Summary
Plante défensines jouent un rôle important dans la défense de la plante contre les agents pathogènes. Pour une utilisation efficace de ces peptides antifungal agents antifongiques, comprendre leurs modes d’action (PA) est critique. Ici, une méthode d’imagerie de cellules vivantes est décrite afin d’étudier les aspects essentiels du ministère de l’agriculture de ces peptides.
Abstract
Petits riches en cystéine défensines sont l’un des plus grands groupes de peptides de défense hôte présents chez toutes les plantes. Nombreuses plantes défensines pièce puissant in vitro une activité antifongique contre un large spectre d’agents pathogènes fongiques et donc sont susceptibles d’être utilisés comme agents antifongiques dans les cultures transgéniques. Afin d’exploiter le plein potentiel des défensines végétales pour le contrôle des maladies, il est crucial d’élucider leurs mécanismes d’action (PA). Avec l’avènement des techniques de microscopie avancées, imagerie de cellules vivantes est devenu un outil puissant pour comprendre la dynamique de la MOA antifongique de défensines végétales. Ici, une méthode d’imagerie de cellules vivantes de microscopie confocale basée est décrite à l’aide de deux plantes fluorescent étiquetés défensines (MtDef4 et MtDef5) en combinaison avec les colorants fluorescents vitales. Cette technique permet la visualisation en temps réel et l’analyse des événements dynamiques de l’internalisation de MtDef4 et MtDef5 en cellules fongiques. Ce qui est important, ce test génère une foule de renseignements dont la cinétique de l’internalisation, mode d’entrée et de la localisation intracellulaire de ces peptides. Ainsi que d’autres outils biologiques cellulaires, ces méthodes ont fourni un aperçu essentiel de la dynamique et la complexité du ministère de l’agriculture de ces peptides. Ces outils peuvent également servir à comparer le ministère de l’agriculture de ces peptides contre les différents champignons.
Introduction
Plantes ont développé un système sophistiqué d’immunitaire inné pour la défense contre l’usine microbiens pathogènes1. Ils expriment de nombreux peptides de défense hôte gène codé avec activité antimicrobienne putatif2. En effet, bon nombre de ces peptides affichent une activité antimicrobienne in vitro3. Défensines constituent un des plus grands groupes de peptides de défense du hôte dans le Royaume de plante4. Ces peptides riches en cystéine, cationiques pièce activité inhibitrice de croissance puissant contre les champignons et oomycètes pathogènes à des concentrations micromolaires et représentent une des premières lignes de défense contre ces agents pathogènes5,6. En raison de leur puissante activité antifongique, défensines peuvent être exploités dans des applications d’agribiotechnological pour générer des cultures résistantes aux maladies. Surexpression constitutive de plusieurs plantes défensines a été démontrée pour améliorer la résistance aux maladies dans les essais en serre et au champ de cultures transgéniques6. Il est important d’éclaircir les mécanismes d’action (PA) de ces peptides antifongiques afin d’exploiter pleinement leur potentiel comme des outils efficaces pour la protection des cultures. Toutefois, le ministère de l’agriculture de ces défensines végétales est mal compris. Données actuelles suggèrent qu’ils présentent différentes MOA5,6,7,8. Certains défensines agissent extracellulaire sur les champignons et ciblent spécifique de paroi cellulaire/plasma membrane sphingolipides résidant, perturbent l’intégrité membranaire et toxicité cellulaire voies9,10,11. Récemment, cependant, les défensines antifongiques qui translocation dans les cellules fongiques ont été découvert12,13,14. Certains de ces défensines lient aux résidents membrane phospholipides bioactifs, forment des complexes oligomères et permeabilize des membranes plasmiques15,16,17. Ainsi, certains aspects du protocole d’entente de défensines végétales ont été élucidés. Toutefois, le ministère de l’agriculture des défensines végétales susceptibles implique un ensemble complex d’événements qui n’ont pas encore été identifiées et intégrées dans un modèle global. En particulier, il reste une importante lacune dans nos connaissances sur les cibles cellulaires de ces peptides.
Avec les progrès récents dans les techniques de microscopie et le développement de nouvelles sondes fluorescentes, les techniques d’imagerie de cellules vivantes sont maintenant fréquemment utilisés pour étudier la MOA des peptides antimicrobiens (ampères). Ces techniques de complément aux méthodes largement utilisés comme immunolocalisation, microscopie, microscopie à force atomique ou de tomographie aux rayons x18, qui ont été employées principalement pour analyser les effets des peptides antifongiques sur la morphologie et croissance des cellules fongiques comprenant l’étude d’intégrité de la paroi cellulaire, altérations dans les modèles de croissance/ramification de cellule, mais aussi de perméabilisation de la membrane plasmique et de tuer. Néanmoins, ces études ont été limitées à l’imagerie de cellules à un certain moment après le traitement avec les peptides au lieu d’exécuter Time-lapse d’imagerie sur les mêmes cellules de surveiller leur évolution dynamique en réponse au défi de defensin. Ces dernières années, utilisation de peptides fluorescent étiquetés en conjonction avec des cellules vivantes d’imagerie à l’aide de la microscopie confocale a permis la visualisation en temps réel de la dynamique des interactions AMP – microbe. Les deux naturellement purifiée et peptides antifongiques chimiquement synthétisés peuvent être étiquetés d’étiquettes fluorescentes (p. ex., DyLight, rhodamine, BODIPY ou Alexa Fluor basé colorants) et directement observé au cours de leur interaction avec les cellules par Time-lapse imagerie de cellules vivantes. L’utilisation de ces étiqueté peptides a considérablement augmenté notre compréhension des différents aspects de leur ministère de l’agriculture y compris le mode d’entrée, la localisation subcellulaire, trafic intracellulaire et sites d’action antifongique dans des cellules fongiques vivantes 18.
Récemment, plusieurs études ont montré que différents peptides antifongiques dont plante défensines sont internalisés par vie cellules fongiques12,14,19,20. Le ministère de l’agriculture de ces défensines probables implique une interaction avec les cibles intracellulaires. Nous avons récemment rapporté l’action antifongique d’une usine de defensin MtDef4 dans deux champignons ascomycètes, Neurospora crassa et Fusarium graminearum. MtDef4 s’est avéré utilisent différentes voies d’entrée de la cellule fongique et la localisation subcellulaire dans ces champignons14. Cette étude utilisée chimiquement synthétisé tétraméthyl rhodamine (TAMRA)-étiqueté MtDef4 en combinaison avec les colorants fluorescents vitales (colorant membrane sélective, FM4-64, colorant membrane perméable, SYTOX vert, la teinture de journaliste de la mort cellulaire, l’iodure de propidium) et inhibiteurs métaboliques. Ces analyses ont démontré la cinétique de l’internalisation des MtDef4, ses mécanismes de transport intracellulaire et ses cibles subcellulaire14.
Est présenté ici, un protocole pour l’imagerie de cellules vivantes par microscopie confocale. Le protocole utilise des peptides fluorescent étiquetés en combinaison avec les colorants fluorescents vitales pour étudier les interactions entre les plantes defensin-champignon, en particulier, les voies de la translocation et les cibles intracellulaires de défensines dans les cellules fongiques.
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Protocol
1. étiquetage des défensines avec des Fluorophores
- Sélectionnez un fluorophore qui a un effet minimal sur les propriétés antimicrobiennes ainsi que la captation et la localisation de defensin à l’intérieur de la cellule vivante.
Remarque : En sélectionnant un fluorophore optimal dépend d’objectifs expérimentales spécifiques. Les propriétés spectrales et chimiques, la photostabilité, la taille et la charge du fluorophore envisager également. - Étiquette defensin avec le fluorophore sélectionné à l’aide d’un peptide approprié labeling kit disponible chez les revendeurs commerciaux. Alternativement, chimiquement synthétiser les défensines marqués au fluorophore. Dans cette étude, l’étiquette MtDef5 defensin avec DyLight550 en utilisant un étiquetage commercial kit selon protocole et tétraméthyle la rhodamine du fabricant (TAMRA)-étiquetée MtDef4 defensin a été synthétisé chimiquement dans le commerce.
Remarque : Il est recommandé que les peptides synthétisés chimiquement fluorophore tag (surtout pour les petits peptides ou inférieure à 50 acides aminés) servir puisque le fluorophore peut être fixé sur les résidus de N - ou C-terminale du peptide pour assurer l’effet minimal sur ses activité antimicrobienne. Il est difficile de la synthèse des peptides longs avec plus de trois ponts disulfures. Dans ce cas, il est recommandé que le peptide être étiquetée avec un fluorophore optimal en utilisant un peptide commercialement disponible adapté kit d’étiquetage. - Test in vitro une activité antimicrobienne de la defensin marqués et déterminer la concentration minimale inhibitrice (CMI) contre les champignons à investiguer.
Remarque : Dans cette étude, la CMI de la DyLight550-MtDef5 et TMR-MtDef4 a été déterminée contre Neurospora crassa et Fusarium graminearum.
2. Cultures fongiques et le milieu de croissance
- Transférer les conidies d’une culture de réserve N. crassa à incliner le tube contenant agar moyenne21 de Vogel et incuber à température ambiante sous la lumière pendant 5 jours.
- La culture F. graminearum PH-1 souche sur des plaques contenant complet moyen (CM)22 à 28 ° c pendant 5 jours. Pour la production des conidies, ensemencer 4 prises (10 mm de diamètre) de la culture âge de 5 jour de F. graminearum PH-1 dans 50 mL de carboxyméthyl cellulose (CMC) milieu (carboxyméthyl cellulose du 15 g, 1 g Extrait de levure, 0,5 g MgSO4.7 H2O, 1 g de NH 4 PAS de3et 1 g KH2PO4) et de la culture pendant 4 à 7 jours à 28 ° c dans un agitateur rotatif à 180 tr/min.
3. préparation de la Suspension conidiale
- F. graminearum conidie suspension
- Vortex la culture liquide F. graminearum et conidies virés en filtrant la culture fongique 1,5 mL par le biais de deux couches de matériau de filtration (par exemple, Miracloth) dans un tube de microcentrifuge de 2 mL. Centrifuger la suspension conidiale à 13 226 x Vitesse g dans une micro-centrifugeuse pendant 2 min.
- Jeter le surnageant et ajouter 1 mL d’eau stérile pour laver le culot.
- Centrifuger la suspension conidiale à 13 226 x Vitesse g dans une micro-centrifugeuse pendant 2 min. jeter le surnageant et Resuspendre le culot dans 1 mL de 2 X SFM (milieux synthétiques fongiques)23.
- Compter les conidies utilisant un hémocytomètre sous un microscope optique.
- Ajuster la suspension conidiale jusqu'à 105 conidies/mL avec 2 X GDF.
- Conidies suspension N. crassa
- Transférer une petite quantité de la culture en croissance (5 jour d’âge) de N. crassa à l’aide d’une boucle de l’inoculation d’un tube de microcentrifuge contenant 2 mL de milieu liquide de Vogel.
- Vortex la suspension de conidies et filtrer sur matériau de filtration dans un nouveau tube de microcentrifuge.
- Centrifuger la suspension conidiale à vitesse maximale dans une micro-centrifugeuse pendant 2 min. jeter le surnageant et Resuspendre le culot de conidies dans 1 mL de milieu liquide de Vogel.
- Compter les conidies utilisant un hémocytomètre sous un microscope optique.
- Ajuster la suspension conidiale jusqu'à 105 conidies/mL avec un milieu liquide de Vogel.
4. préparation des échantillons et la microscopie confocale
- Localisation sous-cellulaire des MtDef4 defensin dans les cellules fongiques
- Pipetter 50 µL de chaque suspension de conidies (105 conidies/mL) dans le micropuits de 10 mm de plats en 35 mm verre bas microwell. Pour l’observation des conidies, directement passer à l’étape suivante, ou pour la préparation de tubes germinatifs, prélever 50 µL de N. crassa et F. graminearum conidies dans les récipients de culture de 35 mm et laisser germer pendant 3 à 6 heures à température ambiante.
- Ajouter 50 µL de defensin fluorescent étiquetés au CEM à chaque plat de micropuits et incuber pendant 2,5 heures. La CMI de défensines marqués au fluorophore utilisé ici (étape 1.3) est de 3 µM pour les N. crassa et F. graminearum et la CMI de TMR-MtDef4 pour N. crassa et F. graminearum a été de 1 µM et 12 µM, respectivement.
- Ajouter 2 µL de membrane sélective teindre FM4-64 (concentration finale : 5 µM) en culture plat et incuber pendant 30 min et monter immédiatement sur le microscope confocal pour l’imagerie.
- Sélectionnez le laser White Light (WLL). Utilisez le deux laser sources 488 nm et 550 nm pour exciter le colorant TMR-MtDef4 et FM4-64, respectivement. Détecter la fluorescence des TMR-MtDef4 à 580-700 nm et détecter les colorant FM4-64 à 690-800 nm.
Remarque : Effectuez la microscopie confocale dans la chambre noire.
- Imagerie en temps écoulé d’internalisation de MtDef5 defensin
- Pipetter 50 µL de suspension conidiale N. crassa et F. graminearum (105 conidies/mL) dans 10 mm micropuits de plats en 35 mm verre bas microwell. Le micropuits de 10 mm est non couché et a un couvercle en verre no 1.5 au fond. Pour l’observation des conidies, passez directement à l’étape suivante. Pour l’observation des tubes germinatifs, incuber les conidies pendant 3 à 6 heures à température ambiante avant de procéder à la microscopie.
- Allumez WLL. Sélectionnez la ligne laser à 550 nm pour exciter les défensines marqués au fluorophore utilisé ici (étape 1.3) et FM4-64 avec une intensité de 1,00 % et activer les détecteurs correspondants. Les défensines marqués au fluorophore utilisé ici (étape 1.3) a été détectée à 560-600 nm et le FM4-64dye a été détectée à 690-800 nm.
Remarque : Utilisation laser de faible intensité pour l’imagerie de cellules vivantes, comme intensité laser haute peut endommager les cellules fongiques vivantes. - Monter le plat de microtitration sur le microscope. Trouver les cellules à l’aide des 10 objectifs de x au départ, puis utiliser le x 100 / 1,44 objectif d’huile pour un grossissement supérieur.
Remarque : Définissez le mode de balayage sur xyzt (combinaison de Z-pile et modes Time-lapse), position du Z, Zoom, fréquence de capture d’image, etc..
Remarque : L’ajout defensin et fluorophore après que plat de micropuits de montage dans le microscope peut défocaliser la région d’intérêt. Donc, après l’ajout de defensin et fluorophore dans des micropuits, région d’intérêt doit être recentré qui peut provoquer le retard dans l’acquisition d’images.
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Representative Results
Vivre l’imagerie cellulaire a été réalisée pour suivre et comparer l’internalisation et la localisation subcellulaire des deux défensines, MtDef4 et MtDef5, de Medicago truncatula; les cellules fongiques. TMR-MtDef4 a été synthétisé chimiquement tandis que MtDef5 a été étiqueté avec Dylight550 (Dylight550-MtDef5). Les conidies sont incubées avec soit defensin en combinaison avec le colorant de membrane sélective FM4-64. La figure 1 montre que TMR-MtDef4 a des différentes voies de trafic chez N. crassa comparé au F. graminearum. Chez N. crassa, le FM4-64 ne pas localiser conjointement avec le defensin mais plutôt les taches les membranes des vacuoles dans lequel la defensin est séquestré. En revanche, dans F. graminearum, TMR-MtDef4 n’est pas localisée dans des organites spécifiques liés à la membrane mais est diffus dans le cytoplasme (Figure 1).
Imagerie en temps écoulé de N. crassa cellules marquées avec les défensines marqués au fluorophore utilisé ici (étape 1.3) et FM4-64 montre que le defensin est capable de pénétrer les cellules fongiques dans 30 à 40 min de traitement (Figure 2). Dès l’entrée dans les cellules, les défensines marqués au fluorophore utilisé ici (étape 1.3) ne pas localiser dans n’importe quel organite spécifique mais se diffuse aisément dans le cytoplasme. Cette méthode diffère TMR-MtDef4, qui pénètre les cellules N. crassa et reste emprisonné dans les corps vésiculaires même après 3 h de traitement (Figure 1).
Figure 1 : MtDef4 a différentes voies de trafic chez N. crassa et F. graminearum. TMR-MtDef4 se localise dans les corps vésiculaires chez N. crassa (A) mais est diffus dans le cytoplasme de F. graminearum (B). Les conidies de N. crassa et F. graminearum sont conjointement étiquetées avec 1 µM à 12 µM TMR-MtDef4 (rouge), respectivement et avec FM4-64 (vert). Des images ont été prises après 3 h de traitement. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : MtDef5 est internalisée par N. crassa et diffuse à l’intérieur des cellules. DyLight550-MtDef5 est internalisée dans les cellules de N. crassa et diffuse dans le cytoplasme. N. crassa cellules sont conjointement marquées avec 3 µM DyLight550-MtDef5 (rouge) et FM4-64 (vert). La vidéo a été enregistrée pendant 2 h et 30 min. Le délai entre l’ajout de MtDef5 et acquisition d’images de départ était de 5 min. échelle bar = 4 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour voir cette vidéo. (Clic droit pour télécharger.)
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Discussion
Dans cette étude, une méthodologie d’imagerie fiable de cellules vivantes avec l’utilisation de fluorescent étiquetés défensines antifongique a été décrite pour étudier la cinétique de l’internalisation de ces peptides dans des cellules fongiques et de déterminer leurs cibles subcellulaires. Cette méthode est un outil puissant pour visualiser la dynamique de l’interaction entre les cellules fongiques et les défensines temporellement et spatialement.
Diverses méthodes ont été utilisées pour étudier l’internalisation et la localisation intracellulaire de défensines végétales dans les cellules fongiques. Dans ces méthodes, les cellules traitées defensin sont habituellement fixes et ensuite traitées pour immunolocalisation, microscopie électronique ou rayons x tomographie15,24,25. En outre, la plupart de ces techniques ont été limitée à l’imagerie de cellules à un moment spécifique, plutôt qu’en temps réel à l’aide de l’imagerie de cellules vivantes même Time-lapse pour surveiller les changements dynamiques qui se déroulent en réponse au défi de defensin. La possibilité de visualiser, d’analyser et de comparer les événements dynamiques qui se déroulent dans les cellules fongiques en temps réel durant l’action antifongique de défensines rend cette technique efficace et excitant. En outre, il fournit mieux comprendre comment la localisation intracellulaire dynamique du peptide affecte la morphogénèse des cellules fongiques individuelles avec le temps.
Un des aspects importants de cette méthode consiste à déterminer les cibles subcellulaires en utilisant des peptides fluorescent étiquetés avec les colorants fluorescents vitales (p. ex. FM4-64 ; SG). La localisation sous-cellulaire détermine l’environnement dans lequel un peptide utilisés et représente une étape importante pour élucider ses partenaires d’interaction, de fonction et rôle potentiel dans la machinerie cellulaire26,,27.
Une limitation mineure de cette technique est que le peptide fluorescent présente souvent une activité antifongique réduite comparée à celle du peptide non étiqueté. Si le peptide est étiqueté avec un kit d’étiquetage peptide disponibles dans le commerce et montre une perte complète de l’activité antifongique, un peptide synthétisé chimiquement étiqueté avec un fluorophore petit à ses N - ou C-terminale est recommandé.
Dans la cellule résumé, vivre l’imagerie de cellules fongiques contesté avec un fluorophore-le tag defensin est un outil efficace qui peut fournir directement à haute résolution spatio-temporelle du ministère de l’agriculture d’un antifongique defensin. Pour étude plus précise de MOA, cette technique peut être combinée avec la durée de vie de fluorescence imaging microscopy (FLIM)28 , qui permettra de mesurer la cinétique de l’interaction d’un peptide avec autres peptides, ou avec d’autres molécules marquées ou cellulaire mandants en temps réel. Cela va enrichir notre compréhension des façons des peptides antimicrobiens travaillent ainsi accélérer leur développement en tant qu’agents antifongiques destinés à l’agriculture et de la médecine.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Nous remercions le Dr R. Howard Berg, directeur de l’établissement de microscopie intégrée à la Donald Danforth Plant Science Center, pour ses conseils et aide à la microscopie confocale. Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FM4-64 Dye | Life Technologies | T13320 | |
| DyLight 550 Antibody Labeling Kit | Thermo Scientific | 84530 | |
| Glass Bottom Microwell Dishes | Mat TeK | P35G-1.5-10-C | |
| Mira cloth | EMD Millipore Corp | 475855-1R | |
| SP8-X confocal microscope | Leica | ||
| ImageJ software | FiJi | For Image analysis | |
| Imaris software | Bitplane | For Image analysis |
References
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