Summary
O presente método serve para identificar a isoforma específica inibidores da histona deacetilases (HDAC) em células HeLa pela análise de vários substratos UHPLC-MS. Este é um método livre de anticorpos desenvolvido para refletir a atividade HDAC1 e HDAC6 do vida ambiente celular, em contraste com o single-isoforma celular livre ensaios.
Abstract
A busca de novos inibidores de histona deacetilase (HDAC) é de crescente interesse na descoberta da droga. Isoform seletividade tem sido o centro das atenções desde a aprovação da romidepsin, uma classe eu HDAC inibidor para terapia do câncer e a investigação clínica de inibidores de HDAC6 específicos para mieloma múltiplo. O presente método é usado para determinar a atividade inibitória de compostos de teste em HDAC1 e HDAC6 nas células. A atividade isoform é medida usando a cromatografia líquida de ultraelevado-desempenho – análise de espectrometria de massa (UHPLC-MS) de substratos específicos incubados com as células HeLa tratadas e não tratadas. O método tem a vantagem de refletir a atividade HDAC endógena dentro do ambiente celular, em contraste com a bioquímicos celular livre ensaios realizados sobre isoformas isoladas. Além disso, porque é baseado na quantificação dos substratos sintéticos, o método não requer o reconhecimento de anticorpos endógenos proteínas acetilado. É facilmente adaptável para várias linhas de células e um processo automatizado. O método já provou útil em encontrar compostos HDAC6-seletiva em neuroblastos. Resultados representativos são mostrados aqui com a padrão HDAC inibidores tricostatina um (não-específica), MS275 (HDAC1-específico), e tubastatin um HDAC6 (específico) usando as células HeLa.
Introduction
Das HDACs pertencem a uma família de enzimas capazes de deacetylate histones dentro da estrutura da cromatina. Eles também têm outros substratos de proteína no citosol e localizam-se em vários compartimentos da célula. Um total de 18 HDAC isoformas foram identificados até agora e têm sido relacionados a vários mecanismos de célula, incluindo a regulação de factores de transcrição e expressão gênica, bem como sinalização celular e transporte1,2,3,4,5,6,7. Catalíticos inibidores HDAC têm emergido como drogas terapêuticas potenciais para a terapia do câncer. A maioria dos inibidores HDAC atualmente aprovados pela FDA são para o tratamento de linfoma de células T e mieloma múltiplo e são inibidores HDAC não específicos, tais como vorinostat (Santos), belinostat e panobinostat8,9. No entanto, uma série de efeitos colaterais foram associados com pan-inibidores, e a busca de pequenas moléculas específicas isoform é um tema quente na descoberta química e drogas medicinal. Nesse sentido, a classe romidepsin de inibidor seletivo (HDAC1-3 e HDAC8) é uma droga já aprovada10, embora inibidores de HDAC6 específicas estão atualmente em ensaios clínicos, com maior potencial terapêutico em mieloma múltiplo11,12,13,14,15.
Seleção de ensaios de caracterização de HDAC inibidores baseiam-se na incubação de um substrato HDAC com uma fonte enzimática (única isoforma, extrato nuclear ou lisado celular). O substrato é geralmente uma sequência de pequenos peptídeos contendo um resíduo de lisina acetil acoplado a um fluoróforo cleavable (por exemplo, cumarina), tais como N-(4-methyl-7-aminocoumarinyl)-Nα-(t-butoxycarbonyl)-Nω-acetyllysineamide (MAL)16. Para distinguir entre isoform-atividades específicas, separadas sem célula ensaios envolvendo cada isoform são necessários e podem não refletir a atividade real isoform em pilhas vivas. Isoforma específica substratos são comercialmente disponíveis, tais como benzílico (S)-[1-(4-methyl-2-oxo-2H-chromen-7-ylcarbamoyl)-5-propionylaminopentyl]carbamate (MOCPAC, substrato específico HDAC1) e (éster de ácido tert-butil S)-[5-acetylamino-1-(2-oxo-4-trifluoromethyl-2H-chromen-7-ylcarbamoyl)pentyl]carbamic (BATCP, HDAC6 substrato específico) (figura 1B). No entanto, uma mistura de substrato multi contendo MAL, MOCPAC e BATCP, dado que as células vivas não permitirá a detecção de produtos deacetylated individuais por medição fluorométrica, dado que carregam o fluoróforo cleavable mesmo.
O método descrito aqui permite a detecção e quantificação relativa de cada substrato e seu produto deacetylated em células HeLa, usando um ensaio de substrato multi seguido de análise de UHPLC-ESI-MS/MS17. Um ensaio HDAC é realizado em células de HeLa, para permitir a identificação directa da atividade inibitória de HDAC e da especificidade dos compostos de teste na HDACs endógenas. Há um foco em HDAC1 e HDAC6, que são avaliados simultaneamente. Para alcançar estas medições enzimáticas em um ensaio de incubação único, uma mistura de substratos HDAC não-específica e específicas é adicionada ao tratados e não tratadas células HeLa banhadas em uma placa de 96 poços. Após uma etapa de incubação, as células lysed para liberar os substratos e seus produtos de reação respectivos, que são separados e detectados usando um método de UHPLC-MS (Figura 1). Os produtos deacetylated de substratos MAL, MOCPAC e BATCP são o MAL deacetylated (dMAL), deacetylated MOCPAC (dMOCPAC) e deacetylated BATCP (dBATCP), respectivamente. Curvas dose-resposta podem ser construídas com compostos ativos.
Figura 1: esquema geral para o ensaio HDAC baseada em célula identificar inibidores específicos de HDAC1 e HDAC6 pela análise de vários substratos UHPLC-MS. (A) esquema de uma típica placa de 96 poços contendo tratados (teste compostos) e as células HeLa não tratadas (controle), bem como espaços em branco sem célula. (B) estrutura química de substratos adicionado como uma mistura (21 µM cada) para ser deacetiladas por HDACs endógenas. (C) cromatograma típico UHPLC-MS, mostrando os picos de substratos adicionados (MAL, MOCPAC e BATCP) e seus produtos deacetylated (dMAL, dMOCPAC e dBACTP, respectivamente). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Protocol
1. cultura de pilha
Nota: As seguintes etapas são executadas em uma capa padrão de cultura de tecidos. Familiaridade com a técnica estéril é esperada.
- Cultura de células HeLa a confluência de 80% em um frasco de cultura celular T75 em MEM suplementado com 10% de soro bovino fetal, penicilina G (100 U/mL) e estreptomicina (100 mg/mL).
Nota: Célula cultura, tratamento e lise etapas são realizadas sob fluxo laminar, com passos de célula incubação a 37 ° C, realizado em um ambiente umidificado de 5% de CO2 em condições estéreis. - Lavar as células duas vezes com 5 mL de DPBS, Aspire o DPBS e adicione 1 mL do reagente de dissociação de célula. Incube a 37 ° C por 5 min separar as células.
- Adicionar 9 mL do meio de cultura MEM, completamente Ressuspender a suspensão de eritrócitos e contar as células usando um hemocytometer.
- Ajuste a densidade da suspensão celular 6 x 104 células/ml em MEM.
- Adicionar 100 µ l de suspensão de células para controle e teste os poços de uma placa de 96 poços estéril, de fundo plano, tratada com cultura de tecidos (figura 1A).
- Adicione 100 µ l de meio de cultura MEM em branco aos poços da placa de 96 poços (figura 1A).
- Incube a 37 ° C por 24 h a placa de 96 poços.
Nota: Uma incubação de 24 horas é um tempo adequado para testar a atividade HDAC endógena nas células HeLa. Diferentes tipos de células com actividade desconhecida HDAC podem precisar de uma avaliação de timecourse de células de controle.
2. célula tratamento com teste compostos e substratos HDAC
- Aspire o meio dos poços da placa de 96 poços.
- Adicione 25 µ l de 2 x teste compostos (por exemplo, tricostatina A, MS275 e tubastatin A) em MEM para testar poços. Adicione 25 µ l de MEM para controle e poços em branco.
Nota: A concentração de compostos de teste é para ser ajustado para fornecer uma gama de pelo menos 5 concentrações de teste final (uma concentração por alvéolo). A concentração final de DMSO no teste composto não deve exceder 0,5% e deve ser o mesmo em cada poço, incluindo espaços em branco e controles. O volume final de incubação é de 50 µ l por bem. Trichostatin A é testada em 5 concentrações que variam de 500 a 1.95 nM (diluição de 1:4). MS275 e tubastatin A são testados em 5 concentrações que variam de 8.000 a 6.17 nM (diluição de 1:6). A concentração final desejada para cada teste composto deve ser determinada por cada usuário individual, criando uma curva dose-resposta. - Adicione 25 µ l da mistura de substrato (42 µM de MAL e 42 µM de MOCPAC 42 µM de BATCP em MEM) para controle e teste de poços. Adicione 25 µ l de MEM para poços em branco.
Nota: A concentração final de cada substrato é 21 µM. MOCPAC e BATCP distinguem entre atividade HDAC1 e HDAC6, respectivamente (figura 1B). Quando nenhuma atividade é observada com os substratos, o uso do MAL poderia potencialmente levar à identificação da atividade contra outra isoforma HDAC. - Incubar a placa de 96 poços a 37 ° C para 8 h em um 5% umidificado incubadora de CO2 .
Nota: Este tempo de incubação é apropriado para células HeLa e permite que o HDAC endógena interagir com os substratos sintéticos. Linhagens celulares diferentes podem exigir ajustes na concentração de tempo e/ou substrato de incubação.
3. pilha Lysis e preparação da amostra para UHPLC-ESI-MS/MS
Atenção: As etapas de preparação de amostra usam produtos químicos orgânicos, que são altamente inflamável e tóxico por ingestão ou inalação. Use protecção pessoal adequada, tal como luvas e óculos de segurança.
- Adicione 10 µ l de tampão x RIPA 6 (diluído de 10 x RIPA buffer) suplementado com inibidor de protease para cada poço da placa de 96 poços.
- Pare a reação adicionando 160 µ l de acetonitrilo frio a cada poço e misture pipetando para cima e para baixo.
Nota: Mantenha o acetonitrilo a-20 ° C, antes desta etapa. - Coloque a placa em um freezer-80 ° C por 10 min.
- Retire o prato do freezer e transferir 220 µ l do conteúdo de cada poço a uma placa de 96 poços não-estéril, cónico-parte inferior (V-inferior). Centrifugue a placa em 5.000 x g e 4 ° C por 10 min.
Nota: Este passo visa a remoção de proteínas e sais. Se necessário, as soluções podem ser transferidas para tubos de centrifuga conico individuais antes da centrifugação ou filtradas através de um conjunto de 96 poços, 0,65 µm placas de filtro PVDF. A remoção bem sucedida do precipitado é necessária antes da análise UHPLC. - Transferir 200 µ l do sobrenadante (ou filtrado) em uma placa de 96 poços compatível com o sistema UHPLC e selá-lo com uma folha de peelable, heat-sealing usando um aferidor de placa.
Nota: Evite pipetagem as pelotas ao remover os sobrenadantes. Se a análise UHPLC não pode ser executada imediatamente, a placa pode ser armazenada a 4 ° C por um período máximo de 24 h até análise.
4. UHPLC/MS-MS Analysis
- Prepare o sistema UHPLC enchendo-o com o sistema de fase móvel (95% A:5% B):
R: H2O, grau HPLC, contendo 0,1% de ácido fórmico (preparar 1 L)
B: acetonitrilo, HPLC-grau, contendo 0,1% de ácido fórmico (preparar 1 L).
Atenção: A fase móvel contém produtos químicos orgânicos, que são altamente inflamável e tóxico por ingestão ou inalação. Use protecção pessoal adequada, tal como luvas e óculos de segurança. - Coloque a placa de 96 poços no Gerenciador de amostra contendo um suporte da placa. Execute as amostras de acordo com as condições de UHPLC-ESI-MS/MS fornecidas na tabela 1.
Nota: A cada coluna da placa de 96 poços analítica deve ter um controle bem e um poço em branco (como descrito no regime de placa da figura 1A). Controles são representativos de 100% de atividade enzimática em linhagem celular testado, enquanto espaços em branco estão lá para verificar se a fonte MS está fornecendo consistente fundo. Picos de MS incomuns detectados em um determinado espaço em branco devem ser investigados para impedir alterações de sensibilidade de MS.
5. análise de dados
- Integre a área do pico de cada substrato e seu produto deacetylated com um software de integração de UHPLC apropriado.
Nota: Use parâmetros de integração automática com um método de suavização (média, tamanho da janela 3 e número de liso 2, por exemplo). Usando as condições cromatográficas fornecidas na tabela 1, a ordem de eluição é dMAL (5,8 min), dBATCP (6,0 min), dMOCPAC (6,2 min), MAL (7,6 min), MOCPAC (8,9 min) e BATCP (9,8 min), como ilustrado na Figura 1. - Para cada substrato, calcule a relação de área do pico (deacetiladas/acetilado) em cada cromatograma (amostras de teste e controle).
- Calcule a inibição de HDAC percentual de cada amostra de teste:
Nota: HDAC1 inibição é calculada usando a relação de área do pico de dMOCPAC/MOCPAC; Inibição HDAC6 é calculada com dBATCP/BATCP. O rácio dMAL/MAL pode ser usado para expressar a inibição de HDAC geral.
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Representative Results
Para demonstrar a aplicação do método de identificação de inibidores não-seletivos e seletivos para HDAC1 (classe I) e HDAC6 (classe IIb), as células HeLa foram tratadas com compostos padrão conhecidos: tricostatina A (não-seletivo entre HDAC1 e HDAC6) tubastatin (HDAC6-seletivo inibidor)20, MS275 (inibidor seletivo HDAC1)19e18. Usando o método presente (Figura 1), valores de IC50 podem ser diretamente determinadas em células vivas HDAC1 (olhando deacetilação MOCPAC) e HDAC6 (olhando deacetilação BATCP) (Figura 2). A Trichostatin foi um inibidor potente mas não-seletivo para HDAC1 e HDAC6. Por outro lado, o MS275 foi seletiva para HDAC1, enquanto tubastatin A era claramente seletiva para HDAC6.
Figura 2: Curvas de IC50 Dose-resposta obtidas simultaneamente para HDAC1 e HDAC6 de três inibidores HDAC padrão: a tricostatina não-seletivo A, o MS275 HDAC1-seletiva e o HDAC6-seletivo tubastatin r. Valores de IC50 apresentados na tabela adjacente são a média ± DP de três medições independentes. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Volume de injeção | 5 ΜL |
| Coluna | C18 (2,6 μm, identificação de 100 x 3 mm) |
| Temperatura da coluna | 40 ° C |
| Taxa de fluxo de eluição | 0,8 mL/min (faixa de pressão típica: barras de 400-600) |
| Gradiente de eluição | 5-45% B em 10 min |
| 45-98% B em 2 min | |
| Etapa de lavagem | 98% B por 2 min |
| Desenroscada passo | 5% B por 4 min |
| ESI-MS/MS | tensão de cone, 30 V; tensão da fonte capilar, 3,0 kV; temperatura capilar, 350 ° C; temperatura da fonte, 120 ° C; bainha de gás - nitrogênio (600 L/h); pressão de gás de colisão, argônio definido como 3 x 10-3 mbar |
| Parâmetros de colisão e canais de reação otimizados com um tempo de interrupção de 0,1 s, 0,01 s interscan atrasos e energia de colisão fixado em 20 eV. | |
| Detecção de MAL com massa transições 446 → → 346 (MAL) e 404 304 (dMAL). | |
| Detecção de MOCPAC com massa transições 494 → → 449 (MOCPAC) e 439 394 (dMOCPAC). | |
| Detecção de BATCP com massa transições 500 → → 400 (BATCP) e 476 376 (dBATCP). |
Tabela 1: Condições de UHPLC-ESI-MS/MS.
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Discussion
Inibição de HDAC é um tema quente na descoberta de medicamentos, com foco atual em inibidores de HDAC6-seletivo para terapia de câncer21. Seletividade HDAC geralmente é avaliada por uma série de ensaios de alta produtividade, sem célula, que pretende determinar a potência inibitória no sentido individual HDAC isoformas21. No entanto, a seletividade de um inibidor deve ser adicionalmente confirmada em células vivas, avaliando o status de acetilação de substratos de proteína endógena, tais como as histonas (para classe I das HDACs) e tubulina (para HDAC6). Portanto, a célula ensaios envolvendo reconhecimento de anticorpos (por exemplo, imunocoloração, borrão ocidental, citometria de fluxo e ELISA) são geralmente necessários para alcançar uma avaliação quantitativa ou semi-quantitativa de isoforma potência de um determinado composto em vida as células do21. Não é raro que um composto que foi seletivo em um ensaio enzimático celular livre acaba por ser não-seletivo em células ou tecidos de17,22e vice versa,19. Isso pode ser explicado por diferenças nas fontes enzimáticas não-padronizadas e ausência de co-fatores ou parceiros de proteína em ensaios bioquímicos21.
O método descrito aqui é uma alternativa rápida, livre de anticorpo, permitindo a medição direta da classe I (HDAC1) e classe IIb (HDAC6) potência inibitória no vivo celular ambiente17. Outra vantagem do método é que pode ser facilmente adaptado para linhas de células diferentes, tais como neuroblastos23, com a possibilidade de miniaturização e automação, como descrito anteriormente por outros ensaios cell-based24. A detecção de substratos específicos por espectrometria de massa contribui para a medição precisa dos produtos deacetylated, fornecendo resultados quantitativos comparáveis. Este é o primeiro método disponível para determinar os valores de IC50 no sentido de isoformas HDAC específicas em células vivas. Por uma questão de comparação, foram demonstrados o perfil seletivo não-quantitativa de inibidores HDAC observado pelo borrão ocidental estar em consonância com o perfil de seletividade obtido com o método descrito aqui17. Mesmo que esse método foi desenvolvido para a descoberta de novos inibidores HDAC classe-seletivos, ele também poderia ser aplicado para medir a atividade HDAC dentro de modelos de célula ao longo de uma doença. Isso poderia contribuir para a elucidação dos mecanismos epigenéticos e moleculares em doenças relevantes e potencialmente poderia identificar candidatos a fármacos. Tendo em conta extrapolando esse método no sentido de HDAC isoforms diferentes HDAC1 e HDAC6, o desenvolvimento de novos substratos HDAC seletivos é fortemente encorajado. Além disso, a especificidade de substrato de MOCPAC e BATCP deve ser totalmente caracterizada em termos de segmentação única isoformas. Com efeito, enquanto MOCPAC é classificado como um substrato HDAC1 específicos (classe I sobre classe II), é mais provável que é um genérico classe I substrato (incluindo isoform HDAC3), como demonstrado anteriormente,25. Da mesma forma, BATCP é um substrato bem conhecido HDAC6-seletivo (classe II mais classe I das HDACs), mas sua especificidade para outra classe II das HDACs, tais como HDAC4, merece ainda mais caracterização25.
Atividade enzimática pode diferir dependendo da linhagem celular, tempo de incubação, confluência e número de células. Quando uma linha celular é usada pela primeira vez no ensaio, é importante testar uma gama de concentrações de substrato em células de controle, nos pontos de tempo diferente, de analisar a cinética enzimática por UHPLC-MS (por exemplo, através de uma trama de Michaelis-Menten). Isso permitirá que os investigadores a escolher a mais adequada concentração de tempo e substrato de incubação. Esta escolha depende de dois parâmetros principais: 1) a cinética enzimática e 2) a detecção de substratos e seus produtos deacetylated. Ao analisar a cinética enzimática, é essencial para avaliar os valores de velocidade inicial (ou seja, quando a formação do produto está dentro do intervalo linear) para estabelecer a cinética enzimática. De acordo com a cinética, concentrações de substrato sob o Km devem ser escolhidas para fornecer uma porcentagem exata de inibição, especialmente no caso de inibidores competitivos e não competitivos26. Por outro lado, a concentração de substrato escolhido deve fornecer sinais de MS detectáveis e quantificáveis para o substrato e o produto deacetylated (relação sinal / ruído ≥ 20)17. Ao usar vários substratos, o método cromatográfico deve garantir a separação dos picos de todos para ser analisado. Alternativos sistemas cromatográficos podem exigir mudanças no tipo de gradiente e coluna de separação.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Os autores reconhecem custo ação CM1406 (epigenéticas biologia química). Pesquisa reportada nesta publicação foi apoiada pela Fundação Pierre Mercier.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BATCP | Sigma-Aldrich | B4061 | |
| MAL | Sigma-Aldrich | SCP0168 | Synonym: BOC-Ac-Lys-AMC |
| MOCPAC | Sigma-Aldrich | M2195 | |
| MS275 | Sigma-Aldrich | EPS002 | |
| Trichostatin A | Sigma-Aldrich | T8552 | |
| Tubastatin A | Sigma-Aldrich | SML0044 | |
| Acetonitrile, HPLC grade | Fisher Scientific | 10660131 | |
| Formic acid, LC/MS grade | Fisher Scientific | 10596814 | |
| H2O, HPLC grade | distilled H2O filtered through a Milli-Q purification system | ||
| HeLa cells | ATCC | ATCC CRM-CCL-2 | |
| Cell dissociation reagent TrypLE Express | ThermoFisher Scientific | 12604013 | |
| DMSO, cell culture grade | Applichem | 146463 | |
| DPBS | ThermoFisher Scientific | 14190144 | |
| Fetal bovine serum | Biowest | S1810 | |
| MEM | ThermoFisher Scientific | 22561021 | |
| Penicillin-Streptomycin | Bioconcept | 4-01F00-H | |
| 10x RIPA buffer | Abcam | ab156034 | |
| SigmaFast protease inhibitor tablets | Sigma-Aldrich | S8820 | |
| 96-well plates, sterile, flat-bottom, tissue culture treated Corning | VWR | 29442-058 | |
| 96-well plates, non-sterile, V-bottom Corning | VWR | 29442-404 | used in the centrifugation step |
| 96-well plate, conical bottom, Nunc | ThermoFisher Scientific | 249944 | compatible with the Acquity UHPLC system |
| T75 cell culture flasks Corning | Sigma-Aldrich | CLS430641 | |
| Peelable heat sealing foil | Waters | 186002789 | |
| Acquity UPLC system | Waters | ||
| Eppendorf Centrifuge 5810 R | Fisher Scientific | 05-413-323 | |
| Integration software: MassLynx V4.1 | Waters | Catalog number not available | |
| Combi thermo-sealer SP-0669/240 | Waters | Catalog number not available | |
| Quattro micro API Tandem Quadrupole System | Waters | Catalog number not available |
References
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