를 선택합니다.
- 리간드로서 "30 ㎍ / ML 프로아 / G"를 입력 목표 레벨이 설정되도록하여 플로우 셀의 모든 "10000"반응 단위 (RU).
- "실행 전에 프라임"을 확인하고 "다음"을 클릭합니다. 선택 "시약 랙 (2)"을 따라서 개개의 샘플 바이알에 시약 피펫의 위치를 정의한다. 다시 기기에 랙을 삽입 한 다음 "시작"을 클릭하고 실행을 시작 저장할 실험의 이름을 입력합니다.
- 분석 바인딩 및 재생주기
- "20,140,812 후 반 PCSK9의 IgG가 후 PCSK9 바인딩"을 선택, | "오픈 / 새로운 방법 파일"과 방법을 엽니 클릭합니다. 메소드의 매개 변수를 검토합니다.
- "분석 단계"에서 PURP "선택"샘플 "로 이름입니다"후 PCSK9 "하는 10주기가 보장OSE 1 "". 복제 번호로 설정됩니다. "
- 접촉 시간을 설정 "사이클 유형"에 유동 경로를 통해 캡쳐 1 "220"에서의 "2", 유로를 통해 캡처 3 유로를 통해 캡쳐 2 "110"에서의 "3", 및 "55"를 (S)에 "4". 유량은 캡처 사이클 모두 "10"μL / 분이다.
- 변수로 "샘플 솔루션을"확인 "샘플 1"을 선택합니다. 접촉 시간을 "600"s 및 해리시에 유동 경로를 통해 "2700"에서의 "1, 2, 3, 4"를 설정한다. 유속은 "30"μL / 분으로 설정된다.
- 접촉 시간을 용액 필드에 "글리신 - 염산 pH를 1.5"입력 "재생 1"을 선택하고 설정하는 유동 경로를 통해 "20"에서의 "1, 2, 3, 4 '.
- "변수 설정 ','100 nM의 - 6.25 nM의"적정 농도의 2 배의 입력주기 1-3 "50 nM의 - 3.12 nM의"사이클 4-8 및 "5 nM의 - 0.323 nM의"F또는주기 9-10.
- "설치 실행"에서 검출 흐름 경로를 선택 "2-1, 3-1, 4-1", "다음"을 클릭, "실행 전에 프라임"을 확인하고 "다음"을 클릭합니다.
- 선택 "샘플과 시약 1 랙", 따라서 개별 샘플 바이알에 상기 시약 피펫 위치를 정의한다. 기기에 랙을 삽입 한 다음 "시작"을 클릭하고 실행을 시작 저장할 실험의 이름을 입력합니다.
- BIA 평가를 사용하여 데이터 분석
- 클릭 |, "3-1"를 "2-1"된 Fc를 선택하거나, "4-1"별도로뿐만 아니라 "제로"등의 다양한 분석 농도에서 표시된 곡선을 모두 확인 "속도론 / 선호도는 표면 바운드" 농도 빈.
- 버퍼 공백을 감산 곡선을 얻기 위해 "다음"버튼을 클릭하세요. 피팅 운동 parame를 얻을 : "1 바인딩 1"모델과 "맞춤"클릭 "키네틱는,"를 선택 클릭TERS.
- 여러 항체 표면의 글로벌 피팅 하단의 "다중 R 최대"버튼을 클릭리스트 동일한 단클론 항체에 대한 다른 FCS에서 결합 곡선을 추가한다.
- 버퍼 빈 감산 결합 곡선을 모두 얻기 위하여 "다음"버튼을 클릭하세요. 그런 다음 "속도론은,"선택 클릭 모델을 "1 바인딩 1", 그리고 전 세계적으로 장착 운동 매개 변수를 얻기 위해 매개 변수의 각 R 최대는 "지역에 맞게"를 선택합니다.
ProteOn의 XPR36 3. 운동 측정
- 장비 및 시약 제조
- GLM 센서 칩과 PBS-T-EDTA의 2 L 병 (PBS [pH가 7.4, 0.005 % 트윈 -20, 3 mM의 EDTA)을 15 분 동안 실온에서 버퍼를 실행 평형.
- 제어 소프트웨어에서 "꺼내기"를 클릭 한 후 GLM 칩을 삽입합니다. C와 C ° 자동 시료 주입기 온도 "10"° 칩 온도에 "25"을 설정한다."글리세롤 초기화"버튼을 클릭 칩을 초기화하라는 메시지가 지시를 따릅니다.
- 목록에서 전처리 프로토콜 96 웰 플레이트에 솔루션을 준비 | "파일 열기"를 클릭합니다. 그런 다음, "실행"을 클릭하여 프로토콜을 선택하고 "시작"을 클릭합니다.
- 400 mM의 하나의 EDC 1 mL의 분취 액을 실온에서 100 mM의 N 히드 록 (술포 NHS) 중 하나 개를 1 mL의 분취 량을 해동.
- 0.25 ㎍ / ㎖, 0.125 ㎍ / ㎖, 및 PBS-T에 0.063 ㎍ / ㎖의 10 mM의 아세트산 나트륨 (PH 4.5) 및 (500) 각각의 단클론 항체 샘플 μL에 60 ㎍ / ㎖의에 2 ㎖의 단백질 A / G의 준비 -EDTA 버퍼 실행. 얼음에 인간의 PCSK9의 냉동 병을 녹여.
- 고정화, 분석 물 바인딩 및 재생
- "| 새로운 | 새 프로토콜 파일"을 클릭합니다. "구성"에서 "마이크로"을 선택 "GLM"칩을 선택 실험 이름을 입력하고, "2.2"mL의 부피를 입력한다.
- 고르다"프로토콜 | 샘플"H1-H6 "단백질 A / G"에서 "불활성"로 G1-G6에서 "리간드", "에탄올 아민"로 F1-F6 웰 "활성제"로 "EDC가 / 술포 NHS"를 정의 빈 "로"E1-E6, PBS-T-EDTA에 "재생기"로, "글리신" "D1-D6에서,"분석 물 "로", "C1-C6, 그리고"리간드 사람 PCSK9 "로"단클론 X 샘플 제 96 웰 플레이트에 웰 H1-H6있다.
- 단계가 "30"μL 유속 EDC / 술포 NHS, 단백질 A / G의 세 개의 연속적인 수평 주사하고, 1 개 M 에탄올 아민을 각각 포함하는 상기 "프로토콜 편집기"에서 "단계"더블 클릭 "고정화"를 선택 / 분 "300"(S)의 접촉 시간.
- 로 PBS-T-EDTA의 펄스 -s 개의 "60"다음에 수평 및 수직 방향 모두에서 "100"μL / 분, 글리신 (PH 1.5)의 펄스 -s 세 "18"주입 "재생성"을 클릭 "25"μL / 분또한 양 방향이다.
- "25"μL / 분의 유속 및 "160"(S)의 접촉 시간을 사용하여 수직 방향으로 2 단클론 항체를 주입 한 "리간드"클릭.
- "분석 물"클릭 사람 PCSK9 다섯 개 농도 주입 하였다 연관 시간 "600"s의 "40"μL / 분으로하고, 동시에 6 개 수평 채널을 통해 빈 버퍼 (100 nm 내지 6.25까지를 연속 희석을 2 배) 해리 시간의 "2700"의에 의해.
- "재생성"을 클릭 두 "18"은 수직과 수평 방향 모두에 "100"μL / 분에서 글리신 (PH 1.5)의 펄스를 주사 -s.
- 나머지 단클론 항체에 대한 각각의 바인딩주기 후 위의 단계를 반복합니다.
참고 : 100 nm의에 추가 - 6.25 nM의 인간의 PCSK9 농도 시리즈, 25 nm의 - 1.56, 5㎚ - 0.313 nM의 농도 시리즈가 사용된다. - 시약의 위치에 따라 두 개의 96- 웰 플레이트에 시료 및 시약을 준비단계 3.2.2에 정의 된 후, "실행"탭을 클릭하고 프로토콜 / 실험을 선택하고 "시작"을 클릭합니다.
- ProteOn 관리자를 사용하여 데이터 분석
- "패널 종류"를 클릭하고 "분석 물"을 선택합니다. 그런 다음 "프로토콜 단계"를 클릭하고 목록에있는 모든 바인딩 곡선을 선택합니다.
- "| 채널 참조 | Interspot 프로세스" "자동 프로세스"를 클릭, 클릭합니다. 그런 다음 "| 더블 참조 | 행 | A6 프로세스"를 클릭합니다.
- 운동 분석을위한 세 가지면에서 각 단클론 항체에 대한 개별 데이터 세트를 저장하는 "데이터 집합 만들기"를 클릭합니다.
- "분석 데이터 세트"를 클릭하여 각 단클론 항체의 데이터 집합을 강조하고 "분석 | 운동을". "랭 뮤어"모델과 "동시 카 / KD"을 선택하고 "다음"을 클릭합니다.
- 협회와 해리에 맞는 범위를 모두 강조 "로컬"R 최대를 선택하고 얻기 위해 피팅을 수행하려면 "다음"을 클릭피팅 운동 매개 변수.
- 상기 단계를 반복하되, 리간드 표면 활성을 계산하기위한 실험 R의 최대 값을 획득하기 위해 상기 피팅 "그룹화"R 최대 선택.
옥 테트 RED384 4. 운동 측정
- 시약 및 샘플 플레이트의 제조
- 1X KB 50 ㎖의 PBS에 10 배 스톡 용액을 희석하여 (PBS pH가 [7.4, 0.02 % 트윈 20, 0.1 % 알부민 및 0.05 % 아 지드 화 나트륨을 함유하는 키네틱 버퍼)를 준비한다.
- 물론 당 200 μL에서 96 웰 플레이트에 1 배 KB를 분배. 적어도 10 분 동안 이러한 개별 웰 하이드레이트 48 항 인간 캡처 (AHC) 바이오 센서 팁.
- 1.56 nM 내지 100 nM 내지 7 개 적정 농도 20 ㎍ / ㎖, 10 ㎍ / ㎖, 5 μg의 1X KB IN / ㎖,뿐만 아니라 인간 PCSK9 각 단클론 항체 샘플을 제조 희석액을 2 배.
- 384도 경사 바닥 마이크로 플레이트에 항체 샘플 하중 (REFErred에 시약 판금) 및 웰 당 90 μL의 시료 접시이라 다른 384- 웰 마이크로 플레이트 ()로 인간 PCSK9 해결책으로서.
- 로드 1X KB 일련의 글리신 (PH 1.5), 샘플 플레이트 내의 웰 솔루션.
주의 : 이러한 1X KB 웰이 칩 전처리 기준선 안정화 및 해리 분석을 위해 사용된다. 글리신 솔루션은 재생을 위해 사용됩니다.
- 실험 방법 설정
- 데이터 수집 소프트웨어에서 "| 새로운 실험 마법사 | 뉴 속도론 실험 | 기본 속도론 실험"을 클릭합니다.
- "플레이트 정의"에서, 샘플 종류와 위치를 정의하려면 아래 단계를 수행하십시오.
- "16"채널 "384도"형식을 선택합니다.
- 한 번에 16 웰을 강조도에서 좌 클릭 Shift 키를 누른 상태로 접시 디스플레이의 샘플과 시약의 위치를 정의한다.
- 온 오른쪽 클릭단클론 항체 샘플 "로드"선택을 포함하는 웰의 모노클로 날 항체가 AHC 센서에 탑재 (또는 캡처)하는 단계로를 의미한다. 오른쪽에있는 테이블의 단클론 항체 이름과 농도를 입력합니다.
- 마우스 오른쪽 버튼으로 인간의 PCSK9를 포함하는 우물을 클릭하고 단클론 항체 - 캡처 센서가 감소하고 바인딩 상호 작용을 측정하는 단계를 표시하기 위해 "샘플"를 선택합니다. 우측의 표에 대응하는 몰 농도를 입력.
- "버퍼"또는 "중화"로 1X KB를 함유하는 웰 및 "재생"으로 글리신을 함유하는 웰을 정의한다.
- "분석 정의"에서 실험 설정을 정의하려면 다음 단계를 수행하십시오
- 클릭 3 ","30 "s의시기와 목록에"베이스 라인 ","재생 ","평형 ","로드 ","협회 "및"해리 "단계를"추가 "를 선택0 ","18 "에서의"200 "에서의"500 "의 S 및"1800 "의 각각. 진탕 속도는"1000 "RPM.
- "분석 단계 목록"의 단계를 추가하려면 단계에서 첫 번째 클릭 후, 샘플 또는 시약 판 중 하나에있는 우물을 클릭합니다. 단계는 다음과 같습니다
- 평형 재생성 : 전제 글리신 (PH 1.5)의 "15"-s 딥 3 개주기에 의해 AHC 센서, "15"은 교대로 1X KB에 딥을 -s.
- 로드 : "200"의 초 동안 AHC 센서 위에 단클론 항체 샘플을 캡처합니다.
- 기준 : 연관 단계 이전에 "60"s에 대한 BLI 신호를 확립한다.
- 협회 : "500"-s 연관 동안 사람 PCSK9의 다양한 농도를 함유하는 웰에 센서를 담근다.
- 해리 :에 "1800"-s 해리 기간 동안 1 배 KB의 새로운 우물에 PCSK9 바인딩 센서를 찍어.
- 재생 : 단클론 항체 - PCSK9 보우를 찍어ND 개의 "18"와 글리신 (PH 1.5)의 우물에 센서는 각 결합주기와 펄스 -s.
- "검토 실험"에서 단계를 밀어 이전 탭으로 다시 이동하여 필요에 따라 변경합니다.
- "실행 실험"으로, "60"의 지연 시간을 입력하고 기다리는 동안 샘플 판을 흔들. C 키를 누릅니다 ° 플레이트 온도를 "25"설정 "GO를."
- ForteBio의 데이터 분석 소프트웨어를 사용하여 데이터 분석
- 클릭 "데이터 선택 |로드 데이터 | 속도론 | PCSK9 항체는 PCSK9 7.23.14에 바인딩"
- "처리"에서, 프로세스 데이터는 다음과 같다 :
- 1 단계에서 : H1-H6에 센서를 강조하기 위해 "센서 선택"을 클릭, 바로 그들을 클릭 클릭 "변경 센서 유형 | 참조 센서를."
- 2 단계에서 "빼기"확인 "평균 참조 센서"를 선택; 6 개 빈 버퍼 센서의 평균으로부터 각각의 액티브 센서 샘플을 뺀다.
- 3 단계에서, "Y 축 정렬을"클릭과 연관 전의 초기 단계에있는 모든 결합 곡선을 정렬하는 "기준"을 선택한다.
- 단계 5에서, "비츠 키 - 골 레이 필터링"은 신호대 잡음비를 증가시킴으로써 결합 곡선을 매끄럽게하고 클릭 확인 "프로세스 데이터!".
- 6 단계에서, 상기 처리 된 결합 곡선을 확인하는 "처리 된 결과"버튼을 클릭.
- 단계 7에서, 각 처리 공정 후에 결합 곡선을 표시하는 우측 네 개의 패널을 검토하고 "처리 된 데이터 저장".
- "분석"에서 "협회와 해리"을 확인하고 "1 : 1"모델.
- "(전체) 글로벌" "색"에 의해 맞게 그룹을위한 바인딩 곡선을 강조 표시합니다. 그룹이 동일한 m 코팅 센서에 피팅 수행 "연결된 R 최대"를 사용AB 농도 여러 항체의 농도로 코팅 된 센서에 글로벌 피팅을 수행하는 실험 리간드 표면 활성을 계산하기위한 R의 최대 값 및 "R 최대 센서에 의해 연결 해제"를 얻었다.
- 피팅 반응 속도 매개 변수를 얻기 위해 "맞춤 곡선"을 클릭합니다. 각 피팅 분석의 마지막에 결과를 저장합니다.
IBIS MX96 5. 운동 측정
- 장비 및 시약 제조
- 15 분 동안 실온에서 G-COOH 칩 평형.
- 시스템의 주행 완충액 (PBS [pH가 7.4, 0.01 % 트윈 -20) 및 고정화 완충액 (10 mM의 나트륨 아세테이트의 pH 5.0, 0.01 % 트윈 -20)의 1-L 병을 준비한다.
- 시스템 실행 버퍼 및 아세트산 나트륨 (PH 5.0) 고정화 완충액 모두에서 2 배 연속 희석하여 0.16 ㎍ / ㎖의 20 ㎍ / ㎖의 각 단클론 항체를 준비한다.
- 두 개의 단클론 항체에 9월 샘플 분주arate 96 웰 각각의 항체가 웰 당 200 μL의 적정 농도를 8 수직 웰 점유하는 판.
- 실온에서 400 mM의 EDC와 100mM의 NHS 술포의 녹여 분취.
- 나트륨 아세테이트 50 ㎍ / ㎖ (pH를 5.0) 바이알에 고정화 완충액에 피펫을 단백질 A / G 300 μL를 준비한다.
- 버퍼를 실행하는 시스템에서 2 배 연속 희석하여 0.39 nM 내지 100 nM 내지 사람 PCSK9의 200 μL를 준비한다. 별도의 튜브로 피펫.
- 아민 결합 항체 어레이와 멀티 사이클 반응 속도
- EDC / NHS 설포 (400 밀리미터 / 100 mM)을 분취 액을 혼합하고 웰 당 200 μL로 새로운 96- 웰 플레이트의 상부 웰 (48)에 혼합물을 분배.
- 위치 2에서 단클론 소스 플레이트 (아세트산 나트륨의 희석 된 [pH를 5.0]) 및 프린터 내부 위치 1의 EDC / NHS 술포 시약 플레이트를 놓는다.
- CFM에 센서 칩을 설치한다. 은 "CFM 2.0"softwar를 엽니 다전자, 다음 "로드 설정 | 96 아민 커플"을 클릭합니다. 다음과 같이 10 × 8 항체 어레이가 생성된다 :
- 48 마이크로 채널을 사용하여 센서 시약 플레이트의 상부 절반에 EDC / NHS 술포을 제공하고, "5"분간 센서면 위에 사이클들을.
- "10"분 동안 활성화 된 표면을 가로 질러 센서주기들을 위해 소스 플레이트의 상부 절반에있는 단클론 항체 샘플을 제공한다.
- "5"분 항체 표면 50ml의 원뿔형 튜브에서 고정화 완충액을 제공한다.
- 소스 판의 아래쪽에 남아있는 항체의 샘플에 대한 상기 절차를 반복한다.
- 기기로 프린트 센서 칩 도킹. 와 "2014년 8월 15일"을 선택 "기존의 측정 | 연결 | | 열기 측정 파일"을 제어 소프트웨어에서 클릭합니다.
- "전체 시스템 스크립트"에서 - "일반"에서 "시스템 프라임 G"를 선택합니다. 그런 다음 "G를 선택 - Quenc을H는 "150 μL 1 개 M 에탄올 아민을 주사하여 표면 항체를 비활성화.
- 단클론 항체 배열을 시각화하고 필요한 경우 대비를 조정하기 위해 "카메라"를 클릭합니다. 단클론 항체 명소를 포위하는 빨간색 사각형 상자를 놓고 참조에 대한 활성 단클론 항체 지점 사이에있는 interspots에 녹색 사각형 상자를 이동합니다.
- "IBIS 스크립트"에서 - "AP 표준 실행 A"를 "분석주기"에서 선택합니다. 기준 1.0 분, 10.0 분 협회 및 8 μL / s 속도로 해리 90과 같이 설정한다.
- 은 "사이클"안쪽 다섯 버퍼 주사를 다음 시간에 사람 PCSK9 하나 개 농도를 주입. 각 결합주기 사이 글리신 pH를 2.0 단클론 표면을 재생성.
- 된 Fc-캡처 항체 어레이와 단일 사이클 반응 속도
- CFM에 새로운 센서 칩을 설치한다. 반복 단백질 A / G와 단클론 항체의 샘플로 대체하여 상기 5.2.5 5.2.3 단계.
- 제거상기 센서 칩 MX96에서 다시 CFM 프린터에 삽입.
- 48 마이크로 채널을 사용하여 단백질 A / G 센서면에 플레이트의 상부 절반의 모노클로 날 항체를 제공하고, 10 분 동안 양방향 흐름을 이용하여 표면에 걸쳐주기들을.
- 플레이트의 아래쪽에서 나머지 항체 샘플에 대해 상기 단계를 반복한다.
- MX96 기기로 프린트 센서 칩 도킹. "| 연결 | 열기 측정 | 기존의 측정 | 다음 파일"과 "kinetic7.30.14 바인딩 단백질 A + G를"선택 데이터 수집 소프트웨어에서 클릭합니다.
- 단클론 항체 배열을 시각화하고 필요한 경우 대비를 조정하기 위해 "카메라"를 클릭합니다. 단클론 항체 명소를 포위하는 빨간색 사각형 상자를 놓고 참조에 대한 활성 단클론 항체 지점 사이에있는 interspots에 녹색 사각형 상자를 이동합니다.
- "IBIS 스크립트"에서 - "AP 표준 실행 A"를 "분석주기"에서 선택합니다. "베이스 라인에 대한 10.0"1.0 분 "으로 설정분 "협회 및"8 μL / 초 "10 배속"로 분리하는 단계. "
- 은 "사이클"안쪽 다섯 버퍼 주사를 다음 시간에 사람 PCSK9 하나 개 농도를 주입. 어떤 재생 각 분석 분사 사이에서 수행되지 않는다.
- 스프린트와 스크러버를 사용하여 데이터 분석
- , | "열기 삼각형 파일 파일"목록에있는 모든 샘플 주사를 선택하고 분석 "을 클릭하기 전에" "저장 SprintX 파일", "교정"및 "RLL 결정을 확인"를 SprintX의 sofware에서 클릭합니다.
주 : RLL 값을 센서 표면에 고정 / 포획 항체 수준을 참조. - "참조하는"확인하고 인접한 참조 지점을 사용하는 "로컬"를 선택합니다. 또한 확인 처음 주입에 "정렬"다음 "시작 자동화를."
- 직렬 탭에서이를 조정 ", 도구 모음에서 눈금자 표시"를 선택첫번째 샘플 주입 직전 기준선의 작은 영역을 선택하고 선택 "제로."
- "파일을 IBMX 내보내기"를 누른 다음 선택하여 스크러버의 분석을위한 .IBMX 파일을 생성 "시작 자동화를."
- 스크러버를 실행하고 .IBMX 파일을로드합니다. 은 "희석 요인"로 "주식의 진한"로 "100N"과 "2"를 입력합니다.
- 작물 데이터는 분사의 개시에 앞서 모든 기준을 분리 및 결합 개시시 결합 곡선을 맞추.
참고 : 단일 사이클 반응 속도 실험의 경우, 곡선을 일치하지 않습니다. - 상기 "속도론 '탭으로 이동 분사 종료 시간을 조정 눈금자"케이 D "및 착용감을 누른 후"수정 된 K D입니다. " 선택 "는 케이 D를 K"다시 맞습니다.
- K 개의 D 열에 플로트 또한 착용감을 세분화 다시 장착한다.
참고 : 단일 사이클 바인딩 곡선의 끼워 맞춤"것으로 선택"버튼을 클릭 및 해제 "빼기"다음 "분리"를 선택하고 다시 이론적 기준 원점에 대한 연관 정보에 맞도록 "INJ 시작 '항목 로트. - 결과 탭에 장착 속도론 매개 변수를 검토합니다.
- , | "열기 삼각형 파일 파일"목록에있는 모든 샘플 주사를 선택하고 분석 "을 클릭하기 전에" "저장 SprintX 파일", "교정"및 "RLL 결정을 확인"를 SprintX의 sofware에서 클릭합니다.
Representative Results
도 1은 두 고정화 방법에 의해 CFM 및 발견 항체 농도에서 항체 어레이 이미지를 도시하고,도 2는 이러한 항체 어레이의 다중 사이클에서 MX96에 운동 생성 대응 결합 sensorgrams 및 단일주기 운동 측정을 도시 . 6 - 바인딩 4 개 개의 바이오 센서 플랫폼에서 발생하는 다수의 항체가 코팅 된 표면으로부터 역학적으로 장착 곡선 실시간은도 3에 도시된다. 도 7은 이러한 결합 곡선의 글로벌 분석으로부터 얻어진 최종 운동 속도 및 평형 결합 상수를 비교 한 것이다. 개별 협회 (a를 K), 해리 (유전율 d), 평형 (K D) 결합 상수를 표 1에 나타내었다. 같은 기기 내에서 생성 된 데이터 세트의 변동성을 설명하기 위해,
아민 결합 (A) 및 IBIS MX96에 CFM에서 출력 (B) 표면 항체를 포획 된 Fc-그림 1. 다중 리간드 어레이. 인쇄 어레이 이미지 붉은 사각형으로 둘러싸인 회색 영역은 항체의 존재를 나타내는 왼쪽 패널에 나타낸다. 활성 항체 스폿 간의 위치 진한 interspots 참조 감산에 사용된다. 각 열은 다음과 화상의 좌측 식별 적정 농도로 인쇄하는 항체를 포함한다. 디을 계산하여 정량 인쇄 된 항체의 양은활성과 기준 위치 사이의 부피 변화에 fference는 우측 패널에 도시되어있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
멀티 사이클 (A)에서 Sensorgrams 바인딩 실시간 및 단일 - 사이클 (B)를 IBIS MX96의 운동 실험 그림 2. 비교. 10 × 8 항체 어레이에 걸쳐 증가하는 농도에서 사람 PCSK9의 순차 주사는 각 해당 센서 그램 세그먼트 위에서 언급된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
ProteOn XPR36 1 운동 모델 맞춤 오버레이 : 그림 4. 인간의 PCSK9 1과 상호 작용 캡처 항체의 Sensorgrams 바인딩. 상호 작용은 고 (상단 패널), 메디을 통해 평가각하, (중간 패널), 및 낮은 (하단 패널) 밀도면. 한 상호 작용 모델 : 포개어 부드러운 검은 선은 (1) 서로 다른 사람 PCSK9 농도 (컬러 라인)에서 바인딩 응답 신호의 운동 착용감을 나타낸다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
옥 테트 RED384 1 운동 모델 맞춤 오버레이 : 그림 5. 인간의 PCSK9 1과 상호 작용 캡처 항체의 Sensorgrams 바인딩. 상호 작용은 하이 (상단 패널), 중간 (중간 패널), 및 낮은 (하단 패널) 밀도면에 걸쳐 평가된다. 포개어 적색 라인 1에 다른 사람 PCSK9 농도 (컬러 라인)에서 바인딩 응답 신호의 운동 착용감을 나타낸다 : 1 개 상호 작용 모델. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
IBIS MX96 1 운동 모델 맞추기 오버레이 :도 6 인간 PCSK9 1과 상호 작용 아민 결합 (A)과의 Fc- 캡처 (B) 항체의 Sensorgrams 바인딩. 바인딩 정보는도 1의 배열 판지도를 따라 10 × 8 패널로 구성된다. 검은 색 선은 다른 사람 PCSK9 농도에서 기록 된 결합 응답 신호를 나타내고, 포개어 적색 라인 피팅 곡선을 나타낸다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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도 협회 항 비교 포 바이오 센서 플랫폼에 의해 생성 된 바인딩 상수 A (A), 해리 (K)의 D (B)를 K, 평형 K D (C). 6 - 운동 파라미터는도 3의 결합 곡선 글로벌 분석으로부터 유도된다. 다음과 같은기구가 표현된다 : 비아 코어 T100 (블루) ProteOn XPR36 (녹색), 옥텟 RED384 (적색), 아민 결합 (보라색) IBIS MX96 및 IBIS MX96 (오렌지색)이 된 Fc-캡처. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
BIAC의 여러 항체 표면 밀도 이상 운동 속도 상수의 일관성의 그림 8. 비교 T100 석 (A), ProteOn XPR36 (B), 옥텟 RED384 (C) IBIS MX96 아민 결합 (D), 및 캡처 된 Fc-IBIS MX96 (E). 운동 파라미터는 (상위 서브 패널), 케이 D (중간 서브 패널) K, D 및 K (하단 서브 패널) 개별 항체 표면 밀도 그룹 분석으로부터 유도된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 네 개의 바이오 센서 플랫폼의 항체 표면과 그 표준 편차 (오차 막대)의 9 바인딩 활동. 값은 연구 논문 (17)에 기재된 식을 사용하여 계산된다.large.jpg "target ="_ blank "> 검색이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| (KA) | K D | K D | |
| (M -1 (S) -1) | (S-1) | (㎚) | |
| 단클론 항체 (1) | (7.8) 11.7 10 5 X | (4.18) 4.89 10 X -5 | 0.052 (0.05) |
| 단클론 항체 2 | (0.28) 1.53 10 5 X | (1.54) 1.30 10 X -5 | 0.092 (0.12) |
| 단클론 항체 3 | (8.3) 11.4 10 5 X | (11.0) 27.6 10 X -5 | 0.333 (0.20) |
| 단클론 항체 4 | (1.6) 3.61 10 5 X | (12.3) 20.1 10 X -5 | 0.659 (0.54) |
| 단클론 항체 (5) | (0.21) 0.59 10 5 X | (2.50) 3.46 10 X -5 | 0.663 (0.46) |
| 단클론 항체 (6) | (0.78) 1.19 10 5 X | (3.83) 7.21 10 X -5 | 0.894 (0.64) |
| 단클론 항체 (7) | (0.53) 1.29 10 5 X | (5.63) 16.4 10 X -5 | 1.57 (1.02) |
| 단클론 항체 (8) | (2.23) 4.02 10 5 X | (10.7) 22.8 10 X -5 | 0.768 (0.68) |
| 단클론 항체 (9) | (2.13) 4.20 10 5 X | (4.3) 6.67 10 X -5 | 0.197 (0.16) |
| 단클론 항체 (10) | (0.49) 1.20 (1) X0 5 | (7.64) 12.5 10 X -5 | 1.27 (0.80) |
표 1 : 1 상호 작용 모델 : 운동 요금 및 평형이 1 개의 바이오 센서 인스트루먼트의 바인딩 곡선의 글로벌 피팅에 의해 획득 (10) 단클론 항체의 상수 바인딩.
Discussion
우리의 일대일 비교 연구는 각 바이오 센서 플랫폼은 자신의 강점과 약점을 가지고 있음을 보여준다. 항체의 결합 프로파일 (도 3 - 6) 시각 비교 유사하다하더라도, 취득 된 운동 속도 상수의 순위가 악기에 걸쳐 고도의 일치 (도 7), 우리의 결과와 악기 SPR 기반 보여 연속 흐름 유체는) 느린 해리 속도와 높은 친화력 상호 작용을 해결에서 더 낫다. 해리 단계에서 상향 드리프트는 데이터 세트에서 관찰된다 (예, 항체 2, 5 항체, 단클론 항체 및 9;도 5)의 유체 BLI없는 악기에 의해 발생. 이러한 결과는 시스템의 기본 제한되는 마이크로 플레이트, 경시 시료 증발에 상당 부분 기인 할 수있다. 이 고유 한 한계로, 실험 시간은 12 시간 이하로 제한되고; 실험 따라서 쉬로 프로그램 된배의 orter 다른 플랫폼들 (10 분 및 45 분 연관 해리)에 비해 (500 S 협회 30 분간 해리). BLI 기반기구에 의해 생성 된 속도 상수가 오프 비율의 일부 변동의 결과 (도 8의 (c)으로서 이하의 선형성을 표시하지만, 실험 시간을 단축하여 데이터 품질 / 일관성 증발의 영향을 완화하기 위해 나타나지 않았다 ). 시료 증발에 더하여, 사용되는 캡쳐 시약의 차이는 또한 얻어지는 결과의 차이에 기여 할 수있다. 단백질 A / G가 세 유체 기반 SPR 플랫폼에 사용되는 동안, AHC 센서는 비 유체의 BLI 플랫폼에서 사용되었다. 단백질 A / G가 AHC 항체 기반의 바이오 센서의 표면, 단백질 A / G 표면에서 항체 - 항원 복합체의 오프 속도 인위적보다 빨리 나타나는 않는보다 mAb에 대한 강한 친 화성을 가질 가능성이 있기 때문에 AHC 표면으로부터 얻어진. 이러한 가능성은 b를 지원설명 y BLI 플랫폼에 의해 발생 된 오프 속도 값은 다른 장치 (도 7의 적색 선)에 의한 것보다 더 지속적으로 낮았다 것을 보여주는 실험 데이터. 그럼에도 불구하고, BLI 플랫폼은 다른 플랫폼에 걸쳐 서로 다른 장점이 있습니다. 예를 들면, 즉시 사용으로 인해 다양한 사전 - 코팅 센서 센서 선택 및 분석에 관한 구성이 매우 유연하다. 우리의 실험에서 AHC 센서의 사용은 준비 시간을 줄이고, 리간드의 고정화 단계의 필요성을 제거. 또한, BLI 플랫폼은 복잡한 튜브 및 가치 스위치 구성을 특징으로 다른 유체의 SPR 플랫폼에 비해 훨씬 적은 유지 보수를 필요로한다. 이 기능은 막힘 오염 문제가 발생할 수 있습니다 원유 샘플을 포함하는 실험 장점이다.
치료 후보 증가, 효율적으로 신속하고 정확한 식별에 대한 수요, BI에 대한 요구로osensor 처리량도 증가하고있다. 네 개의 바이오 센서 플랫폼 중에서 96 리간드 어레이 인쇄 할 수있는 바이오 센서의 처리량 궁극적 증가 십자 36 리간드 포맷 및 16 채널 동시 판독과 BLI 기반 바이오 센서에 결합 된 바이오 센서, 다음으로 높은은 각각 96, 36, 16, 단일 결합 사이클에서 측정 된 상호 작용의 수. 이 처리량 기능은 하나의 일련의 흐름에 의해 연결된 네 개의 흐름 세포를 가지고에 의해 제한되는 기존의 SPR 플랫폼보다 훨씬 더 높다. 우리의 실험은 긴 해리 시간으로 다수의 표면 밀도에서 평가 10 단클론 항체의 비교적 작은 샘플 세트를 포함하기 때문에, 악기 처리량은 실험의 효율성을 결정하는 중간 역할을했다. 이 세 개의 높은 처리량 플랫폼의 실험 시간에 유의 한 차이는 없었다, 그리고 모든 경우에 실험은 하루에 완료되었습니다. 한편, 기존의 직렬 흐름 SPR 실험은 설치 후 데이터 수집의 도보 거리에 자동화에도 불구하고, 완료 삼일이 필요합니다. 오프 속도 순위 / 운동 검사 또는 에피토프 비닝 (binning)을 위해, (수백 또는 수천의 예) 샘플의 큰 숫자를 포함하는 다른 연구에서, 처리량은 중요한 요소가된다.
IBIS MX96의 처리량이 다른 바이오 센서보다 수십 배 더 높다 따라서 이러한 목적을위한 최적의 선택이지만, 몇 가지 단점을 가지고있다. 특히, CFM하여 배열 인쇄 큰 표면 불일치 (도 1) 및 감소 된 데이터 재현성 (도 8D 및 8E)을 나타낸다. 정확한 동역학 측정을 위해 바이오 센서의 표면 리간드의 양은 결합 반응은 같은 보조 요소들에 의해 방해되지 않도록 제어 할 필요가 중요한 파라미터이다물질 전달 또는 입체 장애. 바이아 코어 T100 및 ProteOn XPR36 들어, 최적의 R L 레벨이 연구 제 17에서 설명한 바와 같이 설정된 R의 최대 값의 표준 계산에 기초하여 결정 하였다. 한편, 옥텟 RED384 및 IBIS MX96 플랫폼, 단클론 항체 캡쳐 레벨은 경험적 상수 배에서 2 배 희석 한 항체의 시리즈를 사용하여 달성 하였다. 기술 또는 캡처 단계의 제어의 부족은 고밀도 표면 운동 속도 상수의 정밀도를 손상 수도 높은 결합 응답 신호 (도 2)였다. 재생성 관련된 여러 바인딩 사이클 측정을 수행 할 때 또한, SPR 검출기로부터 프린터의 분리도 문제를 제시한다. 멀티 사이클 동역학 설정을 수행 할 수있는 유일한 방법은, 고정 된 단백질 A / G에서 단클론 항체를 통해 캡처 된 Fc 반대로 모노클 직접 아민 커플 링으로했다다른 세 개의 바이오 센서 플랫폼의 표면. 결과적으로, 추가로 재생 정찰 실험 최적의 재생 조건을 결정하기 위해 필요했다. 이 설정의 결과는 더 이상 실험 시간 이외에의 Fc 캡처 방법 (그림 9)에 비해 ~ 90 % 낮은 관찰 된 표면 활동과 연결되었다. 은 FC 캡처 방법을 실행하려면, 다른 하나의주기 운동 방식이 채택되었다. 이러한 접근법은 각각의 분사 (도 2) 사이에 재생하지 않고, 증가하는 농도의 분석 물질의 연속 주입을 포함한다. 이것은 매우 편리하지만, 일반적으로 덜 적용 방법뿐만 실험 시간 단축 및 시약의 소비를 줄일뿐만 아니라 다른 바이오 센서 (도 7)의 것과 매우 유사한 운동 속도 상수를 생성. 따라서,이 단일 사이클 반응 속도 접근 방식을 적용하면 악기의 고유 한 구성의 한계를 극복하고 선물높은 처리량 방식으로 고해상도의 운동 속도 상수를 얻기위한 기회를 제공합니다.
처리량이 비아 코어 T100의 주요 제한에도 불구하고, 우리의 결과는 총체적으로는 최고의 품질과 가장 일치하는 데이터를 생성 한 것으로 나타났다. 이것은 ~ 10 배 높은 처리량을 가지고 ProteOn XPR36,으로 이어졌습니다. 악기 '검출 한계에 도달하면 기술적으로 어려울 수 고친 화성 항체 - 항원 상호 작용을 특성화 할 때 고품질의 데이터를 생성하는 능력이있는 장점이된다. 옥 테트 RED384의 장비의 체계적인 제한 해리 속도 상수의 정확한 측정을 방해하는 동안 (즉, 감도의 짧은 떨어지는 속도가 느린 오프 요금에 대한 충분한 신호 부패를 해결하기 위해), 모두 비아 코어 T100 및 ProteOn XPR36는 민감하고 안정적인 제공 할 수 있습니다 차별화를위한 탐지.
Disclosures
이 비디오 기사에 대한 출판 비용은 베링거 인 겔 하임 제약 지불했다.
Acknowledgments
저자는 IBIS MX96에 대한 기술 지원을 노아 디토 아담 마일 감사합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biacore T100 System | GE Healthcare | 28975001 | The T100 system has been upgraded to T200 |
| CM5 Sensor Chip | GE Healthcare | BR100012 | |
| BIAevaluation | GE Healthcare | Version 4.1 | |
| Biacore T100 Control Software | GE Healthcare | The T100 control software has been upgraded to T200 | |
| Amine Coupling Kit | GE Healthcare | BR100050 | It contains: 750 mg 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride (EDC), 115 mg N-hydroxysuccinimide (NHS), 10.5 mL 1.0 M ethanolamine-HCl pH 8.5 |
| HBS-EP+ Buffer 10× | GE Healthcare | BR100669 | Concentrated stock solution |
| Plastic Vials, o.d. 7 mm | GE Healthcare | BR100212 | |
| Rubber Caps, type 3 | GE Healthcare | BR100502 | |
| Plastic Vials and Caps, o.d. 11 mm | GE Healthcare | BR100214 | |
| ProteOn XPR36 Protein Interaction Array System | Bio-Rad | 1760100 | |
| ProteOn Manager Software | Bio-Rad | 1760200 | Version 3.1.0.6 |
| GLM Sensor Chip | Bio-Rad | 1765012 | |
| Amine Coupling Kit | Bio-Rad | 1762410 | It includes EDAC (EDC), sulfo-NHS, ethanolamine HCl |
| Regeneration and Conditioning Kit and Buffers | Bio-Rad | 1762210 | It includes 1 each glycine buffer (pH 1.5, 2.0, 2.5, 3.0), and NaOH, SDS, HCl, phosphoric acid, NaCl; 50 mL each solution |
| 2 L PBS/Tween/EDTA buffer | Bio-Rad | 1762730 | It includes hosphate buffered saline (PBS), pH 7.4, 0.005% Tween 20, 3 mM EDTA |
| Octet RED384 System | FortéBio | ||
| Data Analysis Software | FortéBio | Version 9.0.0.4 | |
| Dip and Read Anti-hIgG Fc Capture (AHC) Biosensors | FortéBio | 18-5060 | One tray of 96 biosensors |
| 384-Well Tilted-Bottom Plate | FortéBio | 18-5080 | |
| Biosensor Dispenser | FortéBio | 18-5016 | |
| Kinetics Buffer 10x | FortéBio | 18-1092 | 10x concentration. Contains ProClin 300. |
| IBIS MX96 SPRi System | Wasatch Microfluidics | ||
| Microfluidics Continuous Flow Microspotter (CFM) Printer | Wasatch Microfluidics | Version 2.0 | |
| SensEye COOH-G chip | Wasatch Microfluidics | 1-09-04-004 | |
| Data Analysis Software | Wasatch Microfluidics | Version 6.19.3.17 | |
| SPRint Data Analysis Software | Wasatch Microfluidics | Version 6.15.2.1 | |
| Scrubber 2 | BioLogic Software | Version 2 | |
| Pierce Recombinant Protein A/G | ThermoFisher Scientific | 21186 |
References
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