Summary
والهدف العام من هذا البروتوكول توليف nanosensors الفنية المحمولة، فعالة من حيث التكلفة، والموجهة خصيصا للكشف السريع عن البكتيريا المسببة للأمراض من خلال مزيج من الاسترخاء المغناطيسي وطرائق الانبعاثات الأسفار.
Abstract
ارتبط O157:H7 الإشريكيّة القولونية Enterohemorrhagic على حد سواء التي تنقلها المياه والأمراض المنقولة عن طريق الأغذية، وما زال يشكل تهديدا على الرغم من أساليب فحص الأغذية والمياه المستخدمة حاليا. بينما أساليب الكشف البكتيرية التقليدية، مثل تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) وفحوصات الممتز المرتبط بالانزيم (ELISA) على وجه التحديد الكشف عن الملوثات المسببة للأمراض، أنها تتطلب إعداد عينة واسعة النطاق وفترات انتظار طويلة. وبالإضافة إلى ذلك، هذه الممارسات تتطلب إعدادات وأدوات مختبرية متطورة، ويجب تنفيذها بواسطة مهنيين مدربين. هنا، يقترح وضع بروتوكول لأبسط تقنية تشخيص التي يتميز بمزيج فريد من المغناطيسية والفلورية المعلمات في منصة المستندة إلى نانوحبيبات. المقترح مولتيباراميتريك مغناطيسي-نيون nanosensors (مفنس) يمكن الكشف عن التلوث O157:H7 كولاي مع أقل قدر من 1 وحدة تشكيل مستعمرة في حل داخل ح أقل من 1. وعلاوة على ذلك، قدرة مفنس تبقى وظيفية للغاية في وسائل الإعلام المعقدة مثل الحليب، وتم التحقق من مياه البحيرة. واستخدمت أيضا فحوصات خصوصية إضافية لإثبات قدرة مفنس الكشف عن البكتيريا المستهدفة المحددة، حتى في وجود الأنواع البكتيرية مماثلة فقط. الاقتران من الطرائق المغناطيسية ونيون يسمح للكشف والتحديد الكمي للتلوث الممرض في طائفة واسعة من التركيزات، نستعرض أداء عالية في كلا الكشف المبكر والمتأخر من مرحلة التلوث. الفعالية والقدرة على تحمل التكاليف، وقابلية مفنس جعلها مرشح مثالي للعناية بنقطة الفرز للملوثات البكتيرية في مجموعة واسعة من الإعدادات، من الخزانات المائية للأطعمة المعلبة تجارياً.
Introduction
استمرار حدوث التلوث البكتيري في كل الأغذية المنتجة تجارياً، ومصادر المياه قد خلق حاجة إلى مناهج التشخيص متزايدة سريعة ومحددة. 1 , 2 بعض الملوثات البكتيرية أكثر شيوعاً المسؤولة عن تلوث الأغذية والمياه من أجناس السالمونيلا، المكوّرات العنقودية، الليستيريا، الضمة، ودوسنتاريا، عصية والاشريكيه. 3 , 4 التلوث البكتيري بمسببات هذه الأمراض غالباً ما ينتج عن أعراض مثل الحمى والكوليرا والتهاب المعدة والأمعاء والإسهال. 4 تلوث مصادر المياه في كثير من الأحيان قد آثار جذرية والضارة على المجتمعات المحلية دون الوصول إلى المياه التي تمت تصفيتها بما فيه الكفاية، وقد أدى تلوث الأغذية لعدد كبير من الأمراض والمنتج نذكر الجهود. 5 , 6
من أجل الحد من حدوث الأمراض الناجمة عن التلوث البكتيري، هناك عدد من الجهود الرامية إلى تطوير الأساليب التي الماء والغذاء يمكن أن تكون كفاءة الممسوحة ضوئياً قبل البيع أو الاستهلاك. 3 تقنيات مثل PCR،1،،من78،9،10 أليسا،11،(التضخيم متحاور بوساطة حلقة12 مصباح)،13،14 ، بين أمور أخرى،15،16،17،،من1819،،من2021، 22،،من2324 قد استخدمت مؤخرا للكشف عن مسببات الأمراض المختلفة. بالمقارنة مع التقليدية البكتيريا استزراع الأساليب، هذه التقنيات الآن أكثر كفاءة فيما يتعلق بخصوصية والوقت. ومع ذلك، هذه التقنيات ما زالت تكافح مع المغلوطة والسلبيات، وإجراءات معقدة وتكلفة. 1 , 3 , 25 لهذا السبب بالذات أن يقترح مولتيباراميتريك مغناطيسي-نيون nanosensors (مفنس) كطريقة بديلة للكشف عن البكتيريا.
هذه nanosensors فريد زوج معا الاسترخاء المغناطيسي وطرائق الفلورسنت، مما يسمح لمنصة مزدوجة-الكشف السريع والدقيق معا. استخدام O157:H7 كولاي كملوث عينة، ويظهر قدرة مفنس للكشف عن قدر ضئيل من 1 زيمبابوي في غضون دقائق. وتستخدم الأجسام المضادة الخاصة بالعوامل الممرضة لزيادة الدقة، ومزيج الطرائق المغناطيسية ونيون يسمح للكشف والتحديد الكمي للملوثات البكتيرية في نطاقات التلوث المنخفضة والعالية على حد سواء. 16 في حالة التلوث البكتيري، سوف سرب nanosensors حول البكتيريا بسبب استهداف قدرات الأجسام المضادة الخاصة بالعوامل الممرضة. الربط بين nanosensors المغناطيسي والبكتيريا يحد من التفاعل بين جوهر الحديد المغناطيسي والبروتونات المياه المحيطة بها. وهذا يؤدي إلى زيادة في أوقات الاسترخاء T2، كما سجلتها ريلاكسوميتير مغناطيسي. كما يرتفع تركيز البكتيريا في الحل، تفريق nanosensors مع العدد المتزايد من البكتيريا، أدى إلى انخفاض قيم T2. على العكس من ذلك، سيزيد انبعاث الأسفار بالتناسب مع تركيز البكتيريا، نظراً للعدد المتزايد من nanosensors ملزمة مباشرة للعوامل الممرضة. الطرد المركزي عينات، وعزل بيليه البكتيرية، إلا الحفاظ على جسيمات نانوية موصول مباشرة بالبكتيريا، وإزالة أي nanosensors التعويم الحر، وربط مباشرة انبعاث الأسفار مع العدد من البكتيريا الموجودة في الحل. ويمثل تمثيل تخطيطي لهذه الآلية في الشكل 1.
تم تصميم هذه المنصة مفنس مع فحص نقطة من الرعاية في الاعتبار، أسفر عن خصائص منخفضة التكلفة والمحمولة. مفنس مستقرة عند درجة حرارة الغرفة، ومطلوبة فقط بتركيزات منخفضة جداً لدقة الكشف عن الملوثات البكتيرية. وعلاوة على ذلك، بعد توليف، استخدام مفنس بسيطة ولا تتطلب استخدام مهنيين مدربين في المجال. أخيرا، يسمح هذا المنهاج التشخيص لاستهداف عالية للتخصيص، توفير وسيلة من ذلك يمكن استخدام منصة واحدة للكشف عن مسببات الأمراض بجميع أنواعها، في العديد من الإعدادات المختلفة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. التوليف والروغان من متعدد حدودي مغناطيسي-نيون Nanosensors (مفنس)-
جسيمات نانوية- توليف أكسيد الحديد سوبيرباراماجنيتيك (إيونبس)
- للتحضير لتوليف إيونب، إعداد الحلول 3 التالية: 1 الحل: فيكل 3 (0.70 غ) وفيكل 2 ح 2 س (2 مل)، 2 الحل: NH 4 يا (2.0 مل، 13.4 م) في ح 2 س (15 مل)، و 3 الحل: حمض polyacrylic (0.855 ز) في ح 2 س (5 مل). إضافة ميليلتر 90 م 2 حمض الهيدروكلوريك (HCl) إلى 1 حل
- وثم تخلط مباشرة مع 2 الحل بينما فورتيكسينج 875 لفة في الدقيقة. قم بإضافة 3 الحل. مواصلة فورتيكسينج للحد الأدنى 60
- أجهزة الطرد المركزي لمدة 20 دقيقة في 1,620 س زاي الطرد المركزي المادة طافية لمدة 20 دقيقة في 2,880 س غ.
- تنقية المادة طافية النهائي عن طريق الغسيل الكلوي. إضافة المادة طافية على كيس الغسيل الكلوي (6 موكو − 8 كيلو) ثم ضعه في كوب يحتوي على الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) (pH = 7.4) وشريط زيادة ونقصان. وليكن نقع ح 12، استبدال مع المخزن المؤقت الطازجة كل حاء 2-3
- تصريف أجسام مضادة محددة الهدف لسطح إيونبس
- إعداد الحلول الأربع التالية: الحل ج: 5 ملغ من 1-إيثيل-3-(3-ديميثيلامينوبروبيل) هيدروكلوريد كاربودييميدي (EDC) في 250 ميليلتر مس [2-(ن- المخزن المؤقت لحمض اثانيسولفونيك morpholino)] (0.1 M، ودرجة الحموضة = 6.8)، الحل ب: 3 مغ من N-هيدروكسيسوكسينيميدي (NHS) في 250 ميليلتر من مس المخزن المؤقت (0.1 M، ودرجة الحموضة = 6.8)، الحل c: 5 ميكروغرام من IgG1، ماب كولاي، في 225 ميليلتر من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) (الرقم الهيدروجيني 7.4) ، والحل d: 4 مل من إيونب (5.0 ميللي مول) في 1 مل من برنامج تلفزيوني (درجة الحموضة 7.4).
- المخزن المؤقت إضافة 2-(ن-Morpholino) حمض اثانيسولفونيك (MES) للحل، ثم فورا إضافة حل أ إلى "د الحل" بزيادات صغيرة في 15 ثانية، عكس الحل بعد كل إضافة لخلط-
- تبدأ على الفور لإضافة حل ب د الحل في زيادات صغيرة على مدى فترة ثلاث دقائق. ميكس بعكس الحل بعد كل إضافة-
- إضافة الحل ج للحل في زيادات بمقدار 5 ميليلتر، عكس الحل بعد كل إضافة لخلط-
- السماح برد فعل تستمر 3 ساعات في درجة حرارة الغرفة ومن ثم تابع في الحضانة عند 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها. تنقية
- إيونبس Ab مترافق الناتجة عن طريق عمود المغناطيسي باستخدام برنامج تلفزيوني (pH = 7.4، النهائي [Fe] = 3.5 ملمول) لإزالة أي أجسام مضادة أونكونجوجاتيد.
- أغسل العمود المغناطيسي مع برنامج تلفزيوني (1 مل). إرفاق العمود إلى اللوحة المغناطيسية، وإضافة حل إيونب.
- أغسل العمود المغناطيسي مع برنامج تلفزيوني (1 مل) مرة أخرى. إزالة العمود المغناطيسي من اللوحة المغناطيسية. إضافة برنامج تلفزيوني للعمود وجمع الحل. مخزن في 4 درجات مئوية
- تغليف 1.1 نيون '-ديوكتاديسيل-3,3,3 '، 3 '-صبغ تيتراميثيليندوكاربوسيانيني فوق كلورات (دي) في الطلاء حمض (PAA) polyacrylic من إيونبس جسم مترافق استخدام طريقة الانتشار المذيبات.
- إضافة إلى 4 مل من إيونبس، دروبويسي 2.0 ميليلتر لصبغ دي (2 ميللي مول) في 100 ميليلتر من [دمس] مع الخلط المستمر 1100 لفة في الدقيقة-
- دياليزي الحل الناتج (كاتشين موكو 6-8، ح 12) ضد برنامج تلفزيوني، إيجاد حل مفنس نهائي مع تركيز حديد نهائية [الحديد] = 2 ملمول.
- "توصيف مفنس"
- لتحليل سبيكتروفوتوميتريك، استخدام قارئ لوحة للكشف عن صبغ دي مغلفة بالانبعاثات fluorescence في 595 نانومتر.
- "تشتت الضوء الديناميكي"
- وضع عينة من الحل مفنس في زيتاسيزير لتحديد حجم متوسط وتهمة السطحية مفنس-
ملاحظة: هنا، بحجم متوسط وتهمة السطحية من مفنس الفنية تبين أن 77.09 شمال البحر الأبيض المتوسط، و-22.3 بالسيارات، على التوالي.
- وضع عينة من الحل مفنس في زيتاسيزير لتحديد حجم متوسط وتهمة السطحية مفنس-
2. البكتيرية كولتورينج وإعداد الأوراق المالية حل
- "البكتيرية استزراع"
- هيدرات بيليه المعصوفه (O157:H7 كولاي) في 1 مل مرق المغذيات ثم قم بإضافة إضافية 5 مل من مرق.
- استخدام ميليلتر 100 تطبيق هذا الحل إلى لوحة أجار والانتصارات حلقة تطعيم عقيمة، تليها الحضانة عند 37 درجة مئوية ل 24 h. حدد مستعمرة معزولة من لوحة أجار
- بعد 24 ساعة، وإضافة إلى 15 مل مرق الثقافة. احتضان في 37 درجة مئوية ح 4-6، في حين رصد قيمة الكثافة البصرية (امتصاص 600 nm).
- حالما يتم الحصول على قيمة كثافة بصرية 0.1، إيقاف استزراع، والقيام بتخفيف المسلسل.
- تخفيف المسلسل
- ميليلتر إضافة 900 من مرق المغذيات إلى ثمانية أنابيب معقمة ميكروسينتريفوجي.
- إضافة 100 ميليلتر من تعليق البكتيرية إلى الأنبوب الأول (التخفيف 10 -1)-
- تأخذ 100 ميليلتر من الأول أنبوب وإضافته إلى الثاني، للحصول على تخفيف من 10 -2. يستمر هذا النمط لأنابيب المتبقية، تنتهي بإضعاف نهائي من 10 -8-
- نقل 100 ميليلتر من كل أنبوبة لفصل لوحات أجار، واحتضان ح 24 في 37 درجة مئوية.
- في اليوم التالي، عد مستعمرة تشكيل وحدات (كفوس) على كل لوحة. حدد اللوحة مع كفوس ~ 100. استخدام تخفيف المقابلة لإجراء مزيد من التجارب (100 ميليلتر = كفوس ~ 100)-
ملاحظة: هنا كان التخفيف 10 -6 التي أدت إلى كفوس ~ 100-
3. سرعة "كشف هاء" القولونية O157:H7 استخدام مفنس
- سبايك برنامج تلفزيوني مختلف الحلول (1 X، درجة الحموضة 7.4، 300 ميليلتر) مع زيادة كميات المخزون البكتيرية 10 -6، أسفر عن زيمبابوي يتراوح من 1-100. إضافة كمية متسقة من مفنس (100 ميليلتر) لهذه الحلول-
- إنشاء أحد الحلول الأساس الذي يحتوي على برنامج تلفزيوني فقط (1 X، درجة الحموضة 7.4، 300 ميليلتر) ومفنس (100 ميليلتر)-
- احتضان الحلول لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية وثم السماح لهم لتبرد بدرجة حرارة الغرفة-
- نقل الحلول الفردية إلى ريلاكسوميتير المغناطيسي (تسلا 0.47) وتسجيل التغييرات في أوقات الاسترخاء (T2) بالنسبة إلى كفوس في كل حل.
- لتسجيل التغييرات في القيم T2، تبدأ بقياس قيمة T2 الحل الأساس الذي يحتوي على برنامج تلفزيوني ومفنس فقط.
ريلاكسوميتير
- مكان الحل في المغناطيسي. فتح البرامج الخاصة بكل منها، وحدد " الاسترخاء T2 " الإعداد والصحافة " التدبير. "
- عقب جمع الأساس T2، قياس القيم T2 الحلول الإضافية التي قد ارتفعت مع مختلف تركيزات البكتيريا.
ملاحظة: التغيير في T2 ما يعادل خط الأساس T2 مطروحاً من T2 ارتفعت.
- لتسجيل التغييرات في القيم T2، تبدأ بقياس قيمة T2 الحل الأساس الذي يحتوي على برنامج تلفزيوني ومفنس فقط.
ريلاكسوميتير
- إزالة عينات من ريلاكسوميتير المغناطيسي والطرد المركزي هذه الأنابيب في 2880 x ز للحد الأدنى 10
- صب المادة طافية وريسوسبيند الكريات البكتيرية في 100 ميليلتر من برنامج تلفزيوني (1 X، درجة الحموضة 7.4).
- ميليلتر 80 إضافة لاستثارة كل لوحة 96-جيدا وكثافات fluorescence سجل في 595 نانومتر.
ملاحظة: اختبار يمكن أن يتكرر استخدام المذيبات المختلفة، بما في ذلك مياه البحيرة والحليب وغيرها، كما هو موضح في المقطع النتائج
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويمثل إليه عمل مفنس في الشكل 1. تجميع مفنس حول سطح الملوثات البكتيرية يتداخل مع التفاعلات بين magnetic cores مفنس ونواة الهيدروجين المحيطة بها. ونتيجة هذا الاسترخاء المغناطيسي، وتجميع قيم زيادة. كما يزيد من تركيز الملوثات البكتيرية، يقلل من التكتل، ويقلل من التغير في القيم T2. ولذلك، إضافة طريقة الفلورسنت الحاسم. كما يزيد من تركيز البكتيرية، يزيد قوة الإشارة الفلورسنت التي تنتجها مفنس، مما يسمح لحساسية الكشف عن الملوثات البكتيرية في نطاقات تركيزات منخفضة وعالية على حد سواء.
في أعقاب البروتوكول، توليف16 مفنس وأول اختبار في الحلول من برنامج تلفزيوني (1 X، درجة الحموضة 7.4). واستخدمت الطريقة الأولية المستخدمة للكشف، الاسترخاء المغناطيسي، لتسجيل التغييرات في القيم T2. وفقا للبروتوكول، ثم تم فصل العينات، كان حراكه الكريات، وجمعت المعطيات الأسفار. ويعرض ΔT2 المقابلة وقيم الانبعاثات fluorescence في الشكل 2. كما هو موضح، قيمة ΔT2 أكبر بتركيزات أقل من التلوث البكتيري، وبلغ التشبع في كفوس 20 تقريبا. الانبعاثات الأسفار، ومن ناحية أخرى، أصبحت أكثر دقة في > كفوس 20، عرض أهمية الجمع بين هذه الطرائق اثنين. وفي أعقاب هذه الاختبارات الأولية، أجريت اختبارات مماثلة في وسائل الإعلام المعقدة، بما في ذلك مياه البحيرة والحليب. وقد تم ذلك لضمان أن nanosensors لا تزال فعالة في وسائل الإعلام أكثر تعقيداً. وترد في الشكل 3 البيانات التي تم جمعها من هذه الاختبارات وهي مشابهة جداً لفحوصات أجريت في برنامج تلفزيوني. وهذا يقوم بالتحقق من أن هذه nanosensors تظل فعالة في وسائل الإعلام المعقدة.
بعد التأكد من أن مفنس ويمكن الكشف عن وجود الملوثات البكتيرية في وسائل الإعلام على حد سواء بسيطة ومعقدة، أجريت ثم عدد من الاختبارات لتحديد مستوى الخصوصية التي تحتفظ بها nanosensors. وتحقيقا لهذه الغاية، كان المحتضنة مفنس في المحاليل المحتوية على البكتيريا المستهدفة والبكتيريا المستهدفة قتل الحرارة والبكتيريا غير المستهدفة (غير ممرضة كولاي و S. typhimurium) وخليط. وكان هذا فقط خصوصية مقايسة، وكان جمع البيانات الاسترخاء المغناطيسي وحدها كافية، ويتم تقديم البيانات المقابلة في الشكل 4. كما يمكن أن يرى، مفنس ملزمة فقط للعيش O157:H7 كولاي ، وليس للبكتيريا قتلت الحرارة أو غير المستهدفة الأخرى. هذا المستوى من التحديد يعزى إلى الأجسام المضادة التي تستهدف مترافق، ويؤكد كذلك أن مفنس تكون فعالة في الكشف عن الملوثات الممرض محددة، حتى عند وجود أنواع البكتيريا غير ممرضة.
الشكل 1 : كشف مغناطيسي-فلوري إليه. التمثيل التخطيطي لتوليف مفنس وآلية مشروط المزدوج للكشف عن البكتيريا. وبعد فترة حضانة قصيرة (30 دقيقة)، مفنس قادرون على حساسية الكشف عن البكتيريا المستهدفة عن طريق الجمع بين الرنين المغناطيسي والانبعاثات الأسفار. تجميع مفنس حول سطح الملوثات البكتيرية تؤدي التغييرات في القيم الاسترخاء المغناطيسي، والتي يمكن كشفها بواسطة ريلاكسوميتير مغناطيسي. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تجمع الإشارات الفلورسنت من مفنس ملزمة مباشرة على الملوثات البكتيرية. وهذا يوفر منبرا كشف المزدوج مشروط قادرة على الكشف عن الملوثات البكتيرية في نطاقات تركيزات منخفضة وعالية على حد سواء. 16 وقد تم تعديل هذا الرقم بإذن من. 16
الشكل 2 : دليل على مفهوم. A) وجمعت البيانات الاسترخاء المغناطيسي (ΔT2) أولاً من تخفيف O157:H7 كولاي (زيمبابوي 1-100) في برنامج تلفزيوني المذيبات (1 X، pH = 7.4). كشف السيد من البكتيريا كانت حساسة للغاية في أقل زيمبابوي التهم (داخلي: بدءاً من زيمبابوي 1-20). ومع ذلك، أصبحت مشبعة قراءات ΔT2 أعلى تركيزات بكتيرية (> زيمبابوي 20)، التي تشير إلى أن السيد أكثر قيمة للكشف والتحديد الكمي للتلوث البكتيري في مرحلة مبكرة. ب) ارتفعت الأسفار بيانات الانبعاثات من نفس الحلول PBS (داخلي: ارسم الخطي). وأظهرت النتائج أن طريقة الكشف الأسفار أكثر حساسية في أعلى زيمبابوي التهم، في حين أنها تفتقر في حساسية لعينات زيمبابوي منخفضة. معا، هذه البيانات إثبات قدرة الطرائق المغناطيسية والفلورية سواء لكشف وقياس التلوث البكتيري في وقت مبكر-والمراحل المتأخرة من التلوث البكتيري. 16 متوسط قيم القياسات الثلاثة هي ± يصور الخطأ القياسي. وقد تم تعديل هذا الرقم بإذن من. 16
الشكل 3 : الكشف عن البكتيريا في وسائل الإعلام المعقدة. الاسترخاء المغناطيسي ΔT2 البيانات التي جمعت من وسائل الإعلام أكثر تعقيداً، بما في ذلك A) بحيرة المياه والحليب الكامل الدسم ب). مشابهة للبيانات التي جمعت من برنامج تلفزيوني الحلول السابقة، لوحظ أن الكشف عن الملوثات الجرثومية كان أكثر حساسية في نطاق زيمبابوي 1-20 (insets). وجمعت بيانات الانبعاثات fluorescence المقابلة جيم) مياه البحيرة ود) الحليب عينات (insets: مؤامرات الخطي)، التي أظهرت حساسية أعلى مع زيادة التهم زيمبابوي. مرة أخرى، هذه البيانات إثبات فعالية التي يكمل كل طريقة أخرى، والتحقق من قدرتهم على تبقى وظيفية في وسائل الإعلام المعقدة. 16 متوسط قيم القياسات الثلاثة هي ± يصور الخطأ القياسي. وقد تم تعديل هذا الرقم بإذن من. 16
الشكل 4 : التحديد مفنس. خصوصية مفنس تم اختباره باستخدام تحليل السيد في حلول مرق المغذيات التي تحتوي على A) رقم الصليب-الملوثات البكتيرية وخليط، وب) الحرارة يخمد O157:H7 كولاي . كما هو موضح، فمن الواضح أن nanosensors قليلاً إلى أي ربط مع البكتيريا غير المستهدفة، وهي لا تزال قادرة على اكتشاف البكتيريا المستهدفة حضور الملوثات الأخرى، ضمان أن هذا النوع من الفحص عن طريقبلي للاستخدام في وسائل الإعلام المعقدة التي تحتوي على عدد من أنواع البكتيريا غير ممرضة. أجرى اختبار ج) مزيد خصوصية بتوليف مفنس مع جسم ايستب (دوائر حمراء: مكافحة O111كولاي )، مما أدى إلى القليل لربط لا مفنس مترافق جسم O157:H7 (المربعات السوداء) بالمقارنة مع. وتبين هذه البيانات أن مفنس إلا تتفاعل مع البكتيريا المستهدفة قابلة للاستمرار، وكذلك التحقق من فعاليتها كمنصة تشخيص نقطة من الرعاية. 16 متوسط قيم القياسات الثلاثة هي ± يصور الخطأ القياسي. وقد تم تعديل هذا الرقم بإذن من. 16
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وقد صمم هذا البروتوكول لإنتاج مفنس تعمل بكامل طاقتها بساطة قدر الإمكان. ومع ذلك، هناك العديد من النقاط الرئيسية التي تحوير البروتوكول قد يكون من المفيد، اعتماداً على الهدف النهائي الخاص بالمستخدم. على سبيل المثال، سيتيح استخدام مختلف الأجسام المضادة لاستهداف العديد من مسببات الأمراض الأخرى. وبالإضافة إلى ذلك، لا يقتصر هذا البروتوكول باستخدام الأجسام المضادة كاستهداف الجزيئات. كما يمكن استخدام أي جزيء التي قد تقارب ملزمة محددة لمسببات الأمراض المستهدفة، مثل مستقبلات الخلية المضيفة، كاستهداف الجزيئات. طالما الجزيء استهداف مجموعة أمين الابتدائي أو الكحول، أو يمكن فونكتيوناليزيد أن يكون واحداً، فإنه قد مترافق لسطح جسيمات نانوية أكسيد الحديد وفقا للكيمياء تصريف الصادرات/دائرة الصحة الوطنية المدرجة في البروتوكول. ثانيا، قد تختلف مقدار مفنس المستخدمة في كل حل الكشف. من المهم استخدام ما يكفي حيث تكون قيمة T2 للحل الأساس (التي تحتوي على المذيبات ونانوسينسور دون الممرض الهدف فقط) في المجموعة من 100-250 السيدة إذا كانت قيمة الأساس أقل من 100، ثم التغيرات في قيم T2 سوف تكون أقل حساسية ، بسبب overabundance النشاط نانوسينسور. لرفع قيمة T2 خط الأساس، الحد من كمية نانوسينسور في الحل. وإذا كان بيد الأساس أعلاه 250، أصبح حساسة بشكل مفرط، والمغلوطة قد تصبح أكثر احتمالاً. لهذه الأسباب، اقترح أن يستهدف حل أساس T2 القيمة بين 100-250 مللي ثانية.
القيود الحالية لهذا البروتوكول، عند النظر في استخدامها كتشخيص نقطة من الرعاية، بالاعتماد على ريلاكسوميتير benchtop المغناطيسي الحالية. بينما فعالة ومستقرة، يمكن تخفيض هذا المنهاج الاسترخاء المغناطيسي في الحجم لزيادة قابلية. وهذا سيزيد من سهولة معها هذا المنهاج يمكن استخدامها في بيئات مختلفة، كما هو الحال في مصادر المياه أو في أسواق البقالة، وفعالية الفحص الجرثومي في الموقع. وهذا يمكن أيضا إلى تخفيض تكلفة هذه الإله، يجعلها أكثر قابلية للتحقيق لكشف الممرض نقطة من الرعاية.
وفيما يتعلق باكتشاف الأمراض التشخيص والممرض في الأوضاع منخفضة الموارد، قد هذا المنهاج يمكن أن تكون أكثر فعالية من الممرض التشخيص التقنيات الحالية المستخدمة اليوم، بما في ذلك بكر وإليزا. بينما أثبتت هذه التقنيات التقليدية لتكون فعالة إلى حد كبير، فشديدة معقدة ومكلفة وبطيئة. على هذا النحو، هناك حاجة إلى منصة تشخيص دقيقة التي يمكن تطويرها للاستخدام في الظروف منخفضة الموارد للكشف عن نقطة من الرعاية من مسببات الأمراض وتشخيص الأمراض. من هذا المنبر نسبيا سهلة الاستخدام وفعالة من حيث التكلفة وسريعة. وبصرف النظر عن تكاليف البدء الأولية للآلات المطلوبة (القارئ ريلاكسوميتير ولوحة)، مفنس الفعلية رخيصة نسبيا ومستقرة جداً. وباﻹضافة إلى ذلك، جمع قيم T2 بسيطة ولا تتطلب فني مختبر مهنية.
في المستقبل، ستواصل التعاون مع مهندسي الكيميائية والبيولوجية لتصميم جهاز أكثر المحمولة باليد التي يمكن أن تستخدم للكشف عن المغناطيسية ونيون للتلوث البكتيري باستخدام مفنس. تطوير جهاز أصغر سيساعد على مواصلة خفض التكاليف المرتبطة بهذا الكشف عن النظام الأساسي وزيادة فعاليتها في المجال. وعلاوة على ذلك، هذا البرنامج لديه القدرة على استخدامها لتحليل فعالية تطوير مبيد وكلاء. كما هو مبين في البيانات المتوفرة لدينا، لدينا مفنس فقط كانت قادرة على الربط مع البكتيريا المستهدفة للعيش، وتنتج القليل إلى أي إشارة عند المحتضنة مع الحرارة قتل البكتيريا. بناء على ذلك، يمكن استخدام برنامجنا لاختبار فعالية مبيد المرشحين، ونحن نخطط لاستكشاف هذا كذلك في المستقبل.
وتشمل الخطوات الحاسمة في هذا البروتوكول التوليف الأولية من مفنس وجمع البيانات T2. من المهم أن تنقية مفنس لضمان أن الأجسام المضادة التعويم الحر لا تتداخل مع T2 جمع البيانات بشكل صحيح. وبالإضافة إلى ذلك، يجب أن يكون مقدار مفنس وضعها في كل عينة الاختبار متسقة، تغييرات في تركيز مفنس سوف يغير القيم T2، والمخاطرة بإيجابيات/سلبيات كاذبة.
وفي الختام، مفنس رواية خطوة إلى الأمام في مجال مكافحة التلوث البكتيري، وسوف تزداد تطورا كما استهداف مسببات إضافية تحقق والتصميم يتم السعي إليه أكثر المحمولة. تكلفة منخفضة ومنخفضة-التعقيد المرتبطة باستخدام مفنس يجعلها مرشحة قابلة للتطبيق لاستخدامها للكشف عن التلوث البكتيري في الموقع. بينما يتطلب تركيب هذه nanosensors التحضير الدقيق، استعمالها الفعلي بسيط نسبيا، ويتيح لهم إمكانية الحد من المنقولة بالأغذية والأمراض المنقولة بالمياه. مع مزيد من التطور، تنفيذ هذه nanosensors قد ينظر في فحص خزانات المياه والأغذية في مواقع التعبئة والتغليف، ونقاط البيع، وربما حتى منازل المنتجة تجارياً.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
أظهر تطبيق تكنولوجيا النانو هذا لم بعد موافقة إدارة الأغذية والعقاقير.
Acknowledgments
هذا العمل معتمد من قبل P20GM103418 إينبري ك وكانساس فول الصويا اللجنة (PSU أبيت/1663)، ACS PRF 56629-UNI7 الأمير سلطان البوليمر الكيمياء بدء تشغيل الصندوق، كل إلى SS. ونحن نشكر جامعة مصور فيديو، السيد جاكوب أنسيلمي، على عمله الممتاز مع الفيديو. كما نشكر السيد روجر هيكيرت والسيدة هيكيرت كاثا على دعمهم السخي للأبحاث.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ferrous Chloride Tetrahydrate | Fisher Scientific | I90-500 | |
| Ferric Chloride Hexahydrate | Fisher Scientific | I88-500 | |
| Ammonium Hydroxide | Fisher Scientific | A669S-500 | |
| Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | A144S-500 | |
| Polyacryllic Acid | Sigma-Aldrich | 323667-100G | |
| EDC | Thermofisher Scientific | 22980 | |
| NHS | Fisher Scientific | AC157270250 | |
| Anti-E. coli O111 antibody | sera care | 5310-0352 | |
| Anti-E. coli O157:H7 antibody [P3C6] | Abcam | ab75244 | |
| DiI Stain | Fisher Scientific | D282 | |
| Nutrient Broth | Difco | 233000 | |
| Freeze-dried E. coli O157:H7 pellet | ATCC | 700728 | |
| Magnetic Relaxomteter | Bruker | mq20 | |
| Zetasizer | Malvern | NANO-ZS90 | |
| Plate Reader | Tecan | Infinite M200 PRO | |
| Magnetic Column | QuadroMACS | 130-090-976 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804 Series | |
| Centrifuge (accuSpin Micro 17) | Fisher Scientific | 13-100-676 | |
| Floor Model Shaking Incubator | SHEL LAB | SSI5 | |
| Analytical Balance | Metler Toledo | ME104E | |
| Digital Vortex Mixer | Fisher Scientific | 02-215-370 | |
| Open-Air Rocking Shaker | Fisher Scientific | 02-217-765 |
References
- Law, J. W., Ab Mutalib, N. S., Chan, K. G., Lee, L. H. Rapid methods for the detection of foodborne bacterial pathogens: principles, applications, advantages and limitations. Front Microbiol. 5, 770 (2014).
- Pandey, P. K., Kass, P. H., Soupir, M. L., Biswas, S., Singh, V. P. Contamination of water resources by pathogenic bacteria. AMB Express. 4, 51 (2014).
- Zhao, X., Lin, C. W., Wang, J., Oh, D. H. Advances in rapid detection methods for foodborne pathogens. J Microbiol Biotechnol. 24 (3), 297-312 (2014).
- Heithoff, D. M., et al. Intraspecies variation in the emergence of hyperinfectious bacterial strains in nature. PLoS Pathog. 8 (4), e1002647 (2012).
- Ishii, S., Sadowsky, M. J. Escherichia coli in the Environment: Implications for Water Quality and Human Health. Microbes Environ. 23 (2), 101-108 (2008).
- Chiou, C. S., Hsu, S. Y., Chiu, S. I., Wang, T. K., Chao, C. S. Vibrio parahaemolyticus serovar O3:K6 as cause of unusually high incidence of food-borne disease outbreaks in Taiwan from 1996 to 1999. J Clin Microbiol. 38 (12), 4621-4625 (2000).
- Zhou, G., et al. PCR methods for the rapid detection and identification of four pathogenic Legionella spp. and two Legionella pneumophila subspecies based on the gene amplification of gyrB. Appl Microbiol Biotechnol. 91 (3), 777-787 (2011).
- Chen, J., Tang, J., Liu, J., Cai, Z., Bai, X. Development and evaluation of a multiplex PCR for simultaneous detection of five foodborne pathogens. J Appl Microbiol. 112 (4), 823-830 (2012).
- LeBlanc, J. J., et al. Switching gears for an influenza pandemic: validation of a duplex reverse transcriptase PCR assay for simultaneous detection and confirmatory identification of pandemic (H1N1) 2009 influenza virus. J Clin Microbiol. 47 (12), 3805-3813 (2009).
- Mahony, J. B., Chong, S., Luinstra, K., Petrich, A., Smieja, M. Development of a novel bead-based multiplex PCR assay for combined subtyping and oseltamivir resistance genotyping (H275Y) of seasonal and pandemic H1N1 influenza A viruses. J Clin Virol. 49 (4), 277-282 (2010).
- Alvarez, M. M., et al. Specific recognition of influenza A/H1N1/2009 antibodies in human serum: a simple virus-free ELISA method. PLoS One. 5 (4), e10176 (2010).
- Huang, C. J., Dostalek, J., Sessitsch, A., Knoll, W. Long-range surface plasmon-enhanced fluorescence spectroscopy biosensor for ultrasensitive detection of E. coli O157:H7. Anal Chem. 83 (3), 674-677 (2011).
- Zhang, J., et al. Rapid visual detection of highly pathogenic Streptococcus suis serotype 2 isolates by use of loop-mediated isothermal amplification. J Clin Microbiol. 51 (10), 3250-3256 (2013).
- Han, F., Wang, F., Ge, B. Detecting potentially virulent Vibrio vulnificus strains in raw oysters by quantitative loop-mediated isothermal amplification. Appl Environ Microbiol. 77 (8), 2589-2595 (2011).
- Wang, J., et al. Rapid detection of pathogenic bacteria and screening of phage-derived peptides using microcantilevers. Anal Chem. 86 (3), 1671-1678 (2014).
- Banerjee, T., et al. Multiparametric Magneto-fluorescent Nanosensors for the Ultrasensitive Detection of Escherichia coli O157:H7. ACS Infect Dis. 2 (10), 667-673 (2016).
- Shelby, T., et al. Novel magnetic relaxation nanosensors: an unparalleled "spin" on influenza diagnosis. Nanoscale. 8, 19605-19613 (2016).
- Bui, M. P., Ahmed, S., Abbas, A. Single-Digit Pathogen and Attomolar Detection with the Naked Eye Using Liposome-Amplified Plasmonic Immunoassay. Nano Lett. 15 (9), 6239-6246 (2015).
- Farnleitner, A. H., et al. Rapid enzymatic detection of Escherichia coli contamination in polluted river water. Lett Appl Microbiol. 33 (3), 246-250 (2001).
- Huh, Y. S., Lowe, A. J., Strickland, A. D., Batt, C. A., Erickson, D. Surface-enhanced Raman scattering based ligase detection reaction. J Am Chem Soc. 131 (6), 2208-2213 (2009).
- Jayamohan, H., et al. Highly sensitive bacteria quantification using immunomagnetic separation and electrochemical detection of guanine-labeled secondary beads. Sensors (Basel). 15 (5), 12034-12052 (2015).
- Kaittanis, C., Naser, S. A., Perez, J. M. One-step, nanoparticle-mediated bacterial detection with magnetic relaxation. Nano Lett. 7 (2), 380-383 (2007).
- Meeker, D. G., et al. Synergistic Photothermal and Antibiotic Killing of Biofilm-Associated Staphylococcus aureus Using Targeted Antibiotic-Loaded Gold Nanoconstructs. ACS Infect Dis. 2 (4), 241-250 (2016).
- Wang, Y., Ye, Z., Si, C., Ying, Y. Subtractive inhibition assay for the detection of E. coli O157:H7 using surface plasmon resonance. Sensors (Basel). 11 (3), 2728-2739 (2011).
- Zhao, X., et al. A rapid bioassay for single bacterial cell quantitation using bioconjugated nanoparticles. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (42), 15027-15032 (2004).
