Summary
Die saure Nachkonditionierung schützt vor der zerebralen Ischämie. Hier stellen wir zwei Modelle vor, um APC auszuführen. Sie werden jeweils durch Übertragung von kortikostriatalen Scheiben auf sauren Puffer nach Sauerstoff-Glukose-Deprivation in vitro und durch Einatmen von 20% CO 2 nach mittlerer zerebraler Arterienverschluss in vivo erreicht .
Abstract
Schlaganfall ist eine der führenden Ursachen für Sterblichkeit und Behinderung weltweit mit begrenzten therapeutischen Ansätzen. Als endogene Strategie für die Neuroprotektion haben sich die Nachkonditionierungsbehandlungen als vielversprechende Therapien gegen die zerebrale Ischämie erwiesen. Allerdings beschränken komplizierte Verfahren und potenzielle Sicherheitsfragen ihre klinische Anwendung. Um diese Nachteile zu überwinden, haben wir eine saure Nachkonditionierung (APC) als Therapie für die experimentelle fokale zerebrale Ischämie entwickelt. APC bezieht sich auf die milde Azidosebehandlung durch Einatmen von CO 2 während der Reperfusion nach Ischämie. Hier stellen wir zwei Modelle vor, um APC in vitro und in vivo auszuführen. Die Sauerstoff-Glukose-Deprivation (OGD) Behandlung von Mäusen und die kortikostriatale Okklusion und mittlere zerebrale Arterienverschluss (MCAO) von Mäusen wurden eingesetzt, um die zerebrale Ischämie nachzuahmen. APC kann einfach durch die Übertragung von Hirnschnitten auf sauren Puffer, der mit 20% CO 2 , o verschmolzen wird, erreicht werdenR durch Mäuse, die 20% CO 2 einatmen. APC zeigte signifikante Schutzwirkungen gegen die zerebrale Ischämie, wie sich aus der Gewebefähigkeit und dem Gehirninfarktvolumen widerspiegelt.
Introduction
Schlaganfall ist eine der führenden Ursachen für Sterblichkeit und Behinderung weltweit. Es wurden große Anstrengungen unternommen, um in den letzten Jahrzehnten wirksame Behandlungen für Schlaganfall zu finden. Allerdings ist die Leistung ganz unbefriedigend. Die Nachkonditionierung ist ein Prozess, der durch subtoxische Spannungen nach einer ischämischen Episode manipuliert wird. Nachkonditionierung, einschließlich ischämischer, hypoxischer, flachglukosierter und entfernter ischämischer Nachkonditionierung, lösen endogene adaptive Mechanismen aus und haben sich als vielversprechende Therapien gegen die zerebrale Ischämie 1 , 2 , 3 , 4 erwiesen. Allerdings kann die ischämische Nachkonditionierung zusätzliche Verletzungen einleiten. Die oberflächliche Ischämische Nachkonditionierung erfordert in der Regel mehrere Zyklen von 5 - 20 min Okklusion und Reperfusion an den ipsilateralen oder bilateralen Hinterbeinen 5 , 6 , 7 . ThDiese Nachkonditionierungsmanipulationen sind daher in der klinischen Praxis gefährlich oder unpraktisch. Um diese Nachteile zu überwinden, haben wir APC als Therapie für die fokale zerebrale Ischämie bei Mäusen entwickelt 8 . Induziert einfach durch Einatmen von 20% CO 2 , reduziert APC die ischämische Hirnverletzung in einer eher machbaren und sichereren Weise. Vor kurzem haben wir bewiesen, dass APC das Reperfusionsfenster erweitert und die Bedeutung von APC für die Schlaganfalltherapie hervorhebt 9 .
Hier stellen wir zwei experimentelle Modelle vor, um die Neuroprotektion von APC gegen die zerebrale Ischämie zu untersuchen. Das erste ist das Sauerstoff-Glukose-Deprivation (OGD) -Modell in Mäusen kortikostriatalen Scheiben. Schnelle Vorbereitung und Übertragung der Hirnschnitten in eine künstliche Umgebung, in der Regel künstliche Cerebrospinalflüssigkeit (ASCF), kann die Lebensfähigkeit der Zellen und die neuronale Schaltung aufrechtzuerhalten, die es ermöglicht , 10 Hirnfunktion in vitro zu studieren <Sup>, 11 . OGD in ASCF imitiert zerebrale Ischämie und induziert ischämische Verletzung 12 , 13 , 14 . Nach OGD werden die Hirnschnitten in regulärem ASCF (r-ASCF) aufgefrischt, um eine Reperfusion zu ermöglichen und dann mit APC unter Verwendung von saurer ASCF, die mit 20% CO 2 geblasen wurde, behandelt. Die kortikostriatale Scheibe behält die intakte histologische Charakterisierung im Vergleich zu primär kultivierten Zellen bei.
Um die Gehirnfunktion in vivo zu untersuchen , wird das Modell der Maus mit mittlerem zerebraler Arterienverschluss (MCAO) verwendet. Die mittlere zerebrale Arterie wird durch Einfügen eines flammunktionellen Monofilaments über die gemeinsame Carotis-Arterie blockiert. Als eines der am häufigsten verwendeten Schlaganfallmodelle zeigt das MCAO-Modell eine klinische Relevanz und die Anwendung eines Monofilaments macht es leichter, eine Reperfusion zu erreichen. Einfach durch Einatmen von normoxischem Mischgas, das 20% CO 2 nach dem Beginn der Reperfusio enthältN, APC zeigte signifikante Schutzwirkungen gegen die zerebrale Ischämie, die durch reduzierte Hirninfarktvolumina angezeigt wurde.
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Protocol
Alle Experimente wurden gemäß den ethischen Richtlinien des Zhejiang University Animal Experimentation Committee genehmigt und durchgeführt und waren in Übereinstimmung mit den National Institutes of Health Guide für die Pflege und Verwendung von Labortieren. Es wurden Anstrengungen unternommen, um Schmerzen oder Unannehmlichkeiten zu minimieren, und die minimale Anzahl von Tieren wurde verwendet.
1. OGD von kortikostriatischen Scheiben
- Lösungsvorbereitung:
- Zubereiten 1.000 ml r-ACSF (124 mmol / l NaCl, 5 mmol / l KCl, 1,25 mmol / l KH 2 PO 4 , 2 mmol / l MgSO 4 , 26 mmol / l NaHCO 3 , 2 mmol / l CaCl 2 , 10 mmol / l Glucose, endgültiger pH-Wert 7,4). Blase mit 5% CO 2 und 95% O 2 während des gesamten Experiments.
- Vorbereiten von 200 ml glucosefreiem ACSF (gf-ACSF) wie oben, jedoch ohne Glukose, mit 5% CO 2 und 95% N 2 geblasen. Blase die Gase für 30 min vor dem Auftragen auf brAin Scheiben, um den Sauerstoffgehalt in der Lösung zu reduzieren. Weiter blasen, bis das OGD-Verfahren beendet ist.
- Bereiten Sie saures ACSF (a-ACSF) durch Äquilibrieren von 200 ml r-ACSF mit 20% CO 2 und 80% O 2 vor . Blasen Sie die Gase für 30 Minuten, bevor Sie auf Gehirnscheiben anwenden, um den pH-Wert der Lösung auf pH 6,8 zu reduzieren, und weiter sprudeln, bis die APC-Prozedur beendet ist.
- Platzieren Sie drei Gewebehalter in r-ACSF, gf-ACSF, a-ACSF.
- Gehirnscheibenvorbereitung:
Anmerkung: 8-Wochen-alte, männliche C57Bl / 6J-Mäuse wurden in dieser Studie verwendet. Die Tiere wurden unter kontrollierter Temperatur (22 ± 2 ° C) untergebracht, mit einer 12 h Hell-Dunkel-Zyklusperiode und dem Zugang zu pelletiertem Essen und Wasser.- Eine Maus mit einer Isofluran-Überdosierung in einer Induktionskammer opfern. Entkuppeln Sie die Maus. Das Gehirn mit kleinen Scheren und Pinzetten herausziehen. Entfernen Sie das Gehirn mit einem dünnen Spatel und lassen Sie es sorgfältig in ein Glasbecher conEiskaltes r-ACSF, das mit 5% CO 2 und 95% O 2 äquilibriert wurde.
HINWEIS: Diese Schritte sollten so schnell, aber sorgfältig wie möglich durchgeführt werden. - Halten Sie das Gehirn in der eiskalten r-ACSF für 5 min. Stellen Sie den Gasdruck ein, um Bewegungen des Gehirns zu vermeiden.
- Legen Sie den Kryopräzipitationskleber auf die Vibrationsplatte in zwei Streifen. Legen Sie ein Stück von 3% Agarose auf den Leimstreifen weg von der Klinge, um das Gehirn zu unterstützen.
- Invertiere eine 10-cm-Petrischale auf Eis und legst dann ein Filterpapier auf die Schale. Befeuchten Sie das Filterpapier mit Tropfen eiskaltem r-ACSF.
- Übertragen Sie das Gehirn mit Pinzette auf das Filterpapier. Schneiden Sie den Stirnpol und den Kleinhirn mit Klinge und Pinzette ab.
HINWEIS: Die Querschnitte sollten so glatt wie möglich und senkrecht zur sagittalen Ebene sein. - Legen Sie das verbleibende Hirngewebe vertikal auf den anderen Leimstreifen und halten Sie das Gehirn an die Agarose gelehnt. Füge eiskaltes r-ACSF zum Schneidreservoir hinzuTauchen Sie das Gehirn ein und fügen Sie Eis zum Eishalterbereich hinzu. Halten Sie die r-ACSF in den Reservoir mit 5% CO 2 und 95% O 2 geblasen.
- Heben Sie den Stausee an und stellen Sie die Position des Rasiermessers ein, um das Rasiermesser so nah wie möglich am Gehirn zu legen und knapp über dem Gehirn.
- Wählen Sie "CONT" -Modus, um die Gehirnabschnitte kontinuierlich zu schneiden. Stellen Sie die Schnittdicke auf 400 μm, die Vibrationsfrequenz auf 6 - 8 und die Geschwindigkeit auf 3 - 4. Drücken Sie die Taste "Start / Stop", um das automatische Schneiden zu starten.
- Schneiden Sie die Spitze einer 3 ml Pasteurpipette ab, um eine Öffnung zu machen, die der Größe der Gehirnscheiben entspricht.
HINWEIS: Die Öffnung sollte groß genug sein, um zusätzliche Schäden an den Gehirnscheiben zu vermeiden. - Ziehen Sie fünf Gehirnscheiben eins nach dem anderen mit der Spitze-cutPasteur-Pipette heraus und legen Sie sie in den Gewebehalter in eiskaltem r-ACSF, geblasen mit 5% CO 2 und 95% O 2 . Sammeln Sie nicht die erste Scheibe produziert. Den Gasdruck einstellen, um zu vermeidenD Bewegungen der Gehirnscheiben.
HINWEIS: Die Gehirnscheiben sollten sich nicht gegenseitig abdecken. - Legen Sie Hirnscheiben mit r-ACSF bei Raumtemperatur für 30 min und dann bei 37 ° C in einem Wasserbad für weitere 10 min, um synaptische Funktionen wiederherzustellen.
- Eine Maus mit einer Isofluran-Überdosierung in einer Induktionskammer opfern. Entkuppeln Sie die Maus. Das Gehirn mit kleinen Scheren und Pinzetten herausziehen. Entfernen Sie das Gehirn mit einem dünnen Spatel und lassen Sie es sorgfältig in ein Glasbecher conEiskaltes r-ACSF, das mit 5% CO 2 und 95% O 2 äquilibriert wurde.
- OGD und APC:
- Legen Sie gf-ACSF und a-ACSF in ein 37 ° C Wasserbad und blasen Sie die Puffer mit den entsprechenden Gasen wie oben in 1.1.2 und 1.1.3 für 30 min.
- Verlasse eine Scheibe in r-ACSF als Kontrolle. Übertragen Sie die anderen vier Gehirnscheiben in den Gewebehalter mit vorgewärmtem gf-ACSF sorgfältig und inkubieren für 15 min. Übertragen Sie die Scheiben wieder in den Gewebehalter in r-ACSF, um Reperfusion zu erreichen.
- Um das Zeitfenster von APC zu studieren, transferiere man eine Scheibe direkt von gf-ACSF zu a-ACSF. Übertragen Sie die anderen drei Scheiben zunächst auf r-ACSF und übergeben Sie dann zwei davon auf den Gewebehalter in a-ACSF 5 und 15 min nach Reperfusion.
- IncubatE die beiden Scheiben in einem ACSF für 3 min und dann übertragen sie zurück zu r-ACSF. Inkubieren Sie die drei Scheiben in r-ACSF für weitere 1 h. Setzen Sie die restlichen Scheiben in r-ACSF als OGD-Gruppe.
- Für eine Dosis-Response-Studie, übertragen Sie alle vier Scheiben auf den Gewebehalter in r-ACSF zuerst nach OGD und inkubieren für 5 min. Dann lassen Sie eine Scheibe in r-ACSF als OGD-Gruppe und übertragen Sie die anderen drei Scheiben zu einem ACSF. Die Scheiben in einem ACSF für 1, 3 und 5 min inkubieren und dann wieder auf r-ACSF übertragen. Inkubieren Sie die drei Scheiben in r-ACSF für weitere 1 h.
- Scheibenlebensfähigkeitsbestimmung:
- Bereiten Sie 0,25% 2,3,5-Triphenyltetrazoliumhydrochlorid (TTC) normale Kochsalzlösung vor. Füge 1,25 g TTC-Pulver zu 500 ml normaler Kochsalzlösung hinzu.
HINWEIS: Nach dem vollständigen Auflösen des Pulvers wird die Lösung in eine mit einer Folie bedeckte Platte mit 24 Vertiefungen (500 μl pro Vertiefung) überführt und bei 4 ° C aufbewahrt. TTC und Gewebe mit TTC gefärbt sind Licht senStetig - Übertragen Sie die Scheiben in eine 24-Well-Platte (eine Scheibe pro Vertiefung) mit TTC-Lösung und strecken Sie die Scheibe in der Lösung aus. Die Scheiben in TTC-Lösung bei 37 ° C in einem flachen Wasserbad für 30 min inkubieren.
- Übertragen Sie die Scheiben in saubere 1,5 ml Zentrifugenröhrchen, die in Folie abgedeckt sind, und messen Sie das Trockengewicht der Scheiben.
- Füge Ethanol / Dimethylsulfoxid (1: 1) in die Zentrifugenröhrchen (v: w = 10: 1) ein, um Formazan zu extrahieren. Inkubieren der Scheiben in Ethanol / Dimethylsulfoxid bei Raumtemperatur weg von Licht für 24 h.
- Fügen Sie alle Ethanol / Dimethylsulfoxid in die Röhrchen in eine 96-Well-Platte und messen Sie die Extinktion bei 490 nm durch einen Plattenleser.
- Normalisieren Sie die Extinktion auf das Trockengewicht der Scheibe und drücken Sie die Lebensfähigkeit als Prozentsatz der Kontrollscheibe aus.
- Bereiten Sie 0,25% 2,3,5-Triphenyltetrazoliumhydrochlorid (TTC) normale Kochsalzlösung vor. Füge 1,25 g TTC-Pulver zu 500 ml normaler Kochsalzlösung hinzu.
2. MCAO
- Vorbereitung:
- Desinfizieren Sie die Werkbank, die Oberfläche des Laser-Doppler-DurchflussesY (LDF) Instrument und sein Zubehör mit 70% Ethylalkohol.
- Vorbereiten von autoklavierten Instrumenten: zwei Scheren, 10 cm; Zwei Zangen, 10 cm; Eine ophthalmische Pinzette, 11 cm; Eine Mikro-ophthalmische Schere, 9 cm; Eine Mikrogefäßklemme, 1,8 cm; Onenedle-Antrieb, r 12,5 cm; Mehrere chirurgische Nähte (△ 1/2 4 × 10); Wattestäbchen.
- Bereiten Sie eine Spritze (ohne Nadel) mit Kochsalzlösung vor, um einen hydratisierten Arbeitsbereich zu erhalten.
- Bereiten Sie das Anästhesiegas (100% O 2 + Isofluran) vor.
- Nachweis des Gehirns Blutfluss:
- Richten Sie das LDF-Instrument ein.
- Intraperitoneal in die Maus injizieren: Metamizol 200 mg / kg, Carprofen 4 mg / kg und Buprenorphin 0,1 mg / kg.
- Legen Sie die Maus in eine Induktionskammer mit 4% Isofluran in Sauerstoff, um es zu betäubern, bis spontane Bewegung von Körper und Vibrissae stoppt.
- Legen Sie die Maus in eine anfällige Position mit der Nase in thE Nase Kegel und pflegen Isofluran bei 1,5% für die nachfolgende Verfahren.
- Tragen Sie Dexpanthenol Augensalbe auf beide Augen.
- Desinfizieren Sie den Kopf mit 70% Ethylalkohol.
- Machen Sie einen richtigen Paramedian Haareinzision zwischen Augen und Ohren mit einem Skalpell, um die Bregma auszusetzen.
- Reiben Sie den Schädel mit steriler Baumwolle.
- Tragen Sie ein bis zwei Tropfen chirurgischen Kleber auf die Oberfläche des Schädels.
- Legen Sie die Spitze der Faseroptik Sonde 5 mm kaudal auf die Bregma und 6 mm seitlich zur Mittellinie.
- Starten Sie die Aufnahme des Blutflusses auf der Computer-Software. Warten Sie, bis eine stabile Blutfluss-Grundlinie auftritt und dann einen 20 μl-Katalysator auf den Kleber auftragen, um die Sonde zu fixieren.
HINWEIS: Eine ideale Grundlinie sollte mehr als 500 Fluss sein. - Wenn die Grundlinie weniger als 200 Fluss ist, passen Sie die Position fein an, um eine geeignete Grundlinie zu erhalten. Halten Sie die Sonde für die Dauer des Experiments an den Schädel.
- Desinfizieren Sie den Kopf mit Iodophor afDie Faseroptik-Sonde befestigt.
- MCAO:
- Platzieren und fixieren Sie die anästhesierte Maus (mit LDF-Sonde an seinem Schädel befestigt) in einer Rückenlage und beibehalten ihre Körpertemperatur mit einer Wärmelampe während der Operation. Desinfizieren Sie den Hals mit 70% Ethylalkohol.
- Machen Sie eine paramedian Hautinzision in den Hals mit einem Skalpell; Stumpfes Sezieren der Weichgewebe mit Pinzette, um Gefäße auszusetzen. Fügen Sie einen Tropfen Salzlösung zu den exponierten Geweben hinzu, um sie zu hydratisieren.
- Die gemeinsame Carotis-Arterie aus dem umgebenden Gewebe und dem Vagusnerv mit ophthalmischer Pinzette zerlegen. Achten Sie darauf, den Vagusnerv nicht zu beschädigen. Desinfizieren Sie die Haut des Nackens wieder mit Iodophor, nachdem die gemeinsame Carotis-Arterie ausgesetzt war.
- Lege eine Mikrogefäßklemme am distalen Ende der Arteria carotis an und binden dann einen toten Knoten mit 6-0 Seidennähten am proximalen Ende. Legen Sie die Klemme so nah wie möglich für nachfolgende Operationen. Stellen Sie sicher, dass die Länge vonDas Gefäß zwischen Klemme und totem Knoten ist so lange wie möglich für nachfolgende Operationen.
- Machen Sie eine vorübergehende Naht proximal zur Klemme, indem Sie einen losen Knoten anbinden. Vergewissern Sie sich, dass zwischen zwei Knoten für die Einfügung von Monofilmen genügend Platz vorhanden ist.
- Machen Sie einen kleinen Einschnitt zwischen den beiden Knoten mit Mikro-ophthalmischen Schere. Stellen Sie sicher, dass der Einschnitt so nah wie möglich an den toten Knoten steht. Achten Sie darauf, das Schiff nicht abzuschneiden.
- Setzen Sie ein 12-mm-Tip-Blunted-Monofilament durch den Einschnitt in das Arterien-Lumen ein und geben Sie es ein paar mm. Ziehen Sie den losen Knoten um die Spitze des Monofilaments und entfernen Sie dann die Klemme.
- Führen Sie den Faden in die A. carotis interna (10 mm, um die mittlere zerebrale Arterie zu verschließen) mit ophthalmischer Pinzette, bis die LDF-Software einen starken Rückgang (> 80% Reduktion vom Baseline-Blutfluss) im Blutfluss zeigt. Notieren Sie die Startzeit der Okklusion.
HINWEIS: LDF-Geräte-Setup istBeschrieben in Abschnitt 2.2. - Okhude die mittlere zerebrale Arterie für 1 h. Die LDF-Sonde abschneiden und die Mäuse in einen 30 ° C-Inkubator für die Dauer der Okklusion stellen.
- Reperfusion und APC:
- Die Tiere mit Isofluran respektieren, wie oben beschrieben 55 min nach Beginn der Okklusion. Platzieren und fixieren Mäuse in einer Rückenlage. Öffnen Sie den Halsschnitt und setzen Sie die Arteria carotis frei.
- Ziehen Sie den Faden vorsichtig nach der Okklusionsperiode mit ophthalmischer Pinzette heraus, um eine Reperfusion zu erreichen und die temporäre Naht in eine permanente zu verwandeln, indem Sie den Knoten festziehen.
- Bei der Azidose-Behandlung das durch den Nasenkonus eingeatmete Gas zu den Mischgasen, die 20% CO 2 , 20% O 2 und 60% N 2 für 5 min bei 5, 50 oder 100 min nach der Reperfusion enthalten, Schließen Sie den Schnitt mit einer unterbrochenen chirurgischen Naht.
- Legen Sie Mäuse in einen 30 ° C Wärmekäfig, bis Mäuse das Bewusstsein wiederherstellenUnd dann die Mäuse wieder reinigen, einzelne Käfige. Mäuse mit einer Petrischale von Wasser und befeuchtetem Essen versorgen. Überwachen Sie die Mäuse genau nach der Operation für übermäßige Schmerzen und Tod.
- Gehirn Infarkt Volumenmessung:
- Messung des Hirninfarktvolumens durch Verwendung von TTC-Färbung 24 h nach Reperfusion.
- Bereiten Sie 0,25% TTC-Lösung vor, wie in Schritt 1.4.1 vor der vorgesehenen Zeit des Opfers erwähnt. Übertragen Sie die Lösung in eine 24-Well-Platte (1 ml pro Vertiefung), die in Folie abgedeckt ist, und lagern Sie sie bei 4 ° C.
HINWEIS: TTC und Gewebe, die mit TTC gefärbt sind, sind lichtempfindlich. - Um 24 h nach der Reperfusion opfern sie das Tier mit einer Isofluran-Überdosierung in einer Induktionskammer. Enthaupte die Mäuse. Die Gehirne mit kleinen Scheren und Pinzetten herausziehen. Untersuche Blutpausen an den Gehirnen, um die Mäuse auszuschließen, die eine Subarachnoidalblutung am Circle of Willis durchmachten.
- Legen Sie das Gehirn auf eine saubere Glasrutsche auf -20 ° C-Pack. Legen Sie das Gehirn und die Glasrutsche in einen -20 ° C Kühlschrank für 5 min, um das Gehirn leichter zu schneiden.
- Nehmen Sie das Gehirn und die Glasrutsche von -20 ° C heraus und legen Sie sie wieder auf den -20 ° C Eisbeutel. Die Stirnpol und das Kleinhirn mit Klinge und Pinzette zerlegen.
- Schneiden Sie die Gehirnabschnitte horizontal auf eine 1-mm-Dicke mit einer Klinge, um 5 Scheiben zu produzieren. Übertragen Sie die Scheiben in die 24-Well-Platte mit TTC-Lösung (1 Scheibe pro Vertiefung) mit Pinzette und strecken Sie die Scheiben in der Lösung aus. Die Scheiben in TTC-Lösung bei 37 ° C in einem flachen Wasserbad für 30 min inkubieren.
- Aspirieren Sie die TTC-Lösung. 10% Formaldehyd (1 ml pro Vertiefung) zugeben und bei Raumtemperatur für 30 min inkubieren. Legen Sie die Scheiben in die Reihenfolge, in der sie auf ein Cellophan-Blatt geschnitten wurden, und scannen Sie die Segmente in die fotografische Platten-Imager.
- Analysieren Sie die Infarktgröße als Prozentsatz des gesamten Gehirns mit Hilfe der ImageJ-AnalysesoftwareLass = "xref"> 8 basierend auf visueller identifikation; Siehe Abbildung 2 (links).
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Representative Results
In dem oben beschriebenen corticostriatalen Scheibenmodell wurde die Lebensdauer der corticostriatalen Scheibe durch TTC-Test bei 1 h nach der Reperfusion quantifiziert. Die TTC-Umwandlung wurde durch Normalisierung der Absorption bei 490 nm an die Kontrollscheibe berechnet. Nach der TTC-Umwandlung, APC geschützt gegen OGD-induzierte Reperfusionsverletzung in einem Einsetzzeit und Dauer-abhängig Weise. Im Detail haben sowohl 1 als auch 3 min der Azidose-Behandlung die Lebensfähigkeit bei 5 min nach 15 min OGD signifikant verbessert, während 5 min nicht (OGD: 0,609 ± 0,029, 5/1: 0,758 ± 0,034, 5/3: 0,821 ± 0,041, 5/5: 0,672 ± 0,053, Daten als Mittelwert ± SEM) ( Abbildung 1 A ). Die Neuroprotektion durch Azidose-Behandlung blieb innerhalb von 5 min nach Reperfusion schützend, während 15 min nicht (OGD: 0,584 ± 0,044, 0/3: 0,762 ± 0,036, 5/3: 0,833 ± 0,062, 15/3: 0,627 ± 0,038) ( Abbildung 1 B ).
Im MCAO-Modell wurde 5 min der Azidose-Behandlung bei 5 min nach dem Beginn der Reperfusion den durch die ischämische Beleidung verursachten Zelltod, der durch kleinere Infarktvolumina (MCAO: 33,4 ± 4,4%, 5/5: 16,6 ± 2,7%, 50) / 5: 19,5 ± 2,1%, 100/5: 37 ± 2,1%). Der Neuroprotektion war noch robust, auch wenn die Einsetzzeit nach Reperfusion auf 50 min verzögert wurde. Allerdings hat die mit 100 min initiierte Azidosebehandlung die ischämischen Verletzungen nicht blockiert ( Abbildung 2 ).
Alle Daten wurden gesammelt und blind behandelt. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM dargestellt. Im kortikostriatalen Scheibenmodell hat jede Gruppe 6-8 Proben. Im MCAO-Modell hat jede Gruppe 9 - 10 Proben. Eine Einweganalyse der Varianz mit dem geringsten signifikanten Unterschied wurde für Mehrfachvergleiche angewendet.
Abbildung 1. APC schützt gegen OGD-induzierte Reperfusionsverletzung in kortikostriatalen Scheiben. Corticostriatale Scheiben wurden mit Azidose (pH 6,8) für die angegebenen Dauern (A) behandelt und die Erholungsperioden (B) nach OGD angegeben. Die Zelllebensfähigkeit wurde durch den 3- [4,5-Dimethylthiazol-2-yl] -2,5-diphenyltetrazoliumbromid-Assay nach 24 Stunden nach der Reperfusion beurteilt, und die Lebensdauer der kortikostriaten Schicht wurde durch einen TTC-Test nach 1 Stunde nach der Reperfusion quantifiziert. Werte zeigen Mittelwert ± SEM. N = 6 - 8 für jede Gruppe; * P <0,05 und ** p <0,01 durch Einweganalyse der Varianz; R, Reperfusion. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. APC schützt gegen MCAO-induzierte Verletzungen bei Mäusen. Die Tiere wurden 60 min MCAO unterworfen und durch Einatmen von 20% CO & sub2; für 5 min bei 5, 50 oder 100 min nach der Reperfusion behandelt. Infarktvolumen wurde durch 2,3,5-Triphenyltetrazoliumhydrochlorid-Färbung nach 24 h nach Reperfusion quantifiziert (angedeutet durch schwarze gestrichelte Linie auf der linken Tafel). Werte zeigen Mittelwert ± SEM. N = 8 - 10 für jede Gruppe; * P <0,05 und ** p <0,01 durch Einweganalyse der Varianz; R, Reperfusion. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Hier stellen wir zwei experimentelle Modelle vor, um die Neuroprotektion von APC gegen die zerebrale Ischämie zu untersuchen. In Hirnschnitten wird APC durch Inkubieren von Mäusen kortikostriatalen Scheiben in sauren Puffer, der mit 20% CO 2 nach dem Reperfusionsbeginn geblasen wurde, erreicht, während im MCAO-Modell APC durch Einatmen von 20% CO 2 zu Mäusen nach Reperfusion erreicht wird. Beide Modelle spiegeln die Neuroprotektion von APC gegen die zerebrale Ischämie wider. Der Schutz war vergleichbar mit dem, der durch ischämische Nachkonditionierung erreicht wurde, aber mit einem breiteren Zeitfenster. Im MCAO-Modell könnte das Zeitfenster bis zu 50 min nach Reperfusion im Vergleich zu 10 min für ischämische Nachkonditionierung 15 sein . Darüber hinaus ist das Verfahren von APC einfacher und sicherer.
Im kortikostriatalen Scheibenmodell sind sanfte und schnelle Operationen entscheidend, um die Lebensfähigkeit der Gehirnscheiben in höchstem Maße zu rechtfertigen. Für die MCAO-Leistung ist die zerebrale BlutflussüberwachungErforderlich, und der scharfe Abfall des Blutflusses muss beobachtet werden, um die Okklusion der mittleren zerebralen Arterie zu gewährleisten. Nachdem die Gehirne für die TTC-Färbung seziert wurden, ist eine sorgfältige Untersuchung des Gehirns notwendig, um die Subarachnoidalblutung auszuschließen.
Die Extension und die Dauer der Azidose sind entscheidend für die Neuroprotektion von APC. Eine längere Dauer der Azidosebehandlung ist bei dem Modell der kortikostriatalen Scheiben nicht vorteilhaft ( Abbildung 1 A ). Darüber hinaus zeigte unsere bisherige Studie, dass sowohl 10% als auch 20% CO 2 Inhalation, anstatt 30% CO 2 Inhalation Neuroprotektion auf Mäusen verleihen 8 . Diese deuten darauf hin, dass eine leichte Azidose entscheidend für die Neuroprotektion von APC ist und somit die Konzentration von CO 2 und die Dauer von APC für die Azidose-Neuroprotektion unentbehrlich sind.
Neben der TTC-Färbung können viele Techniken zu s kombiniert werdenAtisfy diverse Forschungsbedürfnisse. Zum Beispiel kann extrazelluläre elektrische Aufzeichnung zum letzten Schritt hinzugefügt werden , zu beobachten , wie Ischämie und Azidose 16 neuronales Potentials beeinflussen. Die Perfusionslösung der Hirnscheibe kann auch gesammelt werden, um die Konzentrationsänderung von Aminosäure-Neurotransmittern nach APC durch HPLC 17 zu messen. Scheiben von bestimmten Gehirnregionen können vorbereitet werden, um die Reaktionen eines bestimmten Bereichs auf Ischämie und APC zu untersuchen. Insgesamt können viele Alternativen eingeführt werden, um die Auswirkungen von Ischämie und Azidose zu beleuchten.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der Nationalen Naturwissenschaftlichen Stiftung von China (81573406, 81373393, 81273506, 81221003, 81473186 und 81402907), Zhejiang Provincial Natural Science Foundation (LR15H310001) und dem Programm für Zhejiang Leading Team von S & T Innovation Team (2011R50014) finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium chloride | Sigma | S5886 | |
| Potassium chloride | Sigma | P5405 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma | P9791 | |
| Magnesium sulfate | Sigma | M2643 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma | C5080 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G7021 | |
| Vibratome | Leica | VT1000 S | |
| 2,3,5-triphenyltetrazolium hydrochloride | Sigma | T8877 | |
| Absolute Ethanol | Aladdin Industrial Corporation | E111993 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D8418 | |
| Laser Doppler Flowmetry | Moor Instruments Ltd | Model Moor VMS-LDF2 | |
| Diethyl ether anhydrous | Sinopharm Chemical Reagent Corporation | 80059618 | |
| Trichloroacetaldehycle hydrate | Sinopharm Chemical Reagent Corporation | 30037517 | |
| 10% Formalin | Aladdin Industrial Corporation | F111936 | |
| 24-well plates | Jet Biofil | TCP-010-024 |
References
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