Summary
Dit werk beschrijft een geoptimaliseerd methyl-CpG-bindingsdomein (MBD) sequentieringsprotocol en een berekeningspijpleiding om differentieel gemethyleerde CpG-rijke regio's bij patiënten met chronische lymfocytische leukemie (CLL) te identificeren.
Abstract
De rol van lange noncoding RNAs (lncRNAs) bij kanker komt naar voren als gevolg van de groeiende interesse in het begrijpen van hun mechanistische functies tijdens de ontwikkeling van kanker en progressie. Desondanks is de globale epigenetische regulering van lncRNAs en repetitieve sequenties bij kanker niet goed onderzocht, vooral bij chronische lymfocytische leukemie (CLL). Deze studie richt zich op een unieke aanpak: de immunoprecipitatie-gebaseerde opname van dubbelstrengige, gemetileerde DNA-fragmenten met behulp van methyl-bindende domein (MBD) eiwitten, gevolgd door volgende generatie sequencing (MBD-seq). CLL patiëntenmonsters die behoren tot twee prognostische subgroepen (5 IGVH gemuteerde monsters + 5 IGVH niet gemuteerde monsters) werden in deze studie gebruikt. Analyse onthulde 5.800 hypermethylated en 12,570 hypomethylated CLL-specifieke differentieel gemethyleerde genen (cllDMGs) in vergelijking met normale gezonde controles. Het is belangrijk dat deze resultaten verschillende CLL-specifieke, differentieel gemethyleerde lncRNAs, opnieuw identificerenPetitieve elementen, en proteïne-coderende genen met potentiële prognostische waarde. In dit werk wordt een gedetailleerd protocol beschreven voor een MBD-SEQ en bioinformatica pijpleiding die is ontwikkeld voor de uitgebreide analyse van globale methylatie profielen in zeer CpG rijke regio's met behulp van CLL patiëntenmonsters. Tenslotte werden een proteïne coderend gen en een lncRNA gevalideerd met behulp van pyrosequencing, welke een zeer kwantitatieve methode is om CpG methyleringsniveaus te analyseren om de bevindingen verder te bevestigen uit het MBD-seq protocol.
Introduction
Het gebruik van volgende generatie sequencing technieken om globale DNA-methylering profielen te analyseren is in de afgelopen jaren steeds populairder geworden. Genoom-brede methyleringsbepalingen, met inbegrip van microarray- en niet-microarray gebaseerde methoden, werden ontwikkeld op basis van het volgende: de bisulfietomzetting van genomisch DNA, methylatiegevoelige restrictie-enzymverdigingen en de immunoprecipitatie van gemethyleerd DNA onder gebruikmaking van methyl-CpG-specifieke antilichamen .
Aberrant DNA methylering is een van de kenmerken van leukemie en lymfomen, waaronder chronische lymfocytische leukemie (CLL). Vroeger hebben verschillende groepen, waaronder onze, de DNA-methyleringsprofielen van verschillende CLL-prognostische subgroepen en normale, gezonde B-celcontroles gekenmerkt door gebruik te maken van de bisulfietomzetting van genomisch DNA, gevolgd door micro-array-gebaseerde methoden of sequentiebepaling van het genoom-genoom 1 , 2 , 3 , <Sup class = "xref"> 4. De bisulfietomzetting van genomisch DNA leidt tot de deaminatie van ongewijzigde cytosinen naar uracil, waardoor de gemodificeerde methylated cytosines in het genoom verlaten worden. Zodra geconverteerd kan de methyleringsstatus van het DNA bepaald worden door PCR amplificatie en sequentiebepaling onder toepassing van verschillende kwantitatieve of kwalitatieve methoden, zoals micro-array-gebaseerde of full-genome bisulfiet sequencing (WGBS). Hoewel bisulfietomzetting gebaseerde methoden veel voordelen hebben en veel gebruikt worden in verschillende kankersoorten om DNA-methyleringsniveaus te analyseren, zijn er een paar nadelen verbonden aan deze techniek. WGBS sequencing maakt het mogelijk om single-base pair resolutie met lagere hoeveelheden DNA en is de beste geschikte optie voor het analyseren van een groot aantal monsters. Echter, deze methode slaat er niet in om de wijzigingen tussen de 5 mC en 5 hmC niveaus in het genoom 5 , 6 te differentiëren. Bovendien bieden microarray-gebaseerde methoden geen complete cOverage van het genoom.
In een recente studie uit ons laboratorium 7 werden immunoprecipitatie gebaseerde methoden, in plaats van bisulfietomzetting, gebruikt om zeer CpG-rijke, differentieel gemetileerde regio's op wereldwijde schaal te identificeren bij CLL-patiënten en normale gezonde controles. Inmethyl-CpG-bindende domein (MBD) sequentiebepaling van volgende generatie (MBD-seq), is de verrijking van dubbelstrengs gefragmenteerd DNA afhankelijk van de mate van CpG-methylering. Deze methode kan de nadelen van de bisulfietomzettingsmethode overwinnen en kan ook genoom-brede dekking van CpG-methylering op een onbevooroordeelde en PCR-onafhankelijke wijze verschaffen. Bovendien kan MBD-seq, in tegenstelling tot bisulfietomzettingsgebaseerde microarraymethoden, worden gebruikt om de methyleringsstatus van herhalende elementen te analyseren, zoals langdurige kernelementen (LINE's), korte interversionele kernelementen (SINE's), lange terminale herhalingen (LTRS), Enz . In vergelijking met bisulfietomzettingsmethoden,Een MBD-seq protocol vereist een relatief grote hoeveelheid input DNA. Ook leest de kwaliteit van de sequentie en de gegevens zijn afhankelijk van de specificiteit, affiniteit en kwaliteit van de gebruikte antilichamen.
De huidige studie legt een gedetailleerd MBD-seq protocol uit om methylated DNA te verrijken voor de volgende generatie sequencing. Het gebruikt een commerciële methylated DNA binding verrijkingskit (vermeld in de Material Table ), evenals een berekeningspijpleiding om de methylering sequencing data te visualiseren en te interpreteren om CLL-specifieke hyper- en hypomethylated gebieden te identificeren in vergelijking met normale gezonde controles. In principe maakt deze methode gebruik van het vermogen van de MBD van de menselijke MBD2-eiwitinteractie met gemethyleerde CpG's om DNA te verrijken verrijkt met gemethyleerde CpG's, en dit wordt gevolgd door de high-throughput sequencing van gemethyleerd DNA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De ethische goedkeuring voor het verzamelen van de CLL-monsters is vanaf 2007-05-21, met het volgende registratienummer: EPN Gbg dnr 239/07. Alle CLL patiënten werden gediagnosticeerd volgens recentelijk gewijzigde criteria 8 , en de monsters werden verzameld op het moment van diagnose. De patiënten in de studie werden opgenomen uit verschillende hematologieafdelingen in het westelijke deel van Zweden na schriftelijke toestemming. Alleen in deze studie werden alleen monsters van CLL perifere bloedmononucleaire cellen (PBMC) met een tumorpercentage leukemic cellen ≥70% geselecteerd.
1. Voorbereidingen
- Isolate PBMC's voor DNA-extracties van CLL en normale, gezonde perifere bloedmonsters met behulp van een commerciële isolatie kit (zie de Material Table ), volgens de instructies van de fabrikant.
- Autoclaaf 1,5 ml buizen. Doe alle reagentia op in de methylated DNA binding kit (zie de Material Table )/ Li>
- Gebruik DNase-vrij water om 10 ml 1x kraalwasbuffer te bereiden uit de 5x voorraadwasbuffer die door de kit wordt geleverd om kralen te wassen en het MBD-eiwit dat door de kit wordt geleverd te verdunnen.
- Verkrijg of berei de volgende voorwerpen vooraf op: 3 M natriumacetaat, absolute ethanol en 70% ethanol voor DNA neerslag ( Material Table ).
2. Genomische DNA-extractie en sonicatie
- Gebruik een commercieel verkrijgbare DNA-extractie kit ( Material Table ) om genomisch DNA van patiënt- en normale PBMC-monsters te isoleren volgens het protocol van de fabrikant. Kwantificeer het genomische DNA met behulp van een spectrofotometer bij 260 nm.
OPMERKING: De capaciteit van de extractiekolom van DNA is 5-6 miljoen cellen, maximum; Daarom is het belangrijk om meer dan één kolom te gebruiken voor monsters met meer dan 5 miljoen cellen. Verwijder het DNA tweemaal in gelijke volumes in totaal 100 μl 10 mM Tris EDTA (TE) buffer. Het MBD-biotine-eiwit dat in het methyl wordt gebruiktMineraal kit voor MBD sequencing zal niet binden aan enkelstrengs DNA. Zo is het zeer belangrijk om het geëlueerde DNA te bevriezen ofwel bevroren of bij 4 ° C om zijn dubbelstrengs natuur te behouden. - Verdun 5 μg genomisch DNA van elk monster tot in totaal 200 μl met gebruikmaking van TE-buffer (pH 8), waarbij een eindconcentratie van 25 ng / μl wordt verkregen.
- Doe sonicatie in speciaal ontworpen buizen met een sonicator ( Materialetafel ) gedurende een totaal van 30 cycli (30 s aan en 30 s per cyclus; draai om elke 5 cycli de buizen kort om de monsters op de bodem te verzamelen).
OPMERKING: Dit zal gefragmenteerd DNA produceren tussen 150 bp en 300 bp, wat optimaal is voor dit protocol. - Controleer het sonicatiebereik voor alle monsters voordat u verder gaat naar de volgende stap van MBD-sequencing door 1 μl van de gefragmenteerde DNA-monsters en een DNA-grootte ladder op een in de handel verkrijgbare pre-cast 2% agarosegel te gebruiken met behulp van DNA-elektroforese-beeldapparatuur. Visualiseer tHij DNA met behulp van een standaard UV transilluminator.
3. Voorbereiding van kraal voorafgaand aan binding met MBD-biotineproteïne
- Resuspendeer de magnetische streptavidine kralen uit de voorraadbuis die door de kit wordt geleverd, voorzichtig pipetteren omhoog en omlaag om een homogene suspensie te verkrijgen. Vortex de kralen niet of laat ze drogen.
- Plaats 50 μl kralen (voor elk 5 μg gefragmenteerd DNA-monster) in afzonderlijke, schone en gelabelde 1,5 ml buizen. Voeg 50 μl 1x kraalwasbuffer toe om het uiteindelijke volume van 100 μl te bereiken.
OPMERKING: Bij gebruik van kleine 0,5 ml polymerase kettingreactie (PCR) strips voor het wassen van kralen wordt ongeveer 150-200 μL wasbuffer per buis gebruikt, zoals vermeld in het kit protocol. In het geval van 1,5 ml buizen, dient echter ten minste 250 μL tot 300 μL wasbuffer per buis te worden toegevoegd voor de kraalwas. - Plaats de buizen op een magnetische stand voor een minuut om alle magnetische kralen te concentreren op de binnenwand van de buisNaar de magneet gericht. Verwijder de vloeistof, zonder de kralen aan te raken, met een 200 μL pipet.
- Verwijder de buizen uit de magnetische stand, voeg 250 μL 1x kraalwasbuffer toe en meng de kralen voorzichtig met een pipet.
- Herhaal stappen 3.3 en 3.4 minstens 4-5 keer voor alle monsters en eindig opnieuw in 250 μl 1x kraalwasbuffer. Houd ze op ijs.
4. Binding van het MBD-biotineproteïne aan de gewassen kralen
- Voeg 35 μl MBD-eiwit (7 μL voor 1 μg DNA-monster) toe om buizen te scheiden en breng het totale volume tot 250 μl door gebruik te maken van 1x kraalwasbuffer.
- Voeg 250 μl verdund MBD-eiwit toe aan de 250 μl gewassen kralen en laat deze gedurende 1 uur op de rotatie van de eind-tot-einde draaien.
- Na het mengen van de kralen en eiwit gedurende 1 uur was de MBD-eiwitbiotine gebonden met magnetische streptavidine kralen.
- Plaats de buizen op de magnetische stand gedurende 1 minuut en verwijder tHij vloeibaar zonder de kralen aan te raken met een pipet. Voeg 250 μL 1x kraalwasbuffer toe en plaats de buizen op een rotatiemenger gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Herhaal stap 4.3.1 nog twee keer en laat de gewasde MBD-biotine-kralen eindelijk opnieuw opruimen in 200 μl 1x kraalwasbuffer, waardoor de kralen klaar zijn voor methylated DNA capture.
OPMERKING: Wassen 2-3 keer op deze manier verwijdert alle achtergrondgebonden niet-gebonden MBD-eiwitkrullen en verbetert de efficiënte binding van MBD-eiwitgekoppelde kralen met gefragmenteerd genomisch DNA.
5. Bindende MBD-biotine Kralen Met Gefragmenteerd Genomisch DNA
- Voeg in een schone 1,5 ml DNase-vrije buis 100 μL 5x kraalwasbuffer en 180 μl van het gefragmenteerde genomische DNA (stap 2.3) toe. Breng het uiteindelijke volume tot 500 μl met behulp van vrij water van DNase.
- Voeg 380 μL DNase-vrij water toe aan de resterende 20 μl van het gefragmenteerde genomische DNA en vries ze. Gebruik deze monsters als input DNEen controle en ze later samen met de uiteindelijke geëlueerde gemethyleerde DNA monsters (zie stap 7.1).
- Plaats de buizen met gewassen MBD-biotine kralen (stap 4.4) op een magnetische stand gedurende 1 minuut en verwijder de vloeistof zonder de kralen te storen. Voeg 500 μl gefragmenteerd genomisch DNA, verdund in kraalwasbuffer toe.
- Zet alle buizen stevig dicht met de paraffinefilm en laat ze overnacht bij 4 ° C op een rotatiestand van 10 tot 10 minuten bij 8-10 rpm.
OPMERKING: De DNA- en biotin-kraalbindingsreactie kan gedurende 1 uur bij kamertemperatuur worden uitgevoerd, maar het verlaten van de nacht bij 4 ° C kan het herstel van het uiteindelijke gemethyliseerde DNA verbeteren.
6. Verwijder het onbonden DNA en verwijder het gemetileerde DNA uit de kralen
- Na de DNA- en MBD-kraalbindingsreactie, plaats de buizen op het magnetische rek gedurende 1 minuut om alle kralen op de binnenwand van de buis te concentreren.
- Verwijder de supernatant vloeistof met een pipet zonder aan te rakenDe kralen en sla deze ongebonden DNA-monsterfractie op ijs op.
- Voeg 200 μL 1x kraalwasbuffer toe aan de kralen en plaats de buizen op de roterende stand gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur. Plaats de buizen op de magnetische stand en verwijder de vloeistof. Herhaal de was nog twee keer om het resterende ongebonden DNA te verwijderen.
- Na de laatste was, voeg 200 μl hoge zout elueringsbuffer (2000 mM NaCl) toe, die in de kit wordt geleverd om het DNA te elueren.
- Plaats de buizen op de roterende stand gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Plaats ze op de magnetische stand gedurende 1 minuut en gebruik een pipet om de supernatant zorgvuldig over te brengen naar een nieuwe, schone 1,5 ml buis.
- Voeg 200 μl hoge zout elueringsbuffer toe en herhaal de elutie door de buizen bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten te roteren. Voeg de tweede elute toe aan dezelfde buis die de 200 μl van de eerste elut bevat.
OPMERKING: De uiteindelijke 400 μL totaal geëlueerd DNA is nu klaar voor ethanol precipitatie om de gezuiverde extract te extraherenDNA geschikt voor sequentiebepaling van de volgende generatie.
7. Ethanol Precipitatie en verrijking van gemethylated DNA
- Voeg 1 μL glycogeen toe (20 μg / μL; inbegrepen in de kit); 40 μl 3 M natriumacetaat, pH 5,2; En 800 μL ijskoud absolute ethanol tot 400 μl geëlueerd DNA en ook aan de 400 μl input DNA-monsters bereid in stap 5.2.
- Meng de buizen goed door vortexen en incubeer hen bij -80 ° C overnacht.
- Centrifugeer de buizen bij 12.000 xg (maximale snelheid) en 4 ° C. Gooi de supernatant voorzichtig uit, zonder de pellet te storen, voeg 500 μL 70% ethanol toe en draai de buizen om.
- Centrifugeer opnieuw bij maximale snelheid gedurende 15 minuten bij 4 ° C en verwijder het supernatant met een pipet zorgvuldig. Centrifugeer de buizen bij maximale snelheid gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur en verwijder de resterende ethanol volledig met een pipetpunt.
- Luchtdroog de pellet gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Voeg 10 μL DNase-vrij water toe aan de DNA-pellet. Ga verder naar de methylated DNA kwantificering (stap 7.6), MBD sequencing (stap 7.7) en analyse (secties 8 en 9).
- Kwantificeer de uiteindelijke herstelde gemethyleerde DNA-monsters met behulp van een in de handel verkrijgbare fluorometrische kwantitatieve kit (zie de Materialtabel ) volgens de instructies van de fabrikant.
- Opmerking: Met dit protocol werd 30-50 ng definitief DNA van elk monster hersteld. DNA monsters zijn klaar om op droogijs te sturen voor downstream bibliotheekconstructie en high-throughput MBD sequencing
- Voer DNA-bibliotheekconstructie en high-throughput MBD-sequencing uit met een commercieel platform ( Material Table ), zoals beschreven in referentie 9 .
OPMERKING: Voor de initiële kwaliteitscontrole van het uiteindelijke gemethyleerde DNA, voer bibliotheekpreparaten uit met behulp van 50-bp pair-end sequencing voor alle monsters. Bewerk de ruwe gegevens voor kwaliteitscontrole na sequencing, aS uitgewerkt in stap 8.1, en verder verwerken met behulp van bioinformatica benaderingen en statistische methoden, zoals hieronder beschreven (stappen 8.2-9.6).
8. Bioinformatica Analyse Methode 1: Identificatie van CLL-geassocieerde Differentieel Gemethylde Regio's (cllDMRs)
- Reinig de verkregen 49-bp leest (FASTQ formaat) voor adapters met behulp van beschikbare kwaliteitscontrole tools, zoals Trimmomatic 10 of Cutadapt. Crosscheck de kwaliteit van de getrimde leest met behulp van de FastQC toolkit:
Java -jar trimmomatic.jar SE SAMPLE_uncleaned.fastq SAMPLE.fastq ILLUMINACLIP: adapters.fasta: 2: 30: 10 - Zet de gereinigde FASTQ-bestanden uit met de korte-lees-genoom-aligner Bowtie tegen een referentie genoom 11 . Geef de parameters hieronder op:
- Toestaan maximaal twee mismatches (Bowtie parameter: -v 2).
- Beperk de rapportage aan de zes beste uitlijningen per gelezen (Bowtie parameter: -m 6) om te controlerenVoor multi-mapping leest.
Bowtie -v 2 -a -m 6 HG19_INDEX -S SAMPLE.fastq> SAMPLE.sam
OPMERKING: Omzetten van de SAM-bestanden die zijn gegenereerd voor individuele monsters na uitlijning in BAM met behulp van SAMtools.
Samtools view -bS -o SAMPLE.bam SAMPLE.sam
- Gebruik de model gebaseerde analyse van ChIP-Seq (MACS) piek beller op uitgelijnde monsters (BAM) om verrijkte / methylated gebieden te voorspellen uit de CLL subgroepen 12 .
OPMERKING: Vergelijking I: Gebruik de Input-sample als de controlegroep en zowel de normale als de CLL-patiëntmonsters als behandelingsgroepen. Deze stap is om alle negatieve pieken te verzamelen (pieken verrijkt in Input / Background). Vergelijking II: Gebruik de Normale steekproefgroep als de controlegroep en de CLL-patiëntmonstergroep als de behandelingsgroep. Verkregen positieve pieken zijn CLL-hyper-gemetileerde gebieden, en negatieve pieken zijn CLL-hypomethyleerde gebieden boven normale of differentieel gemetileerde gebieden (DMR's).
macs14-t SAMPLE_TREATMENT.bam -c SAMPLE_CONTROL.bam --format BAM -g hs - Verwijder vergelijking I achtergrond pieken uit differentieel gemetificeerde gebieden (DMR's) met behulp van BEDtools 13 .
Bedtools trekken -a <CLL_enriched_regions> -b <Input_enriched_regions> - Voorspel het percentage herhaalelementen (SINE-Alu, LINE, enz. ) Verrijkt in DMR's.
- Gebruik fastacmd om de FASTA sequentie van DMR's te extraheren door de chromosomale coördinaten van referentiegenoom HG19.
Fastacmd -d HG19_genome.fa -s Chromosoom -L Begin, Eind -l 50000> DMRs.fasta - Gebruik het commando-gereedschap RepeatMasker om het percentage herhaalelementen dat aanwezig is in de FASTA-volgorde van DMR's te voorspellen.
RepeatMasker -gc -gccalc -s -species human -html DMRs.fasta
- Gebruik fastacmd om de FASTA sequentie van DMR's te extraheren door de chromosomale coördinaten van referentiegenoom HG19.
- Annotate de voorspelde DMR's met Homer "annotatePeaks.pl" met het beschikbare Ensembl [PMC4919035] oR Gencode [PMID 22955987] transcript annotatie (proteïne-codering en noncoding transcripten).
AnnotatePeaks.pl DMRs.bed <GENOME> -gtf <Ensembl of Gencode GTF>
OPMERKING: Dit geeft informatie over de verdeling van pieken over verschillende genische gebieden (bijvoorbeeld promotor, exon, intron, 3 'UTR's en 5' UTR's) en intergenische gebieden. Transcripties of genen die verband houden met DMR's worden differentieel gemetyleerde genen (DMG's) genoemd. - Gebruik het verrijkingsgereedschap met de bijgewerkte of huidige functionele database om functies te verrijken die worden verrijkt door CLL DMG's (alleen eiwitcoderende genen) 14 .
OPMERKING: Gene Set Clustering gebaseerd op Functionele Annotatie (GeneSCF) 14 is een real-time-based tool voor functionele verrijking analyse die gebruik maakt van geupdate KEGG en Gene Ontology als referentie database.
9. Bioinformatica Analyse Methode 2: Het identificeren van CLL-geassocieerde significant verschilMethylated Regions (cll sigDMR's)
- Volg de stappen 8.1-8.5 van methode I (sectie 8) en gebruik de differentiaalverrijkingsanalyse op basis van read-count-analyse door gebruik te maken van de beschikbare tools, zoals beschreven in stappen 9.2 - 9.6, om nog een niveau van statistieken toe te voegen aan de analysepijpleiding.
- Kwantificeer het aantal lezingen die zijn toegewezen aan individuele pieken of DMR's in Normale en CLL patiëntmonsters met behulp van "featureCounts" in het "Subread" pakket 15 .
Subread / bin / featureCounts -Q 30 -F SAF -a DMRs.SAF -o DMRs_counts.table SAMPLE_TREATMENT.bam SAMPLE_CONTROL.bam
OPMERKING: een kwaliteitsfilter kan worden geïntroduceerd om kwantificering van slechte kwaliteit lezingen te vermijden ( bijv. -Q 30). Voor deze stap, maak SAF-bestanden voor de verkregen DMR's op. Voor meer informatie over het SAF-bestandsformaat, gebruik deze link http://bioinf.wehi.edu.au/featureCounts/. - Gebruik een RAW-read-count tabel met het aantal lezingen voor de afzonderlijke pieken in Normal anD CLL patiëntmonstergroepen in randR als ingang 16 .
OPMERKING: Vergelijk de normale versus CLL patiëntmonstergroepen om sigDMRs te vinden. Voor differentiële verrijking analyse, volg de gids van edgeR voor gedetailleerde stap-voor-stap instructies (https://bioconductor.org/packages/release/bioc/vignettes/edgeR/inst/doc/edgeRUsersGuide.pdf). - Filter de sigDMR's met behulp van de FDR (false detection rate) en de log-fold-verandering die wordt voorspeld door edgeR 16 .
- Annotate de voorspelde sigDMR's met Homer "annotatePeaks.pl" met de beschikbare annotatie Ensembl of Gencode transcriptie (proteïne-codering en noncoding transcripts).
AnnotatePeaks.pl sigDMRs.bed HG19_genome.fa -gtf <Ensembl of Gencode GTF> -CpG
OPMERKING: Dit geeft informatie over de verdeling van pieken over verschillende genische gebieden (bijvoorbeeld promotor, exon, intron, 3 'UTR's en 5' UTR's) en intergenische gebieden. Transcripties of genen geassocieerd met siGDMRs heet sigDMGs. - Gebruik een verrijking tool met de bijgewerkte of huidige functionele database om functies te verrijken die worden verrijkt door CLL sigDMGs (alleen proteïne-coderende genen) 14 .
OPMERKING: GeneSCF, een van de real-time tools voor functionele verrijking analyse, gebruikt KEGG en Gene Ontology als referentie databases.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
MBD-seq werd recentelijk uitgevoerd op CLL-patiënten en gecombineerde, normale, gezonde controles om CLL-specifieke differentieel hyper- en hypomethyleerde genen te identificeren 7 . De experimentele en bioinformatische pijpleiding die wordt gebruikt voor het analyseren van de gegevens die worden gegenereerd uit CLL en normale gezonde monsters, worden getoond in Figuur 1A en 1B . Deze analyses identificeerden verschillende CLL-specifieke differentieel gemethyleerde gebieden (cllDMRs), die significant waren van hyper / hypomethylated van IGHV-gemuteerde en IGHV-niet gemuteerde monsters in vergelijking met controlemonsters, met een p-waarde <0.00001. Figuur 2A toont alle cllDMRs verkregen uit zowel normale B-cel als normale PMBC vergelijkingen. Alle cllDMR's werden toegewezen aan verschillende klassen van proteïne-coderende en niet-coderende genen, zoals getoond in Figuur 2B . Belangrijk, in deze analyse waren de vergelijkingen perforMede onafhankelijk tussen de CLL patiëntenmonsters, met twee verschillende normale controles, gesorteerd B-cel en PMBCs. Interessant genoeg leidde de analyse tot een grote overlap van gemeenschappelijke CLL-specifieke differentieel gemetyleerde genen (cllDMGs, 851 hypermethylated en 2,061 hypomethylated) in vergelijking met normale B-celcontrole en normale PBMC controle monsters ( Figuur 2C ), wat suggereert dat deze cllDMGs kunnen zijn Mogelijke CLL-signatuurgenen met significante rollen bij ziektepatogenese. Om de geanalyseerde data te versterken werden meerdere CpG-sites in een hypermethylated eiwit coderend gen, SKOR1 en één hypomethylated lang niet-coderende lncRNA, AC012065.7 , gevalideerd met behulp van een pyrosequencing methode, zoals beschreven in eerdere publicaties 7 , 17 , 18 ( Figuur 3A En B ). Figuur 4 toont gesneden DNANa het sonicatieprotocol. Het gefragmenteerde DNA varieert tussen 150 en 300 bp, waardoor het ideaal is voor sequencing doeleinden.
Figuur 1: Overzicht van de werkstroom die in deze studie wordt gebruikt. Dit cijfer, verkregen uit onze recente publicatie 7 , toont het ontwerp van de algehele analyse die wordt gebruikt om de differentieel gemetileerde gebieden (DMR's) in patiëntenmonsters met chronische lymfocytische leukemie (CLL) te identificeren. (A) Experimenteel ontwerp van de MBD-gebaseerde verrijking van gemethyleerd DNA. ( B ) De bioinformatica analyse pijpleiding gebruikte CLL-specifieke differentieel gemetileerde gebieden (cllDMRs) te identificeren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Hypermethylated en Hypomethylated cllDMRs en cllDMGs van CLL Patient Monsters In vergelijking met normale, gezonde, gesorteerd B cellen 7 . (A) Alle chronische lymfocytische leukemie (CLL) -associeerde differentieel gemetileerde gebieden met significante p-waarden (<0.00001) verkregen uit het vergelijken van de IGHV gemuteerde en-gemuteerde CLL monsters naar normaal gesorteerd B cellen (bovenpaneel) en normale PBMC monsters (Onderste paneel). De verrijking die in de heatmap is getoond, bevinden zich binnen een ± 3 kb venster uit differentieel gemetileerde regio (DMR's). ( B ) Venn diagram dat de overlap van CLL-specifieke differentieel gemethyleerde genen (cllDMGs, hypermethylated en hypomethylated) tussen IGHV-gemuteerde en IGHV-niet gemuteerde groepen toont. De taartdiagram staat voor het percentage genen die behoren tot verschillende classificatie, zoals eiwitcodering, Lang niet-coderend RNA (lncRNA), pseudogenen, antisense en andere niet-coderende RNA's. ( C ) Venn diagram dat de overlapping van gemeenschappelijke differentieel gemetileerde genen (IGHV-gemuteerde en IGHV-ongemuteerde prognostische groepen) tussen B-cel en PBMC vergelijkingen toont. Het linker paneel van het Venn-diagram toont de overlap voor hypermethylated genen en het rechter paneel voor hypomethylated genen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Validatie van de DNA Methylation Status voor Individuele CpG Sites op de Geselecteerde Significantly Differentially Methylated Target Genes. Pyrosquencinggegevens voor de kwantificering van het percentage DNA-methylering voor twee geselecteerde genen onder toepassing van een onafhankelijke chronische lymfocyteIc leukemie (CLL) monster cohort die 54 monsters bevat en 6 normale, gezonde, leeftijdsmatchende B-celmonsters. ( A ) De doosplots vertegenwoordigen het percentage methyleringsniveaus voor 3 afzonderlijke CpG-plaatsen van het hypermethylated SKOR1- gen met behulp van pyrosequencing. ( B ) De boxplot toont de mate van methylering voor 5 afzonderlijke CpG-plaatsen van hypomethylated AC012065.7- gen met pyrosequencing. De vakken geven het interkwartielbereik aan (25-75%), terwijl de binnenste horizontale lijn de gemiddelde waarde aangeeft. De whiskers vertegenwoordigen de minimum- en maximumwaarden. De p-waarde die overeenkomt met de mate van differentiële methylering van CLL-monsters over normale B-cellen, worden in de doosplots voor elke afzonderlijke CpG-plaats getoond. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
MBD-seq is een kosteneffectieve, immunoprecipitatie-gebaseerde techniek die gebruikt kan worden om methylatiepatronen te bestuderen met volledige genoombrede dekking. Zowel MeDIP seq (methylated DNA immunoprecipitatie gevolgd door sequencing) en MBD-seq resulteren in de verrijking van CpG-rich methylated DNA. MBD-SEQ toont echter meer affiniteit naar binding aan zeer CpG-rijke gebieden wanneer vergeleken met MeDIP SEQ 19 . Met behulp van een methylbindende verrijkingskit kan men het DNA fractioneren in hoge CpG- en laag-CpG-rijke gebieden door respectievelijk DNA met respectievelijk hoge zout- en laagzoutbuffers te elueren. In dit onderzoek werd slechts een enkele fractie-elutie uitgevoerd om zeer verrijkte CpG-rijke gebieden te vangen die de meeste CpG-eilanden bedekken.
MBD-SEQ kan een krachtig alternatief zijn voor WGBS, die vaak gebruikt wordt in CLL en andere leukemieonderzoeken. Hoewel MBD-SEQ een relatief hogere hoeveelheid input DNA vereist in vergelijking met het bisulfietOmzettingsgebaseerde methoden, maakt het mogelijk het onderzoek van globale methylatieveranderingen die alleen specifiek zijn voor modificaties van 5 mC, zonder PCR amplificatie bias die na de conversie wordt gecreëerd. Zo is MBD-seq een ideale methode om cllDMGs aan te pakken, die potentiële epigenetische CLL-signatuurgenen met prognostische waarde kunnen zijn.
De cruciale factoren voor het uitvoeren van deze methode zijn de kwaliteit en het sonicatiebereik van het gefragmenteerde DNA dat gebruikt wordt voor de bindingsreactie. Alle monsters vertoonden kortere fragmenten, tussen 150 en 300 bp ( Figuur 4 ), wat resulteert in kwalitatieve sequencing resultaten, met ongeveer 25-33 miljoen unieke leest voor elke steekproef naar het genoom na data-filtering en reiniging.
Tenslotte is de methyleringsstatus van hyper- en hypomethylated cllDMGs gevalideerd voor weinig genen die een pyrosequencingmethode gebruiken in een onafhankelijke steekproefcohort. Deze methode geeft de perceAfhankelijk van de DNA-methylering, afhankelijk van de verhouding van C-to-T bij individuele CpG-plaatsen, gebaseerd op de hoeveelheid C en T die tijdens de sequentieverlenging werd opgenomen. De hypermethylated cllDMG's vertoonden hoge percentages methylering in CLL-monsters in vergelijking met de normale monsters. Evenzo lieten de hypomethylated cllDMGs het tegenovergestelde zien. Pyrosequencing data voor twee cllDMGs is weergegeven in Figuur 3 .
In vergelijking met array-gebaseerde methoden maakt deze methode het mogelijk om het sequentieverbreidingsproces over het genoom te onderzoeken, met inbegrip van eerder geannoteerde gebieden die eiwitcoderende regio's strekken en niet-geannoteerde sequenties die herhalende elementen en lncRNAs overspannen. Zo heeft deze aanpak op CLL-patiënten verschillende nieuwe cllDMG's gevonden die lncRNAs en herhalende elementen bestrijken. Aangezien deze onderzoeken nog niet eerder zijn uitgevoerd in CLL patiëntmonsters, dient deze studie als een waardevolle bron voor het identificeren van CLL-geassocieerde differentiële gemethyleerde gebieden inVerschillende prognostische subgroepen. Deze cllDMG's zullen dienen als nieuwe biomarkers en doelen voor epigenetische medicamentherapie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Deze studie werd ondersteund door de Zweedse Onderzoeksraad, de Zweedse Kankervereniging, de Knut en Alice Wallenberg Stichting (KAW), en de Rekenkamer VästraGötalandsregionen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dneasy Blood and tissue kit | Qaigen | 69504 | |
| Lymphoprep solution | A X I S-S H I E L D | 1114544 | |
| Nano drop 2000 | Thermo Fischersceintific | ||
| TE buffer pH 8 | Sigma aldrich | 93283 | |
| Bioruptor standard sonication device | Diagenode | UCD-200 | |
| TPX bioruptor tubes 1.5 mL | Diagenode | C30010010-300 | |
| 3 M Sodium acetate | Diagenode | C03030002 | |
| E-gel iBase safe imager combo kit | Thermo Fischersceintific | G6465EU | |
| E-gel 2% Agarose gels | Thermo Fischersceintific | G441002 | |
| Methylminer Methylated DNA enrichment kit | Thermo Fischersceintific | ME10025 | |
| Labquake Tube Shaker/Rotators | Thermo Fischersceintific | 415110 | |
| Dynal MPC-S | Thermo Fischersceintific | A13346 | |
| Vortex mixer | VWR | 12620-848 | |
| Absolute Ethanol | Any company | ||
| 70% Ethanool | Any company | ||
| DNAse free water | Milli Q | ||
| DNA precipitant (3M sodium acetate) | Diagenode | C03030002 | |
| Safe seal 1.5 mL eppendorf tubes | Eppendorf | 4036-3204 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fischersceintific | Q32851 | |
| Qubit 0.5 mL tubes | Thermo Fischersceintific | Q32856 | |
| Qubit | Thermo Fischersceintific | Q32866 | |
| Illumina Hiseq2000 Platform | Illumina | ||
| Water Bath | Grant | ||
| Heat block | grant | ||
| Tube rotater | Labquake |
References
- Kanduri, M., et al. Differential genome-wide array-based methylation profiles in prognostic subsets of chronic lymphocytic leukemia. Blood. 115 (2), 296-305 (2010).
- Cahill, N., et al. 450K-array analysis of chronic lymphocytic leukemia cells reveals global DNA methylation to be relatively stable over time and similar in resting and proliferative compartments. Leukemia. 27 (1), 150-158 (2013).
- Kanduri, M., et al. Distinct transcriptional control in major immunogenetic subsets of chronic lymphocytic leukemia exhibiting subset-biased global DNA methylation profiles. Epigenetics. 7 (12), 1435-1442 (2012).
- Kulis, M., et al. Epigenomic analysis detects widespread gene-body DNA hypomethylation in chronic lymphocytic leukemia. Nat Genet. 44 (11), 1236-1242 (2012).
- Booth, M. J., et al. Quantitative sequencing of 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine at single-base resolution. Science. 336 (6083), 934-937 (2012).
- Yu, M., et al. Base-resolution analysis of 5-hydroxymethylcytosine in the mammalian genome. Cell. 149 (6), 1368-1380 (2012).
- Subhash, S., Andersson, P. O., Kosalai, S. T., Kanduri, C., Kanduri, M. Global DNA methylation profiling reveals new insights into epigenetically deregulated protein coding and long noncoding RNAs in CLL. Clin Epigenetics. 8, 106 (2016).
- Hallek, M., et al. Guidelines for the diagnosis and treatment of chronic lymphocytic leukemia: a report from the International Workshop on Chronic Lymphocytic Leukemia updating the National Cancer Institute-Working Group 1996 guidelines. Blood. 111 (12), 5446-5456 (2008).
- De Meyer, T., et al. Quality evaluation of methyl binding domain based kits for enrichment DNA-methylation sequencing. PLoS One. 8 (3), e59068 (2013).
- Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).
- Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biol. 10 (3), R25 (2009).
- Zhang, Y., et al. Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biol. 9 (9), R137 (2008).
- Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
- Subhash, S., Kanduri, C. GeneSCF: a real-time based functional enrichment tool with support for multiple organisms. BMC Bioinformatics. 17 (1), 365 (2016).
- Liao, Y., Smyth, G. K., Shi, W. featureCounts: an efficient general purpose program for assigning sequence reads to genomic features. Bioinformatics. 30 (7), 923-930 (2014).
- Robinson, M. D., McCarthy, D. J., Smyth, G. K. edgeR: a Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data. Bioinformatics. 26 (1), 139-140 (2010).
- Martinelli, S., et al. ANGPT2 promoter methylation is strongly associated with gene expression and prognosis in chronic lymphocytic leukemia. Epigenetics. 8 (7), 720-729 (2013).
- Kopparapu, P. K., et al. Epigenetic silencing of miR-26A1 in chronic lymphocytic leukemia and mantle cell lymphoma: Impact on EZH2 expression. Epigenetics. 11 (5), 335-343 (2016).
- Robinson, M. D., et al. Evaluation of affinity-based genome-wide DNA methylation data: effects of CpG density, amplification bias, and copy number variation. Genome Res. 20 (12), 1719-1729 (2010).
