Summary
È descritto un metodo in vitro per stabilire doppia resistenza a un EGFR-TKI e un MET-TKI in cellule tumorali. Questo metodo è utile per lo sviluppo di terapie per i pazienti con mutazioni di EGFR, che esibiscono la progressione di malattia malgrado il trattamento di EGFR-TKI con MET-amplificazione. Può anche essere modificato per gli inibitori di altre molecole di targeting.
Abstract
Resistenza ai farmaci è una sfida importante nella terapia del cancro. La generazione di sublines resistente in vitro è necessaria per scoprire nuovi meccanismi per superare questa sfida. Qui, un metodo 2-passo dose-escalation per stabilire dual-resistenza per un recettore del fattore di crescita epidermico (EGFR)-inibitore tirosin-chinasi (TKI), gefitinib e un MET-TKI, PHA665752, è descritto. Questo metodo si basa sul semplice incremento graduale della dose di inibitori per l'induzione di resistenza in linee cellulari acquisita. Il metodo alternativo per la generazione di resistente sublines consiste nel sottoporre le cellule ad alte concentrazioni dell'inibitore in un unico passaggio. Il metodo di dose-escalation graduale ha una maggiore possibilità di indurre con successo acquisito resistenza rispetto a questo metodo. Attivazione di EGFR mutazioni sono biomarcatori di una risposta al trattamento con EGFR-TKI, che è un trattamento di prima linea applicato per tumori polmonari non a piccole cellule (NSCLC) che ospitano queste mutazioni. Tuttavia, nonostante i rapporti di risposte efficaci, l'uso di EGFR-TKI è limitato perché i tumori inevitabilmente acquisiscono resistenza. I principali meccanismi dietro resistenza EGFR-TKI comprendono una mutazione secondaria presso il sito di gatekeeper, T790M in essone 20 di EGFR e un segnale di bypass di MET. Così, una potenziale soluzione per questo problema sarebbe una combinazione di EGFR-TKI e MET-TKI. Questo trattamento combinato ha dimostrato di essere efficace in un modello di Studio in vitro . Gefitinib-resistenza acquisita è stata stabilita tramite MET-amplificazione di incremento graduale della dose di gefitinib per 12 mesi, e una linea cellulare denominata PC-9MET1000 è stata generata in uno studio precedente. Per indagare ulteriormente i meccanismi di MET-TKI acquisito ed EGFR-TKI resistenza, un MET-TKI, PHA665752, è stato amministrato a queste cellule con incremento graduale della dose in presenza di gefitinib per 12 mesi. Questo protocollo è stato applicato con successo anche per una serie di terapie di combinazione per stabilire la resistenza acquisita ad altre molecole di inibitore.
Introduction
Oncogeniche mutazioni nel recettore del fattore di crescita epidermico (EGFR) sono trovate in un sottogruppo di pazienti con carcinoma polmonare non a piccole cellule (NSCLC) e sono importanti biomarcatori predittivi di questa malattia1,2. Questi attivazione delle mutazioni di EGFR più comunemente si verificano come un'omissione in-struttura in essone 19 (delE746-A750) o una mutazione di punto in sostituzione della leucina con arginina a codone 858 dell'esone 21 (L858R) in EGFR tirosin chinasi dominio3,4. Il trattamento con inibitori di EGFR-tirosina chinasi (TKI) è una terapia clinicamente efficace per i pazienti con NSCLC che harboring le mutazioni di EGFR. Tuttavia, questa terapia è limitata dall'inevitabile acquisizione di resistenza all'EGFR-TKI come gefitinib ed erlotinib. La resistenza acquisita più comune si verifica attraverso una mutazione T790M secondaria in essone 20 di EGFR, che è stato rilevato in circa il 60% dei pazienti con EGFR-TKI (gefitinib o erlotinib) resistenza acquisita. Altri meccanismi molecolari associati con resistenza acquisita a EGFR-TKI sono attivazione di bypass segnalazione causato dall'amplificazione di MET, trasformazione di tumori polmonari a piccole cellule e la transizione epiteliale-mesenchimale5,6. Il recettore per il fattore di crescita dell'epatocita, codificato dal gene MET, che è dysregulatedin molti tumori, è stato segnalato per essere un candidato importante per mirate terapie7,8.
Strategie per superare la resistenza acquisita a EGFR-TKI sono ora in fase di valutazione clinica. Studi preclinici e clinici hanno dimostrato che gli inibitori EGFR di terza generazione come osimertinib sono efficaci per i pazienti con la mutazione T790M9. Inoltre, la crescita di tumori EGFR-mutante con MET amplificazione può essere inibita dal trattamento combinato con EGFR e MET TKI6,10. Test clinici che valutano una combinazione di inibitori MET ed EGFR nei pazienti con resistenza acquisita a gefitinib ed erlotinib sono in corso ora11.
Per studiare il meccanismo molecolare della resistenza acquisita agli agenti chemioterapeutici, linee cellulari che inizialmente rispondono agli inibitori sono trattati in continuo con questi inibitori. Due metodi sono disponibili per stabilire la resistenza acquisita in linee cellulari. Uno è incremento graduale della dose, e l'altro è l'esposizione ad alta concentrazione. Il metodo di escalation graduale è stato più comunemente utilizzato, perché ha un più alto tasso di successo. Le cellule sono esposte prima a basse concentrazioni di inibitori, quasi un decimo del valore della concentrazione inibitoria mezzo massima (IC50), e la concentrazione quindi viene gradualmente aumentata del 10-30% fino a quando la concentrazione target è raggiunto. Il metodo di esposizione ad alta concentrazione consiste nel sottoporre le cellule alla dose finale di inibitore nel terreno di coltura, che è maggiore del valore di50 IC, quindi cellule parentali vengono uccisi quasi completamente. Questo metodo di esposizione ad alta concentrazione ha molto un più basso tasso di successo rispetto al metodo graduale escalation.
In uno studio precedente, il trattamento combinato con EGFR-TKI e MET-TKI è stato indicato per essere efficace in un sistema in vitro . Resistenza acquisita ad un EGFR-TKI, gefitinib, è stata stabilita tramite graduale escalation per 12 mesi, insieme a MET-amplificazione, e così, una linea cellulare gefitinib-resistente chiamata PC-9MET1000 è stato generato12.
Il protocollo qui presentato è una procedura di dose-escalation in due fasi per ottenere cellule di NSCLC EGFR-mutato del PC-9 con doppia resistenza all'EGFR-TKI, gefitinib e un MET-TKI, PHA665752 (Figura 1). Questo metodo per stabilire acquisito resistente in linee cellulari è relativamente facile da effettuare, con un alto tasso di successo. Il protocollo descritto può essere modificato per applicazione con inibitori di altri farmaci a bersaglio molecolare e agenti citotossici pure.
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Protocol
1. stabilire le cellule resistenti a Gefitinib
- Da 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-dimethylthiazolyl analisi del bromuro (MTT), determinare la concentrazione iniziale di gefitinib.
- PC-9 cellule in medium di crescita della coltura (medium RPMI-1640 con 10% FBS e 1% antibiotici (penicillina: 100 U/mL e streptomicina: 100 µ g/mL)), in un 5% CO2 incubatore a 37 ° C.
- Regolare le cellule a 1,0 × 105 cellule/mL utilizzando una cella automatizzata contaminuti (si veda tabella materiali) e seme 50 µ l di questo in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti utilizzando il mezzo di crescita; la concentrazione finale delle cellule dovrebbe essere 5.0 × 103 cellule/pozzetto.
- Incubare la piastra durante la notte a 37 ° C.
- Aggiungere 50 µ l di gefitinib (alle 2 X concentrazione finale) a diverse concentrazioni: 0, 0,002, 0,006, 0.02, 0,06, 0,2, 0,6, 2, 6 e 20 µM a questi pozzi tali che il volume finale in ciascuna è ben 100 µ l.
- Incubare la piastra per 72 h a 37 ° C.
- Aggiungere 15 µ l della soluzione colorante (Vedi Tabella materiali) in ciascun pozzetto (uso 13% concentrazione finale della soluzione colorante) e incubare per 4 h a 37 ° C.
- Aggiungere 100 µ l della solubilizzazione/stop solution (Vedi Tabella materiali) per solubilizzare il formazano prodotta dalla soluzione colorante (Vedi Tabella materiali) in ogni bene e incubare per una notte a 37 ° C.
- Misurare la densità ottica a 570 nm (OD570) utilizzando un lettore di micropiastre per ottenere il valore di IC50 generando una curva di proliferazione delle cellule.
- Utilizzare un software statistico (Vedi Tabella materiali) per visualizzare i dati graficamente e calcolare il valore di50 IC (Figura 2).
- Preparare 6-12 ripetizioni e ripetere gli esperimenti almeno tre volte.
- Continuo graduale dose-escalation di gefitinib per il trattamento delle cellule PC-9.
- Cellule di cultura PC-9 (1 mL in condizioni sub-confluenti) in piatti p100 con 10 mL di terreno di coltura in un 5% CO2 incubatore a 37 ° C.
- Aggiungere un decimo del valore di50 IC di gefitinib nel piatto p100.
- Quando le cellule in coltura diventano Sub-confluenti, aggiungere 1-2 mL di cellule a 10 mL di terreno di coltura fresco utilizzando una pipetta da 1mL con 10-30% più alta concentrazione di gefitinib nelle stesse condizioni di cultura.
- Aumentare progressivamente la concentrazione di gefitinib 10-30% con ogni split fino a 1 µM; Questa operazione potrebbe richiedere circa 6-12 mesi.
Nota: Quando la concentrazione di gefitinib raggiunge il valore di50 IC, la proliferazione delle cellule diventa notevolmente più lenta, e quindi, 2-4 mL di cellule possono essere aggiunti a 10 mL di mezzo di crescita fresco con maggiore concentrazione di gefitinib; ridurre l'aumento della concentrazione di gefitinib potrebbe risolvere il problema. Inoltre, sarebbe ideale per memorizzare le celle rimanenti a-80 ° C e riutilizzarli alla concentrazione precedente. Come le cellule PC-9 sono in sospensione, è necessario utilizzare tripsina per passaggio; Tuttavia, durante il processo di aumento della concentrazione di gefitinib, le cellule possono fissare alla parte inferiore della piastra di coltura. In una situazione del genere, può essere utilizzato un cellulare-raschietto per staccare le cellule aderenti. - Coltura le cellule PC-9 gefitinib-resistenti nel terreno di crescita con 1 µM di gefitinib.
- Eseguire l'analisi di MTT per confermare il gefitinib-resistenza delle cellule13; Queste cellule gefitinib-resistenti erano chiamate PC-9MET1000 (indicato come MET1000 cellule), perché hanno esibito aumentata della proteina ed i livelli di RNA di MET (Figura 3A, Figura 4A, B).
2. stabilire Dual-resistenza a Gefitinib e PHA665752
- Determinare la concentrazione iniziale di PHA665752 dall'analisi di MTT.
- Cellule di cultura del MET1000 in piatti p100 con 10 mL di terreno di coltura e 1 µM gefitinib in un 5% CO2 incubatore a 37 ° C.
- Le cellule del seme in una piastra a 96 pozzetti a 5,0 × 103 cellule/pozzetto con 50 µ l di medium della crescita in ciascun pozzetto. Regolare la concentrazione finale delle cellule a 1.0 × 105 cellule/mL utilizzando una cella automatizzata del contatore (Vedi Tabella materiali).
- Incubare la piastra durante la notte a 37 ° C.
- Aggiungere 50 µ l di PHA665752, un MET-TKI (alle 2 X concentrazione finale), per le cellule in diverse concentrazioni: 0, 0,002, 0,006, 0.02, 0,06, 0,2, 0,6, 2, 6 e 20 µM compresa 2 µM gefitinib (alle 2 X concentrazione finale); il volume finale in ciascun pozzetto deve essere 100 µ l.
- Incubare la piastra per 72 h a 37 ° C.
- Aggiungere 15 µ l della soluzione colorante (vedere Tabella materiali) per ciascuno ed incubare per 4 h a 37 ° C.
- Aggiungere 100 µ l del solubilizzazione/stop soluzione per solubilizzare il formazano prodotta dalla soluzione colorante (vedere Tabella materiali) per ogni bene e di nuovo durante la notte Incubare a 37 ° C.
- Misurare la densità ottica a 570 nm (OD570) utilizzando un lettore di micropiastre per ottenere il valore di IC50 generando una curva di proliferazione delle cellule.
- Utilizzare un software statistico (Vedi Tabella materiali) per visualizzare i dati graficamente e calcolare il valore di50 di IC del PHA665752 in presenza di gefitinib (Figura 3B).
- Preparare 6-12 ripetizioni e ripetere gli esperimenti almeno tre volte.
- Stabilire la dual-resistenza in cellule MET1000 di gefitinib e PHA665752.
- Cellule di cultura del MET1000 in piatti p100 con 10 mL di terreno di coltura e 1 µM gefitinib in un 5% CO2 incubatore a 37 ° C.
- Aggiungere un decimo del valore di50 di IC del PHA665752 nel mezzo di crescita in presenza di 1 µM di gefitinib con le stesse condizioni di cultura.
- Aumentare la concentrazione di PHA665752 progressivamente da 10-30% con ogni split fino a 1 µM. Questa operazione potrebbe richiedere circa 6-12 mesi.
Nota: Quando la concentrazione di PHA665752 raggiunge il valore di50 IC, la proliferazione delle cellule diventa notevolmente più lenta, e quindi, 2-4 ml di cellule possono essere aggiunti utilizzando una pipetta da 1 mL a 10 mL di mezzo di crescita fresco con maggiore concentrazione di PHA665752; ridurre l'aumento della concentrazione di PHA665752 potrebbe risolvere il problema. Inoltre, sarebbe ideale per memorizzare le celle rimanenti a-80 ° C e riutilizzarli alla concentrazione precedente. Non è necessario utilizzare tripsina per passaggio; Tuttavia, durante l'aumento di concentrazione di PHA665752, le cellule possono fissare alla parte inferiore della piastra di coltura. In tali situazioni, può essere utilizzato un cellulare-raschietto per staccare le cellule. - Infine, le cellule di cultura il PC-9 resistente a gefitinib e PHA665752 nel mezzo di crescita con 1 µM di gefitinib e PHA665752 in un 5% CO2 incubatore a 37 ° C.
- Eseguire l'analisi di MTT per confermare che le cellule sono dual-resistenti a gefitinib e PHA66575213, e che non sono sensibili alle PHA665752 in presenza di gefitinib; Queste cellule dual-resistenza sono state nominate il PC-9 DR (designato come cellule DR) (Figura 5).
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Representative Results
Panoramica del protocollo presentato in questo manoscritto è illustrata nella Figura 1, compresa l'induzione di dual-resistenza acquisita a gefitinib e PHA665752 in cellule PC-9 da una procedura 2-passo dose-escalation. La figura 2 Mostra una diminuzione nella proliferazione delle cellule parentali di PC-9 come la concentrazione di gefitinib aumenta. Ciò indica che le cellule PC-9 è diventato sensibile a gefitinib dopo la procedura di incremento della dose è stata effettuata. La figura 3 Mostra che le cellule PC-9MET1000 esibiscono la resistenza a gefitinib, ma sono sensibili a un MET-TKI, PHA665752, in presenza di gefitinib. La proliferazione delle cellule PC-9 è stata soppressa a concentrazioni più elevate di gefitinib, che indica che essi erano sensibili a gefitinib. Tuttavia, le cellule PC-9MET1000 non hanno mostrato proliferazione in diminuzione anche alle alte concentrazioni di gefitinib, che indica che avevano acquisito resistenza a gefitinib. Quando le cellule PC-9MET100 sono state trattate con aumento delle concentrazioni di PHA665752 in presenza o assenza di gefitinib per 72 h, sua proliferazione, come misurato da un'analisi di MTT, è stato diminuito significativamente. C'era anche una modesta diminuzione nella proliferazione delle cellule PC-9MET1000 in assenza di gefitinib. Così, una combinazione di gefitinib e PHA665752 sarebbe sopprimere la proliferazione delle cellule in modo più efficace rispetto al trattamento con PHA665752 da solo.
La figura 4 Mostra livelli amplificati di MET (RNA e proteina) in cellule PC-9MET1000 e PC-9 DR; nessun mutazioni acquisite sono presenti in EGFR e MET. Pertanto, l'emergere di bypass segnalazione è altamente consigliato come causa di resistenza acquisita per EGFR-TKI e/o MET-TKI. La figura 5 Mostra la resistenza delle cellule PC-9 DR per PHA665752 in presenza di 1 µM di gefitinib, come misurata da un'analisi MTT. Anche se la proliferazione delle cellule PC-9MET1000 sono stati inibiti dal trattamento con gefitinib e PHA665752, le cellule PC-9 DR è sopravvissuto il trattamento, indicante che erano dual-resistente a gefitinib e PHA665752. Così, attraverso una procedura 2-passo dose-escalation, PC-9 celle acquisito resistenza a gefitinib e cellule PC-9MET1000 acquisito resistenza alla PHA665752 in presenza di 1 µM di gefitinib. Figura 6 Mostra la proliferazione di ancoraggio-indipendente di MET1000 e DR cellule in agar molle in presenza o in assenza di PHA665752 e gefitinib. La crescita delle cellule PC-9MET1000 sia PC-9 DR sono stati osservati su agar molle, che indica che questi sublines potrebbe crescere nei sistemi sia in 2D che in 3D. Così, il resistente sublines aveva superato la limitazione di non essere in grado di crescere in sistemi 2D. Inoltre, le cellule PC-9 DR, ma non le cellule PC-9MET1000, potrebbero crescere in un agar con 1 µM di gefitinib e PHA665752. Questo risultato indica che le cellule PC-9 DR erano resistenti a gefitinib e PHA665752 e potrebbero crescere in un sistema di coltura 3D pure. La proprietà tumorigenica del established sublines resistente dovrebbe essere controllata da un'analisi di formazione della Colonia o da in vivo trapianto14.
Figura 1: Schema di generazione dual-resistenza: PC-9 DR cellule dalle cellule PC-9.
Diagramma per la generazione di cloni dual-resistenti da PC-9 celle da una procedura 2-passo dose-escalation. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: EGFR-TKI gefitinib ha inibito la proliferazione delle cellule PC-9.
PC-9 celle sono state seminate in una piastra a 96 pozzetti a 5 x 103 cellule/pozzetto con 50 µ l di terreno di coltura in ciascun pozzetto, pre-incubate durante la notte e poi trattati con gefitinib alle concentrazioni indicate per 72 h. È stata eseguita un'analisi di MTT e il OD570 è stato misurato da un lettore di micropiastre. Il valore di50 IC era 0,048 ± 0.01 µM. dati sono mostrati come la media ± SEM per pozzi da 6. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: PC-9MET1000 cellule mostravano resistenza al gefitinib, ma il trattamento con PHA665752 in presenza di 1 µM di gefitinib ha soppresso la sua proliferazione.
(A) PC-9 e MET1000 le cellule sono state seminate in piastre da 96 pozzetti a 5 x 103 cellule/pozzetto con 50 µ l di crescita medio in ogni bene, pre-incubate durante la notte e poi trattati con gefitinib alle concentrazioni indicate per 72 h. MET1000 (B) le cellule sono state seminate in una piastra a 96 pozzetti a 5 x 103 cellule/pozzetto con 50 µ l di medium della crescita in ciascun pozzetto , pre-incubate durante la notte e poi trattati con PHA665752 alle concentrazioni indicate in presenza o assenza di 1 µM di gefitinib per 72 h. È stata eseguita un'analisi di MTT e il OD570 è stato misurato da un lettore di micropiastre. Il valore di50 IC in presenza di gefitinib era 0,014 ± 0.01 µM, mentre che in assenza di gefitinib è non stato determinato. I dati vengono visualizzati come la media ± SEM per pozzi da 6. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: MET amplificazione è stata osservata in cellule PC-9MET1000 e PC-9 DR con nessun mutazioni acquisite in EGFR e MET.
Espressione (A) i livelli di fosforo-MET e totale MET sono stati determinati mediante analisi Western blot. Β-actina è stato usato come un controllo di carico. (B) mRNA trascritti da cellule PC-9, 9MET1000-PC e PC-9 DR sono stati quantificati mediante RT-PCR in tempo reale e normalizzato con quello di GAPDH. I dati sono presentati rispetto al PC-9 valori, come media ± SEM (n = 8). Significatività statistica è stata stimata utilizzando i due code Student t-test e un p < 0,05 è stato considerato statisticamente significativo. *, p < 0.05, confrontato con il valore di PC-9. (C) esone 19-21 del gene EGFR e nell'esone 14-21 del gene Met sono stati amplificati da DNA genomic di PCR. I prodotti di PCR sono stati quindi purificati e analizzati. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Le cellule PC-9 DR sono resistenti alla PHA665752 in presenza di 1 µM di gefitinib.
DR cellule sono state seminate in una piastra a 96 pozzetti a 5 x 103 cellule/pozzetto con 50 µ l di terreno di coltura in ciascun pozzetto, pre-incubate durante la notte e poi trattati con PHA665752 alle concentrazioni indicate in presenza di 1 µM di gefitinib per 72 h. È stata eseguita un'analisi di MTT e il OD570 è stato misurato da un lettore di micropiastre. I dati vengono visualizzati come la media ± SEM per pozzi da 6. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: proliferazione di ancoraggio-indipendente delle cellule PC-9MET1000 e PC-9 DR su agar molle in presenza o in assenza di PHA665752 e gefitinib.
Cellule (1 × 10-4) ri-sospese in agar 0,3% con 10% FBS sono state seminate in piastre da 6 pozzetti prerivestite con 0,6% agar molle. Il giorno seguente, le cellule sono state trattate con gefitinib (1 µM) e PHA665752 (1 µM) e poi incubate per 14-21 giorni. Colonie erano macchiati con cristalvioletto 0,005% per 1 h. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Il protocollo descritto qui può essere utilizzato per la creazione di dual-resistenza acquisita in cellule di cancro usando una dose crescente 2-passo metodo in vitro. Molti documenti di ricerca hanno segnalato che le cellule PC-9 sviluppato EGFR-TKI (gefitinib o erlotinib) resistenza attraverso mutazioni EGFR T790M15,16. Tuttavia, non abbiamo rilevato le mutazioni T790M in essone 20 delle nostre cellule PC-9MET1000 mediante sequenziamento diretto (Figura 4). Inoltre, MET amplificazione è stata osservata ad per agire come un via di segnalazione di bypass. Così, le cellule PC-9MET1000 sono estremamente rare. Precedentemente abbiamo riferito che le cellule PC-9 di adenocarcinoma del polmone che harboring un'omissione di 15 punti di ebollizione in essone 19 di EGFR sviluppato gefitinib-resistenza con MET amplificazione dopo continuo-incremento graduale della dose è stato effettuato per 12 mesi fino a raggiungere la dose 1 µM (denominato cellule PC-9MET1000)17. Questa linea cellulare era sensibile ad un tem-TKI in presenza di gefitinib. Al fine di determinare il meccanismo dietro resistenza di EGFR e MET-TKI, un metodo continuo-incremento graduale della dose è stato sviluppato per indurre dual-resistenza per MET-TKI, PHA665752 ed EGFR-TKI, gefitinib, in cellule di PC-9MET100012. Questo metodo si basava sui risultati di un test clinico per studiare la progressione della malattia oltre il trattamento di gefitinib. Nel caso di MET-amplificato EGFR-TKI-resistenza, un inibitore MET singolo non inibire significativamente la proliferazione delle cellule. Perché la trasduzione del segnale tra il recettore e la valle molecole sono separati (EGFR-ERK1/2 e MET-AKT), la soppressione combinata di EGFR e MET sarebbe necessaria. In un'altra linea cellulare di adenocarcinoma del polmone, HCC827, che ospita anche una mutazione di EGFR, EGFR-TKI resistenza è stato sviluppato con l'amplificazione di MET. Suda et al ha segnalato che HCC827 le cellule esposte alle concentrazioni aumentanti di erlotinib in presenza di MET-TKI PHA665752 sviluppato resistenza a MET-TKI ed EGFR-TKI18. Inoltre, sono stati condotti studi clinici per studiare casi di MET-amplificazione con EGFR-TKI-resistenza. Così, per studiare il meccanismo di resistenza di MET-TKI acquisita dopo il trattamento con EGFR-TKI, è necessario per indurre dual-resistenza per MET inibitori e inibitori EGFR.
Il protocollo descritto qui coinvolti graduale dose-escalation di un MET-TKI, PHA665752, in presenza di 1 µM di gefitinib. Il metodo di dose-escalation graduale è il più affidabile e il metodo più comunemente usato18,19. La fase più critica in questo protocollo sta ottenendo il valore di50 di IC dell'inibitore. Se questo valore non è determinato con precisione, le cellule non riuscirà a crescere a tutti nella piastra di coltura. Pertanto, se la crescita delle cellule inizia a rallentare, ridurre l'aumento della concentrazione dell'inibitore potrebbe risolvere il problema. Inoltre, se le cellule cominciano a morire, sarebbe ideale per memorizzare le celle rimanenti a-80 ° C, per riutilizzarli alla concentrazione precedente.
Un metodo alternativo per stabilire la resistenza nelle linee cellulari è il metodo di esposizione ad alta concentrazione, in cui le cellule sono esposte alla concentrazione dell'inibitore di destinazione direttamente, e le cellule sono coltivate fino a quando le cellule resistenti superstite iniziano a proliferare. Sebbene questo metodo sia più clinicamente rilevante, ha un tasso di successo più basso perché la concentrazione target dell'inibitore, che è amministrato inizialmente, potrebbe uccidere tutte le cellule parentali immediatamente. Interessante, è stato segnalato che sublines resistenti ottenuti attraverso questi due metodi presentano diverse proprietà cellulari19,20.
Un altro metodo per stabilire la resistenza è il in vivo resistenza metodo, in cui una sospensione di cellule (1,0 × 106-2.0 × 107) viene iniettata nei fianchi dei topi, e quando il tumore raggiunge un volume di 200 mm3, i topi sono sottoposti a continuo trattamento con gli inibitori. I tumori che rispondere completamente e quindi ricorrono durante mantenuto terapia sono raccolte, macinate, digerito con tripsina e poi filtrato e seminate su piastre di coltura. Questo metodo, anche se un po ' complicato, può essere utilizzato efficacemente in caso di anticorpo-resistenza. Tuttavia, quando i tumori che mostrano resistenza nel sistema in vivo sono trasferiti da un sistema in vitro , le cellule a volte non riescono a crescere sistemi di coltura 2D. Di conseguenza, sistemi di coltura 3D come una matrice della membrana basale dovrebbero essere usato21.
Anche se tutti e tre questi metodi richiedono un tempo relativamente lungo per eseguire, il metodo di dose-escalation graduale è più economico. Inoltre è il metodo più adatto per chiaramente la comprensione e lo studio del processo di acquisizione della resistenza agli inibitori. Inoltre, il tasso di successo degli altri due metodi è notevolmente inferiore a quello del metodo incremento graduale della dose.
Una volta stabilita la resistenza, è necessario testare la potenza cancerogena di queste linee cellulari. Test di formazione di Colonia o trapianti in vivo sono utilizzati spesso per questo scopo (Figura 6). Questi metodi potrebbero superare lo svantaggio dell'utilizzo di sistemi di coltura 2D.
Una limitazione importante di questi metodi è che le cellule con resistenza acquisita spesso non riflettono accuratamente la resistenza in cellule tumorali umane. Di conseguenza, i meccanismi scoperti attraverso studi in modelli in vitro dovrebbero essere confermati nei campioni di tessuto umano attraverso ripetute prove sui campioni bioptici. Inoltre, anche se questi protocolli potrebbero essere utili per esaminare il meccanismo dietro resistenza acquisita durante lo sviluppo delle cellule del tumore, è possibile che la resistenza acquisita è stata indotta da alterazioni del microambiente tumorale. Si tratta di un'altra grave limitazione di indagare l'efficacia di questi protocolli nel solo le cellule tumorali. Sarebbe meglio usare tessuti da banche di tessuti umani, che sono disponibili per molti ricercatori.
Il protocollo qui presentato possa essere modificato per stabilire la resistenza agli altri inibitori molecolari pure. Pertanto, questo metodo è potenzialmente utile per lo sviluppo di strumenti terapeutici per il controllo del cancro in futuro.
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse a divulgare.
Acknowledgments
Ringraziamo i membri dell'Istituto di oncologia molecolare per i loro commenti riflessivo e consigli utili ed Editage per la loro assistenza con la modifica di lingua inglese. Questo lavoro è stato supportato dal programma MEXT-supportato per la Fondazione di ricerca strategica alle università Private (2012-2016) dal Ministero della pubblica istruzione, cultura, sport, scienza e tecnologia del Giappone. Tohru Ohmori ricevuto (2015-2016) di finanziamento della ricerca da Boehringer-Ingelheim (Ingelheim, Germania).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI-1640 | Wako | 189-02025 | with L-Glutamine and Phenol Red |
| CellTiter 96 | Promega | G4100 | Non-Radioactive Cell Proliferation Assay |
| FBS | gibco | 26140-079 | |
| Pen Strep | gibco | 15140-163 | |
| gefitinib | Selleck | S1025 | stocked 10 mM/EMSO at -20ºC |
| PHA665752 | Selleck | S1070 | stocked 10 mM/EMSO at -20ºC |
| 96-well plate | IWAKI | 860-096 | flat bottom with lid, low evaporation type |
| TC10 Automated Cell Counter | BIO RAD | #1450010 | |
| CellTiter 96 Non-Radioactive Cell Proliferation Assay | Promega | G4100 | Dye Solution and Solubilization/Stop Solution |
| Powerscan HT microplate reader | BioTek | ||
| GraphPad Prism v.5.0 software | GraphPad Inc. | ||
| PC-9 | Riken BioResource Center | RCB4455 | |
| P100 dish | FALCON | 353003 |
References
- Lynch, T. J., et al. Activating mutations in the epidermal growth factor receptor underlying responsiveness of non-small-cell lung cancer to gefitinib. N Engl J Med. 350 (21), 2129-2139 (2004).
- Paez, J. G., et al. EGFR mutations in lung cancer: correlation with clinical response to gefitinib therapy. Science. 304 (5676), 1497-1500 (2004).
- Pao, W., et al. EGF receptor gene mutations are common in lung cancers from "never smokers" and are associated with sensitivity of tumors to gefitinib and erlotinib. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (36), 13306-13311 (2004).
- Mitsudomi, T., et al. Mutations of the epidermal growth factor receptor gene predict prolonged survival after gefitinib treatment in patients with non-small-cell lung cancer with postoperative recurrence. J Clin Oncol. 23 (11), 2513-2520 (2005).
- Sequist, L. V., et al. Genotypic and histological evolution of lung cancers acquiring resistance to EGFR inhibitors. Sci Transl Med. 3 (75), 75ra26 (2011).
- Engelman, J. A., et al. MET amplification leads to gefitinib resistance in lung cancer by activating ERBB3 signaling. Science. 316 (5827), 1039-1043 (2007).
- Schmidt, L., et al. Novel mutations of the MET proto-oncogene in papillary renal carcinomas. Oncogene. 18 (14), 2343-2350 (1999).
- Olivero, M., et al. Novel mutation in the ATP-binding site of the MET oncogene tyrosine kinase in a HPRCC family. Int J Cancer. 82 (5), 640-643 (1999).
- Janne, P. A., et al. AZD9291 in EGFR inhibitor-resistant non-small-cell lung cancer. N Engl J Med. 372 (18), 1689-1699 (2015).
- Bean, J., et al. MET amplification occurs with or without T790M mutations in EGFR mutant lung tumors with acquired resistance to gefitinib or erlotinib. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (52), 20932-20937 (2007).
- NCT02468661 - ClinicalTrials.gov. , Available from: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02468661 (2017).
- Yamaoka, T., et al. Acquired Resistance Mechanisms to Combination Met-TKI/EGFR-TKI Exposure in Met-Amplified EGFR-TKI-Resistant Lung Adenocarcinoma Harboring an Activating EGFR Mutation. Mol Cancer Ther. 15 (12), 3040-3054 (2016).
- Mosmann, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. J Immunol Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).
- Cifone, M. A., Fidler, I. J. Correlation of patterns of anchorage-independent growth with in vivo behavior of cells from a murine fibrosarcoma. Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (2), 1039-1043 (1980).
- Ercan, D., et al. Amplification of EGFR T790M causes resistance to an irreversible EGFR inhibitor. Oncogene. 29 (16), 2346-2356 (2010).
- Ogino, A., et al. Emergence of epidermal growth factor receptor T790M mutation during chronic exposure to gefitinib in a non small cell lung cancer cell line. Cancer Res. 67 (16), 7807-7814 (2007).
- Ando, K., et al. Enhancement of sensitivity to tumor necrosis factor alpha in non-small cell lung cancer cells with acquired resistance to gefitinib. Clin Cancer Res. 11 (24 Pt 1), 8872-8879 (2005).
- Suda, K., et al. Reciprocal and complementary role of MET amplification and EGFR T790M mutation in acquired resistance to kinase inhibitors in lung cancer. Clin Cancer Res. 16 (22), 5489-5498 (2010).
- Shien, K., et al. Acquired resistance to EGFR inhibitors is associated with a manifestation of stem cell-like properties in cancer cells. Cancer Res. 73 (10), 3051-3061 (2013).
- Sagawa, Y., et al. Establishment of three cisplatin-resistant endometrial cancer cell lines using two methods of cisplatin exposure. Tumour Biol. 32 (2), 399-408 (2011).
- Ritter, C. A., et al. Human breast cancer cells selected for resistance to trastuzumab in vivo overexpress epidermal growth factor receptor and ErbB ligands and remain dependent on the ErbB receptor network. Clin Cancer Res. 13 (16), 4909-4919 (2007).
