Summary
الخلايا الجذعية هي حاملات علاجية واعدة لعلاج أورام المخ بسبب استدارة الورم الجوهرية. غير الجذعية داخل الخلايا الجذعية تسليم تسليم يتجاوز حاجز الدم في الدماغ ويظهر إمكانات قوية للترجمة السريرية. هذه المقالة تلخص المبادئ الأساسية للتسليم الخلايا الجذعية داخل الأنف في نموذج الماوس من الورم الدبقي.
Abstract
إن النزعة الذاتية تجاه الأورام الخبيثة في الدماغ تجعل الخلايا الجذعية ناقلات واعدة من العوامل العلاجية ضد الأورام الخبيثة. تسليم الخلايا الجذعية العلاجية عبر الطريق الأنف هو استراتيجية بديلة اكتشفت مؤخرا، مع إمكانات قوية للترجمة السريرية، وذلك بسبب طبيعته غير الغازية مقارنة مع زرع داخل الجمجمة أو التسليم عن طريق الطرق النظامية. عدم وجود حاجز الدم في الدماغ يزيد من القدرة العلاجية للخلايا الجذعية التي تمر دخول الدماغ داخل الأنف. يلخص هذا المقال التقنيات الأساسية المستخدمة في دراساتنا ويحدد المبادئ الأساسية لاستراتيجية الأنف لتسليم الخلايا الجذعية باستخدام نموذج الماوس من زينوغرافتس الورم داخل الجمجمة. نحن نبرهن على الإجراءات المثلى التي تولد نتائج متسقة وقابلة للتكرار مع معلمات تجريبية محددة سلفا وتقديم مبادئ توجيهية لتدفق العمل مبسطة التي تضمن التنفيذ الفعال وموثوق بها إكسيريمناتال. تم تصميم هذه المادة لتكون بمثابة خط الأساس لمزيد من التخصيص التجريبي على أساس الفرضية، أنواع الخلايا الجذعية، أو تفاصيل الورم.
Introduction
سمية منخفضة، وانخفاض المناعة، و تروبيسم ورم الدماغ الذاتية من الخلايا الجذعية البشرية هي سمات جذابة لتقديم المركبات العلاجية 1 . العلاجات المستندة إلى الخلايا الجذعية الجديدة لأورام الدماغ الخبيثة هي ابتكارات واعدة وضعت في السنوات الأخيرة، والتكيف الأنف من هذه الاستراتيجية العلاجية يمثل قفزة نحو الترجمة السريرية، في أن الإدارة غير الغازية والمتكررة قد تقلل بشكل كبير من حاجز لتطبيقات المريض و قد تكون قابلة للتكيف لخدمات المرضى الخارجيين دون التخدير العام أو خدمة طويلة للمريض الداخلي المرتبطة الإجراءات الجراحية الغازية 1 ، 2 ، 3 ، 4 .
نحن وغيرنا من رواد رائدة في طريق الأنف من تسليم الخلايا الجذعية إلى أورام الدماغ، ووضعت الأرض العمل لبعض المبادئ الأساسيةمن البحوث متعدية باستخدام نماذج الطعم أجنبي الماوس 2 ، 3 ، 4 ، وكذلك التحقيق في هجرة الخلايا الجذعية في الجسم الحي عن طريق التصوير بالرنين المغناطيسي (مري) حاملات كاشف 2 . من خلال هذه الاستكشافات الرائدة، تراكمت لدينا خبرة كبيرة واكتسبت نظرة على كيفية بناء أفضل استراتيجية تقييم ما قبل السريرية قوية باستخدام الراسخ المستمدة المريض طيور أجنبي (بدكس) نماذج الماوس من الورم الخبيث، مع الحفاظ على قرار التحقيق لفحص تفاصيل ميكانيكية دقيقة من الظواهر البيولوجية المتطورة من دخول الدماغ داخل الأنف من الخلايا الجذعية العلاجية تسليمها إلى تجويف الأنف. هنا، نحن تصف مبادئ بروتوكول التشغيل موحدة لإظهار الحالة الراهنة من التحقيقات التجريبية باستخدام راسخة العصبية البشرية خط الخلايا الجذعية HB1.F3.CD 5
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
يجب أن تتم الموافقة على جميع الإجراءات الحيوانية من قبل اللجنة المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام (إاكوك) أو ما يعادلها. إذا كان هناك أي عدم يقين بشأن الإجراءات المحددة الموضحة هنا، لا المتابعة. توضيح مع إاكوك المؤسسة وموظف بيطري معين.
1. ضمان عقم الخلايا المستزرعة واتباع مبادئ تقنيات العقيم
- اتبع الممارسة مختبر جيد القياسية في جميع إجراءات زراعة الخلايا ومتطلبات إاكوك لاختبار الخلايا والممرضة تأكيد حالة خالية قبل أن تدير على الفئران 9 ، 10 .
- اتبع متطلبات المعاهد الوطنية للصحة لمصادقة الخلية لضمان النتيجة استنساخه 11 .
- اتبع تقنيات الجراحة الحيوانية المعقمة التي تم تحديدها في هذه المخطوطة 4 .
2. إعداد خلايا غليوما ل <إم> في فيفو إكسيريمنت 2 ، 4
- خلايا الدم الدبقية (GBM43 و GBM6 و U87MG) في مصل الدم البقري الجنيني (10٪) في وسط دولبيكو المتوسط النسر المعدل (دمم)) أو الوسط الخالي من المصل (الوسط العصبي مع المكملات B27، N2، الهيبارين، عامل نمو البشرة [ إغف]، عامل نمو الخلايا الليفية الأساسية [بفغف]، والمضادات الحيوية، و L- الجلوتامين 12 )، في ترطيب كو 2 حاضنة ثقافة الخلية.
- اختبار جميع خطوط الخلايا عبر لوحة الماوس واضحة تشغيل من مقدمي الخدمات التجارية.
- جمع الخلايا الملتصقة عن طريق إزالة المتوسطة الثقافة. احتضان مع 0.05٪ التربسين لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (1 مل من التربسين لقارورة T25، 2 مل ل T75 قارورة، وحجم وفقا لثقافات قوارير مع مساحة أكبر) ثم يغسل الخلايا مع الكالسيوم 2 + و مغ 2 + الفوسفات الحرة مخزنة المالحة (بس).
- اضغط علىقارورة لطرد الخلايا وتحييدها فورا مع فائض من المتوسطة التي تحتوي على مصل (8 - 9 مل). ثم استخدام ماصات المصلية لنضح تعليق الخلية في أنابيب الطرد المركزي.
- تعليق خلية الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 5 دقائق. غسل الخلية مرتين على الأقل مع 10 مل من برنامج تلفزيوني عن طريق الطرد المركزي المتكررة.
- جمع خلايا الورم نمت كما المجالات الورم في وسط خالية من المصل عن طريق الطرد المركزي (نفس السرعة والمدة على النحو الوارد أعلاه). فصل خلية بيليه عن طريق الحضانة في 1 - 2 مل من محلول انفصال الخلية عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق قبل غسل مرتين مع 10 مل من برنامج تلفزيوني عن طريق الطرد المركزي (400 × 5 دقائق).
- إعادة تعليق الورم الدبقي في محلول ملحي معقم بتركيز من 50،000 - 200،000 خلية لكل 2.5 ميكرولتر. أرقام الخلايا المستخدمة للحقن في الدماغ الماوس تعتمد على معدل النمو الثابت لكل خط خلية دبقية. هنا، استخدام 25،000 و 100،000 ل GBM43 و GBM6 الخلايا السرطانية المستمدة من المريض، على التوالي.
- إعداد ضعف كمية نيسساري لعدد الزرع لحساب فقدان جزء أثناء الإجراء. نقل تعليق خلية عن طريق الحقن إلى أنبوب ميكروسنتريفوج العقيمة ووضع أنبوب على الجليد. إبقاء الخلايا على الجليد لمدة 2 ساعة كحد أقصى أثناء العمليات الجراحية، وإعداد دفعة جديدة إذا كان من المقرر الجراحات الممتدة.
3. داخل الجمجمة زرع لخلق طعم أجنبي نماذج الماوس ( الشكل 1A ) 2 ، 4 ، 13
- قبل يوم الجراحة، وتعقيم جميع الأدوات الجراحية في الأوتوكلاف، وإعداد كل ما قبل وبعد الجراحة المواد رعاية الحيوان في إاكوك بروتوكول المعتمدة. تعقيم الإطار التجسيمي والمعدات الطرفية لضمان ظروف معقمة أثناء العملية، وبالتالي تقليل المضاعفات.
- تنظيم منطقة العملية للحد من فوضى وإمكانية التلوث.
- اللباس في معدات الحماية الشخصية المناسبة(ب) وفقا لمتطلبات إاكوك.
- إعداد المناسبة غرفة الانتعاش بعد الجراحة. تأكد من أن التخدير والمسكنات مستعدة طازجة باستخدام الكواشف غير المنتهية. إعداد المناسبة أدوات صيانة حرارة الجسم في إاكوك وافق البروتوكول.
- لإنشاء زينوغرافتس خلية دبقية المستمدة من المريض البشري لاختبار تسليم الأنف من نسس الإنسان، واستخدام أنواع الماوس المناعة مثل نو / نو الماوس الأثيمية من أي نوع الجنس في حوالي 6 أسابيع من العمر.
- تخدير الحيوان على أساس وزن الجسم باستخدام الكواشف المعتمدة، أي إما عن طريق الحقن داخل الصفاق (إب) من خليط من الكيتامين (50-100 ملغ / كغ؛ استشارة إاكوك المؤسسي لنطاق الجرعة المعتمدة) وزيلازين (5-10 ملغ / كغ؛ استشارة إاكوك المؤسسية لنطاق الجرعة المعتمدة) في 200-250 ميكرولتر محلول ملحي معقم، أو عن طريق 4-5٪ إيسوفلوران التخدير باستخدام جهاز استنشاق.
- تأكد من أن الحيوان قد وصلت إلى طائرة التخدير الجراحية بy تو معسر قبل شق الجلد. تطبيق وافرة هلام العيون العقيمة لضمان حالة رطبة من القرنيات من الحيوان.
- تعقيم الجمجمة باستخدام مناديل دائرية المتكررة والتناوب من بيتادين والكحول الأيزوبروبيل لكل بريتشيت-كورنينج وآخرون. 14 -
- توريد قبل تسكين شق عن طريق حقن سك من بوبرينكس (0.05 - 2 ملغ / كلغ) قبل شق باستخدام شفرة الجراحية.
- استخدام قضيب تعقيم القطن ذات الرؤوس لمساعدة مرقئ في حين تعريض الجمجمة. استخدام 3٪ بيروكسيد الهيدروجين لتسهيل إزالة النزيف العرضي.
- استخدام بطارية تعمل باليد الحفر الكهربائية المحمولة (أقل من 1 ملم في العرض) لخلق ثقب لدغ في 2 مم الوحشي، إما اليسار أو اليمين، إلى خط الوسط، و 2 مم وراء بريجما (يمكن تخصيص إحداثيات الموقع على أساس على نموذج الورم المقصود لدراسة معينة).
- جبل الحيوان إلى الإطار التجسيمي إلى أدوبلاته رئيس الموقف، بحيث إدراج هاميلتون الحقنة الصغيرة عمودي على سطح الجمجمة حول ثقب لدغ. الحرص على ضمان أن الطائرة مخدر الحيوان في وضع جيد من قبل اصبع القدم معسر. مراقبة معدل التنفس للتأكد من أن الحيوان ليس تحت الإجهاد الألم خلال الخطوات التالية.
* نحن لا نؤكد في الأذن بار المواضع ل:- لدينا بريدريلد ثقب لدغ لوضع الإبرة، وبالتالي، دقيقة إحداثيات الجمجمة هي لا لزوم لها.
- قنوات الأذن الماوس هي هشة، ووضع الأذن في الأذن الحانات دقيقة تتطلب التدريب أكثر تورطا التي ليست ذات صلة غرضنا. مخاطر الأضرار التي لحقت قنوات الأذن الفئران تفوق فوائد وضع الدقيق.
- دعم الخد هو أسهل بكثير لأداء وقادرة على تحقيق نفس مستويات استقرار الرأس الماوس والتوازن أثناء تحديد المواقع. بل هو فائدة إضافية لعدة عمليات حساسة للوقت لضمانوالانتهاء في الوقت المناسب مع بقاء الخلية جيدة.
- استخدام المقابض الإطار التجسيمي لوضع الحقنة الصغيرة طرف مسطح إلى ثقب لدغ، ثم خفضه ببطء إلى 3 مم تحت سطح الجافية. سحب 0.5 ملم للحفاظ على غيض من الإبرة في 2.5 مم تحت الجافية.
- حقن 2.5 ميكرولتر من الخلايا الدبقية مسبقة على مدى فترة 1 دقيقة. السماح لإبرة الحفاظ على موقفها لمدة 1-2 دقيقة أخرى قبل ببطء، على مدى 1 دقيقة، وسحب الإبرة من الدماغ ورعاية للحد من ارتجاع الخلية. تطبيق شمع العظام العقيمة لتجنب خارج الورم خارج الورم.
- إغلاق الجرح باستخدام مقاطع الفولاذ المقاوم للصدأ الجرح (7 ملم). تقديم حقن تحت الجلد (سك) من 1 مل من محلول رينغر العقيمة لاكتاتد (قبل تحسنت إلى 37 درجة مئوية)، ووضع الحيوان في غرفة الانتعاش الذي هو في منتصف الطريق على وسادة التدفئة.
- عودة الحيوانات إلى رف التهوية مرة واحدة أنها استعادة الحركة، واتبع الرعاية بعد الروتينية الروتينية لضمان سموت ساعة.
4. في فيفو تلألؤ بيولوجي (بلي) من نمو الورم ( الشكل 1B ) 15
ملاحظة: يتم تعديل الخلايا الدبقية المستمدة من المريض للتعبير عن لوسيفيراس اليراع. هذا يسمح لنا لمتابعة تطور الورم بعد زرع داخل الجمجمة.
- إعطاء الحيوانات حقنة الملكية الفكرية من D- لوسيفيرين، ملح البوتاسيوم (150 ملغ / كلغ) 10 دقيقة قبل جلسة التصوير.
- وضع الحيوانات على الفور في غرفة تحريض الأيزوفلورين الأكسجين التي وافقت عليها إاكوك.
- وضع الحيوانات داخل غرفة التصوير ساخنة (37 درجة مئوية) لالتقاط إشارة بلي باستخدام إعدادات البرنامج (لمزيد من التفاصيل، انظر تعليمات الشركة المصنعة).
5. كله تشعيع الدماغ ( الشكل 1C ) 2 ، 4 ، 13
> ملاحظة: لتعزيز الهجرة من هنسس تسليمها داخل الأنف إلى أورام الدماغ، يمكن استخدام كامل تشعيع الدماغ من الفئران تحمل زينوغرافتس الورم داخل الجمجمة 4 .
- استخدام حقنة الملكية الفكرية من الكيتامين وخليط زيلازين (50-100 ملغ / كغ و5-10 ملغ / كغ على التوالي؛ استشارة إاكوك المؤسسية لمدى الجرعة المعتمدة) مع طائرة التخدير تحت الجراحية لحث معتدل التخدير للفئران.
- استخدام علبة عينة لوضع الفئران داخل الغرفة بين كتل التدريع الرصاص، والسماح للرئيس فقط التعرض لمسار الإشعاع ( الشكل 2 ).
- إعطاء الفئران مع تأكيد بلي إيجابية من نمو الورم (عادة في اليوم 7-8 بعد زرع خلايا الورم) جرعة يومية من 2 غراي من التشعيع لمدة 5 أيام متتالية. أداء بلي تقييم الورم بعد الجرعة الإشعاع الماضي.
6. التعديل الوراثي للخلايا الجذعية العصبية البشرية (نسس؛ الشكله 3A) 4
- الحفاظ على نسس الإنسان (استنساخ HB1.F3.CD) 6 ، 7 في دمم المتوسطة مع 10٪ فبس و 1٪ البنسلين الستربتومايسين في رطوبة 37 درجة مئوية تحت حاضنة 95٪ الهواء الغرفة و 5٪ كو 2 ( N نسس).
- تنفيذ أوفيركسريسيون الوراثية من مستقبلات كيميائية، مثل مستقبلات تشيموكين موتيف تشيموكين 4 (CXCR4)، في هنسس عن طريق تنبيغ مع ترميز لنتيفيروس الإنسان CXCR4.
- عندما نسس بالقرب من 75-80٪ كونفلنسي، إضافة الفيروس المضاد CXCR4 إلى وسط الثقافة جنبا إلى جنب مع البوليبرين (8 ميكروغرام / مل)، واحتضان لمدة 8 ساعات أو بين عشية وضحاها.
- استبدال المتوسطة التي تحتوي على الفيروس مع المتوسطة الطازجة التي تحتوي على بلاستيسيدين في 4 ميكروغرام / مل لاختيار إيجابي من الخلايا ترانسدوسد.
- التحقق من مستوى التعبير CXCR4 في هنسس المعدلة ( CXCR4 نسس) عن طريق التدفق الخلوي باستخدام الأجسام المضادة المضادة لل CXCR4 والمطابقة إيزوتيب الأجسام المضادة و السادسكمي رت-ير باستخدام زوج من الاشعال تضخيم CXCR4 و نازعة غليسيرالدهيد 3-فوسفات (غابد) كدناس 4 .
- توليد نسس مكافحة ناقلات ( فك نسس) باستخدام نفس الاستراتيجية، مع رفب استبدال الجينات CXCR4، والتحقق عن طريق الفحص المجهري أو التدفق الخلوي بسبب وجود طلب تقديم العروض رفب.
7. نقص الأكسجين المسبق ل نسس الإنسان ( الشكل 3A ) 4
- لوحة نسس المستزرعة في قوارير ثقافة T75 كما هو موضح أعلاه حتى يتم التوصل 90٪ كونفلنسي.
- مكان قوارير ثقافة الخلية داخل ترطيب غرفة كو 2 / حاضنة مع الحفاظ على 1٪ O 2 مستويات لمدة 24 ساعة، عن طريق N 2 إمدادات الغاز التي تسيطر عليها الآلي المدمج في متر التدفق. ويشار إلى هذه الخلايا باسم H نسس. ويرد وصف نسس التحكم N في الخطوة 7.1.
8. تحميل هورجل نسس مع فيروس أونكوليتيك ( الشكل 3B -3H ) 5
- 8.1.In نسكت N نسس، H نسس، نس نس، و CXCR4 نسس مع 50 اتشدي متماثل الشرطية (كراد) -S-pk7 الجسيمات الفيروسية / خلية 4 ، 16 .
- 8.2.بعد 2 ساعة من الحضانة في درجة حرارة الغرفة مع التنصت الدوري، وغسل الخلايا ثلاث مرات مع وسائل الإعلام لإزالة الجسيمات الفيروسية غير منضم وتعليق الخلايا في محلول ملحي معقم للحقن.
تنبيه: تنفيذ جميع الإجراءات المتعلقة بالفيروسات في الخلايا المختبرية المتعلقة بالفيروسات في المنشآت ذات المستوى المناسب للسلامة الأحيائية، مثل BSL2. يجب أن يرتدي معدات الوقاية الشخصية المناسبة من قبل الباحثين الذين يتعاملون مع فيروس الورم في المبادئ التوجيهية منشأة الحيوان الحيوان 4 ، 16 .
9. تحميل الخلايا الجذعية مع مايكروn- حجم أكاسيد الحديد باراماجنيتيك (مبيوس) لفي فيفو تتبع عن طريق التصوير بالرنين المغناطيسي (مري؛ الشكل 3B -3H ) 2
- لتسمية الخلايا الجذعية، إضافة مبيوس لوقف الثقافات الخلية في ~ 80٪ كونفلنسي، في وجود كاشف ترنسفكأيشن للحضانة بين عشية وضحاها. يتم تحديد كفاءة وضع العلامات الخلايا الجذعية (نسس 4 أو اللجان الدائمة 2 ) مع مبيوس (فلاش الأحمر مترافق) عن طريق التدفق الخلوي.
- لتصور هجرة الخلايا الجذعية والتوزيع في أدمغة الحيوانات الدبقية، والحصول على كل من شريحة متعددة عالية الدقة T2 المرجح اكتساب السريع مع الاسترخاء تعزيز تدور صدى الصور ومتعددة شريحة T1 المرجحة سريع تسديدة منخفضة الزاوية تسديدة (فلاش) تسلسل صدى التدرج إلى وتقييم هيكل عبر كل من الاكليلية والمحورية الطائرات من الدماغ الماوس 2 .
10. داخل الأنف تسليم نسس العلاجية (
- الثقافة وجمع نسس ( N نسس، H نسس، نس نسس، و نسكس CXCR4 ) وفقا للبروتوكول الموصوفة في القسم 3.
تنبیھ: یجب تنفیذ جمیع الإجراءات الحیوانیة التي تنطوي علی نسس المحملة ب أوف في المرافق ذات التصنیف المناسب لمستوى السلامة البیولوجیة، مثل مرافق BL2 أو BSL2. - تخدير الفئران عن طريق حقن الملكية الفكرية من الكيتامين وخليط زيلازين وفقا للخطوة 3.6.
- وضع الفئران على ثنى نظيفة مواجهة مع وسادة التدفئة تحته للحفاظ على درجة حرارة الجسم. ضبط وسادة مبطن مصنوعة من مناشف ورقية ملفوفة مع الأشرطة لضمان زاوية تستقيم من فتحتي الأنف عند وضعها تحت رأس الماوس.
ملاحظة: هيالورونيداز قبل العلاج (مجموعه 100 U كما أربع التطعيمات المتكررة في فترات 5 دقائق، 3 ميكرولتر في كل منخر) من الأنف هتم وصف بيثليوم سابقا 2 ، 17 . - باستخدام ميكروبيبيت، والاستغناء 2 ميكرولتر من تعليق نسك إلى كل منخر من الفأر. تأكيد بصريا طموح قطرة قبل الانتقال إلى الماوس التالي. ويمكن تحديد العدد الإجمالي للخلايا تسليمها من قبل المستخدم. استخدام 62،500-125،000 خلية / ميكرولتر، بحيث 0.5-1 مليون خلية يمكن تسليمها في 4 × 2 ميكرولتر جرعات.
- استخدام جهاز توقيت لضمان فترات 5 دقائق بين كل إدارة تعليق خلية، وتصل إلى 4 مرات.
- السماح للحيوانات لاستعادة الحركة في غرفة الانتعاش، مع موقف ضعيف حافظت طوال الوقت.
11. بقاء تحليل ( الشكل 3E )
- إدخال بيانات مدة البقاء على قيد الحياة من الحيوانات في البرمجيات الإحصائية، وإجراء مقارنات إحصائية باستخدام اختبار رتبة السجل مع التسميات أهمية التالية: * p < 0.05، ** p <0.01، *** p <0.001.
12. الأنسجة جمع والأنسجة / إمونوسيتوشيميستري التحقق من داخل الدماغ الخلايا الجذعية دخول الدماغ 2 ، 4
- في نهاية نقطة الدراسة، الموت ببطء الفئران عبر البروتوكولات المعتمدة إاكوك. والممارسة القياسية هي استخدام غرفة كو 2 التي تسيطر عليها معدل التدفق للتضحية الحيوانات كاستراتيجية القتل الرحيم الأولية تليها إكسانغينييناتيون عن طريق تثبيت نضح.
- على الفور بعد التضحية بها، إجراء نضح داخل القلب مع برنامج تلفزيوني على الحيوان لضمان القضاء على بقايا الدم من الأوعية الدموية والحفاظ على الأنسجة لتحليل النسيجي اللاحقة.
- وضع ثاني أكسيد الكربون الحيوان 2 -thutized على الجزء العلوي من وسادة ماصة في موقف ضعيف، المضي قدما في البطن لفضح العضلات الحجاب الحاجز، الذي يتم تشريح جنبا إلى جنب مع القفص الصدري، لفضح القلب.
- بعد ماملك نيك على الأذين الأيمن باستخدام زوج من مقص تشريح، وتسريع إكسانغينييناتيون مع 3-5 مل من حقن بس عبر البطين الأيسر في قمة. حقن الباردة الباردة بارافورمالدهيد 4٪ (بفا) في الدورة الدموية باستخدام حقنة. تشنجات العضلات الطرفية توفر تأكيدا بصريا أنه لا يوجد انسداد كبير في الدورة الدموية التي من شأنها منع تثبيت الأنسجة المناسبة.
- إزالة جراحيا رأس الذبيحة والحفاظ عليها في أنبوب الطرد المركزي 50 مل في 4٪ بفا عند 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها. تغيير الحل إلى 30٪ السكروز في اليوم التالي قبل تشريح أنسجة المخ آخر 24 ساعة في وقت لاحق.
- تضمين أنسجة المخ في مجمع أكتوبر وتجميد فلاش على الأيزوبنتان على الجليد الجاف. أداء كريوسكتيونينغ من كتلة الأنسجة الناتجة لتوليد 10-20 ميكرون أقسام الأنسجة لتطبيقات الأنسجة وتطبيقات إمونوسيتوشيميستري.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
كل من نقص الأكسجين قبل المعالجة ( الشكل 4A ) 4 و أوكسيركسريسيون CXCR4 ( أرقام 4B و 4 C) 4 بشكل كبير أوبريغولات وجود غشاء الخلية من مستقبلات CXCR4 كما يتضح من التدفق الخلوي. وتظهر تروبيسم الورم التي أظهرتها نسس (الأسهم الزرقاء)، في الأنسجة الأنسجة الورم (دائرة حمراء). يتم تأكيد وجود مبيو المسمى ( الشكل 4D ) الخلايا الجذعية في الورم عن طريق تلطيخ الأزرق البروسي ( الشكل 4E ). 4
تحليل الأنسجة يشير إلى أن الرأس فقط التشعيع ( الشكل 2 ) يدفع إلى الحد من حجم الورم، وكذلك أوبرفولاتيون سدف-1 في الورم والأنسجة المحيطة بها ( أرقام 5A و 5 B )4، مما يؤكد فرضية أن مستقبلات CXCR4 أوبريغولاتد في نسس قد تسهل تروبيسم الورم بعد سرت.
ويشير تحليل البقاء على قيد الحياة إلى أنه على الرغم من التشعيع (سرت) وحده هو مفيد لبقاء الحيوانات التي تحمل ورم ( الشكل 6A ) 4 ، يمكن تحقيق فوائد إضافية باستخدام H نسس محملة أوف على N نسس تحميلها مع أوف في سياق زرت ( الشكل 6B ) 4 . فوائد كبيرة البقاء على قيد الحياة يمكن أن ينظر أيضا مع نسكس CXCR4 نسس وراثيا في نفس النظام العلاجي السياقية ( الشكل 6C ) 4 .
تحليل الأنسجة يؤكد أن كلا نسس H و نسكس 4 CXCR4 تعزيز كبير في تسليم الورم المستهدفة من المركبات العضوية الثابتة، كما هو مبين من قبل ستاإينينغ لبروتين هيكسون الفيروسي ( أرقام 7A و 7 B) 4 .
الشكل 1: الرسم التخطيطي تدفق الإجراءات العامة الحيوانية المشاركة. ( A ) يتم إنشاء نماذج الورم عن طريق طعم أجنبي للخلايا الدبقية المستمدة المريض. ( B ) يتم رصد نمو الورم عن طريق بلي. ( C ) يتم تسليم العلاج الإشعاع رئيس فقط كما هو موضح في الإجراء 6. ( D ) يتم الحفاظ على مستلق وميل الرأس الموقف خلال الخلايا الجذعية العلاجية الأنفية التسليم كما هو مفصل في الإجراء 11. ( E ) بعد العلاج بقاء الرصد، حيوان صغير والتصوير والتحليل النسيجي للأنسجة إذا لزم الأمر متابعة. الرجاء الضغط هنا للمشاهدةنسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: إعداد الحيوانات للتشعيع. يتم وضع الفئران تخدير بين الدروع الرصاص داخل علبة العينة مما يسمح للتشعيع الرأس فقط. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: مخطط تدفق للإجراءات العامة لإعداد الخلايا الجذعية المشاركة قبل التسليم داخل الأنف. (أس) المعالجة المسببة للأكسجين أو التعديلات الجينية للخلايا الجذعية إلى الإفراط في التعبير عن CXCR4. (بد) الغسيل، التفكك الأنزيمي، وجمع الخلايا، وخطوات العد هي لكلشكلت لتحميل لاحق من الخلايا الجذعية مع البضائع العلاجية أو التشخيص. ( E ) يمكن تحميل الكواشف العلاجية، مثل الفيروسات أونكوليتيك، أو أجهزة التتبع التشخيصية، مثل جسيمات مبيو، في الخلايا الجذعية التي تم جمعها في تركيزات مناسبة مع الهز الدوري والتهيج لطيف ( F ). ( جي ) يمكن بعد ذلك غسل الخلايا الجذعية المحملة وتحسب للتسليم داخل الأنف إلى الفئران. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: تحليل تعديلات الخلايا الجذعية لتعبير CXCR4 و مبيو لوادينغ. (أس) التدفق الخلوي يمكن تشغيل للتحقق من التعديلات المظهرية للخلايا الجذعية نتيجة لنقص الأكسجين قبل المعالجة أو الوراثيةهندسة. (التفاصيل يمكن العثور عليها في دي وآخرون 4 ) ( دي ) الكشف عن نجاح تحميل مبيو من الخلايا الجذعية والنتائج في الجسم الحي يمكن أن يتحقق عن طريق التدفق الخلوي والتلطيخ الأزرق البروسي، على التوالي. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: يتم تأكيد الفرضية القائلة بأن التشعيع ييسر 1-سدف-1 (الإشارات الخضراء) أوبريغولاتيون في الأنسجة الدبقية والمحيطة عن طريق التشريح المرضي و إمونوسيتوشيميستري من أقسام الأنسجة. يزيد التشعيع التعبير سدف-1 في طعم أجنبي GBM43. تحليل H & E تلطيخ و إمونوسيتوشيميستري من أقسام أنسجة المخ من السيطرة والفئران المشععة ديموندريخفض عبء الورم ولكن زيادة مستويات سدف-1 في مواقع الورم بعد العلاج كرت. ( A ) التعبير سدف-1 (الأخضر) هو موضعيا بقوة في موقع الورم (مربعات بيضاء) بعد زرت. ( B ) قياس الكثافة في حقول المشاهدة يدل على زيادة أربعة أضعاف في التعبير سدف-1 في الحيوانات المعالجة كرت بالمقارنة مع الحيوانات السيطرة (ن = 3 تجارب، *** p <0.001، الطالب تي اختبار). التفاصيل يمكن العثور عليها في دي وآخرون. 4 الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: فوائد البقاء على قيد الحياة من نسس المعدلة تمت ملاحظتها (التفاصيل يمكن العثور عليها في دي وآخرون 4 ). ( أ ) تم إنشاء سياق الفوائد العلاجية من كرت (*** p <0.001، اختبار رتبة السجل). ( B ) نقص الأكسجين قبل المعالجة من الخلايا الجذعية محملة أوف يعزز البقاء على قيد الحياة الحيوانية (* p <0.05). C. CXCR4 تعزيز وراثي يزيد من بقاء الحيوانات (** p = 0.0013). التفاصيل يمكن العثور عليها في دي وآخرون. 4 الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 7: تأكيد أوف توفيرها من قبل نقص الأكسجة أو CXCR4 تعزيز نسس إلى ورم المخ زينوغرافتس يتم تحقيقه عن طريق الفيروس هيكسون الكشف عن البروتين بواسطة إمونوسيتوشيميستري (النقاط الخضراء) من أقسام الأنسجة من أدمغة الفئران تعامل مع إما H A ) أو CXCR4 نسس ( B )، *** p <0.001 t تيست. التفاصيل يمكن العثور عليها في دي وآخرون. 4 الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
على الرغم من أن طريق الأنف من تسليم المخدرات وقد تم استكشاف على نطاق واسع للجزيئات الصغيرة، نانومديسينس، والمركبات البروتين على حد سواء 18 ، وتطبيق الخلايا الجذعية العلاجية لاستئصال ورم الدماغ في الأنف هو جديد جدا في الطيف من العلاجات الورم في الدماغ تحت التطوير 2 ، 3 ، 4 - هناك تعقيدات جوهرية تتعلق بسلوك الخلايا الجذعية في تجويف الأنف، والتفاصيل الجزيئية لا تزال غير واضحة. حجم الخلايا الجذعية وآليات توزيعها على طول الأعصاب القحفية تختلف بشكل كبير عن تلك البيولوجية البيولوجية غير الخلية أو الجزيئات الصغيرة، ونحن حاليا تشارك في تحقيقات ميكانيكية مفصلة تنطوي على سلوكيات الخلايا الجذعية العلاجية في ظهارة الأنف. التفاعلات الجزيئية التي تنطوي على سطح الخلايا الجذعية مستقبلات التعبير السيتوكين التعبير، فضلا عن المصفوفة خارج الخلية(إسم) جزيئات الالتصاق مثل إنتغرين، قيد التحقيق لتسليط الضوء على أسس إدخال الدماغ داخل الأنف من الخلايا الجذعية. الخطوات الحاسمة داخل البروتوكول الحالي متعددة: 1) إنشاء مناسب للطعم أجنبي الورم داخل الجمجمة، كما الاختلافات في موقع الورم وأنماط النمو قد تؤثر على الكيميائي أن نسس تعتمد على الهجرة نحو الورم. 2) الإعداد السليم لل نسس وحالتها الصحية والأنماط الظاهرية التي تؤثر على السلوكيات الهجرة هيموتاكسيك. 3) إعداد كاف للتجويف الأنفي مع هيالورونيداز، الذي ثبت لتحسين هجرة الخلايا الجذعية من تجويف الأنف إلى الدماغ 17 ؛ و 4) الموقف مستلق الصحيح من الفئران أثناء الأنف الخلايا الجذعية التسليم لمنع فقدان الخلايا خارج منخرات، وبعد الولادة نسك رعاية الحيوانات. التصوير بالرنين المغناطيسي 2 أو تقنيات التصوير القائم على راديوتراسر 13 في الحيوانات الحية يمكن تطبيقها ل ه تقييم في الوقت الحقيقي من في الجسم الحي الهجرة الجذعية بعد الولادة داخل الأنف.
لإجراء دراسة قبل السريرية باستخدام النماذج الحيوانية، وهناك قيود على التنبؤ بالنتائج العلاجية في الترجمة إلى الدراسات السريرية للمريض البشري. هناك اختلافات كبيرة في العصب القحفي تنتهي أنماط التوزيع بين القوارض والبشر 19 ، 20 ؛ وبالتالي، استراتيجيات لتوجيه الخلايا الجذعية العلاجية لتوزيع على طول شبكات نهاية العصب أكثر أهمية لدخول الدماغ البشري من خلال طريق الأنف يجب أن يكون التركيز للبحوث المستقبلية. هذه التفاصيل هي مفاتيح لجهود الترجمة السريرية الناجحة، والمبادئ الموصوفة هنا ضرورية لوضع الأساس لمزيد من التنويع من المعلمات البحثية تهدف إلى التمييز بين الإشارات الجزيئية والاختلافات وظيفية وتشريحية بين نماذج الماوس وتفاصيل التطبيق البشري.
إن "في هذا الدليل التجريبي للمبادئ الأساسية لاستخدام نماذج بدكس الماوس من الورم البشري، وتبين لنا إمكانية استراتيجيات متنوعة لتعزيز تروبيسم الورم من هنسس عن طريق مسبق نقص الأكسجين وتعزيز الوراثية في تشيموتروبيسم تعزيز CXCR4 مستقبلات التعبير لاستهداف الورم- السيتوكينات المرتبطة بها، وأهمية هذا الوصف الشامل لتقنية الخلايا الجذعية العلاجية الأنفية هو واضح، كما هو أول بروتوكول خطوة بخطوة تصف استراتيجية علاجية الخلايا الجذعية العلاجية البديلة إلى الجهاز العصبي المركزي (نس) دون نهج الغازية عادة وهو ما يتطلب اضطرابات الجهاز العصبي المركزي، ونحن نهدف إلى تقديم منصة علاجية تجريبية قوية إلى طليعة الطب التنموي لأورام الدماغ الخبيثة، بحيث يمكن أن تظهر تفاصيل ميكانيكية أكبر من استكشافات بحثية واسعة في المجتمع العلمي.تطبيقات موسعة في المستقبل لعلاج اضطرابات الجهاز العصبي المركزي واسعة التعقيد والتنوع الميكانيكي يمكن ب(ه) استكشفها الباحثون في المجالات ذات الصلة.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين أي تعارض في المصالح.
Acknowledgments
تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة R01NS087990 (مسل، إيفب).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereotaxic frame | Kopf Instruments | Model 900 | |
| Hypoxic Cell Culture Incubator | ThermoFisher Scientific | VIOS 160i | |
| Cell culture supplies (Plastics) | ThermoFisher Scientific | Varies | Replaceable with any source |
| Legend Micro 21R Refrigerated Microcentrifuge | ThermoFisher Scientific | 75002490 | Replaceable with any source |
| Bench centrifuge Sorvall ST16R | ThermoFisher Scientific | 75004240 | Replaceable with any source |
| Micro syringe 702N 25 µl (22S/2"/2) | Hamilton Company | 80400 | Flat tip |
| Sample Tray for Irradiator | Best Theratronics | A13826 | To set up mice protection with lead shield |
| Leica DMi8 Microscope | Leica Microsystem | Custom setup | |
| Leica CM1860 UV cryostat | Leica Microsystem | Custom setup | |
| Exel International Insulin Syringe | ThermoFisher Scientific | 14-841-31 | |
| Corning Phosphate Buffer Saline | Corning Cellgro/ThermoFisher | 21-031-CV | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Corning Cellgro/ThermoFisher | 11965-084 | |
| Trypsin 0.05% | Corning Cellgro/ThermoFisher | 25300054 | |
| Hyaluronidase from bovine testes | MilliporeSigma | H3506 |
References
- Shah, K. Stem cell-based therapies for tumors in the brain: are we there yet? Neuro Oncol. 18 (8), 1066-1078 (2016).
- Balyasnikova, I. V., et al. Intranasal delivery of mesenchymal stem cells significantly extends survival of irradiated mice with experimental brain tumors. Mol Ther. 22 (1), 140-148 (2014).
- Reitz, M., et al. Intranasal delivery of neural stem/progenitor cells: a noninvasive passage to target intracerebral glioma. Stem Cells Transl Med. 1 (12), 866-873 (2012).
- Dey, M., et al. Intranasal Oncolytic Virotherapy with CXCR4-Enhanced Stem Cells Extends Survival in Mouse Model of Glioma. Stem Cell Reports. 7 (3), 471-482 (2016).
- Ahmed, A. U., et al. A preclinical evaluation of neural stem cell-based cell carrier for targeted antiglioma oncolytic virotherapy. J Natl Cancer Inst. 105 (13), 968-977 (2013).
- Kim, S. K., et al. Human neural stem cells target experimental intracranial medulloblastoma and deliver a therapeutic gene leading to tumor regression. Clin Cancer Res. 12 (18), 5550-5556 (2006).
- Lee, D. H., et al. Targeting rat brainstem glioma using human neural stem cells and human mesenchymal stem cells. Clin Cancer Res. 15 (15), 4925-4934 (2009).
- Lesniak, M. S. Targeted therapy for malignant glioma: neural stem cells. Expert Rev Neurother. 6 (1), 1-3 (2006).
- Robinson, K. GLPs and the Importance of Standard Operating Procedures. BioPharm International. 16 (8), (2003).
- World Health Organization on behalf of the Special Programme for Research and Training in Tropical Diseases. Handbook: Good Laboratory Practice (GLP). , (2009).
- NIH. Number: NOT-OD-16-011. Implementing Rigor and Transparency) in NIH & AHRQ Research Grant Applications. , (2015).
- Wakimoto, H., et al. Maintenance of primary tumor phenotype and genotype in glioblastoma stem cells. Neuro Oncol. 14 (2), 132-144 (2012).
- Cheng, S. H., et al. Dynamic In Vivo SPECT Imaging of Neural Stem Cells Functionalized with Radiolabeled Nanoparticles for Tracking of Glioblastoma. J Nucl Med. 57 (2), 279-284 (2016).
- Pritchett-Corning, K. R., Luo, Y., Mulder, G. B., White, W. J. Principles of rodent surgery for the new surgeon. J Vis Exp. (47), (2011).
- Clark, A. J., Fakurnejad, S., Ma, Q., Hashizume, R. Bioluminescence Imaging of an Immunocompetent Animal Model for Glioblastoma. J Vis Exp. (107), (2016).
- Ulasov, I. V., et al. Survivin-driven and fiber-modified oncolytic adenovirus exhibits potent antitumor activity in established intracranial glioma. Hum Gene Ther. 18 (7), 589-602 (2007).
- Danielyan, L., et al. Intranasal delivery of cells to the brain. Eur J Cell Biol. 88 (6), 315-324 (2009).
- Dhuria, S. V., Hanson, L. R., Frey, W. H. Intranasal delivery to the central nervous system: mechanisms and experimental considerations. J Pharm Sci. 99 (4), 1654-1673 (2010).
- Gross, E. A., Swenberg, J. A., Fields, S., Popp, J. A. Comparative morphometry of the nasal cavity in rats and mice. J Anat. 135 (Pt 1), 83-88 (1982).
- Marieb, E. N., Hoehn, K. Human Anatomy & Physiology. , Pearson. (2007).
