Summary
竹粉用NaOH预处理，酶水解。竹纤维素水解产物被用作2,3-丁二醇，β-乙酰胆碱，2-酮基葡萄糖酸和肺炎克雷伯菌产生的木糖酸的原料。
Abstract
竹是重要的生物质，竹科水解产物被克雷伯杆菌用作化学生产的原料。这里，用NaOH预处理竹粉，洗涤至中性pH。将纤维素酶加入预处理的竹粉中以产生含有30g / L葡萄糖和15g / L木糖的水解产物，并用作碳源以制备用于化学生产的培养基。当在微需氧条件下培养时，野生型肺炎克雷伯菌产生12.7g / L 2,3-丁二醇。在需氧条件下， 肺炎支原体 芽胞芽孢杆菌突变体产生了13.0g / L的R-丝氨酸。在肺炎链球菌的budA突变体的两阶段，pH控制的发酵中补充高空气产生了25.5g / L的2-酮基葡萄糖酸和13.6g / L的木糖酸的混合物。在发酵的第一阶段，将培养物保持在中性pH值;细胞生长后，发酵n进入第二阶段，在此阶段，文化被允许变成酸性。
Introduction
肺炎克雷伯杆菌是一种在有氧和无氧条件下都能良好生长的细菌。 肺炎支原体是用于生产许多化学物质的重要工业微生物。 1,3-丙二醇是一种有价值的化学物质，主要用作合成聚对苯二甲酸丙二醇酯的单体。聚对苯二甲酸丙二醇酯是一种可生物降解的聚酯，其表现出比1,2-丙二醇，丁二醇或乙二醇1更好的性能。 1,3-丙二醇由肺炎链球菌在氧气限制条件下使用甘油作为底物生产2 。 2,3-丁二醇及其衍生物在塑料，溶剂生产和合成橡胶领域有应用，有潜力被用作生物燃料3 。以葡萄糖为底物，2,3-丁二醇是野生型菌株4的主要代谢物。 2,3-丁二醇是合成的从丙酮酸。首先，两分子丙酮酸缩合得到α-乙酰乳酸;该反应由α-乙酰乳酸合成酶催化。然后通过α-乙酰乳酸脱羧酶将α-乙酰乳酸转变成乙偶姻。当丁二醇脱氢酶催化时，β-维生素可进一步还原成2,3-丁二醇。已经探索了适用于肺炎克雷伯菌的有效基因替代方法，并且已经构建了许多突变体5,6,7 。失去其2,3-丁二醇脱氢酶活性的budC突变体在培养液中积累高水平的乙偶姻。乙酰头痛被用作增加食物味道的添加剂。当编码α-乙酰乳酸脱羧酶的budA被突变时，2-ketogluconic acid积聚在肉汤中。 2-酮基葡萄糖酸用于合成异抗坏血酸（异抗坏血酸），用于食品工业的抗氧化剂9 。 2-酮葡萄糖酸是葡萄糖氧化途径的中间体;在该通路中，位于周质空间中，葡萄糖被氧化成葡萄糖酸，然后进一步氧化成2-酮基葡萄糖酸。葡萄糖酸和在周质中产生的2-酮葡萄糖酸可以转运到细胞质进一步代谢。 2-酮基葡萄糖酸的积累取决于酸性条件，更高的空气补充有利于2-酮葡萄糖酸生产10 。葡萄糖酸脱氢酶，由gad编码， 催化葡萄糖酸转化为2-酮聚糖酸。 肺炎克雷伯氏菌的gad突变体产生高水平的葡萄糖酸而不是2-酮葡萄糖酸，并且该过程也依赖于酸性条件。葡萄糖酸是一种大量有机酸，用作添加剂以增加水泥1的性能1。葡萄糖氧化成葡萄糖酸由葡萄糖脱氢酶催化。木糖也是葡萄糖脱氢酶的合适底物。当木糖用作底物时， 肺炎克雷伯菌产生木糖酸12 。
使用生物质作为原料的化学生产是生物技术的热门话题13 。生物质的主要成分是纤维素，半纤维素和木质素。然而，这些大分子化合物不能被大多数微生物（包括肺炎克雷伯菌 ）直接分解代谢。生物质中的纤维素和半纤维素必须水解成葡萄糖和木糖，然后可以被微生物使用。在木质纤维素中木质素的存在产生防止酶的生物质水解的保护屏障。因此，消除木质素和半纤维素并降低纤维素的结晶度的预处理过程总是在通过麦克风的生物量利用期间进行roorganisms。已经开发了许多预处理方法：酸，碱，氨和蒸汽预处理是常见的。
竹子在热带和亚热带地区丰富，是重要的生物质资源。本文介绍了竹水解产物的制备和竹水解产物的化学生产
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Protocol
竹水合物的制备
- 在40 mL NaOH溶液中加入5 g竹粉，使其在250 mL烧瓶中达到10％（g / g）终浓度。使用0.05M至0.50M的一系列NaOH溶液，以0.05M的增量。
- 将混合物在60℃或100℃的水浴中孵育60分钟。在121℃下在高压釜中孵育。
- 孵育后，将混合物在室温下静置4小时。然后，取出上清液。加入100ml淡水并混合。
- 重复洗涤5-6次，直到上清液的pH达到6.8。使用所得固体进行下一步酶促水解。
- 对于水解，使用98％H 2 SO 4调节50mL上述混合物至pH 5.0。然后加入0.5 mL 200张滤纸活性（FPU）/ mL纤维素酶。
注意：纤维素酶与竹子的最终比例每1g竹子要20 FPU。 - 将混合物在振荡器中在50℃下孵育36小时。
注意：水解后，混合物中将残留一些固体。 - 通过以7,690 xg离心5分钟获得透明的水解产物。
- 用配有折射率检测器和光电二极管阵列检测器的高压液相色谱系统对葡萄糖，木糖和其他化学物质进行定量。使用HPX-87H柱（300 mm x 7.8 mm）和流动相为5 mM H 2 SO 4溶液，流速为0.8 mL / min。
- 对于大量的水解产物，在30L不锈钢罐中混合2kg竹粉和18L 0.25M NaOH。
- 在121℃下在高压釜中孵育罐60分钟。孵育后，用60升塑料罐中的40升水清洗混合物。重复洗涤5次。
- 用水调整洗涤的竹子总量为20升。使用98％H 2 SO 4将混合物的pH调节至5.0。
- 在配备有机械搅拌器的改进的摇动水浴中将混合物酶水解，以确保混合物分布良好。加入200 mL 200 FPU / mL纤维素酶，并将混合物在50℃孵育36小时。
- 水解后，以4,700 xg离心混合物10分钟。
2.野生型肺炎支原体的 2,3-丁二醇生产
- 使用3升竹水解产物作为介质制备的溶剂。
- 制备含有4g / L玉米浆，2g / L（NH 4 ） 2 SO 4，6g / LK 2 HPO 4,3g / L KH 2 PO 4和0.2g / L MgSO 4的发酵培养基。使用2.5M NaOH将介质的pH调节至中性。使用含有3升高压灭菌发酵培养基的5升生物反应器进行发酵。
- 使用肺炎支原体细胞储存在-80℃的低温冰箱中。
- 对于种子培养物，在37℃下，以200rpm摇动培养含有50mL Luria-Bertani（LB）培养基的250mL烧瓶过夜。使用含有10g / L胰蛋白胨，5g / L酵母提取物和10g / L NaCl的LB培养基。
注意：种子培养的细胞密度应达到OD 2（600nm处的光密度）。 - 接种一瓶50ml的种子培养物在生物反应器中。在pH 6.0和37℃保持培养。使用2升/分钟的空气补充速率和250rpm的搅拌速率，产生微量厌氧条件。
- 在发酵过程中每2 h收集5 mL样品，并用高压液相色谱法分析，以确定肉汤中的化学物质浓度。
- 使用MFCS / DA在线监测添加到生物反应器中的碱。
注意：有机酸在发酵过程中产生，a加入NaOH以保持培养物pH稳定。加入的碱的体积代表产生的酸的量。碱添加线高原时，由于碳源耗尽或细胞死亡，该过程完成。
- 使用MFCS / DA在线监测添加到生物反应器中的碱。
3.由肺炎克雷伯菌的budC突变体产生R-丝瓜素
- 制备含有4g / L玉米浆，2g / L（NH 4 ） 2 SO 4，3g / L乙酸钠，0.4g / L KCl和0.1g / L MgSO 4的乙偶姻生产的培养基。
- 使用肺炎支原体ΔbudC进行R-丝氨酸生产。重复步骤2.4-2.5。
注意： budC编码2,3-丁二醇脱氢酶。 肺炎克雷伯菌ΔbudC失去2,3-丁二醇脱氢酶活性，产生R-乙酰胆碱代替2,3-丁二醇。 - 在pH 6.0和37℃保持培养。使用4升/分钟的空气补充率和搅拌n速率为450 rpm，有氧条件。
注：补氧量高于2,3-丁二醇生产。 - 按照步骤2.6测定样品。
4. 肺炎克雷伯菌的budA突变株的2-酮葡萄糖酸生产
- 对于2-酮葡萄糖酸生产，使用与R-组氨酸生产相同的培养基。
- 使用肺炎克雷伯菌ΔbudA生产2-酮葡萄糖酸。重复步骤2.4-2.5。
注意： budA编码α-乙酰乳酸脱羧酶。 肺炎克雷伯菌ΔbudA失去α-乙酰乳酸脱羧酶活性，并以葡萄糖为底物产生2-酮基葡萄糖酸。
注意：2-酮葡萄糖酸合成是酸性条件依赖性过程。开发了2-酮葡萄糖酸生产的两阶段发酵10 ;在第一阶段，将种子培养物接种在生物反应器中。 - 按照步骤2.6测定样品。使用竹子的水解物作为碳源。
注意：将培养基中的葡萄糖转化为2-酮葡萄糖酸，并将木糖转化为木糖酸。由此得到2-酮基葡萄糖酸和木糖酸的混合物。
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Representative Results
在这个方案中，竹子是用碱预处理的。在图1和图 2中确定了最佳孵育参数 - 温度为121℃和0.25M NaOH。将预处理的竹子酶水解，测定水解产物中得到的葡萄糖和木糖浓度。更高的温度有利于糖的生产，所以选择121°C作为最佳温度。在水解产物中产生的葡萄糖和木糖在NaOH浓度范围内在0.05-0.25Ma范围内增加。NaOH浓度的进一步增加对糖的产生没有积极的影响。因此，选择0.25M的NaOH作为最佳浓度。
图1：预处理温度对葡萄糖和木糖的影响竹子水解物的浓度。红柱：葡萄糖;蓝色柱：木糖。更高的温度有利于糖的生产，并且选择121℃用于大量水解产物。 请点击此处查看此图的较大版本。
图2：预处理过程中NaOH浓度对竹子水解产物葡萄糖和木糖浓度的影响。红线：葡萄糖;蓝线：木糖。在水解产物中产生的葡萄糖和木糖在0.05-0.50M的范围内随着NaOH浓度的增加而增加，对于大体积的水解产物，选择0.25M。 请点击他重新查看这个数字的较大版本。
在烧瓶规模酶水解过程中，在水解产物中产生约20g / L葡萄糖和10g / L木糖;从大容量水解产物得到30g / L葡萄糖和15g / L木糖。这是因为在开放式水浴摇床中进行了大批量的制备，并且在该过程中蒸发了一些水，导致了水解产物的浓缩。竹子水解液中的葡萄糖和木糖被肺炎克雷伯杆菌用作化学生产的碳源。水解产物中的其他化合物为：纤维二糖（1.4g / L），阿拉伯糖（8.9g / L），乙酸（1.9g / L）和甲酸（0.2g / L）。
2,3-丁二醇由肺炎支原体在微需氧条件下生产（ 图3 ）。该过程分为两个时期。在f首先，细胞使用葡萄糖产生7.6g / L 2,3-丁二醇，而肉汤中的木糖水平保持不变。葡萄糖在8小时内耗尽，这时候转移到下一个时期。在第二时期，细胞中使用肉汤中的木糖，并产生另外的5.1g / L 2,3-丁二醇。第二期2,3-丁二醇的生产速度较慢。在该方法结束时，已经生产了总共12.7g / L的2,3-丁二醇。该方法的副产物是乳酸，乙酸和乙醇。在第一阶段（当葡萄糖用作碳源时）主要合成乳酸和乙醇，并连续合成乙酸。
图3：使用竹水解产物作为原料的2,3-丁二醇生产。红线：葡萄糖;蓝线：木糖;嘛红线：2,3-丁二醇;橙线：乳酸;黑线：乙酸;绿线：乙醇。水解产物中的葡萄糖和木糖均用于2,3-丁二醇合成，但首先使用葡萄糖，其次是木糖。 请点击此处查看此图的较大版本。
R-乙偶姻由有氧条件下的肺炎克雷伯氏菌的budC突变体产生（ 图4 ）。如在野生型菌株的2,3-丁二醇生产中，由肺炎支原体ΔbudC依次使用葡萄糖和木糖。木糖在16 h时耗尽，消耗速度快于野生型2,3-丁二醇生产。该方法结束时， R-乙酰胆碱的产量为13g / L，副产物为2,3-丁二醇，乙酸和eTHANOL。
图4：使用竹水解产物作为原料的L-丝氨乙酰胺生产。红线：葡萄糖;蓝线：木糖;紫线：乙偶姻品红线：2,3-丁二醇;黑线：乙酸;绿线：乙醇。水解产物中的葡萄糖和木糖均用于R-丝氨酸合成，其使用顺序为。 请点击此处查看此图的较大版本。
2-酮葡萄糖酸和木糖酸由肺炎克雷伯氏菌的budA突变体产生（ 图5 ）。这个过程需要高空气补充。培养基中的葡萄糖首先转化为葡萄糖积酸在肉汤中的酸性酸。葡萄糖酸在培养8 h时达到最高水平15 g / L，此后浓度降低。在培养6小时之前不产生2-酮葡萄糖酸。然后以高速率合成，并且在该方法结束时产生25g / L 2-酮基葡糖酸。将培养基中的木糖转化为木糖酸;该反应开始比葡萄糖转化为葡萄糖酸。在该过程中产生一些乙酸作为副产物。
图5：使用竹水解产物作为原料的2-酮基葡萄糖酸和木糖酸生产。红线：葡萄糖;橙线：葡萄糖酸;品红线：2-酮基葡萄糖酸;蓝线：木糖;黑线：乙酸;绿线：乙醇。水解产物中的葡萄糖转化为葡萄糖酸并进一步转化为2-酮基葡萄糖酸。将水解产物中的木糖转化为木糖酸。 请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
肺炎 克雷伯杆菌属于肠杆菌科科克雷伯 菌属 。 肺炎克雷伯病在土壤，植被和水等自然环境中广泛分布14 。本研究中使用的野生型肺炎克雷伯杆菌菌株从土壤中分离，用于1,3-丙二醇生产15 。这种物种的肺炎支原体和突变体在不同条件下产生许多化学物质。
培养pH和空气补充是影响肺炎克雷伯氏菌化学生产的关键因素。野生型肺炎克雷伯菌在pH6下产生2,3-丁二醇作为主要的分解代谢物。然而，当在pH5或更低的pH 9培养时，2-酮基葡萄糖酸变为主要的分解代谢物。增加空气补充剂减少了2,3-丁二醇的合成，而R-乙酰胆碱的合成改善了8 等人提出的方法16 ，这在实验室很容易执行，特别是在放大级。
较高的预处理温度有利于酶水解过程中的糖生产。在水浴中和121℃下在高压釜中进行≤100℃的处理。这两台设备在实验室中很常见，每批处理几升液体。较高的温度需要高压反应堆。例如，我们的实验室有50 mL和1 L高压反应堆，但这些反应堆的体积限制了其在生物量预处理中的使用。
本研究中显示的竹子水解产物在烧瓶中易于进行。然而，当大量进行时，有时会获得较低水平的葡萄糖和木糖。水解混合物必须分布良好。生物量的沉淀将导致较低的水解水平。
与纯葡萄糖和木糖不同，生物质水解物被许多可能抑制微生物生长的有毒化学物质污染。已经开发了许多方法去除这些抑制剂，但是它们增加了工艺成本，并且倾向于降低糖产量17 。在这项研究中，没有做任何特别的工作去除抑制剂。使用本工作中生成的竹水解产物作为原料，当葡萄糖消耗时，第一阶段葡萄糖与2,3-丁二醇的生产率（0.95g / Lh）和转化率（0.25g / g）较低比纯化葡萄糖作为碳源时，先前报道（分别为1.4g / Lh和0.3g / gm） 4 。 2,3-丁烷的生产率在第二阶段，当木糖消耗时，iol比第一阶段慢。然而，木糖与2,3-丁二醇的转化率达到0.34g / g，高于纯化葡萄糖作为碳源4时的转化率。使用竹水解产物作为原料的R-维生素B的生产率和底物转化率分别为0.92g / Lh和0.29g / g。这两个比例都低于使用纯化葡萄糖作为底物（分别为1.7g / Lh和0.34g / g）。本研究中2-酮基葡萄糖酸的生产率和转化率分别为2.3 g / Lh和0.91 g / g，分别低于纯化葡萄糖作为碳源时（4.2 g / Lh和1g / g） ） 10 。
葡萄糖后，木糖是自然界中第二大丰富的糖。与葡萄糖不同，大多数微生物不容易利用木糖。在这个螺柱y，木糖完全被K. pneumoniae用于化学生产。 2,3-丁二醇， R-乙酰胆碱，2-酮基葡萄糖酸和木糖酸都是有价值的化学物质，其生产工艺从微需氧到高需氧条件不同。发酵结果表明，竹子水解产物中的糖是不同条件下肺炎克雷伯杆菌生长和化学生产的合适碳源。
使用生物质水解产物作为原料是化学生产的有希望的方法。然而，仍然有许多缺点必须克服，例如洗涤预处理的生物质所需的大量水和酶水解所需的漫长时间。
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Disclosures
作者没有什么可以披露的。
Acknowledgments
这项工作得到了国家自然科学基金（批准号：21576279,20906076）和KRIBB研究计划（KGM2211531）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| autoclave | SANYO | 3780 | |
| bioreactor | Sartorius stedim biotech | Bostat Aplus | |
| agitator | IKA | RW 20 | |
| water bath shaker | Zhicheng | ZWY-110X50 | |
| high performance liquid chromatograph system | Shimadzu Corp | 20AVP | |
| centrifuge | Hitachi | CR22G III | |
| Bamboo powder | purchased from Zhejiang Province, China | mesh number, 50 | |
| cellulase | Youtell Biochemical, Shandong, China | 200 PFU/mL |
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