Summary
Vi presenterar ett filtreringsbaserat protokoll för att isolera högkvalitativa kärnor från tvärbunden muskelskelettmuskel, där vi avlägsnade behovet av ultracentrifugering, vilket gör det lätt att använda. Vi visar att kromatin framställt från kärnorna är lämplig för kromatinimmunutfällning och sannolikt kromatinimmunutfällnings-sekvenseringsstudier.
Abstract
Kromatinimmunutfällning (ChIP) är en kraftfull metod för att bestämma proteinbindning till kromatin-DNA. Fiberrik skelettmuskel har dock varit en utmaning för ChIP på grund av tekniska svårigheter i isolering av högkvalitativa kärnor med minimal förorening av myofibriller. Tidigare protokoll har försökt att rena kärnor före tvärbindning, vilket medför risken för förändrad DNA-proteininteraktion under det långvariga kärnberedningsförfarandet. I det nuvarande protokollet korsade vi först skelettmuskulaturvävnaden uppsamlad från möss och vävnaderna hakades och sonikerades. Eftersom vi fann att ultracentrifugering inte kunde separera kärnor från myofibriller med användning av tvärbunden muskelvävnad, utformade vi en sekventiell filtreringsprocedur för att erhålla högkvalitativa kärnor utan betydande myofibrilförorening. Vi framställde därefter kromatin genom användning av en ultraljudsapparat, och ChIP-analyser med anti-BMALl-antikropp avslöjade robust cirkadisk bindningMönster av BMAL1 till målgenpromotorer. Detta filtreringsprotokoll utgör en lättanvänd metod för att isolera högkvalitativa kärnor från tvärbunden skelettmuskelvävnad, vilket möjliggör konsekvent provbehandling för cirkadian och andra tidskänsliga studier. I kombination med nästa generations sekvensering (NGS) kan vår metod användas för olika mekaniska och genomiska studier med inriktning på skelettmuskelfunktion.
Introduction
Skelettmuskel spelar viktiga roller i fysiologi och beteende. Den flerkärniga muskelfibern består av myofibriller där aktin och myosin bildar funktionella enheter som kallas sarkomerer för att generera kontraktil kraft. Skelettmuskel är också det största metabola organet i kroppen, som står för> 80% postprandial glukosintag och reglerar insulinreaktion och metabolisk homeostas 1 , 2 . Muskelfysiologi och ämnesomsättning är nära reglerad av cirkadian klockan, en inneboende biologisk timer 3 , 4 , 5 , 6 . Exempelvis resulterade den skelettmuskelspecifika deletionen av Bmal1 , en av de kärna cirkadiska klockkomponenterna, i insulinresistens och minskad glukosupptagning i skelettmuskulaturen, och djuren visade sig utveckla typ 2-diabetes 7 . jagN tillägg skelettmuskel blir också alltmer uppskattat som ett endokrin organ 8 , som utsöndrar myokiner för att reglera systemisk metabolism och fysiologi. Mekanistiska studier krävs för att fullständigt förstå dessa regleringsfunktioner i skelettmuskeln.
ChIP är ett kraftfullt sätt att avgränsa promotorrekrytering av DNA-bindande proteiner. ChIP utvecklades initialt för att identifiera nukleosomorganisationen på kromatin-DNA 9 , 10 . En rad olika metoder har sedan rapporterats till tvärbindningsproteiner och kromatin-DNA med användning av formaldehyd, dimetylsulfat eller ultraviolett bestrålning (UV) 11 , 12 . Formaldehyd-tvärbindning är den vanligaste, konserverande kromatinstrukturen och DNA-protein-interaktionerna 9 , 13 , 14 . Tvärbunden kromatografiIn sönderdelas genom sonikering och immunutfälls med antikropp mot det specifika DNA-bindande proteinet av intresse 15 , 16 . Under de senaste åren har ChIP-sekvensering (ChIP-seq), en metod som kombinerar ChIP med NGS, utvecklats för att förhöra genombrett transkriptionsfaktorbindning 17 och i vissa fall för att övervaka dynamiska förändringar över en tidskurs 18 , 19 , 20 . Exempelvis har cirkidiska ChIP-seq-studier avslöjat en starkt orkestrerad sekvens av genomisk bindning av cirkadiska klockkomponenter och histonmarkörer, som driver temporärt precist genuttryck under hela 24 h cirkadiancykeln 18 .
De flesta tillgängliga ChIP-protokoll är utformade för mjukvävnad (t ex lever, hjärna etc. ), och väldigt få har publicerats för hårda vävnader inklusive skeleTalmuskel. Det är tekniskt utmanande att homogenisera fiberrik skelettmuskel och isolera högkvalitativa kärnor 21 , speciellt för ChIP-experiment som kräver tvärbindning. I en nyligen genomförd muskel-ChIP-studie 22 separerades satellitceller från myofibrer, och kärnor framställdes från båda celltyperna genom en långvarig procedur som involverade vävnadsdigestion. Hela processen tog ungefär tre timmar att slutföra innan formaldehyd-tvärbindning utfördes på isolerade kärnor. Även om detta förfarande undviker tvärbindning av muskelfibrer, vilket gör muskelvävnaden ännu mer eldfast mot effektiv homogenisering och kunde producera högkvalitativa kärnor, innebär den signifikanta tidsfördröjningen från vävnadssamling till kärnbindning att risken för förändrat DNA -proteininteraktion. Däremot utförde de flesta studierna tvärbindning omedelbart efter experimentell behandling eller vävnadssamling för att bevara realtids DNA-proteiN-bindning 12 . En andra nackdel med kärnorisolering före tvärbindning är att den utesluter tidskänsliga tillämpningar såsom cirkadisk samling av prov som vanligtvis förekommer med mellanrum på 3 - 4 timmar. Utan tvärbindning av kärnorna behöver isoleringen fortgå omedelbart efter dissektion, medan tvärbundna prover kan bearbetas tillsammans efter att hela tidskursen är klar och därigenom säkerställer större experimentell konsistens.
Andra protokoll för kärnisolering från okrossbunden skelettmuskel har också rapporterats. Två studier beskrev användningen av gradient ultracentrifugering för att separera kärnor från kvarvarande myofibriller och cellrester 23 , 24 . Medan sackaros eller kolloidal gradient ultracentrifugering är effektiv med icke tvärbundna muskelvävnader, visade våra experiment att efter tvärbindning misslyckades gradient ultracentrifugering att separera kärnor från cell dEbris på gradienten.
Vi utvecklade därför ett förfarande för att isolera högkvalitativa kärnor med hjälp av tvärbundna muskelvävnader från muskelskelett. I stället för gradient ultracentrifugering utformade vi en seriefiltreringsmetod för att effektivt separera kärnor från skräp. Efter ultraljud användes kromatinproverna framgångsrikt för ChIP-studier som visade ett cirkadiskt mönster av BMALl-proteinbindning till målpromotorer. Vår metod kan i stor utsträckning tillämpas på olika mekanistiska studier av muskelvävnader.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Djurvård utfördes enligt riktlinjerna för institutionell djurvård och användning (IACUC), och förfarandena utfördes enligt ett djurprotokoll godkänt av University of Texas Health Science Center i Houston.
1. Nukleär isolering från tvärbunden skelettmuskel
- Skelettmuskulaturen väger och hakar, isolerad från ungefär 20 veckor gamla C57BL / 6 hanmöss, i iskall fosfatbuffrad saltlösning (PBS) som beskrivits i detalj tidigare 22 .
OBS! Vi brukar få 1,0 - 1,5 g skelettmuskel från en mus.- Placera hakade skelettmuskulaturvävnad i ett 50 ml koniskt rör innehållande 10 ml PBS på is.
- Centrifugera vid 300 xg vid 4 ° C i 5 min.
- Ta försiktigt bort PBS-supernatanten genom aspiration.
- Uppskatta pelletsvolymen i varje 50 ml rör genom att använda referensrör med 1, 2, 3 och 4 ml vatten.
- Lägg till 7 volymer avIskall 1% formaldehyd i PBS och homogenisera proven på is med en sondvävnadshomogenisator (se tabell över material ).
OBS: Valfritt: Homogeniseringsproceduren kan utföras i ett kallrum. - Tvärbinda provet genom att inkubera vid rumstemperatur i 10 minuter.
- Avsluta tvärbindningsreaktionen genom tillsats av 1 M glycin till en slutlig koncentration av 0,125 M och inkubera i 5 min vid rumstemperatur.
- Centrifugera proverna vid 3000 xg under 5 minuter vid 4 ° C. Ta bort supernatanten via aspiration.
- Skölj med 10 ml iskall basbuffert (10 mM HEPES-KOH vid pH 7,3, 10 mM EDTA, 10 mM KCl, 5 mM MgCl2, 0,5 mM DTT) innehållande nyligen tillsatta proteashämmare (0,2 mM fenylmetylsulfonylfluorid (PMSF) , Och 10 | ig / ml leupeptin). Centrifugera vid 3000 g under 5 min vid 4 ° C och försiktigt avlägsna supernatanten genom aspiration.
- Resuspendera pelleten i 6 ml lysbuffert (10 mM HEPES-KOH vid sH 7,3, 10 mM EDTA, 10 mM KCl, 5 mM MgCl2, 0,5 mM DTT, 1% Triton X-100) innehållande färskt tillsatta proteashämmare (0,2 mM PMSF och 10 | ig / ml leupeptin).
- Överför provet till en förkylad 15 ml Dounce-homogenisator och inkubera i 10 minuter på is. Avlägsna homogenisera varje prov på is med 15 långsamma slag genom att använda lös pestel följt av 15 slag med tätt pistel för att frigöra kärnorna.
- Filtrera homogenatet (6 ml) genom cellfiltret (porstorlek: 100 μm) och skölj med 4 ml lysbuffert. Centrifugera proverna vid 1000 xg under 10 minuter vid 4 ° C. Resuspendera i 5 ml iskall basbuffert och doppa 10 gånger med tätt pistel för att frigöra kärnor.
- Ta bort en alikvot på 20 μl för DNA-koncentrationsmätning med en spektrofotometer (OD260 / OD280) och mikroskopisk observation med trypanblå vid behov (se nedan) ( Figur 1 A ).
- Filtrera suspensionen genomEn cellfilm (porstorlek: 70 | im), skölj röret och filtrera igen med 2 ml basbuffert som ovan.
- Upprepa filtreringen som i steg 1.13 med cellstimulatorer med gradvis reducerad porstorlek (40 | im, 30 | im, 20 | im och 10 | im).
OBS: Totalt användes strängare med 6 porstorlekar i steg 1,12-1,14. - Centrifugera vid 1000 g vid 4 ° C i 10 min. Ta bort supernatanten och resuspendera pelleten i 500 μl basbuffert.
- Mät DNA-koncentrationen enligt ovan.
OBS: Ca 200 μg nukleins DNA erhölls från att kombinera båda bakbenen från ett djur. Alternativt, spara 20 μL för mikroskopisk observation med trypanblåfärgning (stamkoncentration 0,4%, 1: 5 utspädning); Kärnor kommer att färga blått ( figur 1 B ). - Centrifugera vid 1000 g vid 4 ° C under 10 minuter och kassera supernatanten. Förvara pelleten vid -80 ° C.
2. Sonication
<ol>OBS! Ett exempel för utvärdering av sonikeringseffektivitet visas i Figur 2 .
3. Utvärdering av Sonication och Quantitation
- Lägg till 1,0ΜL RNase A (500 U / ml RNas A: 20 000 U / ml RNase T1) till de sparade 50 | jL sonikerade proverna och inkubera i 30 minuter vid 37 ° C.
- Tillsätt 8 μl proteas K (10 mg / ml) och inkubera 30 minuter vid 55 ° C.
- Skär DNA genom att använda ett DNA-extraktionspaket.
- Tillsätt 5 volymer bindningsbuffert, applicera den på spinnkolonnen och centrifugera vid 4000 xg, 10 min.
- Applicera genomgången i samma kolonn och centrifugera igen.
- Tvätta med tvättbuffert två gånger vid 13 000 xg, 1 min.
- Centrifugera igen vid 13 000 xg, 1 min för att torka kolonnen.
- Tillsätt 50 μl H20 och centrifugera vid 13.000 xg, 1 min för att eluera DNA.
- Applicera genomgången i samma kolonn och centrifugera igen.
- Kvantifiera mängden DNA med en spektrofotometer (OD260 / OD280). Kör prov på 0,8% geler för att utvärdera storleken och mängden (1 μg) av de sonikerade produkterna ( Figur 2 ).
OBS: Det genomsnittliga kromatinutbytet är ca ~ 20%.
4. ChIP
- Tina det tidigare sparade kromatinet vid -80 ° C och alikvot kromatinet till ~ 100 - 120 μg per rör. Späd 1:10 med radioimmunprecipitationsanalys (RIPA) -buffert (20 mM Tris-HCl (pH 7,4), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM NaF, 1 mM Na3VO4, 1 mM PMSF, 1x proteashämmare-cocktail (PIC), 0,1% Na-deoxikolat Vikt / volym), 1% Triton X-100).
- Om det finns flera prover i varje grupp, kombinera lika stora mängder kromatin-DNA till den slutliga mängden ~ 100 - 120 μg / prov. Spara 10% som inmatning.
- Lägg till 40 μL (50% v / v uppslamning i RIPA-buffert) av BSA-förspärrad (~ 2 h, 4 ° C) Protein A / G-agaros (icke-kycklingantikropp) eller IgY-pärlor (Kycklingantikropp) och inkubera på En rotator i 3 h vid 4 ° C.
- Centrifugera vid 1000 xg, 10 min och försiktigt överföra supernatanten till nya rör.
- Tillsätt antikroppar vid 1 μg antikropp per ~25 - 100 | ig kromatin-DNA.
- Rotera försiktigt vid 4 ° C över natten vid ungefär 15 rpm.
- Tillsätt 10 μl BSA-förblåst (~ 2 h, 4 ° C) Protein A / G-agaros (icke-kycklingantikropp) eller IgY-pärlor (Kycklingantikropp) blandas och roteras i kallrummet i 2 timmar.
- Tvätta pärlor enligt följande. Tvätta med 1 ml RIPA-buffert under 3 minuter två gånger, tvätta med 1 ml hög saltbuffert (20 mM Tris-HCl (pH 7,4), 500 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1 mM PMSF, 1% Triton X-100) under 3 min , Tvättas med 1 ml LiCl-buffert (20 mM Tris-HCl (pH 7,4), 250 mM LiCl, 2 mM EDTA, 1 mM PMSF, 1% Na-deoxikolat, 0,5% NP40) i 3 minuter två gånger.
- Tvätta med 1 ml Tris-EDTA (TE) -buffert (10 mM Tris-HCl (pH 7,4), 1 mM EDTA) under 3 min en gång. Därefter elueras DNA med elueringsbuffert (20 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA och 0,5% SDS).
- Centrifugera vid 1000 g, 1 min och försiktigt avlägsna supernatanten.
- Resuspendera pärlan med 50 pi elueringsbuffert.
- Inkubera för 10Min vid 65 ° C.
- Centrifugera vid 12 000 g under 5 min.
- Överför supernatanten till ett nytt rör, tillsätt ytterligare 50 μl och centrifugera återigen vid 12 000 g under 5 min. Den slutliga elueringsvolymen kommer att vara 100 pl.
- Omvänd tvärbindning och DNA-eluering.
- Inkubera det eluerade kromatinet över natten vid 65 ° C.
- Tillsätt 1,0 μl RNas A och inkubera i 30 min vid 37 ° C.
- Tillsätt 8 μl proteas K (10 mg / ml) och inkubera 30 minuter vid 55 ° C.
- Skär DNAet genom att använda ett PCR-rengöringssats med elueringsvolymen vid 50 μl enligt tillverkarens protokoll.
- Analysera profilerna med realtids qPCR som tidigare beskrivits 25 , 26 .
OBS: Primersekvenserna är listade i figur 3 Legend . Data presenteras som medelvärde ± SEM ( Figur 3 ).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Här utfördes formaldehyd-tvärbindning omedelbart efter vävnadssamling för att bevara DNA-proteininteraktion i realtid. Vi fann emellertid att sackaros eller kolloidal gradient, som vanligtvis användes för kärnisolering 23 , 24 , inte var effektiv vid separation av kärnor från myofibriller (data ej visad). Orsaken kan vara att tvärbindning ger liknande gravitation för kärnor och myofibriller. Därför utvecklade vi en seriefiltreringsprocess för att effektivt avlägsna stora myofibriller och andra skräp från kärnfraktionen. Efter 100 μm filtrering fanns fortfarande stora vävnadsavfall och myofibriller ( Figur 1 A ). I jämförelse, vid slutet av sekventiell filtrering, avlägsnades majoriteten av stora vävnadsavfall, intakta celler och stora myofibriller med framgång ( Figur 1 B ).
27 eller musembryonfibroblast (MEF) 28 , har det i vår erfarenhet stört sonikering av skelettmuskulaturkärnor och resulterat i bred uttryckning, vilket indikerar Ineffektiv sonication. Med användning av det nuvarande protokollet med omedelbar sonikering efter suspension i SDS-lysbuffert observerades effektiv eliminering med kromatin gradvis på ett cykelberoende sätt och slutligen producera ~ 500 bp DNA-fragment ( Figur 2 ). Förinkubering i lysbufferten påvisade avsevärt sonikeringseffektiviteten.
Att luraFastställa kvaliteten på kromatinberedningen för ChIP, undersökte vi DNA-bindning av den cirkadiska transkriptionsfaktorn BMAL1, vilken visade bindande topp och tråg vid Zeitgeber-tiden (ZT) 6 och ZT18 respektive 18 , 29 . Skelettmuskelprover från C57B / 6J möss uppsamlades vid ZT6 och ZT18, och kromatinprover framställdes som ovan. Kort efter, efter sonikering, förskruvades strimlade kromatinprover med IgY-pärlor som har blivit förspärrade med BSA följt av inkubation med anti-BMALl-antikropp vid 4 ° C över natten. Efter eluering och rening av kromatin utförde vi RT-qPCR för att detektera BMALl-bindning på E-Box-element av två målgener, Nr1d1 och Dbp 30 . Vi upptäckte robust bindning av BMAL1 till E-box-elementen vid ZT6 och minimal bindning vid ZT18 ( Nr1d1 : 0,452 ± 0,022 vs. 0,039 ± 0,002, Dbp -0,4: 0,627 ± 0,013 vs. 0,062 ± 0,009, Dbp+0,8: 0,176 ± 0,013 vs 0,008 ± 0,001, Dbp + 2,4: 0,466 ± 0,010 vs 0,122 ± 0,014; Alla värden är medelvärden ± SEM) ( Figur 3 ), validering av protokollet för tidskänslig transkriptionsfaktorbindningsanalys i skelettmuskeln.
Figur 1 : Sekventiell filtrering avlägsnat effektivt vävnadspåse. (A) Representativa bilder som visar prover efter 100 μm filtrering. Stora vävnader och fiberskräp observeras. (B) Representativa bilder som visar prover efter seriefiltrering. Stora fiberskräp rensades. Endast isolerade kärnor och små myofibrilfragment observeras. Bilder togs genom att använda ett ljussmikroskop vid 10X, 20X och 40X förstoringar. Skala barer visas på höger sida paneler.Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2 : Progressiv kromatinförstärkning genom 10 cykler av sonikering. Tio cykler av sonikering med digererat kromatin-DNA till ~ 500 bp, som avslöjas i en 0,8% agarosgel, körs vid 150 V under 60 min. Den högra panelen indikerar en lägre ljudbehandling effektivitet efter förinkubation i iskall SDS lysisbuffert under 1 h. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
FiGure 3 : Representativa qPCR-resultat för BMAL1 ChIP med muskelsmuskelprover samlade vid ZT6 och ZT18. Data presenteras som medelvärde ± SEM. Dbp -0,4, +0,8 och +2,4 anger placeringar av E-Box-elementen på Dbp- genen. NC: negativ kontroll med IgY. Det temporala mönstret för BMAL1-bindning överensstämmer med tidigare resultat som visar BMAL1-bindningstopp vid omkring ZT6 18 . Fram- och bakåtprimrarna är som följer. Rev-erba: 5'-GTAGACTACAAATCCCAACAATCCTG och 5'-TGGAGCAGGTACCATGTGATTC; Dbp -0,4: 5'-ACACCCGCATCCGATAGC och 5'-CCACTTCGGGCCAATGAG; Dbp +0,8: 5'- ATGCTCACACGGTGCAGACA och 5'-CTGCTCAGGCACATTCCTCAT; Dbp +2,4: 5'-TGGGACGCCTGGGTACAC och 5'-GGGAATGTGCAGCACTGGTT. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här beskriver vi en robust metod där tvärbundna skelettmuskelvävnader användes för att isolera högkvalitativa kärnor. Sekventiell filtrering utfördes för att effektivt separera kärnor från skräp och ultraljudsakustisk energi från skålformad omvandlare skjuvade kromatinet för ChIP-analys. Resultaten visade cirkadisk tidsspecifik bindning av BMAL1 till målpromotorer.
ChIP kan användas för att fånga realtids proteinbeläggning på genomiskt DNA när tvärbindning sker. För att dra nytta av denna potential, syftade vi till att utveckla en metod för att möjliggöra tvärbindning av skelettmuskeln vid tidpunkten för vävnadsdissektion och för att effektivisera kärnans isolering utan gradient ultracentrifugering. På grund av svårigheten att homogenisera fiberrik skelettmuskulatur jämfört med mjuka vävnader såsom lever, malsade vi muskelvävnad i iskall PBS och homogeniserades sedan provet i en formaldehydbuffert. Efter quenching vätskesuspension waS centrifugeras och sköljs med iskall basbuffert för att skölja bort eventuell kvarvarande formaldehyd. Nuklein frisattes genom Dounce-homogenisering och homogenaten filtrerades i följd för att gradvis avlägsna cellavfall och myofibriller. Vi utformade filtreringsserien för att minimera filterstoppning vilket skulle kunna påverka avkastningen negativt. Endast mycket korta myofibriller kvarstod när sekventiell filtrering fullbordades.
Sonication- och ChIP-procedurerna anpassades från en tidigare rapport 12 med modifieringar innefattande sonikeringstidpunkt och SDS-buffertmängd. Den skålformade sonikatorn möjliggör exponering för centraliserad ultraljudsvåg för prov i glasflaskor i ett kallvattenbad. Jämfört med sondhögtalare reglerar denna sonikatorn provtemperaturen för att undvika överhettning och förhindrar även tvärkontamination av provet. Om sondhögtalare används, måste optimala sonikeringsbetingelser bestämmas empiriskt. Vi minskade också amounT av SDS-buffert eftersom utbytet av muskelkromatin är lägre än det i lever 12 . Flera protokoll 28 , 31 , 32 innefattar inkubation på is eller vid rumstemperatur före sonikering. Men enligt vår erfarenhet förbättrades inte pre-inkubation på is effektiviteten. Faktum är att sonikering i vissa fall äventyras. Det är möjligt att residuella myofibriller sammanfogade kromatin-DNA under inkubation och dämpad sonikeringseffektivitet. Med omedelbar sonikering efter kärnuppslamning i SDS-lysbuffert lyckades vi uppnå progressiv kromatinfragmentering med ökande sonikationscykler ( Figur 2 ).
Vi validerade kromatins kvalitet med ChIP qPCR. Såsom visas i figur 3 var BMALl-promotorns beläggning robust vid ZT6 och minimal vid ZT18, i överensstämmelse med tidigare visad BMAL1-cirkaDian-promotorbindning 18 . Denna funktionella analys bekräftade kärnornas och kromatins kvalitet. Under de senaste åren har den snabba utvecklingen i NGS öppnat en ny horisont för ChIP-applikationen där ChIP-seq kvantitativt kan undersöka genomisk bindning med hög känslighet 17 . Speciellt för ChIP-seq krävs högkvalitativa kärnor och kromatin för att konsekvent fånga protein-DNA-interaktion. Förfarandet som beskrivs häri kan utgöra en värdefull resurs för ChIP-seq-studier med användning av skelettmuskulatur. Observera kräver ChIP-seq-bibliotekspreparat ytterligare åtgärder för att förbättra signalupplösningen, såsom PAGE-baserat storlekval 18 .
Sammanfattningsvis utvecklade vi ett filtreringsbaserat protokoll för att förbereda högkvalitativa kärnor från tvärbunden skelettmuskel. Vi tar bort behovet av ultracentrifugering, vilket gör det lätt att använda. Förutom ChIP för gener av intresse, är kärnorna och kromatinet prEpared enligt beskrivningen kan vara brett tillämplig på ChIP-seq-studier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar Karyn Esser, Nobuya Koike och Noheon Park för användbara råd. Detta arbete stöddes delvis av NIH / NIGMS (R01GM114424) till S.-HY och Robert A. Welch Foundation (AU-1731) och NIH / NIA (R01AG045828) till ZC
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Formaldehyde solution | Sigma Aldrich | F8775 | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-5 | |
| Trypan Blue solution (0.4%) | Fisher Scientific | 15250061 | |
| RNase A | Sigma Aldrich | 10109142001 | |
| Protease K | Sigma Aldrich | 3115887001 | |
| Chicken Anti-BMAL1 antibody | Generated in chicken (Cocalico Biologicals) against antigen aa 318 - 579, and IgY was affinity purified using the same antigen. | ||
| Chicken IgY Precipitating Resin | GenScript | L00405 | |
| Equipment | |||
| KINEMATICA Polytron PT2100 Benchtop Homogenizer | Fisher Scientific | 08-451-178 | |
| 15 mL Dounce tissue grinder | Whearton | 357544 | |
| Falcon Cell Strainers 100 µm | Fisher Scientific | 08-771-19 | |
| Falcon Cell Strainers 70 µm | Fisher Scientific | 08-771-1 | |
| Falcon Cell Strainers 40 µm | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| pluriStrainer 30 µm | PluriSelect | 43-50030-03 | |
| pluriStrainer 20 µm | PluriSelect | 43-50020-03 | |
| pluriStrainer 10 µm | PluriSelect | 43-50010-03 | |
| Covaris S2 Focused-ultrasonicator | Covaris | Model S2 | |
| Labquake | Thermo Scientific | C415110 | |
| CCD Microscope Camera | Leica Microsystems | DFC3000 G | |
| Reagent Kit | |||
| DNA extraction kit | Thermo Scientific | K0691 | |
| Buffers | |||
| All buffer components are discribed in the protocol. Each component was purchased from Sigma Aldrich |
References
- Bouzakri, K., et al. siRNA-based gene silencing reveals specialized roles of IRS-1/Akt2 and IRS-2/Akt1 in glucose and lipid metabolism in human skeletal muscle. Cell Metab. 4 (1), 89-96 (2006).
- Boucher, J., Kleinridders, A., Kahn, C. R. Insulin receptor signaling in normal and insulin-resistant states. Cold Spring Harb Perspect Biol. 6 (1), (2014).
- Green, C. B., Takahashi, J. S., Bass, J.
- Liu, A. C., Lewis, W. G., Kay, S. A. Mammalian circadian signaling networks and therapeutic targets. Nat Chem Biol. 3 (10), 630-639 (2007).
- Harfmann, B. D., Schroder, E. A., Esser, K. A. Circadian rhythms, the molecular clock, and skeletal muscle. J Biol Rhythms. 30 (2), 84-94 (2015).
- Nohara, K., Yoo, S. H., Chen, Z. J. Manipulating the circadian and sleep cycles to protect against metabolic disease. Front Endocrinol (Lausanne). 6, 35 (2015).
- Harfmann, B. D., et al. Muscle-specific loss of Bmal1 leads to disrupted tissue glucose metabolism and systemic glucose homeostasis. Skelet Muscle. 6, 12 (2016).
- Pedersen, B. K., Febbraio, M. A. Muscles, exercise and obesity: skeletal muscle as a secretory organ. Nat Rev Endocrinol. 8 (8), 457-465 (2012).
- Solomon, M. J., Varshavsky, A. Formaldehyde-mediated DNA-protein crosslinking: a probe for in vivo chromatin structures. Proc Natl Acad Sci U S A. 82 (19), 6470-6474 (1985).
- Jackson, V. Studies on histone organization in the nucleosome using formaldehyde as a reversible cross-linking agent. Cell. 15 (3), 945-954 (1978).
- Gilmour, D. S., Lis, J. T. Detecting protein-DNA interactions in vivo: distribution of RNA polymerase on specific bacterial genes. Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (14), 4275-4279 (1984).
- Takahashi, J. S., et al. ChIP-seq and RNA-seq methods to study circadian control of transcription in mammals. Methods Enzymol. 551, 285-321 (2015).
- Kuo, M. H., Allis, C. D. In vivo cross-linking and immunoprecipitation for studying dynamic Protein:DNA associations in a chromatin environment. Methods. 19 (3), 425-433 (1999).
- Chen, Z., Manley, J. L. Core promoter elements and TAFs contribute to the diversity of transcriptional activation in vertebrates. Mol Cell Biol. 23 (20), 7350-7362 (2003).
- Menet, J. S., Abruzzi, K. C., Desrochers, J., Rodriguez, J., Rosbash, M. Dynamic PER repression mechanisms in the Drosophila circadian clock: from on-DNA to off-DNA. Genes Dev. 24 (4), 358-367 (2010).
- Miki, T., Matsumoto, T., Zhao, Z., Lee, C. C. p53 regulates Period2 expression and the circadian clock. Nat Commun. 4, 2444 (2013).
- Furey, T. S. ChIP-seq and beyond: new and improved methodologies to detect and characterize protein-DNA interactions. Nat Rev Genet. 13 (12), 840-852 (2012).
- Koike, N., et al. Transcriptional architecture and chromatin landscape of the core circadian clock in mammals. Science. 338 (6105), 349-354 (2012).
- Zhou, J., Yu, W., Hardin, P. E. ChIPping away at the Drosophila clock. Methods Enzymol. 551, 323-347 (2015).
- Takahashi, J. S. Transcriptional architecture of the mammalian circadian clock. Nat Rev Genet. , (2016).
- Edelman, J. C., Edelman, P. M., Kniggee, K. M., Schwartz, I. L.
- Ohkawa, Y., Mallappa, C., Vallaster, C. S., Imbalzano, A. N. Isolation of nuclei from skeletal muscle satellite cells and myofibers for use in chromatin immunoprecipitation assays. Methods Mol Biol. 798, 517-530 (2012).
- Wilkie, G. S., Schirmer, E. C. Purification of nuclei and preparation of nuclear envelopes from skeletal muscle. Methods Mol Biol. 463, 23-41 (2008).
- Hahn, C. G., Covault, J. Isolation of transcriptionally active nuclei from striated muscle using Percoll density gradients. Anal Biochem. 190 (2), 193-197 (1990).
- Jeong, K., et al. Dual attenuation of proteasomal and autophagic BMAL1 degradation in Clock Delta19/+ mice contributes to improved glucose homeostasis. Scientific reports. 5, 12801 (2015).
- Nohara, K., et al. Ammonia-lowering activities and carbamoyl phosphate synthetase 1 (Cps1) induction mechanism of a natural flavonoid. Nutrition & metabolism. 12, 23 (2015).
- Zhang, L., Rubins, N. E., Ahima, R. S., Greenbaum, L. E., Kaestner, K. H. Foxa2 integrates the transcriptional response of the hepatocyte to fasting. Cell Metab. 2 (2), 141-148 (2005).
- Gade, P., Kalvakolanu, D. V. Chromatin immunoprecipitation assay as a tool for analyzing transcription factor activity. Methods Mol Biol. 809, 85-104 (2012).
- Kondratov, R. V., et al. BMAL1-dependent circadian oscillation of nuclear CLOCK: posttranslational events induced by dimerization of transcriptional activators of the mammalian clock system. Genes Dev. 17 (15), 1921-1932 (2003).
- Ripperger, J. A., Schibler, U. Rhythmic CLOCK-BMAL1 binding to multiple E-box motifs drives circadian Dbp transcription and chromatin transitions. Nat Genet. 38 (3), 369-374 (2006).
- Laplante, M., et al. DEPTOR cell-autonomously promotes adipogenesis, and its expression is associated with obesity. Cell Metab. 16 (2), 202-212 (2012).
- Blechman, J., Amir-Zilberstein, L., Gutnick, A., Ben-Dor, S., Levkowitz, G. The metabolic regulator PGC-1alpha directly controls the expression of the hypothalamic neuropeptide oxytocin. J Neurosci. 31 (42), 14835-14840 (2011).
