Summary
Le cellule staminali sono promettenti vettori terapeutici per curare i tumori cerebrali a causa del loro tropismo tumorale intrinseco. La consegna delle cellule staminali intranasali non invasive bypassa la barriera del cervello e dimostra un forte potenziale per la traduzione clinica. Questo articolo riassume i principi fondamentali della consegna delle cellule staminali intranasali in un modello di topo di glioma.
Abstract
Il tropismo intrinseco verso malignità del cervello rende le cellule staminali come vettori promettenti di agenti terapeutici contro tumori maligni. La consegna di cellule staminali terapeutiche attraverso il percorso intranasale è una strategia alternativa scoperta di recente, con un forte potenziale di traduzione clinica, a causa della sua natura non invasiva rispetto all'intestazione intracranica o alla consegna attraverso percorsi sistemici. La mancanza di barriera sanguigna del sangue rafforza ulteriormente il potenziale terapeutico delle cellule staminali sottoposte a entrata intranasale del cervello. Questo articolo riassume le tecniche essenziali utilizzate nei nostri studi e delinea i principi fondamentali della strategia intranasale per la consegna delle cellule staminali usando un modello di mouse degli xenograft intracranici degli gliomi. Eseguiamo le procedure ottimizzate che generano risultati coerenti e riproducibili con specifici parametri sperimentali predeterminati e offrono linee guida per un flusso di lavoro semplificato che garantisca un'efficace esecuzione e un'esperienza affidabileRisultato ntal. L'articolo è stato progettato per servire da base per un'ulteriore personalizzazione sperimentale basata su ipotesi, tipi di cellule staminali o specifiche tumorali.
Introduction
Bassa tossicità, bassa immunogenicità e tropismo tumorale intrinseco del cervello di cellule staminali umane sono tratti attraenti per la consegna di veicoli terapeutici 1 . Le nuove terapie a base di cellule staminali per tumori cerebrali maligni sono promettenti innovazioni sviluppate negli ultimi anni e l'adattamento intranasale di questa strategia terapeutica rappresenta un salto verso la traduzione clinica, in quanto la somministrazione non invasiva e ripetuta potrebbe ridurre drasticamente la barriera per le applicazioni del paziente e Può essere adattabile per i servizi out-patient senza anestesia generale o un lungo servizio in pazienti associati a procedure chirurgiche invasive 1 , 2 , 3 , 4 .
Noi ed altri abbiamo introdotto la via intranasale di consegna delle cellule staminali nei tumori del cervello e abbiamo posto il terreno per alcuni dei principi fondamentaliDella ricerca traslazionale usando i modelli xenograft 2 , 3 e 4 del mouse, oltre a studiare la migrazione di cellule staminali in vivo tramite i rivelatori di risonanza magnetica (MRI) 2 . Attraverso queste esplorazioni pilota, abbiamo accumulato un'esperienza notevole e abbiamo approfittato di come costruire una robusta strategia di valutazione pre-clinica usando modelli di topi xenograft (PDX) di pazienti derivanti da malattie degli amiomi maligni, pur mantenendo la risoluzione investigativa per esaminare I dettagli meccanici più sfumati dei fenomeni biologici sofisticati dell'ingresso cervello intranasale delle cellule staminali terapeutiche consegnate alla cavità nasale. Qui descriviamo i principi di un protocollo operativo standardizzato per dimostrare lo stato attuale di indagini sperimentali utilizzando una linea di cellule staminali neurali umane ben consolidate HB1.F3.CD 5
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Protocol
Tutte le procedure animali devono essere approvate dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (IACUC) o equivalente. Se esiste qualche incertezza riguardo alle procedure specifiche descritte qui sopra, non procedere. Chiarire con l'IACUC dell'istituzione e un membro del personale veterinario designato.
1. Garantire la sterilità delle cellule coltivate e seguire i principi delle tecniche asettiche
- Seguire le pratiche standard di laboratorio in tutte le procedure di coltura cellulare e requisiti IACUC per la sperimentazione delle cellule e la conferma di stato senza patogeni prima della somministrazione ai topi 9 , 10 .
- Seguire il requisito di NIH per l'autenticazione delle celle per assicurare il risultato riproducibile 11 .
- Seguire le tecniche asettiche di chirurgia estetica stabilite stabilite in questo manoscritto 4 .
2. Preparazione delle cellule Glioma per <Em> Esperto in vivo 2 , 4
- Le cellule degli gliomi di cultura (GBM43, GBM6 e U87MG) in siero contenenti 10% di siero fetale bovino nel mezzo di Dulbecco's Modified Eagle [DMEM]) o in un siero-libero medium (Neurobasal medium con integratori B27, N2, eparina, fattore di crescita epidermica [ EGF], fattore di base di crescita del fibroblasto [bFGF], antibiotici e L-glutamina 12 ), in un incubatore di coltura di cellule CO 2 umidificato.
- Prova tutte le linee cellulari attraverso il pannello di pulizia del mouse eseguito da fornitori di servizi commerciali.
- Raccogliere le cellule aderenti rimuovendo il mezzo di coltura. Incubare con 0,05% di trysina per 5 minuti a temperatura ambiente (1 mL di trypsina per la tampone T25, 2 mL per la fiala T75, scalare di conseguenza per i flaconi di coltura con superficie più grande) e quindi lavare le cellule con Ca 2+ e Mg 2+ Salina tamponata (PBS).
- Clicca ilPallone per dispiegare le cellule e neutralizzare immediatamente con un eccesso di terreno contenente siero (8 - 9 ml). Quindi utilizzare pipette sierologiche per aspirare la sospensione cellulare in tubi di centrifuga.
- Centrifugare la sospensione cellulare a 400 xg per 5 min. Lavare la cellula almeno due volte con 10 ml di PBS mediante centrifugazione ripetuta.
- Raccogliere le cellule degli gliomi coltivate come sfere tumorali nel mezzo libero di siero mediante centrifugazione (stessa velocità e durata come sopra); Dissociare il pellet cellulare mediante incubazione in 1 - 2 ml di soluzione di distacco cellulare a 37 ° C per 5 minuti prima di lavare due volte con 10 ml di PBS per centrifugazione (400 xgx 5 min).
- Rieccendere lo glioma in soluzione salina sterile ad una concentrazione di 50.000 - 200.000 cellule per 2,5 μL. I numeri delle cellule utilizzati per l'iniezione nel cervello del mouse dipendono dal tasso di crescita stabilito per ogni linea di cellule degli gliomi. Qui usa 25.000 e 100.000 per le cellule tumorali derivate dal paziente GBM43 e GBM6 rispettivamente.
- Preparare il doppio della quantità del neceNumero di cellule ssary per l'impianto per rappresentare la perdita di una frazione durante la procedura. Trasferire la sospensione cellulare in un tubo di microcentrifuga sterile e posizionare il tubo sul ghiaccio. Mantenere le celle sul ghiaccio per massimo 2 ore durante gli interventi chirurgici, preparare il nuovo batch se sono previsti interventi di estensione.
3. Impianto Intracranico per la creazione di modelli di topi Xenograft ( Figura 1A ) 2 , 4 , 13
- Prima della giornata di chirurgia, sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici in autoclave e preparare tutto il materiale precoce e post-chirurgico per la protezione degli animali per protocollo approvato dalla IACUC. Sterilizzare il telaio stereotatico e le apparecchiature periferiche per garantire condizioni asettiche intraoperatorie, minimizzando così le complicazioni.
- Organizzare l'area operativa per ridurre al minimo lo smarrimento e la possibilità di contaminazione.
- Vestire in equipaggiamento protettivo personale appropriato(PPE) per IACUC requisito.
- Impostare una camera di recupero post-operativa appropriata. Assicurarsi che gli anestetici e gli analgesici siano preparati freschi utilizzando reagenti inesperti. Impostare gli appropriati strumenti di manutenzione del calore del corpo per protocollo approvato da IACUC.
- Per stabilire xenografts di cellule degli gliomi derivate dal paziente umano per la sperimentazione della consegna intranasale di NSC umane, utilizzare specie di topo immunocompromettate come il topo atmico nu / nu di qualsiasi genere a circa 6 settimane di età.
- Anestetizzare l'animale in base al peso corporeo utilizzando i reagenti approvati, ovvero mediante un'iniezione intraperitoneale (ip) di una miscela di ketamina (50-100 mg / kg; consulta IACUC istituzionale per gamma di dosaggio approvata) e xilazina (5-10 mg / Kg, consultare l'IACUC istituzionale per l'intervallo di dosaggio approvato) in 200-250 μL di soluzione salina sterile o attraverso 4-5% di anestesia isoflurana utilizzando un dispositivo inalatorio.
- Assicurarsi che l'animale abbia raggiunto il piano di anestesia chirurgica bY toe pinza prima dell'incisione della pelle. Applicare ampio gel oftalmico sterile per garantire lo stato umido delle cornee dell'animale.
- Sterilizzare il cranio utilizzando salviette circolari ripetute e alternate di betadina e alcool isopropilico per Pritchett-Corning et al. 14 .
- Fornire l'analgesia pre-incisione mediante iniezione di Buprenex (0,05 - 2 mg / kg) prima dell'incisione usando la lama chirurgica.
- Utilizzare un applicatore sterilizzato a cotone per aiutare l'emostato esponendo il cranio; Utilizzare il perossido di idrogeno al 3% per facilitare la clearance del sanguinamento accidentale.
- Utilizzare un foro a sfera elettrico palmare a batteria (inferiore a 1 mm di larghezza) per creare un foro di sbavamento a 2 mm laterale, a sinistra oa destra, alla linea mediana e 2 mm dietro il Bregma (le coordinate di posizione possono essere personalizzate Sul modello tumorale destinato ad un determinato studio).
- Montare l'animale al telaio stereotaxicico a quello appropriatoE che la siringa micro Hamilton inserita sia perpendicolare alla superficie del cranio intorno al foro della burrata. Fare attenzione a garantire che il piano anestetico dell'animale sia in buona condizione da pizzicamento del piede. Osservare la frequenza respiratoria per assicurarsi che l'animale non sia sotto stress durante le seguenti fasi.
* Non sottolineiamo i posizionamenti in barra degli orecchi perché:- Abbiamo preforato il foro di bavaggio per posizionare l'ago e pertanto precise coordinate del cranio non sono necessarie;
- I canali dell'orecchio del mouse sono fragili e il posizionamento preciso degli orecchini auricolari richiede una formazione più coinvolgente che non sia pertinente al nostro scopo. I rischi di danneggiamento dei canali uditivi murini superano i vantaggi di un posizionamento preciso;
- Il supporto per le guance è molto più semplice da eseguire e in grado di raggiungere gli stessi livelli di stabilità e bilanciamento della testa del mouse durante il posizionamento. È un vantaggio aggiunto per più operazioni chirurgiche sensibili al tempoCompletamento tempestivo con buona mobilità cellulare.
- Utilizzare le manopole stereotossiche per posizionare la siringa liscia a punta piatta fino al foro della burrata, quindi abbassarla lentamente a 3 mm sotto la superficie dura. Ritirare 0,5 mm per mantenere la punta dell'ago a 2,5 mm sotto la dura.
- Iniettare 2,5 μL di cellule glioma precaricate per un periodo di 1 min. Lasciare che l'ago mantenga la sua posizione per altri 1-2 minuti prima lentamente, nel corso di 1 minuto, prelevando l'ago dal cervello e facendo attenzione a minimizzare il flusso di cellule. Applicare la cera ossea sterile per evitare la crescita del tumore extracranico.
- Chiudere la ferita utilizzando fermagli in acciaio inox (7 mm). Fornire un'iniezione sottocutanea (sc) di 1 ml di soluzione ringer lattata sterile (pre-riscaldata a 37 ° C) e mettere l'animale in una camera di recupero che è a metà su un tampone di riscaldamento.
- Rimetti gli animali alla cremagliera ventilata una volta riconquistati la mobilità e seguite la cura post-op di routine per assicurare lo smootsoH recupero.
4. In Vivo Bioluminescenza Imaging (BLI) della crescita tumorale ( Figura 1B ) 15
NOTA: Le cellule del glioma derivate dal paziente vengono modificate per esprimere luciferasi a fiamma. Questo ci permette di seguire la progressione tumorale dopo l'impianto intracranico.
- Dare agli animali un'iniezione ip di D luciferina, sale di potassio (150 mg / kg) 10 minuti prima della sessione di imaging.
- Immediatamente mettere gli animali in una camera di induzione di isoflurano ossigenata approvata dalla IACUC.
- Posizionare gli animali all'interno della camera di imaging riscaldata (37 ° C) per catturare il segnale BLI usando le impostazioni del software (per dettagli, vedere istruzioni del produttore).
5. Irradiazione del cervello intero ( Figura 1C ) 2 , 4 , 13
4 .
- Utilizzare un'iniezione ip di una miscela di ketamina e xilazina (50-100 mg / kg e 5-10 mg / kg rispettivamente; consultare l'IACUC istituzionale per una gamma di dosaggi approvata) con un piano di anestesia subchirurgica per indurre moderatamente anestesia per i topi.
- Utilizzare un vassoio di campionamento per posizionare i topi all'interno della camera tra i blocchi di schermatura di piombo, consentendo un'esposizione solo a testa al percorso di radiazione ( Figura 2 ).
- Dare ai topi una conferma positiva di BLI della crescita tumorale (normalmente al giorno 7-8 dopo l'impianto di glioma) una dose giornaliera di 2 Gy di irradiazione per 5 giorni consecutivi. Eseguire la valutazione BLI del tumore dopo l'ultima dose di irradiazione.
6. Modifica genetica delle cellule staminali neurali umane (NSCs; FigE 3A) 4
- Mantenere un NSC umano (clone HB1.F3.CD) 6,7 in mezzo DMEM con 10% FBS e 1% penicillina-streptomicina in un incubatore umidificato a 37 ° C sotto l'aria ambiente del 95% e 5% di CO 2 ( N NSCs).
- Eseguire la sovraespressione genetica dei recettori chimotossici, come il ricercatore CKC CXC del chimocino 4 (CXCR4), in hNSC mediante trasduzione con codifica lentivirus per CXCR4 umano.
- Quando i NSC sono vicini alla confluenza del 75-80%, aggiungere il lentivirus CXCR4 al terreno di coltura insieme al polybrene (8 μg / mL) e incubare per 8 ore o durante la notte.
- Sostituire il mezzo contenente virus con un mezzo fresco contenente blasticidina a 4 μg / mL per la selezione positiva delle cellule trasdotte.
- Validare il livello dell'espressione di CXCR4 in hNSC modificati ( CXCR4 NSCs) mediante citometria a flusso utilizzando l'anticorpo anti-CXCR4 e l'anticorpo isotipo corrispondente e viUn RT-PCR quantitativo usando una coppia di primer che amplificano cDNA 4 e CXCR4 e gliceraldehid-3-fosfato deidrogenasi (GAPDH).
- Generare i controlli vettoriali NSC ( VC NSCs) utilizzando la stessa strategia, con RFP che sostituisce il gene CXCR4 e verificare tramite microscopia o cytometry di flusso a causa della presenza di fluorescenza RFP.
7. Precondizionamento ipossico dei NSC umani ( Figura 3A ) 4
- Le piastre coltivano NSCs in tazze di coltura T75 come sopra descritto fino al raggiungimento del 90% di confluenza.
- Posizionare i flaconi di coltura delle cellule all'interno di una camera / incubatrice CO 2 umidificata con livelli di 1% O 2 mantenuti per 24 h, mediante alimentazione a gas N 2 controllata da un automatico flussometro incorporato. Queste cellule sono denominate H NSCs. NSC di controllo N sono descritti nel passaggio 7.1.
8. Carico di HuUomini NSC con virus oncolitico ( Figura 3B -3H ) 5
- 8.1 N Infissi N NSCs, H NSCs, VC NSCs e CXCR4 NSCs con 50 particelle virali di adenovirus replicativa condizionata (CRAd) -S-pk7 / cellula 4 , 16 .
- 8.2. Dopo 2 ore di incubazione a temperatura ambiente con tappatura periodica, lavare le cellule tre volte con i supporti per rimuovere le particelle virali non legate e sospendere le cellule in soluzione salina sterile per l'iniezione.
ATTENZIONE: eseguire tutte le procedure di coltura delle cellule in vitro correlate al virus in strutture con l'indicazione appropriata di livello di biosicurezza, ad esempio BSL2. Appropriate attrezzature protettive individuali devono essere indossate dai ricercatori che trattano il virus oncolitico per linee guida istituzionali degli animali 4 , 16 .
9. Caricamento delle cellule staminali con MicroOssidi di ferro paramagnetici n (MPIO) per il monitoraggio in vivo tramite la risonanza magnetica (MRI, Figura 3B -3H ) 2
- Per etichettare le cellule staminali, aggiungere MPIO a colture di cellule staminali a confluenza del ~ 80%, in presenza di reagente di transfection per incubazione durante la notte. L'efficacia dell'etichettatura delle cellule staminali (NSCs 4 o MSCs 2 ) con MPIOs (flash coniugato rosso) è determinata dalla citometria a flusso.
- Per visualizzare la migrazione e la distribuzione delle cellule staminali nei cervelli degli animali che sopportano gliomi, acquisire sia l'acquisizione rapida di pesata multipla con elevata risoluzione T2, sia le immagini di eco di spin di miglioramento della rilassamento e le sequenze di eco a gradi veloci della velocità bassa (FLASH) ponderata con T1 multipla Valutare la struttura sia attraverso i piani coronali che assiali del cervello del mouse 2 .
10. Consegna Intranasale di NSC Terapeutici ( Figura 3D ) 2 , 4
- Coltivare e raccogliere NSC ( N NSCs, H NSCs, VC NSCs e NSCs CXCR4 ) secondo il protocollo descritto nella sezione 3.
ATTENZIONE: Tutte le procedure di animale che coinvolgono NSC caricate da OV devono essere eseguite in impianti con l'indicazione appropriata di livello di biosicurezza, ad esempio strutture BL2 o BSL2. - Anestetizzare i topi mediante iniezione ip di una miscela di ketamina e xilazina secondo la fase 3.6.
- Posizionare i topi su un tetto pulito rivolto verso l'alto con un sottogruppo di riscaldamento per mantenere la temperatura corporea. Regolare un cuscino imbottito fatto di tovaglioli di carta arrotolati con i nastri per assicurare l'angolo retto delle narici quando posto sotto la testa del mouse.
NOTA: Pre-trattamento dell'alialuronasi (totale di 100 U come quattro inoculazioni ripetute a intervalli di 5 minuti, 3 μL in ogni narice) del naso ePithelium è stato descritto in precedenza 2 , 17 . - Usando una micropipetta, distribuire 2 μL di sospensione NSC ad ogni narice del mouse. Confermare visivamente la aspirazione della gocciolina prima di passare al mouse successivo. Il numero totale di celle consegnate può essere determinato dall'utente; Utilizzare 62,500-125,000 cellule / μL, in modo che 0,5-1 milioni di cellule possano essere consegnate in dosi di 4 x 2 μL.
- Utilizzare un timer per assicurare intervalli di 5 minuti tra ciascuna somministrazione di sospensione cellulare, fino a 4 volte.
- Consentire agli animali di riconquistare la mobilità in una camera di recupero, con la posizione supina mantenuta in tutto.
11. Analisi della sopravvivenza ( Figura 3E )
- Inserire i dati relativi alla durata della sopravvivenza degli animali nel software statistico e eseguire comparazioni statistiche utilizzando il test di log-rank con le seguenti denominazioni di significato: * p < 0,05, ** p <0.01, *** p <0,001.
12. La raccolta dei tessuti e l'istologia / immunocitochimica Verifica dell'entrata cerebrale delle cellule staminali intranasali 2 , 4
- Al punto finale dello studio, eutanizzare i topi attraverso i protocolli approvati da IACUC. Una pratica standard sta usando una camera di CO 2 controllata da flusso di flusso per sacrificare gli animali come la strategia di eutanasia primaria seguita dall'esanguinamento mediante la fissazione della perfusione.
- Immediatamente dopo essere stato sacrificato, eseguire una perfusione intracardiacale con PBS sull'animale per assicurare l'eliminazione dei residui di sangue dai vasi sanguigni e la conservazione dei tessuti per l'analisi istologica successiva.
- Posizionare l'animale CO 2 su un tampone assorbente in posizione supina, procedere con una laparotomia per esporre il muscolo diaframma, che viene disciolto insieme alla gabbia, per esporre il cuore.
- Dopo mammaRe un nick sul atrio destro utilizzando un paio di forbici di dissezione, accelerare l'espansione con un 3-5 ml di iniezione PBS attraverso il ventricolo sinistro all'apice. Inietta una paraformaldeide (PFA) ghiacciata al 4% con una siringa; Le spasmi muscolari periferiche forniscono una conferma visiva che non vi è alcun blocco maggiore nella circolazione che impedisse una corretta fissazione dei tessuti.
- Rimuove chirurgicamente la testa della carcassa e conserva in un tubo centrifuga da 50 ml in PFA al 4% a 4 ° C per una notte. Cambiare la soluzione al 30% di saccarosio il giorno seguente prima della dissezione del tessuto cerebrale altri 24 h più tardi.
- Incorporare il tessuto cerebrale in composto OCT e congelare flash sull'isopentano sul ghiaccio secco. Eseguire la criocuzione del blocco di tessuto risultante per generare sezioni tissutali di 10-20 μm per istologia e applicazioni immunocitochimiche.
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Representative Results
Sia il pretrattamento ipossico ( Figura 4A ) 4 che la sovraespressione di CXCR4 ( figure 4B e 4C ) 4 aumentano significativamente la presenza di membrane delle cellule dei recettori CXCR4 come dimostrato dalla citometria a flusso. Il tropismo tumorale dimostrato da NSC (frecce blu), è mostrato nell'istologia del tessuto tumorale (cerchio rosso). La presenza di cellule staminali con MPIO ( Figura 4D ) nel tumore è confermata mediante la colorazione blu prussiana ( Figura 4E ). 4
Un'analisi dei tessuti indica che l'irradiazione a testa solo ( Figura 2 ) induce una riduzione del volume del tumore, così come l'upregulation SDF-1 nel tumore e nel tessuto circostante ( figure 5A e 5B )4, che conferma l'ipotesi che l'espressione regolata da CXCR4 in NSCs possa facilitare il tropismo tumorale dopo XRT.
L'analisi di sopravvivenza indica che, sebbene l'irradiazione (XRT) da solo sia vantaggiosa per la sopravvivenza di animali portatori del tumore ( Figura 6A ) 4 , si possono ottenere ulteriori vantaggi utilizzando H NSCs caricati con OV su N NSC caricati con OV nel contesto di XRT 6B ) 4 . I vantaggi significativi di sopravvivenza possono essere osservati anche con NSC CXCR4 geneticamente modificati nello stesso regime terapeutico contestuale ( Figura 6C ) 4 .
L'analisi del tessuto conferma che sia NSCs H che CXCR4 NSCs hanno significativamente migliorato la consegna di OVs mirata al tumore, come dimostrato da staPer una proteina esonale virale ( figure 7A e 7B ) 4 .
Figura 1: Diagramma di scorrimento schematico delle procedure generali di animale coinvolte. ( A ) I modelli tumorali vengono creati attraverso xenograft di cellule degli gliomi derivanti dal paziente. ( B ) La crescita del tumore è monitorata tramite BLI. ( C ) La terapia di irradiazione a testa sola viene consegnata come descritto nella Procedura 6. ( D ) La postura superina e testa inclinata viene mantenuta durante la consegna delle cellule staminali intranasali terapeutiche, come specificato nella Procedura 11. ( E ) Monitoraggio della sopravvivenza post-terapia, piccolo animale Imaging e analisi istologica del tessuto se necessario sono seguiti. Clicca qui per visualizzareUna versione più grande di questa figura.
Figura 2: L'installazione degli animali per l'irradiazione. I topi anestetizzati sono posizionati tra gli scudi di piombo all'interno del vassoio di campionamento permettendo solo l'irradiazione della testa. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Una tabella di flusso per le procedure generali di preparazione delle cellule staminali coinvolte prima della consegna intranasale. ( AC ) Pretrattamento ipossico o modificazioni genetiche delle cellule staminali per sovraespressione CXCR4. ( BD ) Il lavaggio, la dissociazione enzimatica, la raccolta delle cellule e le fasi di conteggio sono perFormata per il successivo caricamento di cellule staminali con carico terapeutico o diagnostico. ( E ) I reattivi terapeutici, come i virus oncolitici oi traccianti diagnostici, come le particelle MPIO, possono essere caricati in cellule staminali raccolte in concentrazioni appropriate con agitazione periodica e agitazione leggera ( F ). ( GI ) Le cellule staminali caricate possono quindi essere lavate e contate per la consegna intranasale nei topi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Analisi delle modifiche delle cellule staminali per l'espressione CXCR4 e il caricamento MPIO. ( AC ) La cytometria di flusso può essere eseguita per verificare le modificazioni fenotipiche delle cellule staminali dovute a pretrattamenti ipossici o geneticiingegneria. (Dettagli possono essere trovati in Dey et al. 4 ) ( DE ) La rilevazione di un successo MPIO di caricamento delle cellule staminali e dei risultati in vivo può essere ottenuta mediante citometria a flusso e colorazione blu prussiana. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: L'ipotesi che l'irradiazione facilita SDF-1 (segnali verdi) L'upregulation in glioma e il tessuto circostante è confermato Via istopatologia e immunocitochimica delle sezioni tissutali. L'irradiazione aumenta l'espressione SDF-1 in xenograft GBM43. L'analisi della colorazione H & E e dell'immunocitochimica delle sezioni del tessuto cerebrale dai topi e dai topi irradiati dimostranoHa ridotto il carico tumorale ma aumenta i livelli di SDF-1 nei siti tumorali dopo il trattamento XRT. ( A ) L'espressione SDF-1 (verde) è fortemente localizzata sul sito tumorale (scatole bianche) dopo XRT. ( B ) La quantificazione della densitometria dei campi di osservazione dimostra un aumento di quattro volte dell'espressione SDF-1 negli animali trattati con XRT rispetto agli animali di controllo (n = 3 esperimenti, *** p <0,001, t-test dello studente). I dettagli possono essere trovati in Dey et al. 4 Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Vantaggi di sopravvivenza di NSC modificati sono stati osservati (i dettagli possono essere trovati in Dey et al. ). ( A ) È stato stabilito il contesto dei benefici terapeutici di XRT (*** p <0.001, test di log rank). ( B ) Il pretrattamento ipossico delle cellule staminali cariche con OV migliora la sopravvivenza degli animali (* p <0,05). La crescita genetica C. CXCR4 migliora ulteriormente la sopravvivenza degli animali (** p = 0.0013). I dettagli possono essere trovati in Dey et al. 4 Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7: La conferma della fornitura di OV da NCSs atipica o CXCR4 a Xenografts del tumore del cervello è ottenuta tramite la rilevazione della proteina esotica virale mediante immunocitochimica (punti verdi) delle sezioni tissutali dai cervelli dei topi trattati con entrambi H A ) o CXCR4 NSCs ( B ), *** p <0,001 t test. I dettagli possono essere trovati in Dey et al. 4 Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Sebbene sia stato ampiamente esplorato il percorso intranasale della somministrazione di farmaci per le piccole molecole, le nanomedicine e le proteine, 18 , l'applicazione di cellule staminali terapeutiche per il targeting tumorale intranazionale del cervello è molto nuova nello spettro delle terapie tumorali cerebrali in sviluppo 2 , 3 , 4 . Ci sono complicazioni intrinseche riguardanti i comportamenti delle cellule staminali nella cavità nasale ei dettagli molecolari rimangono ancora poco chiari. La dimensione delle cellule staminali e dei loro meccanismi di distribuzione lungo i nervi cranici differiscono notevolmente da quelli di biologi non-cellule o piccole molecole e siamo attualmente impegnati in indagini meccaniche dettagliate che coinvolgono i comportamenti delle cellule staminali terapeutiche nell'epitelio nasale. Interazioni molecolari che coinvolgono profili di espressione del recettore di citochine superficiali delle cellule staminali, così come matrice extracellulare(ECM), come l'integrin, sono sotto inchiesta per far luce sulle basi dell'inserimento intranasale del cervello delle cellule staminali. Le fasi critiche del protocollo attuale sono molteplici: 1) la corretta istituzione dello xenoografo intracranico degli glioma, in quanto variazioni nella localizzazione del tumore e nei pattern di crescita potrebbero influenzare la chemotaxis che i NSC si affidano per la migrazione verso il tumore; 2) la corretta preparazione dei NSC e il loro stato di salute e fenotipi che influenzano i comportamenti migratori chemiotatici; 3) Preparazione adeguata della cavità nasale con ialuronidasi, che è stato dimostrato di migliorare la migrazione delle cellule staminali dalla cavità nasale nel cervello 17 ; E 4) Correggere la posizione supina dei topi durante la consegna delle cellule staminali intranasali per prevenire la perdita di cellule al di fuori delle narici e la cura post-NSC di consegna degli animali. Potrebbe essere applicata la tecnica MRI 2 o le tecniche di imaging basate su radiotracer 13 in animali vivi E valutazione in tempo reale della migrazione delle cellule staminali in vivo dopo la consegna intranasale.
Per uno studio preclinico che utilizza modelli animali, ci sono limitazioni per prevedere l'esito terapeutico nella traduzione agli studi clinici di pazienti umani. Ci sono differenze significative nei modelli di distribuzione terminale del nervo cranico tra i roditori e gli umani 19 , 20 ; Pertanto, le strategie di dirigere le cellule staminali terapeutiche per distribuire lungo le reti di terminazione nervosa più rilevanti per l'ingresso nel cervello umano attraverso il percorso intranasale dovrebbero essere il focus per le future ricerche. Questi dettagli sono le chiavi per gli sforzi di traduzione clinici di successo e i principi qui descritti sono essenziali per stabilire la base per un'ulteriore diversificazione dei parametri di ricerca progettati per distinguere i segnali molecolari e le differenze funzionali e anatomiche tra i modelli del topo e le specificità dell'applicazione umana.
In questa dimostrazione pilota dei principi fondamentali dell'uso dei modelli PDX di topo umano, mostriamo il potenziale per strategie diversificate per migliorare il tropismo tumorale di hNSC attraverso precondizionamento ipossico e miglioramento genetico nel chemotropismo che promuove l'espressione del recettore del CXCR4 per raggiungere il tumore- Il significato di questa descrizione completa della tecnica di consegna delle cellule staminali terapeutiche intranasali è evidente, in quanto è il primo protocollo passo per passo che descrive una strategia alternativa terapeutica di erogazione delle cellule staminali al sistema nervoso centrale (CNS) senza approcci invasivi tipicamente È necessario portare una piattaforma terapeutica sperimentale all'avanguardia nella medicina dello sviluppo per i tumori maligni del cervello, in modo tale che i dettagli meccanici più significativi possono emergere da ampie ricerche di ricerca nella comunità scientifica. La complessità e la diversità meccanicistica possono bEsplorati dai ricercatori nei rispettivi campi.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori non hanno alcun conflitto di interessi per dichiarare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da NIH R01NS087990 (MSL, IVB).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereotaxic frame | Kopf Instruments | Model 900 | |
| Hypoxic Cell Culture Incubator | ThermoFisher Scientific | VIOS 160i | |
| Cell culture supplies (Plastics) | ThermoFisher Scientific | Varies | Replaceable with any source |
| Legend Micro 21R Refrigerated Microcentrifuge | ThermoFisher Scientific | 75002490 | Replaceable with any source |
| Bench centrifuge Sorvall ST16R | ThermoFisher Scientific | 75004240 | Replaceable with any source |
| Micro syringe 702N 25 µl (22S/2"/2) | Hamilton Company | 80400 | Flat tip |
| Sample Tray for Irradiator | Best Theratronics | A13826 | To set up mice protection with lead shield |
| Leica DMi8 Microscope | Leica Microsystem | Custom setup | |
| Leica CM1860 UV cryostat | Leica Microsystem | Custom setup | |
| Exel International Insulin Syringe | ThermoFisher Scientific | 14-841-31 | |
| Corning Phosphate Buffer Saline | Corning Cellgro/ThermoFisher | 21-031-CV | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Corning Cellgro/ThermoFisher | 11965-084 | |
| Trypsin 0.05% | Corning Cellgro/ThermoFisher | 25300054 | |
| Hyaluronidase from bovine testes | MilliporeSigma | H3506 |
References
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