Summary
Elektroconvulsietherapie overname (ECS) is een experimentele diermodel van elektroconvulsieve therapie voor ernstige depressie. ECS stimuleert wereldwijd activiteit in de hippocampus, wat leidt tot synaptogenese en synaptische plasticiteit. Hier beschrijven we methoden voor ECS inductie bij ratten en voor subcellular versplintering van hun hippocampi te onderzoeken van inbeslagneming-geïnduceerde veranderingen in synaptic eiwitten.
Abstract
Elektroconvulsietherapie overname (ECS) is een experimentele diermodel van elektroconvulsieve therapie, de meest effectieve behandeling voor ernstige depressie. ECS induceert gegeneraliseerde tonic-klonische aanvallen met lage sterfte en neuronale dood en is een veel gebruikte model tot scherm anti-epileptische geneesmiddelen. Hier beschrijven we een ECS inductie methode in die een korte 55-mA stroom wordt geleverd voor 0,5 s aan mannelijke ratten 200-250 g in gewicht via oor-clip elektroden. Dergelijke bilaterale stimulatie geproduceerd etappe 4-5 klonische aanvallen die duurde ongeveer 10 s. Na de stopzetting van acute of chronische ECS sham meeste ratten hersteld te gedragsgestoorde niet te onderscheiden van "geen aanvallen" ratten. Omdat ECS wereldwijd hersenactiviteit verheft, heeft het ook te onderzoeken activiteit-afhankelijke wijzigingen van synaptic eiwitten en hun gevolgen voor synaptic kracht met behulp van meerdere methoden gebruikt. Subcellular versplintering van het postsynaptisch dichtheid (PSD) in combinatie met het westelijke bevlekken voorziet met name in de kwantitatieve bepaling van de overvloed aan synaptic eiwitten op deze gespecialiseerde synaptic structuur. In tegenstelling tot een vorige fractionering methode waarvoor grote hoeveelheid knaagdier hersenen, beschrijven we hier een kleinschalige fractionering methode om te isoleren van de PSD van de hippocampi van een enkele rat, zonder sacharose kleurovergang centrifugeren. Met behulp van deze methode, laten we zien dat de geïsoleerde PSD breuk postsynaptisch membraaneiwitten bevat, met inbegrip van PSD95, GluN2B en GluA2. Synaptophysin van de presynaptische marker en oplosbare cytoplasmatische eiwit α-tubuline werden uitgesloten van de PSD-breuk, tonen van succesvolle PSD isolatie. Bovendien daalde chronische ECS GluN2B expressie in de PSD, waaruit blijkt dat onze kleinschalige PSD fractionering methode kan worden toegepast om de opsporing van de wijzigingen in hippocampal PSD eiwitten uit een enkele rat na genetische, farmacologische of mechanische behandelingen .
Introduction
Elektroconvulsieve therapie is gebruikt voor de behandeling van patiënten met grote depressieve stoornissen, met inbegrip van ernstige resistente depressie, bipolaire depressie, Parkinson ziekten en schizofrenie1,2. In deze therapie, wordt inbeslagneming gegenereerd door elektrische prikkel geleverd aan het hoofd van narcose patiënten via epicranial elektroden,1,,2,3. Herhaalde toediening van ECS is klinisch gunstig voor resistente depressieve stoornissen1,2,3. Het exacte mechanisme dat ten grondslag ligt aan de lange termijn effectiviteit van het antidepressivum effect bij de mens is echter gebleven ongrijpbaar. ECS is een dierlijk model van elektroconvulsieve therapie en wordt veel gebruikt om te onderzoeken zijn therapeutische mechanisme. Bij knaagdieren, zowel acute ECS en chronische ECS behandeling bevorderen van volwassen neurogenesis in het hippocampi en reorganiseren van het neuraal netwerk4,5, die waarschijnlijk zullen bijdragen tot verbeteringen in cognitieve flexibiliteit is. Bovendien, global hoogte van hersenactiviteit door ECS verandert de overvloed van afschriften, zoals een hersenen afgeleide neurotrope factor6en meerdere eiwitten, met inbegrip van metabotropic glutamaat-receptor 17 en de N-methyl-D-aspartaat (NMDA) type glutamaat receptor subeenheden7. Deze wijzigingen zijn betrokken bij het bemiddelen van langdurige wijziging van SYNAPS nummer, structuur en sterkte in de hippocampus7,8,9.
In ECS modellen, wordt elektrische stimulatie bezorgd bij knaagdieren via stereotaxically geïmplanteerde elektroden, hoornvlies elektroden of oor elektroden te roepen gegeneraliseerde tonic-klonische aanvallen10,11. Stereotaxic implantatie van elektroden hersenoperatie impliceert en vereist heel wat tijd aan het verbeteren van de experimentator chirurgische vaardigheden om te minimaliseren van de schade. Minder invasieve hoornvlies elektroden kon veroorzaken hoornvlies schuren en droogheid en anesthesie nodig. Het gebruik van oor-clip elektroden omzeilt deze beperkingen, omdat ze kunnen worden gebruikt op knaagdieren zonder chirurgie of anesthesie en minimale schade veroorzaken. Inderdaad, vonden we dat huidige geleverde te wakker ratten via de elektroden van de oor-clip betrouwbaar induceert stadium 4-5 tonic-klonische aanvallen en verandert van synaptic eiwitten in hun hippocampi10.
Om te onderzoeken de ECS-geïnduceerde overvloed van synaptic eiwitten in de specifieke hersengebieden van de knaagdieren, is het belangrijk om te kiezen van de experimentele methoden die meest geschikt voor de detectie en kwantificering zijn. Subcellular versplintering van de hersenen zorgt voor de ruwe isolatie van oplosbare cytosolische proteïnen; membraaneiwitten; organel-grenzen eiwitten; en zelfs eiwitten in speciale subcellular structuren, zoals de PSD-12,13,14. De PSD is een compact en overzichtelijk subcellular domein in neuronen waarin synaptic eiwitten sterk geconcentreerd op en in de buurt van het postsynaptisch membraan12,13,15 zijn. Het isolement van de PSD is handig voor de studie van synaptic eiwitten verrijkt op de PSD, sinds dynamische veranderingen in de omvang en de functie van postsynaptisch glutamaat receptoren, steigers eiwitten en signaaltransductie eiwitten in de PSD-12 , 15 , 16 , 17 zijn gecorreleerd met synaptische plasticiteit en de synaptopathy waargenomen in diverse neurologische aandoeningen17,18. Een vorige subcellular fractionering methode gebruikt voor het zuiveren van de PSD betrokken het isolement van de breuk wasmiddel onoplosbare uit de ruwe membraan van de hersenen door de differentiële centrifugeren van sacharose verlopen14, 19. de grote uitdaging met deze traditionele methode is dat er grote hoeveelheden knaagdieren brains14,19. Voorbereiding van 10-20 knaagdieren te isoleren van de Fractie van de PSD per behandeling vereist uitgebreide kosten en tijdsinvestering en is niet praktisch haalbaar als er vele behandelingen zijn.
Om te overwinnen deze uitdaging, hebben we een eenvoudiger methode die rechtstreeks isoleert van de PSD-breuk, zonder sacharose kleurovergang centrifugeren20,21, en herzien om te gelden voor PSD isolatie van de hippocampi van een enkele rat aangepast hersenen. Onze kleinschalige PSD fractionering methode levert over 30-50 µg van de PSD-eiwitten uit 2 hippocampi, voldoende voor gebruik in verschillende biochemische tests, met inbegrip van immunoprecipitation en westelijke bevlekken. Westelijke bevlekken toont het succes van onze methode voor het isoleren van de richtlijn betalingsdiensten door te onthullen een verrijking van het postsynaptisch dichtheid eiwit 95 (PSD-95) en de uitsluiting van de presynaptische marker synaptophysin en oplosbare cytoplasmatische eiwit α-tubuline. Onze ECS inductie en kleinschalige PSD fractionering methoden zijn gemakkelijk aan te passen aan andere knaagdieren hersengebieden en bieden een relatief eenvoudige en betrouwbare manier om te evalueren van de effecten van ECS op de expressie van PSD eiwitten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle experimentele procedures, met inbegrip van dierlijke onderwerpen zijn goedgekeurd door de institutionele zorg van dieren en gebruik Comité bij de Universiteit van Illinois te Urbana-Champaign.
1. het behoud van een kolonie van de Rat
- Fokken van Sprague-Dawley ratten (Zie de Tabel van materialen) en handhaven in standaardomstandigheden met een 12-h licht-donker cyclus en ad libitum toegang tot voedsel en water.
- Spenen van de rat pups op postnatale dag (P) 28, en huis ze in groepen van 2-4 mannelijke of vrouwelijke nestgenoten.
- Markeer de staarten van mannelijke ratten met een niet-giftige permanente zwarte marker voor identificatie.
- Weeg de mannelijke ratten 3 keer per week en het opnemen van hun bodyweights.
2. voorbereiding van een ECS-Machine
- 7:30 am, desinfecteren van de Bank in de dierlijke bereidingslokaal en plaats een ECS-machine (pulse generator) op de Bank.
- Plaats een afzonderlijke mannelijke rat met een gewicht van 200-250 g in een schone en lege kooi met een deksel. Herhaal dit voor alle mannelijke ratten te worden behandeld met ECS inductie. Laat de rats koeien voor 30 min.
- Terwijl de ratten zijn fabriekslawaai in hun kooien, een puls generator voor ECS inductie ingesteld op de frequentie van 100 pulsen/s, een pulsbreedte van 0.5 ms, de duur van een schok van 0,5 s, en een stroom van 55 mA(Figuur 1).
- Bereid de puls generator door de "RESET" knop te duwen en ervoor te zorgen dat de "READY" knop brandt. Zorg ervoor dat de oor-clips zijn niet gekoppeld aan een puls generator en druk vervolgens op de knop "SHOCK" voor een paar seconden.
Opmerking: op dit punt, de pulse generator is klaar voor ECS inductie. - Sluit de oor-clips op de pulse generator.
3. de inductie van Acute ECS
Opmerking: Zie Figuur 1B, bovenste paneel.
- NAT van de oor-clips met een steriele zoutoplossing en ervoor te zorgen dat ze zijn verzadigd.
- De oren van een rat met steriele zoutoplossing NAT door inwikkeling ze in zoutoplossing doordrenkte gaas. Zodra ze nat zijn, verwijder het gaas.
- Bevestig één clip per oor, een positie die voorbij de belangrijkste kraakbeen band.
- Op de ECS machine bevestigen dat een ware lus is gevestigd; Als dat niet het geval is, verschijnt een foutbericht of een lezing van "1" op de machine.
- Draag een dik, niet-metalen handschoen. Terwijl de rat zachtjes in een gehandschoende hand, druk op de "SHOCK"-knop voor een paar seconden en langzaam laat de grip op de rat te observeren van de inbeslagneming. Voor de schijn "geen aanvallen" (NS) controle, behandelen de rat identiek maar leveren niet de huidige.
- Koppel de oor-clips zoals clonus begint en het gedrag van de inbeslagneming volgens een herziene Racine schaal22 , waarin "mond en gezicht bewegingen" (fase 1), "hoofd knikken" (fase 2), "voorpoot clonus" opnemen (fase 3), "fokken met voorpoot clonus" (fase 4), en "fokken en vallen met voorpoot clonus" (fase 5). Het beslag moet duren ongeveer 10 s; record de duur van de inbeslagneming met behulp van een timer.
- Terug na beëindiging van de inbeslagneming, de rat naar haar kooi. De rat voor een andere 5 min om er zeker van de terugwinning van de rat uit de vangsten controleren. Houd het afzonderlijk in de kooi waren gehuisvest en de kooi terug te keren naar de recovery room.
- Herhaal de ECS inductie op de volgende rat.
- Toezicht op de rats gedurende de rest van de dag en ten minste eenmaal in de ochtend en eenmaal in de middag de volgende dag totdat zij zijn euthanized voor experimenten.
Opmerking: De ECS inductie methode kan leiden tot klinische symptomen als een incidentele bijwerking, waaraan aandacht moet worden. Bijvoorbeeld, kon het ECS inductie protocol aanvallen die langer dan 15 s en oorzaak onnodig leed aan de ratten duren induceren. In dit geval de inbeslagneming met diazepam (10 mg/kg, i.p.) of pentobarbital (25-30 mg/kg, i.p.) te beëindigen. Als de ratten ontwikkelt respiratoire lijden of ernstige gedrags afwijkingen na stopzetting van de inbeslagneming, euthanaseren hen na inademing kooldioxide gevolgd door onthoofding.
4. de inductie van chronische ECS
Opmerking: Zie Figuur 1B, onderste paneel.
- Induceren een ECS per dag op hetzelfde tijdstip in de ochtend zoals beschreven in stappen 1-3, hierboven, voor zeven opeenvolgende dagen.
- Monitor de rats tweemaal een dag nadat ze worden teruggestuurd naar hun huis kooien.
5. de homogenisering en versplintering van Rat Hippocampi
Opmerking: Zie Figuur 2.
- Voorbereiden van een nieuwe homogenisering buffer (oplossing A), die 320 mM sacharose, 5 mM natrium pyrofosfaat, 1 mM EDTA, 10 mM HEPES pH 7.4 bevat, 200 nM "okadaic acid", en proteaseinhibitors. Filter-steriliseren van de buffer met behulp van filters met een 0,22 µm poriegrootte voor vacuüm filtratie en plaats deze op het ijs.
- Op een gegeven moment punt na acute ECS of chronische ECS (Figuur 1), de rat euthanaseren bij CO2 inademing gedurende 5-10 minuten, gevolgd door onthoofding met behulp van een guillotine.
- Verwijderen van de hersenen en het ontleden van de hippocampi op de metalen plaat geplaatst op het ijs, zoals eerder beschreven23,24.
- Plaats twee hippocampi van een rat op een 30-mm weefselkweek schotel en gehakt ze in kleine stukjes met behulp van schaar.
- Het gehakt hippocampi overbrengen in een handmatige glas homogenizer met behulp van een precisiepipet 1 mL en voeg 1 mL ijskoud homogenisering buffer (oplossing A, stap 5.1). Een ronde stamper invoegen in een glas homogenizer. Terwijl de homogenizer van het glas op ijs is, voorzichtig en gelijkmatig beroerte op en neer op de stamper 10 - 15 keer voor 1 min, tot kleine stukjes hippocampal weefsel verdwijnen.
- Het homogenaat overbrengen in een tube voor het microcentrifuge van 1,7 mL met behulp van een precisiepipet 1 mL en Centrifugeer het homogenaat bij 800 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C te scheiden van het postnuclear supernatant (S1 Fractie) van de pellet met onoplosbare weefsel en kernen (P1 breuk). Breng 50 µL en 950 µL van de S1 breuk twee aparte, nieuwe 1,7 mL microcentrifuge buizen met behulp van een precisiepipet 1 mL en opslaan van deze buizen op ijs. Sla de P1 breuk pellet op ijs.
- Centrifugeer de S1 breuk (950 µL) gedurende 10 minuten op 13,800 x g- en 4 ° C te scheiden van het supernatant (S2 Fractie), verrijkt met cytosolische oplosbare eiwitten, en de pellet (P2 Fractie), verrijkt met membraan-gebonden eiwitten, met inbegrip van synaptosomal eiwitten. De S2 fractie overbrengen in een nieuwe 1,7 mL microcentrifuge met behulp van een precisiepipet 1 mL en sla deze op het ijs.
- Resuspendeer de pellet (P2 breuk) in 498 µL van ijskoude gezuiverd water met behulp van een precisiepipet 1 mL. Voeg 2 µL van 1 M HEPES (pH 7.4) met behulp van een pipet 20 µL om een eindconcentratie van 4 mM HEPES (pH 7.4). Incubeer bij 4 ° C met agitatie voor 30 min. winkel de geresuspendeerde P2 breuk op ijs.
- Bepaal de eiwitconcentratie van de S1, S2, en P2 fracties met behulp van een BCA assay. 50 mM HEPES (pH 7.4) toevoegen aan elke fractie bewaren bij-80 ° C tot gebruik te bereiken van een concentratie van 1 mg/mL, of verwerken van de breuk P2 te isoleren van de PSD.
6. isolatie van de PSD van de ruwe membraan-eiwitoplossing (P2)
- Centrifugeer de P2 breuk (500 µL) voor 20 min op 25.000 x g- en 4 ° C om te scheiden van het lysed supernatant (LS2 breuk) en de lysed pellet (LP1 breuk). De breuk van LS2 overbrengen in een nieuwe 1,7 mL microcentrifuge buis met behulp van een precisiepipet 1 mL en sla deze op het ijs.
- Resuspendeer de pellet LP1 in 250 µL van 50 mM HEPES (pH 7.4) gemengd met 250 µL van 1% wasmiddel in 1 x PBS buffer met behulp van een precisiepipet 1 mL. Incubeer bij 4 ° C met zachte agitatie voor 15 min.
- Centrifugeren van de geresuspendeerde pellet LP1 gedurende 3 uur op 25.000 x g- en 4 ° C te scheiden van het supernatant (niet-PSD Fractie) van de pellet (PSD breuk). Verwijder de bovendrijvende vloeistof tot een microcentrifuge van 1,7 mL koker en resuspendeer de pellet PSD in 100 µL van 50 mM HEPES (pH 7.4) met behulp van een precisiepipet 200 µL.
- Bepaal de concentratie van de eiwitten van de LS2, niet-PSD en PSD fracties met behulp van een BCA assay. 50 mM HEPES (pH 7.4) toevoegen aan elke fractie bewaren bij-80 ° C tot gebruik te bereiken van een concentratie van 1 mg/mL.
Opmerking: Alle oplossingen gebruikt in stap 5-6 (dat wil zeggen, oplossing A, HEPES-buffer en buffer PBS) moeten worden gemaakt met gezuiverde water vrij van Ionische en organische verontreinigende stoffen en deeltjes.
7. het westelijke bevlekken
- Ontdooi elke eiwitoplossing op ijs. 12 µL van elke breuk (S2 P2 en PSD in 1 mg/mL) overbrengen naar een nieuwe 1,7 mL microcentrifuge buis met behulp van een precisiepipet 20-µL.
- Voeg 3 µL van 5 x SDS monster buffer en Incubeer bij 75 ° C gedurende 30 minuten in een waterbad. Koel het monster tot kamertemperatuur (RT).
- 10 µL van het eiwit monster in elk putje van 4-20% helling 15-well kam SDS-polyacrylamide gel elektroforese (SDS-PAGE) gel met behulp van een precisiepipet 20 µL laden. Stel de gel in het apparaat van de SDS-pagina en op 80-100 V in rijklare buffer (0,1% SDS; 25 mM Tris en 190 mM glycine pH 8.3).
Opmerking: Elke gel moet bevatten EiwitSteekproeven van NS ratten en ECS ratten op verschillende tijdstippen na acute of chronische ECS. - De eiwitten van de SDS-pagina gel overdracht naar een membraan polyvinyl difluoride (PVDF) in het apparaat van de overdracht in 25-30 V (60 mA) voor 9-12 h in overdracht buffer (25 mM Tris, 190 mM glycine en 20% methanol; pH 8.3).
- Verwijder het membraan PVDF uit het apparaat van de overdracht en wassen in Tris-gebufferde zoutoplossing (TBS) gedurende 5 minuten op een multifunctionele rotator op RT.
- Blokkeren van de membraan in melk 5% en 0,1% Tween-20 in TBS voor 1 h. Incubeer het in primaire antilichamen (tabel 1) in wassen buffer (melk van 1% en 0,1% Tween-20 in TBS) overnachting op een multifunctionele rotator bij 4 ° C (Zie de Tabel van materialen voor verdunningen).
- Wassen van het membraan 4 keer voor elke 10 min in was buffer en het vervolgens uit te broeden met horseradish peroxidase (HRP)-geconjugeerd secundaire antilichamen in buffer voor 1 h wassen op een multifunctionele rotator op RT.
- Het wassen van het membraan 4 keer voor elke 10 min in was buffer en daarna bij TBS voor 5 min.
- Incubeer het membraan met verbeterde chemifluorescence substraat voor 1 min en worden blootgesteld aan een X-ray film. Ontwikkelen van de belichte film met een film-processor.
8. kwantificering van Western Blots
- Scan de Western blot als een TIFF-bestand en sla het bestand op de computer.
- De westelijke vlek-bestand openen in het programma ImageJ als een afbeelding in grijswaarden, onder "Bestand," "Afbeelding openen," pijl "grijstinten."
- Kies het rechthoekig gereedschap in de werkbalk ImageJ en teken een rechthoek dat betrekking heeft op een enkele westelijke vlek band van een proteïne van belang.
- Onder "Analyze," hit "Maatregel" om het gebied en de gemiddelde dichtheid van een geselecteerde band te verkrijgen.
- Verplaats de rechthoek naar een achtergrondgebied zonder het wijzigen van de grootte en vorm. Herhaal stap 8.4 op het gebied en de gemiddelde dichtheid van een achtergrond.
- Aftrekken van de waarde van de gemiddelde dichtheid van een band van de achtergrond van die van een westelijke vlek band, waardoor de dichtheid van de achtergrond-afgetrokken band van de proteïne van belang.
- Herhaal stap 8.2-8,6 voor alle westelijke vlek bands van belang.
- Verdeel de dichtheid van de achtergrond-afgetrokken band van de proteïne van belang door de dichtheid van de achtergrond-afgetrokken band van een huishouding gene product, zoals α-tubuline; deze stap levert de genormaliseerde waarde van de proteïne van belang.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Met behulp van de gedetailleerde procedure gepresenteerd hier, een elektrische schok (55 mA, 100 pulsen/s voor 0,5 s) geleverd via oor-clip elektroden geïnduceerde niet-terugkerende stadium 4-5 tonic-klonische aanvallen bij ratten (Figuur 1A-B). Een totaal 8 van ratten ontvangen van acute ECS inductie en weergegeven 4-5e etappe tonic-klonische aanvallen. De aanvallen duurde ongeveer 10 s en alle ratten binnen 1-2 min van inbeslagneming stopzetting geïnd. Schijnvertoning "geen aanvallen" ratten niet ontvangen een elektrische schok en daarom deed niet aanvallen kunnen weergeven. Een totaal van 4 sham ratten werden gebruikt. Voor chronische ECS inductie, de ratten kreeg een elektrische schok per dag gedurende 7 opeenvolgende dagen en 4-5e etappe tonic-klonische aanvallen op elke elektrische schok (Figuur 1A-B) weergegeven. Een totaal 8 van ratten ontvangen chronische ECS inductie en een totaal van 4 sham ratten werden gebruikt als "geen aanvallen" ratten. Hoewel de meeste ratten die chronische ECS ontvangen waren gedragsgestoorde niet te onderscheiden van sham "geen aanvallen" ratten, een paar ontwikkelde lichaam tremoren en verminderd verkennend activiteit door de 7th elektrische schok.
Om te onderzoeken als ECS-geïnduceerde global hoogte van activiteit eiwituitdrukking in de hippocampi wijzigt, werden ratten opgeofferd na 3 uur en 24 uur na acute ECS en na 24 uur en 96 uur na de laatste ECS in chronische ECS behandeling (Figuur 1B). Twee hippocampi van elk rat werden snel ontleed en onderworpen aan ons geoptimaliseerde kleinschalige fractionering protocol (Figuur 2). De eerste homogenaat van twee hippocampi vrij van onoplosbare weefsel en kernen (S1 Fractie) werd opnieuw gecentrifugeerd bij 13,800 x g gedurende 10 minuten om te scheiden van de bovendrijvende substantie die oplosbaar cytoplasmatische eiwitten bevatten (S2 Fractie) van de ruwe membraan pellet bevat synaptosomes (P2 Fractie) (Figuur 2). Onze westelijke vlek ontdekt cytoplasmatische eiwit α-tubuline de S2 breuken, maar niet de P2 breuken, van de hippocampi van ratten behandeld met acute en chronische ECS (Figuur 3 en Figuur 4), demonstreren de succesvolle versplintering van cytosolische oplosbare eiwitten uit pellets ruwe membraan.
PSD95 is een lid van de familie van de membraan-geassocieerde guanylaat kinase (MAGUK) en een basiscomponent van de PSD-12,18,25. PSD95 en NMDA receptor subeenheid GluN2B werden ontdekt uitsluitend in de P2 breuken, maar niet de S2 breuken (Figuur 3 en Figuur 4). Sterkere uitdrukking van een andere glutamaterge α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic zuur (AMPA) receptor subeenheid GluA2 werd ontdekt in de P2 breuken ten opzichte van de S2 breuken in de hippocampi ( Figuur 4enFiguur 3 ) die aangeeft dat postsynaptisch membraaneiwitten zijn verrijkt met de pellets ruwe membraan P2 breuk. Interessant, werden synaptic vesikel eiwit synaptophysin en integraal membraan eiwit striatale verrijkt Tyrosine fosfatase 61 (stap61)26 ontdekt even in de S2 en P2 breuken (Figuur 3 en Figuur 4). Gezien de kleine omvang van synaptische vesikels-met een gemiddelde diameter van 39 nm27 en Endosomen, het centrifugeren te isoleren van de ruwe membraan pellet (P2 Fractie) misschien onvoldoende geweest om alle synaptische vesikels en Endosomen pellet. Deze resultaten geven samen dat onze ruwe fractionering protocol membraan-gebonden eiwitten en transmembraan eiwitten die niet gekoppeld met synaptische vesikels, en eventueel met Endosomen in de ruwe membraan P2 fractie zijn kan verrijken.
Om te onderzoeken als ECS-geïnduceerde global hoogte van activiteit de expressie van postsynaptisch eiwitten in de hippocampi wijzigt, de ruwe membraan P2 breuk was lysed in ijskoud water, geresuspendeerde in HEPES-buffer en gecentrifugeerd bij 25.000 x g gedurende 20 min te isoleren de lysed pellet (LP1) (Figuur 2). De pellet LP1 was geresuspendeerde in HEPES-buffer met 1% Triton X-100 wasmiddel en gecentrifugeerd bij 25.000 x g meer dan 3 h voor de PSD pellet (Figuur 2). De daaropvolgende westelijke vlek van de PSD-breuken gedetecteerd PSD95, GluN2B en GluA2 (Figuur 3 en 4 van de figuur), die bekend staan postsynaptisch eiwitten17,25,28. Echter de PSD-breuken α-tubuline ontbrak en, belangrijker, synaptophysin van de presynaptische marker (Figuur 3 en Figuur 4). STAP61, die dephosphorylates GluN2B en GluA2 en fungeert als hun negatieve regelgever29,30,31, werd niet gevonden in de PSD-breuken ( Figuur 4enFiguur 3 ) in overeenstemming met het recente verslag demonstreren de synaptische uitsluiting van stap61, gemedieerd door PSD95 verrijkt in de PSD-26. Over het geheel genomen is deze resultaten wijzen erop dat de methode van onze kleinschalige fractionering met succes PSD eiwitten uit de ruwe membraan P2 afvalfractie isoleert.
De kwantificering van het westelijke bevlekken bleek dat GluN2B expressie in de P2-fractie was ongewijzigd maar een stijgende trend in de PSD-breuk na 3 uur en 24 uur na acute ECS weergegeven (n = 4) (Figuur 3B). GluA2 expressie is niet gewijzigd in zowel de P2 en PSD breuken na 3 uur en 24 uur na acute ECS (Figuur 3C). Na 24 uur en 96 uur na chronische ECS, GluN2B expressie weergegeven van een dalende trend in de Fractie P2 en werd aanzienlijk teruggebracht in de PSD-fractie (24 h: p < 0,05, n = 4; 48 h: p < 0,01, n = 4) (Figuur 4B). In tegenstelling, chronische ECS beïnvloedde niet GluA2 expressie in de P2 en PSD breuken (n = 4) (Figuur 4C).
Figuur 1 : Schema voor de inductie van Acute ECS en chronische ECS. (A) A rat was aangesloten op een puls generator via oor-clip-elektroden en een elektrische schok (55 mA, 100 pulsen/s voor 0,5 s) werd toegepast om te ontlokken stadium 4-5 tonic-klonische aanvallen. (B) Acute ECS is verkregen door een elektrische schok. Chronische ECS was ontlokte door een elektrische schok per dag gedurende 7 opeenvolgende dagen. De punten van de tijd weergegeven vertegenwoordigen de duur na de inductie van acute ECS of de laatste ECS voor chronische ECS inductie vóór dissectie van de hippocampi. "Geen aanvallen" Sham (NS) controle ratten identiek waren behandeld maar heb niet ontvangen een elektrische schok. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : Workflow van Subcellular fractionering te isoleren van de S2 P2 en de PSD breuken uit de Hippocampi van een enkele Rat. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: Onderzoek van Synaptic eiwitten in Hippocampal S2 P2 en PSD breuken uit de ratten die ontvangen NS of Acute ECS. (A) representatieve Western blots tonen de eiwituitdrukking NMDA receptor subeenheid GluN2B, AMPA receptor GluA2 en stap61 in de S2, P2, en PSD breuken uit de hippocampi van sham "geen inbeslagneming" (NS) ratten en ratten die ontvangen acute ECS. De cytoplasmatische-oplosbaar eiwit α-tubuline wordt verrijkt in de Fractie van de S2. Synaptophysin is een eiwit presynaptische blaasje en is verrijkt in het membraan van het ruw P2 breuk, maar niet in de PSD-Fractie. PSD-95 is verrijkt met zowel de P2 en PSD breuken. (B-C) Kwantificering van GluN2B (B) en GluA2 (C) in de P2 en PSD breuken 3 en 24 h na acute ECS (n = 4 ratten per tijdstip). GluN2B en GluA2 expressie in de P2-fractie was genormaliseerd naar α-tubuline in de Fractie van de S2. GluN2B en GluA2 expressie in de PSD-fractie was genormaliseerd naar PSD-95 in de PSD-Fractie. De gegevens worden gepresenteerd als het percentage ± SEM. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: Onderzoek van Synaptic eiwitten in Hippocampal S2 P2 en PSD breuken uit de ratten die ontvangen NS of chronische ECS. Vertegenwoordiger Western vlekken van α-tubuline; synaptophysin; STAP61; en postsynaptisch eiwitten, met inbegrip van PSD95, GluN2B en GluA2, in de S2 P2 en PSD breuken uit de hippocampi van sham "geen inbeslagneming" (NS) ratten en ratten die ontvangen chronische ECS. De cytoplasmatische-oplosbaar eiwit α-tubuline wordt verrijkt in de Fractie van de S2. Synaptophysin is een eiwit presynaptische blaasje en is verrijkt in het membraan van het ruw P2 breuk, maar niet in de PSD-Fractie. PSD-95 is verrijkt met zowel de P2 en PSD breuken. (B-C) Kwantificering van GluN2B (B) en GluA2 (C) in de P2 en PSD breuken op 24 en 96 h na chronische ECS (n = 4 ratten per tijdstip). GluN2B en GluA2 expressie in de P2-fractie was genormaliseerd naar de α-tubuline in de Fractie van de S2. GluN2B en GluA2 expressie in de PSD-fractie was genormaliseerd naar PSD-95 in de PSD-Fractie. De gegevens worden gepresenteerd als percentage ± SEM; * p < 0,05, ** p < 0,01 in vergelijking met controle (ANOVA en van Tukey post hoc test). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| Breuk | Eiwitoplossing | Eiwit marker |
| P1 | Nucleaire | Histon H1 |
| S1 | Cytosol/membrances | a-tubuline (cytoskelet) en GAPDH (cytosol) |
| P2 | Ruwe synaptosomes | AMPA en NMDA receptor subeenheden |
| S2 | Cytosol/licht membrances | GAPDH (cytosol) en LAMP1 (lysosoom) |
| Synaptosomal membraan | Synaptosome/mitochondriën | AMPA en NMDAR receptor subeenheden, Synaptophysin (presynaptische marker) |
| PSD | PSD | AMPA en NMDA receptor subeenheden, PSD95, PICK1, CaMKII |
Tabel 1: Lijst van eiwit Markers en antilichamen te onderscheiden Subcellular breuken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier beschrijven we een ECS inductie methode bij ratten die de globale stimulatie van neuronale activiteit in hun hippocampi lokt. ECS is een dierlijk model van elektroconvulsieve therapie, die klinisch wordt gebruikt voor de behandeling van drug vuurvaste depressieve stoornissen in mensen1,2,3. Ondanks gebruik van elektroconvulsieve therapie voor de behandeling van ernstige depressie, is de precieze onderliggende mechanisme onduidelijk. Omdat ECS anti-depressant-achtig gedrag bij knaagdieren induceert en hippocampal neurogenese4,32 stimuleert, ECS uitgebreid is gebruikt om te onderzoeken of nieuwe neuronen volwassene-geboren in de dentate gyrus van de hippocampus bijdragen tot een anti-depressivum gedrag5,32.
ECS induceert milde tot ernstige veralgemeende tonic-klonische aanvallen bij knaagdieren bij de huidige levering via stereotaxically geïmplanteerde elektroden, hoornvlies elektroden of oor-clip elektroden33,34. EEG opnamen bij patiënten is gebleken dat bilaterale elektrische stimulatie opvallender en meer gegeneraliseerde aanvallen veroorzaakt dan unilaterale stimulatie35,,36 doet. In onze ECS inductie methode, worden tonic-klonische aanvallen veroorzaakt door de huidige levering via noninvasive oor-clip elektroden aangesloten op beide oren, het nabootsen van aanvallen bij mensen opgeroepen door bilaterale stimulatie36. Hoewel we nog niet gecontroleerd dat de werkzaamheid van ECS in de rats waarop sedatie of narcose wordt toegepast, is het mogelijk dat de verdovende drugs te geven aan de ratten kan verminderen de mate van vangsten geïnduceerd door elektrische stimulatie, die misschien wel vanwege het feit dat anesthesie staat is fysiologisch geassocieerd met verbeterde remmende en vochtige excitatory Toon in de hersenen-netwerk. Daarnaast is de kritische stap in de ECS inductie methode experimenteel bellen de stroomsterkte te ontlokken stadium 4-5 generalized tonic - klonische aanvallen op basis van de leeftijd, het gewicht en de soort woelmuis. Onze ECS inductie methode is geoptimaliseerd voor stadium 4-5 vangsten inducerende binnen een paar seconden in wakker mannelijke Sprague-Dawley ratten met een gewicht van 200-250 g. Als de ratten onder verdoving staat worden gebruikt voor ECS inductie, moeten de intensiteit, duur en frequentie van het leveren van huidige worden gewijzigd voor de succesvolle inductie van inbeslagneming variërend van fase 4 tot en met 5.
ECS biedt ook het voordeel van stimuleren van hyperactiviteit bij neuronen en veroorzaakt acute voorbijgaande vangsten met zeer lage sterfte33, in tegenstelling tot chemoconvulsants, met inbegrip van pilocarpine en kaïniet, die status epilepticus induceren en veroorzaken chronische manifestatie van spontane recidiverende aanvallen en ernstige histologische wijzigingen37,38. Hoewel ECS routinematig tot en met scherm anti-epileptische geneesmiddelen33,34 gebruikt is, acute ECS chronische ECS niet resulteren in het genereren van chronische epilepsie en dus in een dierlijk model kan niet worden gebruikt om te studeren van epileptogenese. In plaats daarvan, ECS heeft veel gewerkt te onderzoeken in hoeverre waarnaar de brede verheffing van hersenactiviteit verandert expressie en/of posttranslationele modificaties van synaptic eiwitten in vivo, die aan de voortdurende veranderingen in synaptic bijdragen sterkte en structuren (Figuur 3 en Figuur 4)10,40. In deze studie gebruikt wij alleen mannelijke ratten uit te sluiten van de onverwachte gevolgen van de estrus fase van de cyclus van vrouwelijke ratten op het bedrag van de PSD eiwit na de ECS. Echter werd naar voren gebracht dat er geen verschil van de seks in de steigers eiwitten is, met inbegrip van de PSD-95 en SAP102 in de PSD-regio van de frontale cortex en hippocampus39, hetgeen impliceert dat hormonale wijzigingen bestuur estrus cyclus kunnen geen invloed op de basale hoeveelheid PSD eiwitten.
Meerdere methoden zijn tewerkgesteld te onderzoeken in hoeverre waarnaar ECS veranderingen in neurogenese, synaptogenese en synaptische plasticiteit5,6,7,8,9, induceert 11 , 40. elektrofysiologische opnames van excitatory postsynaptisch huidige (EPSC) worden veel gebruikt om te ontdekken de wijzigingen in de synaptische kracht van glutamaterge excitatory synapses21. Bijvoorbeeld, miniatuur EPSC opnamen is gebleken dat de homeostatische schaalverkleining excitatory synaptic kracht in de corticale piramidale neuronen van lagen II-III van muizen na acute ECS41. Echter, de identificatie van synaptic eiwitten die tot de ECS-geïnduceerde synaptische plasticiteit bijdragen is uitdagend omdat elektrofysiologische opnamen moeten worden gekoppeld met de genetische knock-out of knock-down van specifieke kandidaat synaptic eiwitten. Veranderingen in het niveau van glutamaat receptoren op het postsynaptisch membraan en synaptische eiwitten, verrijkt met de PSD regelen de sterkte en de werkzaamheid van excitatory synaptische transmissie17,18,25. Hoewel immunohistochemistry kan worden gebruikt voor het onderzoeken van de ECS-geïnduceerde veranderingen in de expressie van synaptic eiwitten, deze techniek slechts 1-2 kandidaat synaptic eiwitten tegelijk kunt bekijken en vereist goed gevalideerde antilichamen die specifiek herkennen zonder niet-specifieke kleuring.
De subcellular fractionering van hersenweefsel in combinatie met het westelijke bevlekken biedt voordelen ten opzichte van de elektrofysiologie en immunohistochemistry bij het identificeren van synaptic eiwitten die worden gewijzigd door ECS. De subcellular fractionering van hersenweefsel is een snelle en ruwe biochemische methode om oplosbare cytosolische eiwitten (S2 Fractie) van ruwe membranen (P2 Fractie), met inbegrip van ER en Golgi membranen, membraan-gebonden organellen, plasma membranen, scheiden en Synaptic terminal membranen die tot en met formulier synaptosomes42,43,44 verzegelen. De PSD-fractie verder kan worden geïsoleerd uit de P2 te verrijken de synaptische eiwitten42,43,44. De onbevooroordeelde Proteoom-analyse van de PSD-breuk kon identificeren alle PSD eiwitten waarvan niveaus worden gewijzigd door ECS. Westelijke bevlekken kan uitgevoerd worden snel te onderzoeken van de wijzigingen van de expressie van de PSD-eiwitten, die gemakkelijk kunnen worden geïdentificeerd van niet-specifieke banden.
De vorige methode van hersenen fractionering vereist een grote hoeveelheid knaagdier hersenen weefsel42,43,44, waardoor deze techniek uitdagend voor gebruik bij de behandeling van oplosbare of membraaneiwitten van een individu knaagdier hersenen of een specifieke hersenen regio van een enkele hersenen. Er is een toenemende vraag naar kwantitatief vergelijken de Proteoom uit één hersenen regio naar de andere en van een dier controle een transgene dieren of een dier dat een specifieke behandeling heeft ondergaan. Daarom hebben we herzien en de traditionele hersenen fractionering methode om te isoleren van de ruwe oplosbaar en membraan breuken uit twee hippocampi voor een enkele rat geoptimaliseerd. Ons kleinschalige ruwe fractionering-protocol met succes geïsoleerd ruwe P2 membraan breuken uit cytosolische S2 oplosbare breuken, zoals aangegeven door het ontbreken van cytoplasmatische eiwit α-tubuline in de P2 breuken, overwegende dat de membraan-gebonden PSD95 werd ontdekt de P2 maar niet S2 breuken (Figuur 3A en Figuur 4A). Met behulp van de methode beschreven hier, hebben we kwantitatief aangetoond dat acute ECS aanzienlijk stap61 expressie verhoogt en tyrosine fosforylering van de substraten, GluN2B en de extracellulaire signaal-gereglementeerde kinase 1/2 in de ruwe vermindert membraan P2 Fractie van rat hippocampi bij 48 h na acute ECS10.
Onverwacht, de S2 breuken bevatte synaptophysin; STAP61; en, in veel mindere mate, GluA2 (Figuur 3A en Figuur 4A). STAP61 is een geglycosyleerde integraal membraan eiwit26 die is gekoppeld aan het endoplasmatisch reticulum (ER) en PSD-45. Het is mogelijk dat het centrifugeren te isoleren van de ruwe membraan pellet (P2 Fractie) wellicht niet voldoende om alle synaptische vesikels met synaptosomes, evenals Endosomen pellet geweest en met GluA2 en stap61lysosomen. Desalniettemin duidelijk verrijking van GluN2B, GluA2 en PSD95 en het ontbreken van α-tubuline in de P2 breuken aangeven dat onze fractionering protocol membraan-gebonden eiwitten en transmembraan eiwitten die niet gekoppeld aan de synaptische vesikels zijn kan verrijken en Endosomen in de ruwe membraan P2-Fractie.
Hoewel het ruwe membraan P2 breuk synaptosomes bevat, is een beperking van onderzoekende activiteit-afhankelijke wijzigingen van synaptic eiwitten in de P2-fractie dat de exacte locatie van hun wijzigingen kan niet worden bepaald. Als synaptic eiwitten, verrijkt met de PSD worden vastgesteld moest, kan dan verder biochemische fractionering worden gebruikt om te isoleren van de PSD. De vorige methode van PSD fractionering vereist een grote hoeveelheid knaagdier hersenweefsel (dat wil zeggen, 10-20 knaagdier hersenen) en sucrose verlopen42,43,44. Omdat deze traditionele methode ontoereikend is om een voldoende hoeveelheid van de PSD-breuk van twee hippocampi van een enkele rat isoleren, hebben we een eenvoudiger methode die rechtstreeks de PSD-breuk, zonder een sacharose kleurovergang20,21 isoleert aangepast . Deze methode levert over 30-50 µg van het PSD-eiwit, voldoende is voor diverse biochemische tests, met inbegrip van westelijke bevlekken. Onze methode verrijkt PSD95, GluN2B en GluA2, waarvan bekend is moet worden geconcentreerd in de PSD-Fractie, en detecteert wijzigingen in de GluN2B expressie in PSD fractie na chronische ECS inductie (Figuur 3 en Figuur 4).
Hier, bleek onze kwantitatieve westelijke vlekkenanalyse geen significante verandering in GluA2 expressie in de P2 en PSD breuken na 3 uur en 24 uur na acute ECS (Figuur 3C). De GluN2B uitdrukking in de P2-fractie was ongewijzigd maar weergegeven van een stijgende trend in de PSD-fractie na 3 uur en 24 uur na acute ECS (Figuur 3,B), wat suggereert de mogelijke differentiële regulering van synaptic versus extrasynaptic GluN2B-bevattende NMDA receptoren. We hebben ook vastgesteld dat GluN2B expressie weergegeven van een dalende trend in de P2-fractie na chronische ECS en werd aanzienlijk teruggebracht in de PSD-fractie 24 en 96 uur na chronische ECS (Figuur 4B). Hoewel zeer speculatief, kan dergelijke verwijdering van GluN2B van de PSD na herhaalde inductie van ECS worden gemedieerd door meerdere mechanismen, met inbegrip van directe internalisering van de PSD membraan of laterale verspreiding naar extrasynaptic sites. Gezien onze vorige verslag dat langdurige verbetering van neuronale activiteit aanzienlijk verhoogt stap61 expressie en vermindert de Tyr-fosforylatie van GluN2B in de P2 breuken van gekweekte hippocampal neuronen46, onze bevindingen suggereren dat een afname van de GluN2B expressie in de P2 en de PSD breuken na chronische ECS kunnen waarschijnlijk worden versterkt stap61 expressie en de latere verwijdering van GluN2B uit het extrasynaptic membraan.
Kortom, we hebben laten zien dat onze kleinschalige PSD fractionering methode, in combinatie met een ECS inductie protocol, stelt ons in staat om te differentiëren in vivo de activiteit-afhankelijke regulering van glutamaat receptoren op het postsynaptisch membraan ten opzichte van de totale plasma membranen, met inbegrip van de extrasynaptic membranen. Dit protocol kan gemakkelijk worden toegepast op elke synaptic eiwitten bij excitatory synapsen en kan worden gewijzigd voor andere knaagdieren hippocampi of andere hersengebieden van de door het aanpassen van het volume van elke oplossing gebaseerd op het gewicht van het weefsel. Dus onze kleinschalige PSD fractionering methode is veelzijdig en voor toekomstige toepassingen te onderzoeken van de veranderingen in vivo in de postsynaptisch eiwitten in elk dier op genetische, farmacologische of mechanische behandeling kan worden aangenomen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.
Acknowledgments
De auteurs bedanken dat Dr. Eric C. Bolton te gebruiken zijn centrifuge voor fractionering en Dr. Graham H. Diering in Dr. Richard L. Huganir lab aan de John Hopkins University voor het verstrekken van ons met het kleinschalige protocol voor de PSD fractionering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Spargue-Dawley rat | Charles River Laboratories | ECS supplies | |
| A pulse generator | Ugo Bsile, Comerio, Italy | 57800 | ECS supplies |
| MilliQ water purifying system | EMD Millipore | Z00Q0VWW | Subcellular fractionation supplies |
| Sucrose | Em science | SX 1075-3 | Subcellular fractionation supplies |
| Na4O7P2 | SIGMA-ALDRICH | 221368 | Subcellular fractionation supplies |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | SIGMA-ALDRICH | E9884 | Subcellular fractionation supplies |
| HEPES | SIGMA-ALDRICH | H0527 | Subcellular fractionation supplies |
| Okadaic acid | TOCRIS | 1136 | Subcellular fractionation supplies |
| Halt Protease Inhibitor | Thermo Scientific | 78429 | Subcellular fractionation supplies |
| NaVO3 | SIGMA-ALDRICH | 72060 | Subcellular fractionation supplies |
| EMD Millipore Sterito Sterile Vacuum Bottle-Top Filters | Fisher Scientific | SCGPS05RE | Subcellular fractionation supplies |
| Iris Scissors | WPI (World Precision Instruments) | 500216-G | Subcellular fractionation supplies |
| 30 mm tissue culture dish | Fisher Scientific | 08-772B | Subcellular fractionation supplies |
| Glass homogenizer and a Teflon pestle | VWR | 89026-384 | Subcellular fractionation supplies |
| 1.7 mL microcentrifuge tube | DENVILLE SCIENTIFIC INC. | C2170 (1001002) | Subcellular fractionation supplies |
| Sorvall Legend XT/XF Centrifuge | Thermo Fisher | 75004521 | Subcellular fractionation supplies |
| Pierce BCA Protein Assay Reagent A, 500 mL | Thermo Fisher | #23228 | Western blot supplies |
| Pierce BCA Protein Assay Reagent B, 25 mL | Thermo Fisher | #1859078 | Western blot supplies |
| SDS-polyacrylamide gel (SDS-PAGE) | BIO-RAD | #4561086S | Western blot supplies |
| Running Buffer | Made in the lab | Western blot supplies. | |
| Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophorsis Cell for MiniPrecast Gels, 4-gel | BIO-RAD | #1658004 | Western blot supplies |
| Polyvinyl difluoride (PVDF) membrane | Milipore | IPVH00010 | Western blot supplies |
| Transfer Buffer | Made in the lab | Western blot supplies. | |
| Tris-base | Fisher Scientific | BP152-1 | Western blot supplies |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-5 | Western blot supplies |
| Sodium dodecyl sulfate | SIGMA-ALDRICH | 436143 | Western blot supplies |
| Methanol | Fisher Scientific | A454-4 | Western blot supplies |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | detergent for PSD isolation |
| Mini Trans-Blot Module | BIO-RAD | #1703935 | Western blot supplies |
| Nonfat instant dry milk | Great value | Western blot supplies | |
| Multi-purposee rotator | Thermo Scientific | Model-2314 | Western blot supplies |
| Hyblot CL Autoradiography Film | DENVILLE SCIENTIFIC INC. | E3018 (1001365) | Western blot supplies |
| Enhanced chemifluorescence substrate | Thermo Scientific | 32106 | Western blot supplies |
| a Konica SRX-101A film processor | KONICA MINOLTA | SRX-101A | Western blot supplies |
| Name of Antibody | |||
| PSD-95 | Cell Signaling | #2507 | Antibody dilution = 1:500 - 1,000, time = 9 - 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Rabbit |
| Synaptophysin | Cell Signaling | #4329 | Antibody dilution = 1:500 - 1,000, time = 9 - 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Rabbit |
| alpha-Tubulin | Santacruz | SC-5286 | Antibody dilution = 1:500 - 1,000, time = 9 - 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Mouse |
| GluN2B | Neuromab | 75-097 | Antibody dilution = 1:500 - 1,000, time = 9 - 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Mouse |
| GluA2 | Sigma-aldrich | Sab 4501295 | Antibody dilution = 1:500 - 1,000, time = 9 - 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Rabbit |
| STEP | Santacruz | SC-23892 | Antibody dilution = 1:200 - 500, time = 9 - 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Mouse |
| Peroxidas AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoReserch laboratory | 715-035-150 | Antibody dilution = 1:2,000-5,000, time = 1 h, Reaction Temperature = RT, Host Species = Donkey |
| Peroxidas AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoReserch laboratory | 711-035-152 | Antibody dilution = 1:2,000-5,000, time = 1 h, Reaction Temperature = RT, Host Species = Donkey |
References
- Dierckx, B., Heijnen, W. T., van den Broek, W. W., Birkenhager, T. K. Efficacy of electroconvulsive therapy in bipolar versus unipolar major depression: a meta-analysis. Bipolar Disord. 14 (2), 146-150 (2012).
- McClintock, S. M., et al. Multifactorial determinants of the neurocognitive effects of electroconvulsive therapy. J ECT. 30 (2), 165-176 (2014).
- Jelovac, A., Kolshus, E., McLoughlin, D. M. Relapse following successful electroconvulsive therapy for major depression: a meta-analysis. Neuropsychopharmacology. 38 (12), 2467-2474 (2013).
- Inta, D., et al. Electroconvulsive therapy induces neurogenesis in frontal rat brain areas. PLoS One. 8 (7), 69869 (2013).
- Segi-Nishida, E., Warner-Schmidt, J. L., Duman, R. S. Electroconvulsive seizure and VEGF increase the proliferation of neural stem-like cells in rat hippocampus. Proc Natl Acad Sci USA. 105 (32), 11352-11357 (2008).
- Zetterstrom, T. S., Pei, Q., Grahame-Smith, D. G. Repeated electroconvulsive shock extends the duration of enhanced gene expression for BDNF in rat brain compared with a single administration. Brain Res Mol Brain Res. 57 (1), 106-110 (1998).
- Altar, C. A., et al. Electroconvulsive seizures regulate gene expression of distinct neurotrophic signaling pathways. J Neurosci. 24 (11), 2667-2677 (2004).
- Ploski, J. E., Newton, S. S., Duman, R. S. Electroconvulsive seizure-induced gene expression profile of the hippocampus dentate gyrus granule cell layer. J Neurochem. 99 (4), 1122-1132 (2006).
- Pusalkar, M., et al. Acute and Chronic Electroconvulsive Seizures (ECS) Differentially Regulate the Expression of Epigenetic Machinery in the Adult Rat Hippocampus. Int J Neuropsychopharmacol. 19 (9), (2016).
- Jang, S. S., Royston, S. E., Lee, G., Wang, S., Chung, H. J. Seizure-Induced Regulations of Amyloid-beta, STEP61, and STEP61 Substrates Involved in Hippocampal Synaptic Plasticity. Neural Plast. 2016 (2123748), 1-13 (2016).
- Limoa, E., et al. Electroconvulsive shock attenuated microgliosis and astrogliosis in the hippocampus and ameliorated schizophrenia-like behavior of Gunn rat. J Neuroinflammation. 13 (1), 230 (2016).
- Vinade, L., et al. Affinity purification of PSD-95-containing postsynaptic complexes. J Neurochem. 87 (5), 1255-1261 (2003).
- Dosemeci, A., Tao-Cheng, J. H., Vinade, L., Jaffe, H. Preparation of postsynaptic density fraction from hippocampal slices and proteomic analysis. Biochem Biophys Res Commun. 339 (2), 687-694 (2006).
- Westmark, P. R., Westmark, C. J., Jeevananthan, A., Malter, J. S. Preparation of Synaptoneurosomes from Mouse Cortex using a Discontinuous Percoll-Sucrose Density Gradient. J Vis Exp. (3196), e1-e9 (2011).
- Sheng, M. Molecular organization of the postsynaptic specialization. Proc Natl Acad Sci USA. 98 (13), 7058-7061 (2001).
- Sheng, M., Hoogenraad, C. C. The postsynaptic architecture of excitatory synapses: a more quantitative view. Annu Rev Biochem. 76, 823-847 (2007).
- Ehrlich, I., Malinow, R. Postsynaptic density 95 controls AMPA receptor incorporation during long-term potentiation and experience-driven synaptic plasticity. J Neurosci. 24 (4), 916-927 (2004).
- Schnell, E., et al. Direct interactions between PSD-95 and stargazin control synaptic AMPA receptor number. Proc Natl Acad Sci USA. 99 (21), 13902-13907 (2002).
- Bermejo, M. K., Milenkovic, M., Salahpour, A., Ramsey, A. J. Preparation of synaptic plasma membrane and postsynaptic density proteins using a discontinuous sucrose gradient. J Vis Exp. (91), e51896 (2014).
- Tan, H. L., Queenan, B. N., Huganir, R. L. GRIP1 is required for homeostatic regulation of AMPAR trafficking. Proc Natl Acad Sci USA. 112 (32), 10026-10031 (2015).
- Diering, G. H., Gustina, A. S., Huganir, R. L. PKA-GluA1 coupling via AKAP5 controls AMPA receptor phosphorylation and cell-surface targeting during bidirectional homeostatic plasticity. Neuron. 84 (4), 790-805 (2014).
- Luttjohann, A., Fabene, P. F., van Luijtelaar, G. A revised Racine's scale for PTZ-induced seizures in rats. Physiol Behav. 98 (5), 579-586 (2009).
- Chiu, K., Lau, W. M., Lau, H. T., So, K. -F., Chang, R. C. -C. Micro-dissection of Rat Brain for RNA or Protein Extraction from Specific Brain Region. J Vis Exp. (7), e269 (2007).
- Hagihara, H., Toyama, K., Yamasaki, N., Miyakawa, T. Dissection of Hippocampal Dentate Gyrus from Adult Mouse. J Vis Exp. (1543), e1-e6 (2009).
- Kim, M. J., et al. Synaptic accumulation of PSD-95 and synaptic function regulated by phosphorylation of serine-295 of PSD-95. Neuron. 56 (3), 488-502 (2007).
- Won, S., Incontro, S., Nicoll, R. A., Roche, K. W. PSD-95 stabilizes NMDA receptors by inducing the degradation of STEP61. Proc Natl Acad Sci USA. 113 (32), 4736-4744 (2016).
- Qu, L., Akbergenova, Y., Hu, Y., Schikorski, T. Synapse-to-synapse variation in mean synaptic vesicle size and its relationship with synaptic morphology and function. J Comp Neurol. 514 (4), 343-352 (2009).
- Delaney, A. J., Sedlak, P. L., Autuori, E., Power, J. M., Sah, P. Synaptic NMDA receptors in basolateral amygdala principal neurons are triheteromeric proteins: physiological role of GluN2B subunits. J Neurophysiol. 109 (5), 1391-1402 (2013).
- Zhang, Y., et al. The tyrosine phosphatase STEP mediates AMPA receptor endocytosis after metabotropic glutamate receptor stimulation. J Neurosci. 28 (42), 10561-10566 (2008).
- Braithwaite, S. P., et al. Regulation of NMDA receptor trafficking and function by striatal-enriched tyrosine phosphatase (STEP). Eur J Neurosci. 23 (11), 2847-2856 (2006).
- Paul, S., Nairn, A. C., Wang, P., Lombroso, P. J. NMDA-mediated activation of the tyrosine phosphatase STEP regulates the duration of ERK signaling. Nat Neurosci. 6 (1), 34-42 (2003).
- Malberg, J. E., Eisch, A. J., Nestler, E. J., Duman, R. S. Chronic antidepressant treatment increases neurogenesis in adult rat hippocampus. J Neurosci. 20 (24), 9104-9110 (2000).
- Kandratavicius, L., et al. Animal models of epilepsy: use and limitations. Neuropsychiatr Dis Treat. 10, 1693-1705 (2014).
- Loscher, W. Animal models of epilepsy for the development of antiepileptogenic and disease-modifying drugs. A comparison of the pharmacology of kindling and post-status epilepticus models of temporal lobe epilepsy. Epilepsy Res. 50 (1-2), 105-123 (2002).
- Stromgren, L. S., Juul-Jensen, P. EEG in unilateral and bilateral electroconvulsive therapy. Acta Psychiatr Scand. 51 (5), 340-360 (1975).
- Abrams, R., Volavka, J., Fink, M. EEG seizure patterns during multiple unilateral and bilateral ECT. Compr Psychiatry. 14 (1), 25-28 (1973).
- Duman, R. S., Vaidya, V. A. Molecular and cellular actions of chronic electroconvulsive seizures. J ECT. 14 (3), 181-193 (1998).
- Andre, V., Ferrandon, A., Marescaux, C., Nehlig, A. Electroshocks delay seizures and subsequent epileptogenesis but do not prevent neuronal damage in the lithium-pilocarpine model of epilepsy. Epilepsy Res. 42 (1), 7-22 (2000).
- Sinclair, D., et al. Effects of sex and DTNBP1 (dysbindin) null gene mutation on the developmental GluN2B-GluN2A switch in the mouse cortex and hippocampus. J Neurodev Disord. 8 (14), 1-19 (2016).
- Sakaida, M., et al. Electroconvulsive seizure-induced changes in gene expression in the mouse hypothalamic paraventricular nucleus. J Psychopharmacol. 27 (11), 1058-1069 (2013).
- Hu, J. H., et al. Homeostatic scaling requires group I mGluR activation mediated by Homer1a. Neuron. 68 (6), 1128-1142 (2010).
- Blackstone, C. D., et al. Biochemical characterization and localization of a non-N-methyl-D-aspartate glutamate receptor in rat brain. J Neurochem. 58 (3), 1118-1126 (1992).
- Blackstone, C. D., Levey, A. I., Martin, L. J., Price, D. L., Huganir, R. L. Immunological detection of glutamate receptor subtypes in human central nervous system. Ann Neurol. 31 (6), 680-683 (1992).
- Lau, L. F., et al. Interaction of the N-methyl-D-aspartate receptor complex with a novel synapse-associated protein, SAP102. J Biol Chem. 271 (35), 21622-21628 (1996).
- Braithwaite, S. P., Paul, S., Nairn, A. C., Lombroso, P. J. Synaptic plasticity: one STEP at a time. Trends Neurosci. 29 (8), 452-458 (2006).
- Jang, S. S., et al. Regulation of STEP61 and tyrosine-phosphorylation of NMDA and AMPA receptors during homeostatic synaptic plasticity. Mol Brain. 8 (1), 55 (2015).
