Summary
Células neuronais de rato cultivadas em matrizes de múltiplos eléctrodos apresentam um aumento na resposta após estimulação eléctrica. Este protocolo demonstra como cultivar neurônios, como registrar a atividade, e como estabelecer um protocolo para treinar as redes para responder a padrões de estimulação.
Abstract
Micro-eletrodo arrays (MEAs) pode ser usado para investigar toxicidade de drogas, paradigmas de design para a próxima geração de medicina personalizada, e estudar dinâmica de rede em culturas neuronais. Em contraste com os métodos mais tradicionais, como o patch-clamping, que só pode registrar a atividade de uma única célula, os MEAs podem gravar simultaneamente a partir de múltiplos sites em uma rede, sem exigir a árdua tarefa de colocar cada eletrodo individualmente. Além disso, numerosas configurações de controle e estimulação podem ser facilmente aplicadas dentro da mesma configuração experimental, permitindo uma ampla gama de dinâmicas a serem exploradas. Uma das principais dinâmicas de interesse nestes estudos in vitro foi a extensão em que as redes cultivadas exibem propriedades indicativas de aprendizagem. Células neuronais de rato cultivadas em MEAs exibem um aumento na resposta após o treino induzido por estimulação eléctrica. Este protocolo demonstra como cultivar células neuronais em MEAs; Com sucessoMais de 95% dos pratos banhados; Estabelecer um protocolo para capacitar as redes a responder aos padrões de estimulação; E classificar, plotar e interpretar os resultados de tais experimentos. O uso de um sistema proprietário para estimular e registrar culturas neuronais é demonstrado. Pacotes de software também são usados para classificar unidades neuronais. Uma interface de usuário gráfica personalizada é usada para visualizar histogramas de tempo pós-estímulo, intervalos entre rajadas e duração de rajada, assim como comparar a resposta celular à estimulação antes e depois de um protocolo de treinamento. Finalmente, são discutidos os resultados representativos e as direções futuras deste esforço de pesquisa.
Introduction
Micro-eletrodo arrays (MEAs) pode ser usado para investigar toxicidade de drogas, paradigmas de design para a próxima geração de medicina personalizada, e estudar dinâmica de rede em culturas neuronais 1 . Em contraste com métodos mais tradicionais - como o patch-clamping, que só pode registrar a atividade de uma única célula, ou gravação de campo com uma pipeta de vidro, que pode registrar respostas extracelulares dos neurônios que cercam o eletrodo em um único local - MEAs pode simultaneamente Registro de vários locais em uma cultura de células sem exigir a árdua tarefa de colocar cada eletrodo individualmente. Isso permite o estudo das interações dinâmicas entre grupos de células que formam uma rede dentro dessa cultura. Além disso, os efeitos da estimulação elétrica em padrões de disparo de rede 2 , 3 , 4 , 5 e controle de rede 6 </ Sup> em culturas neuronais têm sido bem documentadas, e numerosas configurações de estimulação elétrica e controles podem ser facilmente aplicados dentro da mesma configuração experimental, permitindo uma ampla gama de dinâmicas espaço-temporais a serem exploradas.
Uma das principais dinâmicas de interesse nesses estudos in vitro foi a extensão em que as redes cultivadas exibem propriedades indicativas de aprendizagem 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 . O Laboratório Peixoto examinou previamente os efeitos dos sinais de treino de alta frequência, tal como descrito em Ruaro et al. 14 , em redes de neurônios de camundongos banhados em matrizes de microeletrodos 15 . Nestas experiências, as redes apresentaram um aumento na respostaG induzido por estimulação elétrica. A resposta aumentada foi considerada uma forma de aprendizagem através do reconhecimento de estímulo, pelo que as redes responderam de forma consistente a uma mudança no estímulo após a aplicação de um protocolo específico de estimulação ( ie, treinamento).
Este protocolo demonstra como cultivar células neuronais em MEAs, registrar com sucesso mais de 95% dos pratos banhados, estabelecer um protocolo para treinar as redes para responder a padrões de estimulação, classificar atividade de unidade única, plotar histogramas e interpretar os resultados de Experiências. O uso de um sistema proprietário (veja a Tabela de Materiais ) para a estimulação e registro de culturas neuronais é demonstrado, bem como a aplicação de pacotes de software (veja a Tabela de Materiais ) para classificar unidades neuronais . Uma interface gráfica personalizada (veja a Tabela de Materiais ) é usada para visualizar asTempo timulus histogramas, inter-burst intervalos, e burst duração, bem como para comparar a resposta celular para a estimulação antes e após um protocolo de treinamento.
Protocol
Todos os procedimentos com animais seguem as diretrizes do NIH e / ou a Política de Serviços de Saúde Pública sobre o Cuidado Humano e Uso de Animais de Laboratório e estão sob um protocolo institucionalmente aprovado de cuidado e uso de animais (IACUC) na Universidade George Mason.
1. Preparação do material
- Autoclave os seguintes materiais: pipetas de vidro de 5,75 polegadas de comprimento dispostas verticalmente em (2) copos de 500 mL, aproximadamente 24 pedaços de papel de filtro (150 mm de diâmetro, cada um cortado em 8 cunhas, o tamanho dos poros não importa), 1.000 μL de pipeta filtrada Dicas, 200 μL de pontas de pipeta filtradas, 10 μL de pontas de pipeta filtradas e água desionizada (DI) para as lavagens (pelo menos 200 mL).
- Preparar os reagentes e meios.
- Preparar todos os reagentes e meios na biofundidade utilizando técnicas assépticas.
- Preparar poli-D-lisina (PDL) de acordo com a Tabela 1 .
- Misture o PDL com água DI estéril para um final cConcentração de 50 μg / mL, como se segue. Use uma pipeta sorológica estéril para transferir 96 mL de água DI estéril para um frasco de reagente de vidro autoclavado.
- Use uma pipeta sorológica estéril para adicionar 4 mL de água DI estéril ao frasco do fabricante contendo PDL. Dissolver o PDL por pipetagem. Use a mesma pipeta para transferir a solução de PDL para o frasco de reagente de vidro contendo 96 mL de água DI estéril.
- Cubra o frasco firmemente antes de removê-lo da biofundidade e vórtice da solução. Na biofundidade, dividir a solução em alíquotas de 5 mL; Congelar qualquer solução não utilizada a -20 ° C. O PDL descongelado pode ser novamente congelado uma vez. Descarte a solução descongelada se for novamente congelada.
- Preparar a solução de laminina de acordo com a Tabela 2 .
- Misturar a laminina com PBS até uma concentração final de 20 μg / mL, como se segue. Use uma pipeta sorológica estéril para transferir 49 mL de PBS para um tubo de centrífuga de 50 mL.
- Use uma serologica estérilL pipetar para adicionar 1 mL de PBS ao frasco do fabricante contendo o peso apropriado de laminina. Dissolver a laminina por pipetagem. Utilizar a mesma pipeta para transferir a solução de laminina para o tubo de centrífuga de 50 mL contendo 49 mL de PBS.
- Cubra o tubo com força antes de removê-lo da biofusão e vórtice da solução. Na biofundidade, dividir a solução em alíquotas de 5 mL; Congelar qualquer solução não utilizada a -20 ° C. A laminina descongelada não pode ser recongelada; Descartar qualquer solução descongelada não utilizada.
- Preparar o meio de armazenamento, de acordo com a Tabela 3 .
NOTA: O meio de armazenamento é usado para armazenar tecidos por até um mês a níveis ambientais de CO 2 . Pode ser adquirido (ver tabela de materiais), ou pode ser preparado usando a receita geral de: meio ambiente de armazenamento de CO2 + 2% de suplemento livre de soro para cultura de células neurais + meio de cultura celular 0,5 mM que contém um estabilizado Forma de L-glutamina (ver tabela de materiais).- Para fazer 10 mL de meio de armazenamento, transfira 10 mL de meio de armazenamento para tecido embrionário sem CaCl2 para um tubo de centrífuga de 15 mL. Adicionar 210 μL de suplemento livre de soro para cultura de células neurais e 55 μL de uma forma estabilizada de L-glutamina. Misture suavemente por inversão.
- Como o meio de armazenamento é sensível à luz, proteja-o cobrindo os tubos de centrifugação de 15 mL com folha de alumínio. Alíquota 2 ml de meio de armazenamento por tubo para um total de 5 alíquotas. Armazene no refrigerador por até 2 semanas ou até pronto para o uso, mas não congele.
- Preparar meio DMEM 5/5, de acordo com a Tabela 4 .
- Descongelar alíquotas de suplemento sem soro para cultura de células neurais, soro de cavalo (HS), soro bovino fetal (FBS) e ácido ascórbico. Descongelar uma alíquota de pen-strep, se necessário, para controlar a contaminação bacteriana. Pipetar cada ingrediente em um tubo de centrífuga de 50 mL. Certifique-se de que as pontas da pipeta não toquem emTs.
- Dentro do biohood, conecte o filtro ao tubo de vácuo com o vácuo ainda fora. Despeje a mistura no topo do filtro e feche-a. Ligue o vácuo na biofundidade e deixe o meio filtrar para o fundo do recipiente. Desconecte o filtro do vácuo antes de desligar o vácuo.
- Aperte a tampa no recipiente do meio estéril, etiquetá-lo, e armazene qualquer meio não utilizado a 4 ° C por até um mês. Abra o recipiente dentro do biohood para manter o meio estéril.
- Preparar o meio DMEM +, de acordo com a Tabela 5 .
- Descongelar alíquotas de suplemento sem soro para cultura de células neurais e ácido ascórbico (e pen-strep, se necessário). Pipetar cada ingrediente em um tubo de centrífuga de 50 mL. Repita os passos 1.2.5.2-1.2.5.3 para o processo restante.
2. Array / preparação do prato
NOTA: Os MEAs utilizados no procedimento são arrays de 60 canais oEm 8 x 8 quadrados. A distância entre os eletrodos é de 200 μm, e cada eletrodo tem 10 μm de diâmetro. O material condutor para as faixas é de titânio, e os próprios eléctrodos são feitos de TiN. O anel de vidro ao redor dos eletrodos tem 6 mm de altura, com 24 mm de diâmetro externo. Uma tampa feita de polioximetileno (POM) é usada para cobrir o MEA e uma película de etileno propileno (FEP) fluoretada permeável a gás / impermeável a líquidos é usada para evitar contaminação durante sessões de gravação e estimulação.
- Um dia antes do chapeamento.
- Tornar os MEAs não utilizados hidrofílicos expondo-os ao plasma; Isso geralmente não é necessário após a primeira utilização. Certifique-se de que as lamelas de vidro usadas para culturas de controlo também recebem um tratamento com plasma.
NOTA: Placas de Petri plásticas (35 mm) também podem ser usadas como pratos de controle e não precisam de nenhum pré-tratamento.- Administrar o tratamento com plasma usando um gravador de plasma para 40-60 s a meia potência (50 W), wiCom a pressão da câmara ajustada para 100-150 mT.
- Encher imediatamente os MEAs com água DI. Submergir as lamelas em uma placa de Petri cheia de água DI. Deixe a água DI em contato com superfícies tratadas por aproximadamente 15 min.
- Dentro da biofundidade, a sucção para fora a água DI. Encha os MEAs com 70% de etanol. Retire a água DI da placa de Petri contendo as lamelas e encha a caixa de Petri com etanol até que os lamínulas estejam totalmente submersas. Permitir que isso permaneça por 10-15 min.
- Rotular todas as placas de Petri e pratos de controle com o MEA ID #, data da cirurgia, tipo de célula e iniciais. Em seguida, coloque cada MEA em sua placa de Petri rotulada.
- Coloque os MEAs em placas individuais de Petri e remova o etanol usando sucção por vácuo. Encha os MEAs com água DI estéril para remover qualquer etanol residual. Use sucção de vácuo para remover a água DI. Deixe o MEAs ar-seco dentro do biohood.
- Adicionar 40-70 μL de 50 μg / mL de poli-D-lisinaE (PDL, peso molecular elevado, pelo menos 50 kDa) ao centro de cada MEA e 0,2 mL aos controlos utilizando pontas de pipeta estéreis.
NOTA: Certifique-se de não tocar o centro do MEA com a pipeta, pois isso pode danificar os eletrodos. A quantidade exacta de PDL dispensada depende da hidrof ilicidade da superfície. - Coloque um pequeno pedaço de papel tissue de laboratório em cada prato e molhe-o com água estéril para evitar a evaporação de PDL durante a noite. Cubra todos os pratos antes de removê-los da biofonia. Colocar os pratos numa incubadora a 37 ° C durante a noite.
- Tornar os MEAs não utilizados hidrofílicos expondo-os ao plasma; Isso geralmente não é necessário após a primeira utilização. Certifique-se de que as lamelas de vidro usadas para culturas de controlo também recebem um tratamento com plasma.
- Plating dia.
- No dia do chapeamento, descongelar 1 alíquota de laminina (20 μg / mL); Cada MEA requer 40-50 μL de laminina, e cada placa de controlo requer 0,2 mL de laminina. Calcule o volume de laminina necessário com base no número de MEAs e controles a serem utilizados.
- Transferir todos os pratos da incubadora para a biofilia.
- Preencher todos os MEAs comDI utilizando uma pipeta serológica estéril e deixe-os sentar durante 10-15 min. Aspirar a água DI utilizando pipetas Pasteur estéreis e repetir o processo duas vezes.
- Adicionar 40 - 50 μL de laminina descongelada ao centro de cada MEA e 0,2 mL de laminina para as placas de controlo utilizando pontas de pipeta estéreis. Cobrir todos os MEAs e os pratos de controlo na biofundidade e transferi-los para uma incubadora a 37 ° C durante 1 h.
- Remova cuidadosamente o excesso de laminina do centro dos MEAs usando sucção com pipetas Pasteur estéreis e deixe a superfície secar ao ar antes de chapear.
- Deixe os pratos na biofundidade, ou colocá-los em uma incubadora até que esteja pronto para prender as células.
NOTA: Os pratos podem permanecer na incubadora até o dia seguinte. No entanto, se for necessário mais tempo, é aconselhável limpar os pratos e recomeçar a partir do passo poli-D-lisina (PDL) (passo 2.1.6).
3. Remoção de embriões e cérebroExtração
- Despeje o meio L-15 (Leibovitz) em 4 das placas de Petri de 100 mm. Cubra-os e coloque-os em um congelador de -20 ° C até que o meio tem uma consistência lamacenta, mas não é sólido congelado (~ 40-60 min).
- Faça isto aproximadamente 40 min a 1 h antes da dissecção.
NOTA: Isso vai esfriar os embriões e cérebros rapidamente, de modo que eles têm uma consistência firme e não se desintegrar após a extração. - Preparar a área de dissecção para remoção de embriões.
- Coloque uma bandeja com gelo perto de uma pia e coloque os instrumentos cirúrgicos e materiais para remoção de embriões. Estes incluem 4 placas de Petri com lâmina fria L-15 ", toalhas de papel, um frasco de spray com etanol a 70%, fórceps com ponta fechada, pinça fina, pequenas tesouras cirúrgicas e grandes tesouras.
- Preparar a área de dissecção para a extração cerebral.
- Coloque uma placa de Petri de vidro faEm uma bandeja cheia de gelo.
- Coloque os instrumentos e materiais cirúrgicos para a extração do cérebro, incluindo toalhas de papel, pequenas tesouras cirúrgicas, uma espátula dupla, um frasco de spray cheio de etanol a 70% e um saco de plástico para a eliminação da carcaça.
- Coloque uma bata de laboratório, uma máscara e luvas. Pulverizar todas as superfícies de trabalho, incluindo as luvas, com etanol a 70%.
NOTA: Embora este não seja um procedimento estéril, é melhor reduzir as chances de contaminação, tanto quanto possível. - Euthanize um rato E17 com tempo de gravidez seguindo as diretrizes NIH 16 e / ou Política de Serviços de Saúde Pública sobre o Cuidado Humano e Uso de Animais de Laboratório e sob um protocolo institucionalmente aprovado de cuidado e uso de animais (IACUC) para asfixia de CO 2 . Certifique-se de liberar o gás CO 2 lentamente na câmara durante um período de 3 a 5 minutos para evitar induzir pânico ou discoMfort no rato.
- Decapite o mouse e coloque-o sobre uma toalha de papel, lado ventral para cima. Pulverizar a parte inferior do abdômen com etanol a 70%. Usando a pequena tesoura cirúrgica, fazer um corte em forma de V através da pele e gordura subcutânea do abdômen inferior, estendendo o corte para as extremidades distais da cavidade torácica e expondo o útero.
- Usando fórceps, cuidadosamente levantar o útero entre os embriões. Corte o tecido conjuntivo com tesoura de dissecção até todo o útero é livre. Enxágüe brevemente o útero com etanol a 70% para remover qualquer sangue e coloque-o em uma das 4 placas de Petri cheias de L-15 fria.
- Solte cada embrião do útero e saco embrionário interior usando um par de pinças de ponta fina. Certifique-se de que o cordão umbilical foi cortado eo saco placentário removido. Coloque os embriões liberados no segundo prato cheio de frio L-15. Decapitar os embriões com fórceps e tesoura. Usando fórceps, transferir as cabeças para uma terceira placa de Petri e os corposPara um quarto, ambos cheios de frio L-15.
4. Remoção do Córtex Frontal
- Em uma biofundidade, coloque uma cunha de papel de filtro autoclavado na fase de prato de Petri de vidro resfriado. Coloque uma única cabeça de embrião sobre o papel de filtro. Aperte o crânio colocando um par de fórceps através das cavidades oculares com a mão não-dominante. Remova a pele eo tecido muscular subjacente com um par de tesoura de íris.
- Coloque a ponta de corte da parte inferior da tesoura de íris na base do crânio. Mantendo o mais baixo contra a superfície interna do crânio, longe do cérebro, corte através da placa occipital e, em seguida, ao longo da linha média entre as placas parietal. Continue cortando rostralmente, entre as placas do crânio frontal cartilaginoso.
- Começando no centro da placa occipital, faça um corte perpendicular à esquerda e à direita do corte do centro.
- Remova o cérebro, cuidadosamente deslizando uma pequena espátula entre a superfície ventralDo cérebro e as placas inferiores do crânio até que esteja completamente sob o cérebro. Levante a espátula para cima; O cérebro inteiro sai intacto.
- Coloque algumas gotas de meio L-15 sobre o papel de filtro para que o cérebro não fique no papel e deslize suavemente o cérebro da espátula sobre o papel de filtro, lado ventral para baixo. Cuidadosamente cortar o bulbo olfativo com a ponta da espátula.
- Usando uma espátula limpa, dissecar o lobo frontal em um padrão trapezoidal. Transferir o tecido para um tubo de centrifugação de 15 mL contendo meio de armazenamento. Repita o acima com os embriões restantes. Certifique-se de usar uma nova cunha de papel de filtro cada vez ( ou seja, uma cunha de papel de filtro por cabeça).
5. Dissociação de Células
- Na biologia, montar os itens listados na Tabela 6 .
- Use uma pipeta sorológica estéril para adicionar 5 mL de DMEM + a um frasco de papaína; Aquecido DMEM + pode ser usado para melhor dissolver a papaína. SuavementePipeta para misturar a solução.
- Utilizar uma micropipeta estéril para adicionar 0,5 mL de DMEM + a um frasco de DNase. Evite pipetting vigoroso ao fazer a solução de DNase, porque DNase é sensível a desnaturação de cisalhamento.
- Transferir 2,5 mL de solução de papaína para um tubo de centrífuga estéril e adicionar 125μL da DNase para o mesmo tubo. Misture a solução invertendo suavemente o tubo de centrífuga tapado cerca de 8 vezes.
- Usando uma pipeta estéril de grande diâmetro, remova o tecido do tubo que contém o meio de armazenamento e coloque-o em uma placa de Petri estéril de 35 mm. Recolher o mínimo possível. Use uma pipeta estéril para remover o máximo de armazenamento possível, sem remover o tecido. O tecido não deve estar flutuando no meio, mas deve estar úmido.
- Use duas lâminas de bisturi estéreis para picar o tecido. Use uma pipeta sorológica estéril para adicionar 2,5 mL da mistura de DNase / papaína ao tecido picado na placa de Petri. Agite suavemente a placa de Petri paraQue todo o tecido está livre na solução e não aderido ao fundo do prato. Colocar o prato numa incubadora a 37 ° C durante 15 min.
- Na biofundidade, use uma pipeta de transferência estéril de grande calibre para transferir todos os meios e tecidos para um tubo criogênico estéril de 5 mL. Coloque a ponta da mesma pipeta de transferência de ângulo largo perto da parte inferior do tubo. Triturar suavemente lentamente pipetando para cima e para baixo 10-15 vezes.
- Evite formar bolhas durante a pipetagem. Repita o processo utilizando uma pipeta de transferência de pequeno calibre até obter uma mistura homogénea. Se o tecido não é dissociado, triturar usando uma pipeta de 1000 μL.
- Adicionar 2 mL de DMEM 5/5 aquecido à mistura de células dissociadas. Cap o tubo de centrífuga enquanto ainda está na biofundidade. Misturar suavemente por inversão. Centrifugar a aproximadamente 573 xg durante 5 min à temperatura ambiente (20-25 ° C).
- Na biofundidade, use uma pipeta sorológica estéril para remover e descartar todo o sobrenadante, sem quebrar oPelete Use uma pipeta estéril para adicionar 1 mL de DMEM 5/5 aquecido ao sedimento no tubo para re-suspender as células. Use uma pipeta de transferência estéril de pequeno calibre para quebrar a pastilha pipetando suavemente para cima e para baixo até que a mistura seja homogênea.
NOTA: Evite formar bolhas durante a pipetagem. Se muito pouco tecido foi coletado, adicionar apenas 0,5 mL de DMEM 5/5. - Dentro da biofundidade, use uma pipeta estéril para transferir 10 μL da suspensão celular para um tubo de microcentrífuga. Fora da biofundidade, adicione 10 μL de azul Trypan aos 10 μL de suspensão celular no tubo de microcentrífuga.
NOTA: Esta etapa não requer esterilidade. - Carregar 10 μL da suspensão de células azul Trypan em um chip hemocytometer descartável, a fim de contar as células.
6. Plating Cells
- Na biofundidade, use uma micropipeta estéril para transferir 50 μL de suspensão de células para o centro de cada matriz e cada placa de Petri de controle. Use um piPette ponta por prato. Certifique-se de colocar as células exatamente no centro da matriz. Re-molhar o papel de laboratório que estava no prato com água estéril, ou colocar novo papel de seda em cada prato. Cubra os pratos.
- Colocar as placas de Petri cobertas num incubador ajustado para 37 ° C e 10% de CO2 durante 3-4 h.
- Na biofundidade, adicione suavemente 1 mL de DMEM 5/5 aquecido a cada MEA.
NOTA: Evite lavar as células longe da matriz central ao adicionar o meio (importante!). Com muito cuidado, use uma micropipeta estéril para adicionar uma gota de cada vez em torno das bordas internas. - Coloque uma tampa contendo uma membrana FEP permeável a gás em cada MEA. Devolva-os para a incubadora por dois dias.
NOTA: A tampa evita a contaminação ea evaporação. Siga a técnica asséptica, secando os tampões na biofundidade com etanol 100% antes de colocá-los no MEA. As culturas devem ser cobertas dentro da biofundidade e devem permanecer tampadas em todos os momentos.
7. PrincipalCulturas
- Após dois dias, efectuar uma substituição completa do meio com DMEM + aquecido.
- Transfira apenas alguns pratos da incubadora para a biofonia de cada vez para evitar estressar as culturas por muito tempo.
- Use uma micropipeta estéril de 1 mL para extrair todo o meio do prato colocando cuidadosamente a ponta da pipeta na parede interna do prato, evitando tocar as células no centro. Utilize apenas uma ponta de pipeta por prato para evitar a propagação de contaminação.
- Use uma micropipeta estéril para dispensar 1 mL de DMEM + quente, colocando cuidadosamente a ponta da pipeta na parede interna do prato.
- Realizar 50% de mudanças de meio com DMEM + aquecido, como descrito acima, 2-3 vezes por semana e com não mais de 4 dias entre as mamadas.
- Use uma micropipeta estéril de 1 mL para extrair 500 μL de meio do prato. Utilize uma micropipeta estéril para dispensar 500 μL de DMEM + quente. </ Li>
8. Inspeções e registros visuais
- Inspecionar as amostras de prato todos os dias sob um microscópio para procurar cobertura celular sobre a matriz (usando 4x e ampliação 10X) e contaminação (usando aumento de 20X), quer bacteriana ou fúngica.
NOTA: A Figura 3a mostra um exemplo de cobertura celular óptima, enquanto que a Figura 3b mostra uma cultura com uma fraca densidade celular. - Duas semanas após o revestimento, testar uma amostra dos pratos MEA para a atividade espontânea. Registre de MEAs, como descrito abaixo, durante 3-5 min. Os picos serão detectados se a atividade estiver presente ( Figura 4 ).
NOTA: Cabe ao experimentador determinar quando começar o teste com base no tipo de experiência e hipótese que está sendo investigada.- Para registrar a atividade em um MEA, use o seguinte equipamento: fonte de alimentação, amplificador, headstage / pré-amplificador, Controlador de temperatura e gerador de estimulação (ver tabela de materiais e Figura 5 ).
- Antes de retirar as culturas da incubadora, ligue o controlador de temperatura e ligue o sistema ligando a fonte de alimentação (de acordo com as instruções do fabricante), permitindo que a placa de base aquecida do pré-amplificador atinja 35 ° C.
- Coloque a cultura tampada no pré-amplificador para que a linha preta no poço MEA alinhe com o solo de referência. Certifique-se de que os pinos do pré-amplificador estão alinhados, de que a parte superior do pré-amplificador está segura e de que a tampa de cultura ainda está ligada.
- Uma vez que a cultura é colocada na placa, desmarque a opção "Change MEA" no software de aquisição de dados (consulte a tabela de materiais para nomes de software e guias de usuário). Além disso, desmarque a caixa "Blanking" antes de fazer qualquer gravação.
- Selecione "Download" em "MEA_Select" depois de tA cultura é colocada no sistema. Verifique se o programa mostra "Download OK" antes de continuar.
- Pressione "Iniciar" no ambiente de software para começar a visualizar os sinais. Na janela principal, selecione: "Spikes" → "Detecção" → "Automático", altere o valor "Std Dev" para "5" e clique em "atualizar" para redefinir o limite.
OBSERVAÇÃO: A janela "Spikes" exibe picos que ultrapassaram o limiar. - Na janela principal, selecione "Gravador" → "Gravador" → "Procurar". Altere o caminho eo nome do arquivo para identificar a data, hora, prato e experiência. Defina o limite de tempo ( por exemplo, para 5 min). Clique em "Parar", "Gravar" e "Reproduzir". Note que a gravação pára automaticamente.
- Abra o software de estimulação. Selecione "Gravador" → "Gravador" → "Procurar" para criar um arquivo eE limite. Clique em "Parar", "Gravar" e "Reproduzir" para gravar novamente. Clique em "Download and Start" (no software de estimulação) para a estimulação a ser entregue ao prato.
- Selecione o botão "Alterar MEA" no controle de software para alterar pratos.
NOTA: Não manter a cultura fora da incubadora por mais de 30 min de cada vez sem um sistema para manter uma atmosfera de CO 2 ao redor da cultura. Se forem necessárias sessões de gravação mais longas, use um adaptador comercial para fornecer CO 2 .
9. Redes de Formação
NOTA: A Figura 6 mostra uma visão geral dos passos 9.1-9.3, descritos abaixo.
- Registar uma linha de base de 5 minutos de actividade espontânea a partir da cultura celular (como descrito no passo 8). Uma vez estabelecida a linha de base, administrar uma estimulação de sondagem pré-treino de 5 minutos constituída por um bifásico de 0,5 HzPulso com uma duração de pulso de 200 μs e uma amplitude de pulso de 900 mV ( Figura 7a ) através dos eletrodos de estimulação selecionados, como mostrado na Figura 8 (veja o manual de software na tabela de materiais para detalhes sobre como selecionar os eletrodos de estimulação).
- Ao completar a estimulação pré-treinamento, administrar um protocolo de "treinamento" para as redes usando os mesmos eletrodos como na estimulação de sondagem. Entregar os trens de alta freqüência uma vez a cada 2 s, como descrito em Hamilton et al. 15 ( Figura 7b e Figura 7c ).
NOTA: O sinal de treinamento consiste em 40 trens de pulso. Cada trem de pulsos é composto por 100 impulsos bifásicos, com 4 ms entre pulsos, uma duração de pulso de 200 μs e uma amplitude de impulso de 900 mV. - Após a conclusão do período de treinamento, administrar uma estimulação de 5 min após o treinamento para as células,Idêntica à estimulação pré-treino. Uma vez terminada a estimulação pós-treino, registar 5 minutos de actividade espontânea pós-estimulação da rede (como descrito no passo 8).
- Use um grupo de controle separado de MEAs para explicar possíveis mudanças na resposta da rede devido a flutuações naturais ou à não estacionariedade do sistema. Administrar o mesmo protocolo experimental descrito acima para aqueles grupos de controlo, com a excepção de que os grupos de controlo recebem um período de treino simulado em que não é administrado nenhum sinal de treino real.
10. Análise de Dados
Nota: Os arquivos de dados são salvos e depois classificados em unidades neuronais usando um software de classificação proprietário (veja a tabela de materiais). Uma interface gráfica de usuário personalizada (GUI) é usada para carregar as unidades e analisar os padrões de atividade nas culturas, intervalos inter-rajadas, duração do estouro e histograma de tempo pós-estímulo (PSTH). O PSTH éO gráfico mais importante a ser analisado, pois exibe a atividade da rede em tamanhos bin (de comprimento variável), proporcionando assim uma representação visual da resposta da rede à estimulação apresentada.
- Converta os arquivos de dados .mcd para o formato .plx usando um software de classificação proprietário (consulte a tabela de materiais para nomes de software e guias de usuário). Exportar o arquivo .plx para um novo arquivo .plx dentro do mesmo programa. Classificar os canais em unidades neuronais ( Figura 9 ). Quando a classificação estiver concluída, exporte os dados como um arquivo .nex.
- Abra o arquivo .nex no software apropriado (consulte Tabela de Materiais ) e salve-o como um arquivo .mat para ser analisado com a GUI customizada, disponível gratuitamente (consulte Tabela de Materiais ).
NOTA: A interface gráfica do usuário (veja a tabela de materiais) traça PSTHs de acordo com a entrada do usuário ( isto é, população PSTH, PSTH média tendenciosa, ou canal P individualSTH), permitindo uma visão geral da experiência de estimulação e comparação imediata entre os arquivos pós e pré-estímulo. Ele também traça o PSTHs inicial versus final, que compara a resposta da rede com o primeiro 6 e os últimos 6 estímulos. A GUI executa várias outras funções, tais como taxa de pico, intervalo inter-spike, picos por estouro, intervalo inter-burst e duração de rajada, tanto para arquivos de estimulação quanto para arquivos com atividade espontânea. - Primeiro, selecione um arquivo .mat com variáveis contendo trens de pico e uma variável contendo o artefato de estimulação; O script analisará os dados ea GUI principal aparecerá com um gráfico médio PSTH à direita ( Figura 10 ).
- Clique nos botões do eléctrodo activo para ver o PSTH individual (em azul) em comparação com o PSTH médio (em vermelho).
NOTA: Os eletrodos ativos serão coloridos para mostrar um mapa de calor, onde valores mais altos (mais vermelhos) representam maiorPSTH, indicando uma resposta mais forte à estimulação. - Selecione uma opção de análise usando o menu pop-up. Selecione o botão "Biased Average" para selecionar um subconjunto de eletrodos e trace a média desse subconjunto; Isso é útil para comparar comportamento de sub-rede dentro de uma cultura.
NOTA: Há várias opções de análise diferentes selecionadas através do menu pop-up, e elas são todas explicadas no botão "Ajuda" no software. - Selecione o botão "Save Graph" para salvar o gráfico atualmente exibido como um arquivo jpeg com alta resolução. Selecione o botão "Tabela de dados" para exportar os dados para uma planilha.
- Clique nos botões do eléctrodo activo para ver o PSTH individual (em azul) em comparação com o PSTH médio (em vermelho).
Representative Results
Usando o procedimento aqui apresentado ( Figura 11 ) , os MEA de 60 canais revestidos com células neuronais de murganho E17 foram incubados até as culturas cobrirem as matrizes num tapete saudável de células ( Figura 12 e Figura 3a ) . Após 3 semanas de incubação a 10% de CO 2 e 37 ° C, as culturas foram verificadas quanto à actividade espontânea utilizando um sistema de registo comercial (ver Tabela de Materiais ). A temperatura foi mantida a 37 ° C durante o procedimento de registo utilizando um controlador de temperatura, uma vez que a temperatura afecta a actividade neuronal e as taxas de disparo.
Testando a atividade
As redes activas espontaneamente exibem normalmente padrões de sinal variáveis. Uma cultura activa média pode registar actividade numaCerca de 40% dos eléctrodos. Destes locais de eletrodos ativos, quase metade registra sinais espontâneos, com taxas de disparo variando de 5 a 10 Hz. Um gráfico raster representativo da actividade espontânea é mostrado na Figura 4a . As marcações indicam os sinais de tempo dos potenciais de acção registados a partir de 9 eléctrodos activos durante uma janela de 20 s, a uma taxa de aquisição de 25 kHz e uma gama de filtro passa banda entre 300 Hz e 3 kHz. A Figura 4b mostra o ruído de linha de base e o sinal extracelular bruto filtrado durante 8 rajadas de actividade antes do procedimento de triagem. Para separar os potenciais de acção do ruído, os limiares para cada canal são ajustados para 5 vezes o desvio padrão do ruído de linha de base e são calculados numa janela de 500 ms 15 .
Antes da análise, as espigas registradas para cada eletrodo foram classificadas off-line para distinguir entre fisioterapiaAtividade lógica e artefatos de estimulação usando um algoritmo k-means e análise de componentes principais. Os sinais que tinham sido identificados como respostas fisiológicas foram agrupados para criar uma resposta populacional em cada eletrodo ( Figura 13 e Figura 9 ) 15 .
Treinamento de redes neurais com estimulação elétrica
As redes foram treinadas usando estimulação elétrica aplicada à cultura diretamente através dos eletrodos MEA usando um gerador de estímulo (veja a tabela de materiais). Neste conjunto de resultados representativos, utilizou-se uma configuração em forma de "L" constituída por 13 eléctrodos ( Figura 8 ), embora muitas outras configurações possam ser aplicadas. A estimulação de sondagem e treinamento baseou-se em parâmetros definidos em Ruaro et al. 14 .
Inicialmente, foi estabelecida uma linha de base registando 5 minutos de actividade espontânea antes da estimulação. Uma vez estabelecida a linha de base, foi administrada uma estimulação de 5 min de pré-treino consistindo num impulso bifásico de 0,5 Hz com uma duração de pulso de 200 μs e uma amplitude de impulso de 900 mV ( Figura 7a ) através dos locais de estimulação seleccionados ( isto é, Em forma). Um protocolo de treinamento foi então administrado às redes a cada 2 s usando o mesmo conjunto de eletrodos. O sinal de treino era composto por 40 trens de pulso, cada um contendo 100 pulsos bifásicos, com um período de inter-pulso de 4 ms, uma duração de pulso de 200 μs e uma amplitude de impulso de 900 mV ( Figura 7b e Figura 7c ). Este período de treinamento foi então seguido por uma fase de pós-treinamento de 5 minutos, semelhante à estimulação pré-treinamento. O protocolo foi entãoConcluiu com um registro de 5 minutos de atividade espontânea pós-estimulação.
O mesmo protocolo experimental foi aplicado a um grupo controle de culturas para explicar flutuações naturais na resposta da rede. A única diferença no protocolo de controlo, contudo, foi a aplicação de um período de treino simulado, durante o qual não foi administrado nenhum sinal de treino real.
As análises estatísticas dos conjuntos de dados ( ie, treinamento versus controle) foram realizadas com uma ANOVA unidirecional, com a variável "treinamento" como fator entre sujeitos. A latência foi utilizada como um fator dentro do sujeito. Se houver interação significativa, o procedimento pós-hoc de Tukey foi realizado. Os resultados mostraram uma resposta pré-treinamento dentro de 20 ms pós-estímulo, embora o intervalo de atividade fosse inconsistente após a primeira resposta. No entanto, a atividade de pós-treinamento exibiu não só ar Durante as primeiras 20 ms pós-estímulo, como visto durante o pré-treino, mas também exibiu atividade significativa 30-50 ms pós-estímulo ( Figura 14 e Figura 15 ) 15 . Houve também uma correlação estatisticamente significante de "freqüência de pico" versus "tempo após estímulo" e de "confiança de pico" versus "tempo após estímulo". A "confiabilidade de pico" pode ser definida como a probabilidade de ver uma resposta de rede a uma estimulação, onde uma resposta a cada estímulo é atribuída a um valor máximo de 1. A Figura 16 mostra quase um aumento de 50% na frequência de pico, -50% na confiabilidade de pico para redes treinadas versus controle na faixa de 20-50 ms pós-estímulo. Estes resultados sugerem que o treinamento mudou fundamentalmente a dinâmica da rede.
1 "class =" xfigimg "src =" / arquivos / ftp_upload / 55726 / 55726fig1.jpg "/>
Figura 1 : Ferramentas e materiais utilizados para remoção de embriões. ( A ) Bandeja cheia de gelo. ( B ) pratos de Petri preenchidos com frio L-15 "lama". ( C ) Toalha de papel. ( D ) Frasco de pulverização com etanol a 70%. ( E ) Pinça fina (x2). ( F ) Pequena tesoura cirúrgica. ( G ) Pinça do polegar com ponta fechada. ( H ) Tesoura grande. ( I ) Bolsa para o corpo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Ferramentas e Materiais Utilizados para a Extração do Cérebro. ( A B ) Placa de Petri contendo cabeças de embriões. ( C ) Tubo de centrífuga coberto de película com meio de armazenamento. ( D ) Placa de Petri de vidro invertido. ( E ) Papel de filtro autoclavado. ( F ) com 70% de etanol. ( G ) Pipeta de plástico. ( H ) Tesoura de íris. ( I ) Pinças finas. ( J ) Espátula fina dupla. ( K ) Toalha de papel. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Culturas Optimal versus Non-Optimal. ( A ) mostra um tapete saudável de células que cobrem as matrizes, em contraste com ( B ),Em que existe uma proliferação celular fraca. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 : Resultados representativos da actividade espontânea. ( A ) Representação gráfica representativa da actividade espontânea. As marcas indicam potenciais de acção registados a partir de 9 eléctrodos activos durante uma janela de 20 s a uma taxa de aquisição de 25 kHz e uma gama de filtro passa banda entre 3 kHz e 300 Hz. ( B ) Potencial de acção extracelular filtrado representativo a partir de um sítio activo. Figura modificada da referência 15 . Clique aqui para ver um verso maiorN desta figura.
Figura 5 : Configuração de Gravação. ( A ) Gerador de estimulação. ( B ) Controlador de temperatura. ( C ) Fonte de alimentação. ( D ) Amplificador. ( E ) Headstage / pré-amplificador. ( F ) MEA encapsulada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6 : Representação esquemática do protocolo de treinamento elétrico. Registar uma linha de base inicial durante 5 min e uma estimulação de sonda durante 3 min. Aplique estímulos tetânicos Ligado por 90 s, que não é gravado. Aplicar e registar uma segunda estimulação da sonda durante 3 min e uma linha de base final durante 5 min. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7 : Sondagem de Provas e Parâmetros do Sinal de Treinamento. ( A ) A estimulação de sondagem consiste em pulsos bi-fásicos de ± 900 mV administrados a uma frequência de 0,5 Hz. ( B ) Os trens de impulsos consistem em 100, ± 900 mV pulsos bi-fásicos a uma frequência de 250 Hz. ( C ) O sinal de treinamento consiste em 40 trens de pulso administrados a cada 2 s. Figura modificada da referência 15 ."_blank"> Clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.
Figura 8 : Representação da configuração da forma "L". Os quadrados representam eletrodos individuais de um MEA. Quadrados azuis indicam eletrodos usados para estimulação, enquanto que todos os outros são usados para gravação. Figura modificada da referência 15 . Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 9 : Distinguindo unidades de artefatos de ruído e estimulação. Os vários painéis superiores ( A -
Figura 10 : Histograma de tempo pós-estímulo (PSTH). Uma interface gráfica do usuário (ver Tabela de Materiais ) plota os PSTHs de acordo com a entrada do usuário ( isto é, PSTH populacional, PSTHCanal PSTH), permitindo uma visão geral da experiência de estimulação e para comparação imediata entre os arquivos pós e pré-estímulo. Ele também traça o PSTHs inicial versus final; Isto compara a resposta da rede aos primeiros 6 e aos últimos 6 estímulos. A GUI executa várias outras funções, tais como taxa de pico, intervalo inter-spike, picos por estouro, intervalo inter-burst e duração de rajada, tanto para arquivos de estimulação quanto para arquivos com atividade espontânea. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 11 : Visão Geral da Preparação e Revestimento de Células. ( A ) Um rato grávido E17 é eutanizado com CO 2 . ( B ) O rato é decapitatE o útero é removido. ( C ) Os embriões são libertados e decapitados. ( D ) O cérebro é extraído de cada embrião e os lobos frontais são removidos. ( E ) As células são dissociadas. ( F ) As células dissociadas são suspensas em meio. ( G ) As células em suspensão são colocadas em placas de múltiplos eléctrodos de 60 canais (MEAs). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 12 : Culturas neuronais plaqueadas em matrizes de microelectrodo. Os neurónios de rato embrionários são revestidos em MEAs de 60 canais, que permitem a gravação simultânea da actividade neuronal através da rede a partir de cada eléctrodo. (Figura modificadaDa referência 15 ). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 13 : Programa de classificação usado para classificar as formas de onda de cada canal. O programa de classificação (ver Tabela de Materiais ) carrega um arquivo de dados e exibe todas as unidades adquiridas inicialmente para cada canal. Um de vários métodos é selecionado para atribuir sinais a unidades específicas. Neste exemplo, o algoritmo de agrupamento em k médias foi selecionado e a unidade amarela (denominada "unidade a" na janela inferior) foi identificada. Outro programa (ver Tabela de Materiais ) é então usado para exportar o arquivo .nex para um arquivo .mat, que é o arquivo de entrada para a GUI customizada (veja
Figura 14 : Atividade alterada da rede em resposta à estimulação após um período de treinamento. Representação gráfica representativa da atividade de oito eletrodos. A linha vermelha vertical indica o tempo do estímulo, e as marcas pretas indicam potenciais de ação. No pré-treinamento ( A ), há uma resposta imediata ao pulso de estímulo através dos canais. No pós-treino ( B ), a rede apresenta uma resposta de atividade mais prolongada, bem como a resposta imediata à estimulação 15 ..jpeg / files / ftp_upload / 55726 / 55726fig14large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.
Figura 15 : Redes Treinadas têm Significativamente Alterado Spike Freqüências. A frequência do spiking da rede para as redes de controlo é calculada integrando o número de picos acima de 50 ms imediatamente após cada estimulação e divisão por esse período. É mostrada a média de 12 redes treinadas e 10 de controle (as barras de erro indicam o erro padrão da média). O asterisco (*) indica uma diferença estatística ( p-valor <0,05) entre os dois conjuntos de dados. Figura modificada da referência 15 . Clique aqui para ver uma listaVersão alemã desta figura.
Figura 16 : As respostas mediadas sinapticamente são significativamente modificadas em redes treinadas. ( A ) A confiabilidade do pico, medida em cachos de 10 ms e normalizada para as redes de controle, não mostra mudança para a ativação direta de neurônios próximos a eletrodos (0-20 ms). Portanto, não há diferença estatística entre os controles e as redes treinadas para essas caixas. Por outro lado, as respostas de latência mais longa (30-50 ms) são sinapticamente mediadas, indicando que este método fornece uma investigação mais detalhada de confiabilidade do que na Figura 15 , acima. ( B ) A freqüência de pico da população repete o comportamento da confiabilidade e não mostra modificação para a ativação direta (0-20 ms), enquanto que uma estatísticaDiferença estaticamente significativa é encontrada para as respostas de longo prazo (30-50 ms). Esse comportamento é consistente com os resultados médios na figura 15 anterior. As barras de erro são o erro padrão da média, calculado para 10 redes de controle e 12 redes treinadas. (*) Valor p <0,05; (**) p-valor <0,001. Figura modificada da referência 15 . Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Quantidade | Item |
| 1 | Frasco de reagente de vidro autoclavado (tamanho mínimo de 100 mL) |
| 20 | 15 mL tubos de centrífuga estéril |
| 1 | 10 mL de pipeta sorológica estéril |
| 4 | 25 mL de esterilE pipeta serológica |
| 2 | Pipeta sorológica estéril de 50 mL |
| 1 | Cremalheira do tubo da centrífuga |
| 150 mL | Água DI estéril |
| 5 mg | Poly-D-lisina frasco |
Tabela 1: Preparação de PDL - Lista de Materiais e Reagentes.
| Quantidade | Item |
| 1 | 50 ml tubos de centrífuga estéril |
| 10 | 15 mL tubos de centrífuga estéril |
| 2 | 1 mL de pipeta sorológica estéril |
| 2 | Pipeta sorológica estéril de 50 mL |
| 1 | Cremalheira do tubo da centrífuga |
| 1 mL | FosfatoTampão salino (PBS) |
| 1 mg | Laminina |
Tabela 2: Preparação de Laminina - Lista de Materiais e Reagentes.
| Quantidade | Item |
| 1 | Frasco de reagente de vidro autoclavado (tamanho mínimo de 100 mL) |
| 20 | 15 mL tubos de centrífuga estéril |
| 1 | 10 mL de pipeta sorológica estéril |
| 4 | 25 mL de pipeta sorológica estéril |
| 2 | Pipeta sorológica estéril de 50 mL |
| 1 | Cremalheira do tubo da centrífuga |
| 150 mL | Água DI estéril |
| 5 mg | Poly-D-lisina frasco |
Tabela 3: Preparação do Meio de Armazenamento - Lista de Materiais e Reagentes.
| Quantidade | Item |
| 44 mL | DMEM com uma forma estabilizada de L-glutamina (ver tabela de materiais) |
| 1 mL | Suplemento sem soro para cultura de células neurais (ver tabela de materiais) |
| 2,5 mL | Soro de cavalo |
| 100 μL | Ácido ascórbico [4 mg / mL] |
| 2,5 mL | O soro bovino fetal (FBS) |
| 0,5 mL | Pen strep (opcional) |
| 1 | 50 ml tubos de centrífuga estéril |
| 2 | 25 mL de pipeta sorológica estéril |
| 2 | 10 mL de pipeta sorológica estéril </ Td> |
| 2 | 1 mL de pipeta sorológica estéril |
| 1 | 250 mL de filtro |
Tabela 4: Preparação de Meio DMEM 5/5 - Lista de Materiais e Reagentes.
| Quantidade | Item |
| 49 mL | DMEM com uma forma estabilizada de L-glutamina (ver tabela de materiais) |
| 1 mL | Suplemento sem soro para cultura de células neurais (ver tabela de materiais) |
| 100 μL | Ácido ascórbico [4 mg / mL] |
| 0,5 mL | Pen strep (opcional) |
| 1 | 50 ml tubos de centrífuga estéril |
| 2 | 25 mL de pipeta sorológica estéril |
| 2 | 1 mL de pipeta sorológica estéril |
| 1 | 250 mL de filtro |
Tabela 5: Preparação de Meio DMEM + - Lista de Materiais e Reagentes.
| Quantidade | Item |
| 1 | Papaína 140 U / frasco |
| 1 | Dnase 1,260 U / vial |
| 7 mL | DMEM + (arrefecido) |
| 5 mL | DMEM 5/5 (aquecido) |
| 10 μL | Azul Trypan |
| 2 | Lâminas de escalpelo |
| 1 | Placa de Petri estéril de 35 mm |
| 4 | 15 mL tubos de centrífuga estéril |
| 2 | 5 mL de tubos criogênicos estéreis |
| 2 | 2 mL de tubos criogênicos estéreis |
| 1 | 50 ml tubos de centrífuga estéril |
| 1 | Tubo de microcentrífuga |
| 2 | Pipetas de transferência de grande diâmetro |
| 3 | Pipetas de transferência de pequeno calibre |
| 5 | 2 mL de pipeta sorológica estéril |
| 5 | 1 mL de pipeta sorológica estéril |
| 2 | 10 μL de pontas de micropipeta estéreis |
| 1 | 1000 μL de pontas de micropipeta estéreis |
| 1 | Hemocytometer chip |
Tabela 6: Dissocia�o de C�ulas - Lista de Materiais e Reagentes.
Discussion
As etapas descritas neste protocolo fornecem detalhes suficientes para que o iniciante aplique suas próprias culturas neuronais nos MEAs e registre a atividade da rede. Este protocolo ajudará a garantir que as culturas aderem adequadamente, formando uma camada de carpete de células sobre as matrizes de eletrodos, e permanecer saudável e livre de contaminantes por meses.
Embora seja melhor aderir a todas as partes do protocolo, existem etapas ao longo do processo que são fundamentais para o resultado bem sucedido. O uso de técnica asséptica ao longo de todo o processo é imperativo para evitar que as culturas se contaminem. Os novos MEAs devem ser hidrófilos, como descrito no protocolo, ou então resultará numa adesão celular fraca. Evitar pipetting áspero ea formação de bolhas de ar durante a dissociação reduzirá o número de pilhas danificadas chapeadas e conduzirá a um rendimento mais elevado e mais saudável. Comutação de DMEM 5/5 para DMEM + após a primeiraAlimentação também é importante. O DMEM 5/5 contém soro de cavalo, o que fará com que as células gliais dominem a cultura se usadas continuamente e resultarão em baixa atividade neuronal, embora as culturas pareçam saudáveis 17 . Alimentar as culturas conforme programado e mantê-las em condições de incubação adequadas também é crucial.
Plating culturas de células em MEAs envolve muitas variáveis que podem levar a menos do que os melhores resultados. Embora a meta seja um "tapete" perfeito de células, a incapacidade de resolver os passos críticos mencionados acima resultará em fraca maturação de células ou em contaminação. A baixa aderência celular, que é diferente da má maturação celular, também é uma preocupação. Isto pode ser causado por vários fatores, incluindo preparação de MEA pobres antes de chapeamento ou o uso de meio velho. Se um meio antigo contendo uma forma estabilizada de L-glutamina e um suplemento sem soro para cultura de células neurais (ver Tabela de Materiais), As células inicialmente aderem mas flutuam depois de cerca de duas semanas. Se a contaminação bacteriana é um problema persistente, um antibiótico, tal como ampicilina ou pen-strep, pode ser adicionado ao meio. Existem também fungicidas disponíveis para tratar a contaminação por fungos. Estas são algumas das variáveis mais comuns que podem afetar o resultado das culturas. Há muitos outros que só serão encontrados depois do tempo e da experiência.
Em comparação com o uso de microeletrodos de vidro, esta técnica é excelente para estudar dinâmica de rede e respostas farmacológicas. Permite o uso de muitos padrões de estimulação espaço-temporais diferentes e permite a gravação de respostas neuronais de múltiplas áreas ao mesmo tempo. Os grupos anteriores demonstraram resultados interessantes usando protocolos semelhantes aos aqui descritos 18 . Como as culturas duram por semanas ou meses e as mesmas culturas podem ser reutilizadas, esta técnicaPara várias experiências ao longo do tempo na mesma rede.
No entanto, existem limitações a esta técnica. Os MEAs não são invasivos. Portanto, eles só podem registrar atividade extracelular, em oposição ao patch-clamping ou gravação intracelular com pipetas. Além disso, uma vez que cada eléctrodo numa matriz é coberto por várias células, não é possível resolver a actividade de um único neurónio. Por outro lado, por serem culturas in vitro , não conseguem reproduzir integralmente as propriedades estruturais das redes no cérebro. Também, a actividade só pode ser registada durante menos de 30 min de cada vez sem algum mecanismo proporcionando uma atmosfera de CO 2 para as células manterem o seu equilíbrio de pH.
Uma vez que esta técnica é dominada, manipulações farmacológicas com ou sem estimulação elétrica podem ser exploradas. Novos protocolos para sondar a aprendizagem ea formação de memória em redes neuronais também podem ser projetados e testados, juntamente com pRotocolos para redes do hipocampo ou da medula espinhal. Protocolos para estimulação e treinamento de redes foram publicados anteriormente, e alguns deles foram desenvolvidos em protocolos in vivo , como a "adaptação seletiva" proposta por Eytan et al. 19 . Vários protocolos foram testados. No entanto, apenas os resultados de uma modificação do procedimento de tétano proposto por Ruaro em 2005 são apresentados aqui 14 , 20 .
Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pela National Science Foundation conceder CMMI-1300007. Gostaríamos de agradecer aos membros do laboratório anterior, que ajudaram com o desenho desses protocolos e com a manutenção das culturas por mais de cinco anos na Universidade George Mason: Dr. Joseph J. Pancrazio, Dr. Hamid Charkhkar, Dr. Gretchen Knaack , Dr. Franz Hamilton, Michael Maquera e Robert Graham.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ascorbic Acid | Sigma Aldrich | A4403 | Make 4 mg/mL aliquots |
| B-27 | Invitrogen | 17504-044 | Serum-free supplement for neural cell culture. Make 1 mL aliquots and freeze |
| Beakers - glass - 100 mL | VWR | 13912-160 | |
| Beakers - glass - 500 mL | VWR | 10754-956 | |
| Blunt-tipped thumb forceps | World Precision Instruments | 500365-G | |
| Cryogenic vial - sterile, 2 mL | Fisher Scientific | 10-500-26 | |
| Cryogenic vial - sterile, 5 mL | Fisher Scientific | 10-500-27 | |
| DMEM with Glutamax | Gibco Life Technology | 10569-010 | Cell culture media that contains a stabilized form of L-glutamine |
| DNase | Worthington Biochemical | LK003172 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | 04-355-451 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | ATCC | 30-2030 | |
| Fine-tipped thumb forceps | World Precision Instruments | 501324-G | |
| Glass Pipets | VWR | 14673-010 | |
| GlutaMAX -- I (100X) | Gibco Life Technology | 35050-061 | A stabilized form of L-glutamine used as a suplement |
| Hemocytometer chip | Fisher Scientific | 22-600-101 | |
| Hibernate EB complete | BrainBits | D00118 | Ambient CO2 cell storage media |
| Horse Serum | Atlanta Biologicals | S12195H | |
| Laminin | Sigma Aldrich | L2020-1MG | |
| MCS filter amplifier | MultiChannel System | FA60SBC | |
| MCS headstage/pre-amplifier | MultiChannel System | MEA1060-INV | |
| MCS microelectrode array | MultiChannel System | 60MEA200/10iR-ITO | |
| MCS power supply | MultiChannel System | PS20W | |
| MCS signal divider | MultiChannel System | SDMEA | |
| MCS stimulus generator | MultiChannel System | STG4002 | |
| MCS temperature controller | MultiChannel System | TC02 | |
| Media storage bottle - glass 500 mL | VWR | 10754-818 | Autoclave |
| Microcentrifuge tubes - 0.4 mL | Thermo Fisher | 3485 | Autoclave |
| Microcentrifuge tubes - 2 mL | Thermo Fisher | 3434ECONO | Autoclave |
| Micropipette tips - 10 μL | VWR | 37001-166 | Autoclave |
| Micropipette tips - 1,000 μL | VWR | 13503-464 | Autoclave |
| Micropipette tips - 200 μL | VWR | 37001-596 | Autoclave |
| Micropipetter - 10 μL | Thermo Fisher | 4641170N | |
| Micropipetter - 1,000 μL | Thermo Fisher | 4641210N | |
| Micropipetter - 200 μL | Thermo Fisher | 4641230N | |
| Papain - 0.22 Filtered | Worthington Biochemical | LK003178 | |
| Penicillin-Streptomycin (Pen Strep) | Thermo Fisher | 15070063 | |
| Petri dishes -100 mm disposable | Fisher Scientific | 08-757-100D | |
| Petri dishes -100 mm glass | VWR | 10754-788 | |
| Petri dishes -35 mm | Fisher Scientific | 08-757-100A | |
| Phosphate buffer saline (PBS) (1x) | Corning | 21-040-CV | |
| Plasma Cleaning System | Plasma Etch, Inc. | PE-50 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide (PDL) | Sigma Aldrich | P6407-5MG | |
| Polyethylene conical (centrifuge) tube -15 mL | Fisher Scientific | 05-527-90 | |
| Polypropylene conical (centrifuge) tube -50 mL | Falcon | 352070 | |
| Procedure masks | Imco | 1530-imc | |
| Pyruvate | Sigma Aldrich | P4562-5G | |
| Scalpel blades | World Precision Instruments | 500237-G | |
| Scissors - iris | World Precision Instruments | 14111-G | |
| Scissors - large | World Precision Instruments | 14214 | |
| Scissors - small surgical | World Precision Instruments | 501733-G | |
| Serological pipette - sterile, 1 mL | VWR | 89130-892 | |
| Serological pipette - sterile, 2 mL | VWR | 89130-894 | |
| Serological pipette - sterile, 25 mL | VWR | 89130-900 | |
| Serological pipette - sterile, 50 mL | VWR | 89130-902 | |
| Software: Matlab GUI | Peixoto Lab | npeixoto@gmu.edu | Used to analyze .mat files. Available for free upon request. Contact npeixoto@gmu.edu to request a copy. |
| Software: MCS MC_Rack | MultiChannel System | N/A | Used for data acquisition |
| Software: NeuroExplorer | Plexon | http://www.plexon.com/products/neuroexplorer | Used to convert .nex files to .mat |
| Software: Offline Sorter | Plexon | http://www.plexon.com/products/offline-sorter | Used to sort neural spikes and convert data files to .plx and then to .nex |
| Software Manual: MCS MC_Rack | MultiChannel System | https://www.multichannelsystems.com/sites/multichannelsystems.com/files/documents/manuals/MC_Rack_Manual.pdf | |
| Software Manual: NeuroExplorer | Plexon | https://www.neuroexplorer.com/downloads/Nex3Manual.pdf | |
| Software Manual: Offline Sorter | Plexon | www.plexon.com/system/files/downloads/Offline%20Sorter%20v2.8%20Manual.pdf | |
| Spatula - small double-ended | World Precision Instruments | 503440 | |
| Stericup 0.22 µm pore filter - 250 mL | Millipore | SCGVU02RE | |
| Transfer pipette - large bore | Thermo Fisher | 335-1S | |
| Transfer pipette - small bore | Thermo Fisher | 242-1S | |
| Trypan blue | Sigma Aldrich | T8154-20ML | |
| Whatman filter paper | Whatman | 1442 150 | Cut into 8 pie wedges and autoclave in a glass Petri dish |
References
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- Fröhlich, F., McCormick, D. A. Endogenous electric fields may guide neocortical network activity. Neuron. 67 (1), 129-143 (2010).
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