Dit werk beschrijft een geoptimaliseerd methyl-CpG-bindingsdomein (MBD) sequentieringsprotocol en een berekeningspijpleiding om differentieel gemethyleerde CpG-rijke regio's bij patiënten met chronische lymfocytische leukemie (CLL) te identificeren.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Omvattende DNA-methyleringsanalyse met gebruikmaking van een methyle-CpG-bindende domein-opnamebaseerde methode bij patiënten met chronische lymfocytische leukemie
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De rol van lange noncoding RNAs (lncRNAs) bij kanker komt naar voren als gevolg van de groeiende interesse in het begrijpen van hun mechanistische functies tijdens de ontwikkeling van kanker en progressie. Desondanks is de globale epigenetische regulering van lncRNAs en repetitieve sequenties bij kanker niet goed onderzocht, vooral bij chronische lymfocytische leukemie (CLL). Deze studie richt zich op een unieke aanpak: de immunoprecipitatie-gebaseerde opname van dubbelstrengige, gemetileerde DNA-fragmenten met behulp van methyl-bindende domein (MBD) eiwitten, gevolgd door volgende generatie sequencing (MBD-seq). CLL patiëntenmonsters die behoren tot twee prognostische subgroepen (5 IGVH gemuteerde monsters + 5 IGVH niet gemuteerde monsters) werden in deze studie gebruikt. Analyse onthulde 5.800 hypermethylated en 12,570 hypomethylated CLL-specifieke differentieel gemethyleerde genen (cllDMGs) in vergelijking met normale gezonde controles. Het is belangrijk dat deze resultaten verschillende CLL-specifieke, differentieel gemethyleerde lncRNAs, opnieuw identificerenPetitieve elementen, en proteïne-coderende genen met potentiële prognostische waarde. In dit werk wordt een gedetailleerd protocol beschreven voor een MBD-SEQ en bioinformatica pijpleiding die is ontwikkeld voor de uitgebreide analyse van globale methylatie profielen in zeer CpG rijke regio's met behulp van CLL patiëntenmonsters. Tenslotte werden een proteïne coderend gen en een lncRNA gevalideerd met behulp van pyrosequencing, welke een zeer kwantitatieve methode is om CpG methyleringsniveaus te analyseren om de bevindingen verder te bevestigen uit het MBD-seq protocol.
Inleiding
Het gebruik van volgende generatie sequencing technieken om globale DNA-methylering profielen te analyseren is in de afgelopen jaren steeds populairder geworden. Genoom-brede methyleringsbepalingen, met inbegrip van microarray- en niet-microarray gebaseerde methoden, werden ontwikkeld op basis van het volgende: de bisulfietomzetting van genomisch DNA, methylatiegevoelige restrictie-enzymverdigingen en de immunoprecipitatie van gemethyleerd DNA onder gebruikmaking van methyl-CpG-specifieke antilichamen .
Aberrant DNA methylering is een van de kenmerken van leukemie en lymfomen, waaronder chronische lymfocytische leukemie (CLL). Vroeger heb....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
De ethische goedkeuring voor het verzamelen van de CLL-monsters is vanaf 2007-05-21, met het volgende registratienummer: EPN Gbg dnr 239/07. Alle CLL patiënten werden gediagnosticeerd volgens recentelijk gewijzigde criteria 8 , en de monsters werden verzameld op het moment van diagnose. De patiënten in de studie werden opgenomen uit verschillende hematologieafdelingen in het westelijke deel van Zweden na schriftelijke toestemming. Alleen in deze studie werden alleen monsters van CLL perifere bloedmononucleaire cellen (PBMC) met een tumorpercentage leukemic cellen ≥70% geselecteerd.
1. Voorbereidingen
- Iso....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
MBD-seq werd recentelijk uitgevoerd op CLL-patiënten en gecombineerde, normale, gezonde controles om CLL-specifieke differentieel hyper- en hypomethyleerde genen te identificeren 7 . De experimentele en bioinformatische pijpleiding die wordt gebruikt voor het analyseren van de gegevens die worden gegenereerd uit CLL en normale gezonde monsters, worden getoond in Figuur 1A en 1B . Deze analyses identificeerden verschil.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
MBD-seq is een kosteneffectieve, immunoprecipitatie-gebaseerde techniek die gebruikt kan worden om methylatiepatronen te bestuderen met volledige genoombrede dekking. Zowel MeDIP seq (methylated DNA immunoprecipitatie gevolgd door sequencing) en MBD-seq resulteren in de verrijking van CpG-rich methylated DNA. MBD-SEQ toont echter meer affiniteit naar binding aan zeer CpG-rijke gebieden wanneer vergeleken met MeDIP SEQ 19 . Met behulp van een methylbindende verrijkingskit kan men het DNA fractione.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Deze studie werd ondersteund door de Zweedse Onderzoeksraad, de Zweedse Kankervereniging, de Knut en Alice Wallenberg Stichting (KAW), en de Rekenkamer VästraGötalandsregionen.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Dneasy Blood and tissue kit | Qaigen | 69504 | |
| Lymphoprep solution | A X I S-S H I E L D | 1114544 | |
| Nano drop 2000 | Thermo Fischersceintific | ||
| TE buffer pH 8 | Sigma aldrich | 93283 | |
| Bioruptor standard sonication device | Diagenode | UCD-200 | |
| TPX bioruptor tubes 1.5 mL | Diagenode | C30010010-300 | |
| 3 M Sodium acetate | Diagenode | C03030002 | |
| E-gel iBase safe imager combo kit | Thermo Fischersceintific | G6465EU | |
| E-gel 2% Agarose gels | Thermo Fischersceintific | G441002 | |
| Methylminer Methylated DNA enrichment kit | Thermo Fischersceintific | ME10025 | |
| Labquake Tube Shaker/Rotators | Thermo Fischersceintific | 415110 | |
| Dynal MPC-S | Thermo Fischersceintific | A13346 | |
| Vortex mixer | VWR | 12620-848 | |
| Absolute Ethanol | Any company | ||
| 70% Ethanool | Any company | ||
| DNAse free water | Milli Q | ||
| DNA precipitant (3M sodium acetate) | Diagenode | C03030002 | |
| Safe seal 1.5 mL eppendorf tubes | Eppendorf | 4036-3204 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fischersceintific | Q32851 | |
| Qubit 0.5 mL tubes | Thermo Fischersceintific | Q32856 | |
| Qubit | Thermo Fischersceintific | Q32866 | |
| Illumina Hiseq2000 Platform | Illumina | ||
| Water Bath | Grant | ||
| Heat block | grant | ||
| Tube rotater | Labquake |
Referenties
- Kanduri, M., et al. Differential genome-wide array-based methylation profiles in prognostic subsets of chronic lymphocytic leukemia. Blood. 115 (2), 296-305 (2010).
- Cahill, N., et al.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
