Summary
Wij rapporteren met behulp van een kunstmatige intronic kleine RNA expressie strategie te ontwikkelen van een niet-defecte recombinant Aedes aegypti densovirus (AaeDV) in vivo uitvoeringssysteem. Een gedetailleerde procedure voor de bouw, de verpakking en de kwantitatieve analyse van de rAaeDV vectoren evenals wat larvale infectie wordt beschreven.
Abstract
In vivo microinjection is de meest gebruikte gene transfer techniek voor het analyseren van de functies van de gene in individuele muggen. Echter, deze methode vereist een meer technisch veeleisende operatie en impliceert ingewikkelde procedures, vooral wanneer gebruikt in larven als gevolg van hun geringe omvang, relatief dunne en breekbare cuticula en hoge mortaliteit, die de toepassing ervan te beperken. Daarentegen zijn virale vectoren voor gene levering ontwikkeld om te overwinnen van extracellulaire en intracellulaire belemmeringen. Deze systemen hebben de voordelen van gemakkelijke manipulatie, hoge gene transductie efficiëntie, onderhoud op lange termijn van genexpressie en de mogelijkheid tot blijvende effecten in vivo. Mosquito densoviruses (MDVs) zijn mug-specifieke, kleine single-stranded DNA virussen die effectief buitenlandse nucleic zuren in mug cellen leveren kunnen; de vervanging of het inbrengen van vreemde genen maken recombinante virussen meestal veroorzaakt echter een verlies van de capaciteiten van de verpakking en/of replicatie, die een belemmering voor de ontwikkeling van deze virussen als levering vectoren vormt.
Hierin, rapporteren we met behulp van een kunstmatige intronic kleine-RNA expressie-strategie te ontwikkelen van een niet-defecte recombinant Aedes aegypti densovirus (AaeDV) in vivo uitvoeringssysteem. Gedetailleerde procedures voor de bouw, de verpakking en de kwantitatieve analyse van de vectoren rAaeDV en larvale infectie worden beschreven.
Deze studie toont aan, voor de eerste keer, de haalbaarheid van de ontwikkeling van een niet-defecte recombinante MDV micro RNA (miRNA) expressie systeem, aldus verschaft een krachtig hulpmiddel voor de functionele analyse van genen in de mug en tot oprichting van een basis voor de toepassing van virale paratransgenesis voor het beheersen van muggen overgebrachte ziekten. Wij laten zien dat Aedes albopictus 1st instar-larven worden eenvoudig en effectief besmet kunnen door de introductie van het virus in het waterlichaam van de larven site fokken en dat de ontwikkelde rAaeDVs kan worden gebruikt om overexpress of neerhalen de expressie van een specifiek streefcijfer gen in larven, die een hulpmiddel voor de functionele analyse van muggen genen.
Introduction
Muggen overgebrachte ziekten zoals malaria, knokkelkoorts, zika koorts en gele koorts, zijn grote internationale volksgezondheidsproblemen die blijven ter verantwoording voor een belangrijke fractie van de mondiale infectieziekte last1,2. Conventionele insecticiden, die in reactie op vectoren zijn gebruikt, zijn een belangrijk onderdeel van duurzame geïntegreerde mug strategie voor toegangsbeheer voor de preventie van muggen overgebrachte ziekten. Echter, dergelijke strategieën hebben bewezen relatief inefficiënt of ongewenste als gevolg van de bijbehorende negatieve milieueffecten, alsmede de ontwikkeling van resistentie bij mug populaties3,4. Om deze redenen is er dringend behoefte aan alternatieve methoden van mug, controle, en het gebruik van transgene methoden voor de productie van steriele mannelijke muggen en de vrijlating van de pathogeen-resistente muggen hebben voorgedaan als veelbelovende nieuwe bestrijdingsstrategieën. Om controle effectieve nieuwe methoden, zoals veilige en effectieve methoden voor in vivo gene levering, de uitgebreide analyse van de genfunctie mug is vereist.
Directe microinjection van plasmide DNA, dubbele stranded RNA (dsRNA) of Klein Mengend RNA (siRNA) is de meest gebruikte in vivo gene leveringsmethode in muggen. In feite, de productie van transgene variëteiten van muggen nog steeds rekenen op een proces van embryo microinjection5,6,7. Microinjection heeft echter verschillende beperkingen. Ten eerste, deze techniek is technisch veeleisende en impliceert ingewikkelde procedures. Ten tweede veroorzaakt injectie een fysieke belediging van het embryo, larven, poppen en volwassen, die rechtstreeks van invloed op de levensvatbaarheid van het doelorganisme. Ten derde is het moeilijk om te immobiliseren muggenlarven voor microinjection, omdat de meeste in een aquatische habitats leven en bezitten een karakteristiek kronkelende beweging. Ten vierde, de grootte van 1st-2nd instar-larven is 10 - aan 20 keer kleiner dan die van 4th instar en oudere larven en de nagelriemen van de voormalige gevoeliger zijn. Deze functies maken het moeilijk om te manipuleren 1st-2nd instar-larven in vergelijking met oudere stadia. Gecombineerd, deze factoren dragen bij aan een verminderde na injectie overlevingspercentage voor larven (ongeveer 5%) in vergelijking met volwassenen8. Viral gebaseerde levering systemen zijn ontwikkeld om de bijbehorende extracellulaire en intracellulaire belemmeringen. Deze systemen hebben de voordelen van gemakkelijke manipulatie, hoge transductie efficiëntie, langdurige en robuuste niveaus van meningsuiting, en het vermogen te produceren permanente effecten in vivo. Daarom gebruikt de gene levering systemen met behulp van de retrovirussen, lentivirussen en adenovirussen wijd zijn inmammalian cellijnen en model soorten. Het Sindbis virale expressie systeem had eerder is gebruikt voor het analyseren van de genfunctie in de volwassen mug; Naast de bioveiligheid zorgen is de injectie echter nog steeds een noodzakelijk proces voor virale infectie9. Hoewel, de mondelinge levering door inweken larven in de dsRNA oplossing is eerder gemeld als een haalbaar leveringsmethode, is het niet geschikt voor kleine RNA functie-analyse10. Effectieve virale afleveringsmethoden moeten dus nog worden ontwikkeld voor muggen.
Mosquito densoviruses (MDVs) behoren tot de onderfamilie Densovirinae van Parvoviridae, en alle maar één vallen onder het geslacht Brevidensovirus11. MDV virionen zijn niet-gehuld en bestaan uit een genoom van single-stranded DNA (ssDNA) en een icosahedrale Eiwitmantel (20 nm diameter). Het virale genoom is ongeveer 4 kb in grootte en wordt gerepliceerd binnen de kernen van cellen van de gastheer. MDVs zijn relatief stabiel in de omgeving en een smalle host bereik weergeven met hoge specificiteit voor muggen. Deze virussen hebben het potentieel om te verspreiden en blijven natuurlijk mug populaties en bijna alle organen en weefsels van deze insecten, met inbegrip van de middendarm, Malpighian tubuli vet lichamelijk, de daaraan gehechte spiermassa, neuronen en speekselklieren12kunnen binnenvallen.
Intact MDV genomen kunnen worden subcloned in plasmide vectoren te produceren plasmide gebaseerde besmettelijke klonen; Wanneer deze klonen worden afgeleverd in cellen van de mug, het virale genoom wordt gewonnen uit de plasmide vector, en besmettelijke virale deeltjes worden geproduceerd. Omdat MDV een kleine ssDNA genoom heeft, besmettelijke klonen zijn gemakkelijk gebouwd en het virale genoom kunnen gemakkelijk gemanipuleerd11,,13. Deze kenmerken maken MDV een waardevolle agent voor de behandeling van de mug biologie. Echter, omdat bijna alle van het virale genoom is essentieel voor de virale proliferatie, het scheppen van recombinante virus door vervanging of toevoeging van buitenlandse genen veroorzaakt een verlies in virale verpakking en/of replicatie capaciteiten, waardoor een belemmering voor de ontwikkeling van MDVs als gene levering vectoren. Hierin, rapporteren we met behulp van een kunstmatige intronic kleine-RNA expressie-strategie te ontwikkelen van een niet-defecte rAaeDV in vivo RNA bezorgingssysteem dat heeft de voordelen van gemakkelijke plasmide constructie en het onderhoud van een functionele virus dat kan produceren stabiele en lange termijn expressie in gastheer cellen zonder de noodzaak voor wild-type virus. Bovendien, zorgt deze methode voor het gemakkelijk transductie van larven.
De protocollen voor de volgende stappen worden beschreven in deze studie: 1) ontwerp van rAaeDVs een intronic kleine-RNA expressie cassette, 2) de productie van recombinante virusdeeltjes de cel C6/36 verpakking te gebruiken codering lijn, 3) kwantitatieve analyse van cel-vrij rAaeDV genoom kopiëren nummers, en 4) infectie van Ae. albopictus larven door directe invoering van virus in het waterlichaam van de larvale habitat. Globaal, dit werk aangetoond dat specifieke kleine RNAs doelgenen kunnen worden overexpressie of neergehaald in met behulp van het ontwikkelde MDV uitvoeringssysteem muggenlarven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
alle protocollen werden goedgekeurd door de ethische commissie van zuidelijke medische universiteit.
1. ontwerpen van een kunstmatige Intron
Opmerking: de kunstmatige intron gebruikt in dit werk is 65 bp in lengte, en de volgorde is 5 ' - GTAAGAGTCGATCGACGCGTTACTAACTGGTACCTCTTCTTTTTTTTTTGATATCCTGCAG - 3 '.
- De Hpa plaats ik beperking site aan beide uiteinden van kunstmatige intron dus dat Hpa ik spijsvertering kan vrijkomen de intron van plasmiden (Zie Figuur 1).
- Plaats de twee Xba ik beperking sites in de intron dus dat Xba ik spijsvertering kan worden gebruikt voor het invoegen van de expressie van de kleine-RNA opeenvolgingen.
- Wordt de chemische synthese van full-length DNA-sequenties van de kunstmatige intron bestellen door een DNA-fabrikant. De synthetische DNA gemaakt is van klonen in een plasmide standaard pUC19.
Opmerking: De essentiële onderdelen van de kunstmatige intron omvatten diverse consensus nucleotide elementen, met inbegrip van een 5 ' donor splice site (DS) met de volgorde van de GUAAGAGU, een reeks (BPS) van de geconserveerde vertakkingspunt met de volgorde van de UACUAAC, een poly-pyrimidine tractus (PPT) met de reeks UCUUC(U) 10, en een 3 '-acceptor splice site (AS) met de reeks GAUAUCCUGCAG ( Figuur 1). Twee Xba ik beperkingsplaatsen geïntroduceerd tussen de DS en BPS die kan worden gebruikt voor het invoegen van de expressie van de kleine-RNA-sequenties. De mogelijkheid om effectief splice deze kunstmatige intron van zoogdier- en mug cellen geweest eerder bevestigde 14.
2. Ontwerpen van een kunstmatige Intronic kleine RNA expressie Cassette
Opmerking: voor overexpressie of knockdown van endogene miRNA, sequenties codering voorloper miRNA of een spons miRNA werden ingevoegd tussen de DS en BPS. Om te dienen als voorbeeld, werd een voorloper van de endogene miRNA van Ae. albopictus aal-laat-7 geselecteerd voor de bouw van recombinante virale vectoren voor miRNA overexpressie en knockdown. Een anti-let-7 spons is ontworpen volgens de eerder beschreven methoden 15. Om het neerhalen doelgenen in larven, ontwierpen we specifiek kunstmatige miRNA (amiRNA) of korte haarspeld RNA (shRNA) sequenties met behulp van online software 16 , 17; om te dienen als een voorbeeld, V-ATPase subeenheid een mRNA (toetreding neen. AY864912) werd geselecteerd als een doel-gen in deze studie. De amiRNA zal worden verwezen als amiVTP hierna. Alle details van de sequenties van pre-miRNA, shRNA, amiRNA en spons worden beschreven in de aanvullende tabel 1.
- De chemische synthese van full-length cDNA sequenties van de voorloper van miRNAs, sponzen miRNA en shRNA met Xba bestel ik beperkingsplaatsen aan beide uiteinden van een DNA-fabrikant.
- Na ontvangst van de bestelde DNA, draai de buizen met DNA blokken op 10.000-14.000 x g voor 1 min om ervoor te zorgen dat alle DNA gedroogd is aan de onderkant van de buis.
- Resuspendeer de gedroogde DNA in DNase-gratis water om een eindconcentratie van 10 ng/µL.
- Verteren de plasmide ruggengraat en DNA sequenties met Xba ik bij 37 ° C gedurende 1 uur, en dan dephosphorylate van de 5 ' uiteinden van de ruggengraat gelineariseerde plasmide met kalf intestinale alkalisch fosfatase (CIAP) volgens de fabrikant ' s-protocol .
- Inactivering van CIAP door verwarming gedurende 60 minuten op 65 ° C.
- Uitvoeren van een 1,0% agarose gel en snijd de gelineariseerde ruggengraat. Pak vervolgens het DNA van het segment van de gel met een gel extractie kit na de fabrikant ' s instructies.
- Het fragment van DNA in de backboneby T4 DNA ligase (5 U/µL) bij 22 ° C gedurende 1 h. ligate
- Transformeren de producten van de reactie van de afbinding van stap 2.7 in bevoegde Escherichia coli (E. coli) cellen en plaat op een lysogenie Bouillon (LB) agarplaat met ampicilline (bij een concentratie van 100 µg/mL).
- Uitvoeren de transformatie via een warmte schok methode 18 en gebruik de juiste E. coli stam. Bijvoorbeeld, het gebruik van E. coli stam DH5α voor warmte schok transformatie.
- Pick een één kolonie uit stap van 2.8 en broeden in een cultuur van 3 mL verrijkt middellange met ampicilline (bij een concentratie van 100 µg/mL).
- Pak het plasmide DNA uit de bacteriële cultuur met behulp van een mini prep kit na de fabrikant ' s instructies. Het monster verzenden een DNA sequencing bedrijf.
Opmerking: Voor overexpressie of knockdown van endogene miRNA, de codering van de voorloper van miRNA of een spons miRNA sequenties werden ingevoegd tussen de twee Xba ik sites. Alle miRNA expressie of spons constructies moet korter zijn dan 400 bp (10% van de lengte van het virale genoom) als gevolg van de limiet van de verpakking van de virus- 19.
3. Het genereren van een rAeaDV bouwen door middel van klonen een miRNA of shRNA expressie Cassette in een plasmide Backbone
Opmerking: pUCA, een besmettelijke kloon bestaande uit een pUCA plasmide die het genoom van de AaeDV (3,981 nt) 19, werd vriendelijk geleverd door Prof. Jonathan Carlson en is eerder beschreven in detail 11. p7NS1-DsRed spreekt een niet-structurele eiwitten 1 (NS1)-fusieproteïne rood fluorescerende eiwit (DsRed) van de p7 promotor en geweest 14 in detail elders beschreven. Een voorloper van de miR-941-1 mens specifiek 20 en de spons, een gecodeerde shRNA (CGACGACTATCGTGCAATTTCAAGAG AATTGCACGATAGTCGTCG), werden ook subcloned in de AaeDV als een negatieve controle.
- Het afbinden van de pre-miRNA, spons, shRNA of een cassette amiVTP expressie in de Hpa ik site van de regio AaeDV NS1-codering in de pUCA plasmide ruggengraat zoals beschreven in het protocol stap 2.4 tot en met 2.7.
- Het DNA transformeren in Stbl3 bevoegde E. coli cellen en selecteer een positieve kloon zoals beschreven in stap 2.8 tot en met 2.10.
- De rAaeDV-plasmide hierna, uittreksel uit de bacteriële cellen met behulp van een maxi prep kit na de fabrikant ' s instructies.
Opmerking: Stbl3 of Stbl4 E. coli cellen moeten worden benut voor rAaeDV DNA transformatie tot een minimum beperken van ongewenste ITR recombinatie. Een maxi prep moet worden gebruikt voor het uitpakken van de plasmide rAaeDV om te verkrijgen van een grote hoeveelheid DNA (> 100 µg). Voordat het virus wordt gegenereerd, moet de integriteit van de volgorde van de plasmide rAaeDV altijd worden geanalyseerd door DNA sequencing 21.
4. Transfecting C6/36 cellen met rAaeDV plasmiden
- cultuur C6/36 cellen in Roswell Park Memorial Instituut (RPMI) 1640 opslagmedium met 10% foetale runderserum (FBS) en 1% penicilline/streptomycine in een 28 ° C incubator.
- Plaat cellen in tien 25 cm 2 cultuur kolven op dag 0, 18-20 h voor transfectie door splitsing van 90-95% confluente cellen in een verdunning 1:2.
Opmerking: Door dag 1, de cellen moeten bereiken 90-95% samenvloeiing. - Op dag 1, transfect de cellen met de serie rAaeDV plasmiden 22.
- Verdun 10 µg DNA in 600 µL van RPMI-1640 medium in een microcentrifuge buis en meng voorzichtig. Ondertussen bereiden 600 µL van RPMI-1640 medium en 25 µL van transfectiereagens per transfectie.
- Incubate gedurende 5-10 minuten bij kamertemperatuur (RT). Dan, voeg 625 µL van het mengsel van 1640-transfectiereagens aan het mengsel van 1640-plasmide DNA.
- Broeden dit mengsel voor 20-30 min op RT. Voor transfectie, wassen de cellen tweemaal met 2 mL RPMI-1640 voedingsbodem.
- Na de RT-incubatie (stap 4.3.3), the1640-transfectie reagens DNA plasmide mengsel toevoegen aan op de maatkolf van 25 cm 2 cultuur en incubeer gedurende 6 uur bij 28 ° C.
- Op ongeveer 6 h na transfectie, verwijderen de transfectie media, wassen van de cellen tweemaal met 5 mL RPMI-1640 middellange en voeg vervolgens RPMI-1640 medium met 10% FBS.
Opmerking: rAaeDV toont hoge tarieven van de infectie (95%) in Ae. albopictus larven; in onze ervaring, in bijna 50% van de geïnfecteerde larven, de infectie was echter beperkt tot de primaire infectie sites (bijv anale mannetjesvissen en bristle cellen) zonder verspreiding 23. Daarom, als er een noodzaak om te infecteren larven in meerdere weefsels, een defecte recombinante virus uiting van fluorescerende eiwit moet mede besmette om de visualisatie van infectie sites. Bijvoorbeeld voor de productie van defecte recombinante virus uiting van DsRed, p7NS1-DsRed moet worden mede transfected met een plasmide helper in C6/36 cellen volgens de hierboven beschreven procedure (de verhouding van de concentratie cotransfection moet 2:1).
5. Oogst rAaeDV virionen van C6/36 cellen Transfected
- oogst de cellen 5 dagen na de transfectie. Verjagen en opschorten van de cellen in de gerechten door een 5 mL glas Druppelbuisje, pipetting omhoog en omlaag met het kweekmedium. Alle cel schorsingen overbrengen in steriele buizen van 15 mL.
- Bevriezen bij-80 ° C, of in een bad van droogijs/ethanol voor 30 min en vervolgens ontdooien bij 37 ° C. Vortex voor 1 min. Herhaal de procedure freeze-en-dooi 3 keer.
- Centrifugeren van het monster bij 4.800 x g gedurende 20 minuten op 4 °C.Collect het supernatant en gooi de pellet. Vervolgens passeren het supernatant een 0,22 µm wegwerp injectiespuit filter. Aliquot en winkel de laatste gezuiverde virion voorraden op -80 ° C.
Opmerking: Voorkomen herhaalde bevriezen-ontdooien cycli.
6. Kwantificeren van rAaeDV
- voorbereiden het DNA normen. Alle rAaeDV plasmiden met Hpa Linearize ik, en zuiveren de verteerd producten met een gel extractie kit 24.
- Bouw van de absolute kwantitatieve standaard curve en meten van de titer van virus volgens de eerder beschreven methoden 25.
7. Mosquito transductie
- Wash 100 1 st instar Ae. albopictus larven driemaal met gedeïoniseerd water, en breng vervolgens de larven in een bekerglas van 95 mL gedeïoniseerd water. Voeg 5 mL van de rAaeDV bestanden (eindconcentratie van 1,00 x 10 10 kopieën/mL).
- Voor 24 h bij 28 ° C, de larven drie keer met gedeïoniseerd water wassen, en vervolgens de larven ook terug overzetten naar de platen uit te broeden en diervoeders regelmatig.
- Toezicht op het niveau van de genexpressie doel in de larven met qPCR of westelijke vlek (vertegenwoordiger van de resultaten worden weergegeven in de figuren 3 en 4).
Opmerking: De fluorescentie signaal detectiemethode kan worden gebruikt om te isoleren van de geïnfecteerde larven nauwkeuriger. Bijvoorbeeld, u wilt opsporen fluorescerende signalen van larven besmet met recombinant virus uiting van DsRed, de larven kunnen worden geplaatst op een dia uitholling en waargenomen onder een omgekeerde fluorescentie Microscoop elke 8 h tot en met 2 dagen na infectie. Zodra de fluorescerende larven worden ontdekt, moeten worden gescheiden in afzonderlijke plastic test koppen te maken voor latere punt van voortdurende aandacht. Larven met meerdere weefsels besmet kunnen worden geïdentificeerd met behulp van deze methode.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Strategieën voor rAaeDV bouw
Een defecte rAaeDV vector werd gegenereerd om uit te drukken van het DsRed-gen in muggenlarven. De resulterende plasmide bevatte een NS1-DsRed fusion protein cassette met de VP eiwit verwijderd(Figuur 1). rAaeDV plasmiden met expressie constructies voor miRNA, zijn spons miRNA, shRNA en amiRNA ontworpen (afgebeeld in Figuur 1B). Bijvoorbeeld, werd een rAaeDV-vector gegenereerd om te overexpress aal-laat-7 in muggenlarven. De resulterende plasmide bevatte een intronic pre-aal-laat-7 cassette in de virale NS1 exon (Figuur 1B). Een vector van de rAaeDV met een intronic aal-laat-7 spons expressie cassette in de virale NS1 exon werd gegenereerd voor het neerhalen van de aal-laat-7 expressie in muggenlarven (Figuur 1B en Figuur 2B). Een rAaeDV shRNA vector- en een rAaeDV amiRNA vector met intronic shRNA en pre-amiRNA expressie cassettes, respectievelijk, werden gebruikt om het neerhalen van V-ATPase mRNA in muggenlarven (Figuur 2C).
Berekening van de rAaeDV-titers gebaseerd op een standaard curve die gegenereerd met de lineaire regressie-analyse
De y-as de Log10-waarde van standaard DNA moleculaire concentratie aangeeft, en de x-as geeft de CT-waarde. De CT nummers (x-as) en de Log10 (concentratie) waarden (y-as) weergegeven een goede correlatie (R2 = 0.9988) en voldoen aan de vergelijking y = - 0.288 x + 13.87 (Figuur 3). Bereken de rAaeDV titers van monsters met behulp van de lineaire vergelijking (tabel 1). Met behulp van de methode beschreven in het protocol (stap 6.2 en tabel 1), de hoge titers van rAaeDV (4 mL, > 7,65 x 1010 deeltjes/mL) zijn geoogst. Recombinante virussen (VrepUCA-7 VrepUCA-7s, VrepUCA-amiVTP, VrepUCA-shVTP, VrepUCA941-1, VrepUCA-941-1s en VrepUCA-shct) werden gegenereerd door het transfecting van de overeenkomstige infectie klonen pUCA-7 pUCA-7s, pUCA-amiVTP, pUCA941-1, pUCA941-1s, pUCA-shct in cellen C6/36 (hoofdstukken 3, 4 en 5).
Bepaling van de miRNA overexpressie en knockdown rendement van rAaeDV vectoren
In het voorbeeld wordt vector 1 van de 100st instar-larven werden behandeld met gelijke hoeveelheden (1,00 x 1010 deeltjes/mL) rAaeDV met de intronic pre-let-7-expressie, de intronic laat-7 spons expressie vector, de mens-specifieke pre-miR-941-1 expressie vector of de miR-941-1 spons expressie vector door toevoeging van het virus in het waterlichaam van de larvale habitat. Vijf dagen na de infectie, de uitdrukking van aal-laat-7 werd bepaald door qPCR (Figuur 4, n = 3; Aanvullende tabel 2). De laat-7 niveaus die worden weergegeven als de gemiddelde ± SD van drie biologische wordt gerepliceerd in de larven, werden aanzienlijk vergroot of verkleind met de rAaeDV pre-let-7-uitdrukken (overexpressie 2,843.31 ± 80.72%, p < 0.0001, t-test) en de laat-7-spons-uiten rAaeDV (werden door 74.78 ± 1,60%, p < 0.0001, t-test), respectievelijk.
De V-ATPase mRNA vechtpartij efficiëntie van rAaeDV vectoren
Een totaal van 100 1st instar-larven werden behandeld met gelijke hoeveelheden (1,00 x 1010 deeltjes/mL) intronic amiRNA-uiting rAaeDV, intronic shRNA-uiting rAaeDV, mens-specifieke pre-miR-941-1-uiting van rAaeDV orscramble shRNA-uiten rAaeDV door toevoeging van het virus in het waterlichaam van de larvale habitat. Vijf dagen na de infectie, de uitdrukking van mRNA van V-ATPase werd bepaald door qPCR (Figuur 5, n = 3; Aanvullende tabel 2). De V-ATPase weergegeven zoals de gemiddelde ± SD van drie biologische wordt gerepliceerd in de larven was aanzienlijk verminderd door rAaeDV amiRNA-uitdrukken (werden door 43.01 ±6.37%, p = 0.0011, t-test) en intronic shRNA-uiten rAaeDV (werden door 72.88 ± 5,74%, p = 0.0001, t-test).
Figuur 1 : Schematische organisatie van de recombinante AaeDV plasmiden. (A) de pNS en pVP virale initiatiefnemers rijden de uitdrukking van de genen van de NS1/NS2 en VP genen, respectievelijk. In het p7NS1-DsRed-plasmide, was het DsRed-gen aan het gen NS1 gesmolten. (B) pUCA-7, pUCA-7s, pUCA-941-1, pUCA-941-1s, pUCA-shct, pUCA-shVTP en pUCA-amiVTP bevatten kunstmatige introns, met inbegrip van de aal-laat-7, aal-laat-7 spons heeft-miR-941-1, heeft-miR-941-1 spons, gecodeerde shRNA, V-ATPase shRNA en kunstmatige miRNA, respectievelijk, die werden gekloond in de Hpaik site van het NS1-gen. De kunstmatige intron flanked wordt weergegeven door een splice donor (DS) en een acceptor site (AS) en bevat een vertakkingspunt domein (BrP) en een pre-miRNA en poly-pyrimidine tractus (PPT). De miRNA spons of kunstmatige miRNA volgorde ingevoegd binnen de intron tussen de 5-splice-site en het BrP. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : Biogenese van kunstmatige intronic microRNA (miRNA) en de strategie voor het genereren van miRNA sponzen en kunstmatige miRNAs. (A) Intronic miRNA is mede getranscribeerde binnen een voorloper van de boodschapper-RNA (pre-mRNA) van NS1, die zal worden aangedreven door de pNS1-promotor en gekloofd uit de pre-mRNA door splicing van RNA. Hoewel de exons als ligatuur zijn verbonden tot een volwassen boodschapper-RNA (mRNA) voor NS1 eiwitsynthese, is de afgesplitste intron met de pre-miRNA verder verwerkt tot volwassen miRNA door Dicer. (B) strategie voor het genereren van de anti-let-7 en anti-miR-941-1 constructies. Aanpassing van de anti-let-7 en anti-miR-941-1 sequenties met aal-laat-7 en heeft-miR-941-1, respectievelijk. Volledige aanpassing aan de zaad-regio's met de anti-miRNA volgorde en staart regio's wordt weergegeven. Zowel laat-7 en miR-941-1. sponzen bevatten drie herhalen antisense constructies (rode letters) die aan aal-laat-7 en heeft-miR-941-1, respectievelijk binden kunnen. (C) sequenties en de voorloper van de voorspelde structuren voor de kunstmatige miRNAs op basis van miRNA en shRNA gebruikt in deze studie. De volwassen kunstmatige miRNAs en shRNA staan in het rood, en hun verwante doelstelling mRNA opeenvolgingen zijn in het blauw. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 : Standaard curve voor rAaeDV titratie en de berekende concentrations van MDVs. (A) Real-time qPCR werd uitgevoerd met een standaard pUCA die was verwaterd door 10 keer de vergrotingsfactor en de waarde van de CT werd gemeten op een ABI-7500 als x. Exemplaaraantal was berekend op basis van stap 6.2 en 6.3 met daarin de volgende formule: kopiëren nummer (y) =-0.288x + 10,87 inch; R2 = 0.9988. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4 : Recombinant MDV-gemedieerde aal-laat-7 overexpressie en knockdown in Ae. albopictus larven. (A) analyse van endogene miRNA expressie in larven na infectie met recombinant virus met de expressie van de aal-laat-7 cassette (linkerdeel). (B) de doelmatigheid van de anti-let-7 construct werd vastgesteld in larven (rechtervenster). Het heeft-miR-941-1 en heeft-941-1 spons (negatieve controle) overexpressie en werden de volwassen laat-7 miRNAs, respectievelijk, in vergelijking met de basale niveaus waargenomen in de controlegroep. miRNA overvloed was genormaliseerd naar 5S rRNA, en de gegevens worden weergegeven als de gemiddelde ± SD van drie biologische repliceert. T-tests werden uitgevoerd op verschillende niveaus van betekenis. De sterretjes geven statistisch significante verschillen tussen de larven van besmette en bijbehorende mock-behandeld (vier sterretjes, p < 0.0001). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5 : Analyse van V-ATPase mRNA uitdrukking na infectie met recombinant virus met cassettes shRNA en amiRNA. mRNA overvloed was genormaliseerd naar aalrpS7. Foutbalken geven de standaarddeviatie van de waarden van de 2−ΔΔCT voor V-ATPase mRNA uitdrukking in de larven Ae. albopictus zoals geëvalueerd door RT-PCR in real time (**, p < 0,01; ***, p < 0,001). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Tabel 1: De recombinant MDV C T waarde bepaald door de qPCR komt overeen met de x waarde in de formule, die wordt gebruikt voor het berekenen van de y waarde. Het virale genoom exemplaaraantal in elk monster 1 µL werd verkregen door de functie macht (10, y), die werd uiteindelijk vermenigvuldigd met 40, de waarde te converteren naar de virus concentratie virussuspensie.
Aanvullende tabel 1: Sequenties van miRNA voorloper.
Aanvullende tabel 2: qPCR gegevens.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het is belangrijk om te overwinnen twee van de belangrijkste belemmeringen die de bouw van de rAaeDV beperken. De eerste is de productie van defecte recombinante virussen. Er werd gemeld dat MDV kan worden gebruikt als een vector naar behoren uitspreken buitenlandse genen, zoals scorpion insect-specifieke neurotoxins20 en het GFP-eiwit middelgrote; maar ongeacht de bouw strategie, kunnen niet zodra de ORFs van MDV worden ingevoegd of door exogene genen vervangen, virionen vormen onafhankelijk tenzij een helper plasmide is cotransfected voor de levering van de ontbrekende onmisbaar virale eiwitten. Het defecte virus kan niet deelnemen aan secundaire transmissie, die in vivo in muggen met defecte genomen voorkomt. Onze resultaten valideren een intronic expressie-strategie die een nieuw paradigma die overwinnen van de beperkingen van MDVs met defecte genomen biedt kan om de efficiënte levering van buitenlandse genen in muggen.
De tweede is de veeleisende lengte-limiet van de recombinante virale genoom opgelegd door de grootte van virale Eiwitmantel. Voor efficiënte verpakking, het genoom mag niet groter zijn 4.400 nucleotiden (110% van de lengte van het genoom van de MDVs wt). Een intronic miRNA expressie cassette (met inbegrip van miRNA expressie cassette en kunstmatige intron) van niet meer dan 400 nt kan worden ingevoerd in het genoom van de AaeDV. Hoewel de lengte van de recombinante virusgenoom nog geschikt voor verpakking is, heeft deze levering systeem ruimte voor verbetering. Vanwege de beperking in de lengte van het genoom is het moeilijk om uitdrukkelijke genen zonder defecte intronic expressie strategieën.
Het is essentieel om ervoor te zorgen dat de cellen C6/36 gezond om het succesvolle transfectie en verpakken van rAaeDV. Echter, de hier gebruikte kationische liposomen-reagentia en commerciële insect cell specifieke transfectie reagentia, niet verbeteren de efficiëntie van de transfectie van de cel C6/36 (40-60%). Het verkrijgen van hoge-titer recombinante virus, daarom moeten de cellen gedurende 5 dagen na de transfectie op basis van bovenstaande groei kenmerken14. Voor succesvolle larvale infectie is het bovendien essentieel voor larven in contact met de besmettelijke virusdeeltjes voor 24-36 h om hoge infectie ratio's23.
Kortom, is de strategie van de intronic expressie zoals hier beschreven de eerste om de belemmeringen die de generatie van defecte MDV oplegt. Deze strategie maakt het mogelijk de productie van niet-defecte recombinant MDVs dat kan overexpress of downregulate miRNAs- en het doeldomein genen in muggen. Deze techniek biedt een instrument voor de functionele analyse van muggen genen zonder het gebruik van ingewikkelde larven microinjection procedures en heeft duidelijke commerciële toepassingen. Verder onderzoek zal het uitbreiden van de toepassing van de strategie van de beschreven expressie te onderzoeken mug biologie en paratransgenesis voor dengue virus zeggenschap.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.
Acknowledgments
De auteurs erkennen financiële steun van de nationale sleutel onderzoek en ontwikkeling programma van China (2016YFC1200500 aan Xiao-Guang Chen), de nationale Natural Science Foundation van China (81672054 en 81371846), het onderzoeksprogramma van het Team van de natuurlijke Science Foundation van Guangdong (2014A030312016), en de wetenschappelijke en technologische programma van Guangzhou (201508020263). Wij erkennen dankbaar Professor Jonathan Carlson (Colorado State University) voor het vriendelijk verstrekken de pUCA en p7NS1-GFP plasmiden en voor het kritisch lezen van dit manuscript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Centrifuge machine | Thermo Scientific | 75004260 | |
| Centrifuge System | Beckman Coulter | 363118 | |
| GeneJET Gel Extraction Kit | Thermo Scientific | K0691 | |
| E.Z.N.A. Plasmid Midi Kit | Omega Biotech | D6904 | |
| Purified Agar | OXOID | LP0028A | |
| FastAP Thermosensitive Alkaline Phosphatase (1 U/µL) | Thermo Scientific | EF0651 | |
| FastDigest HpaI | Thermo Scientific | FD1034 | |
| FastDigest XbaI | Thermo Scientific | FD0684 | |
| T4 DNA Ligase (5 U/µL) | Thermo Scientific | EL0011 | |
| TransStbl3 Chemically Competent Cell | Beijing Transgen Biotech | CD521-01 | |
| Ampicillin | Beijing Tiangen Biotech | RT501 | |
| Proteinase K | Promega | MC5008 | |
| SuperReal PreMix Plus (SYBR Green) | Beijing Tiangen Biotech | FP205 |
References
- Tolle, M. A. Mosquito-borne diseases. Current problems in pediatric and adolescent health care. 39, 97-140 (2009).
- Petersen, L. R., Jamieson, D. J., Powers, A. M., Honein, M. A. Zika Virus. The New England journal of medicine. 374, 1552-1563 (2016).
- Roberts, D. R., Andre, R. G. Insecticide resistance issues in vector-borne disease control. The American journal of tropical medicine and hygiene. 50, 21-34 (1994).
- Attaran, A., Roberts, D. R., Curtis, C. F., Kilama, W. L. Balancing risks on the backs of the poor. Nature medicine. 6, 729-731 (2000).
- Volohonsky, G., et al. Transgenic Expression of the Anti-parasitic Factor TEP1 in the Malaria Mosquito Anopheles gambiae. PLoS pathogens. 13, 1006113 (2017).
- Galizi, R., et al. A synthetic sex ratio distortion system for the control of the human malaria mosquito. Nature communications. 5, 3977 (2014).
- Bourtzis, K., Lees, R. S., Hendrichs, J., Vreysen, M. J. More than one rabbit out of the hat: Radiation, transgenic and symbiont-based approaches for sustainable management of mosquito and tsetse fly populations. Acta tropica. 157, 115-130 (2016).
- Kumar, S. S., Puttaraju, H. P. Improvised microinjection technique for mosquito vectors. The Indian journal of medical research. 136, 971-978 (2012).
- Attardo, G. M., Higgs, S., Klingler, K. A., Vanlandingham, D. L., Raikhel, A. S. RNA interference-mediated knockdown of a GATA factor reveals a link to anautogeny in the mosquito Aedes aegypti. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 13374-13379 (2003).
- Singh, A. D., Wong, S., Ryan, C. P., Whyard, S. Oral delivery of double-stranded RNA in larvae of the yellow fever mosquito, Aedes aegypti: implications for pest mosquito control. Journal of insect science. 13, (Online) 69 (2013).
- Ward, T. W., et al. Aedes aegypti transducing densovirus pathogenesis and expression in Aedes aegypti and Anopheles gambiae larvae. Insect molecular biology. 10, 397-405 (2001).
- Carlson, J., Suchman, E., Buchatsky, L. Densoviruses for control and genetic manipulation of mosquitoes. Advances in virus research. 68, 361-392 (2006).
- Barreau, C., Jousset, F. X., Bergoin, M. Pathogenicity of the Aedes albopictus parvovirus (AaPV), a denso-like virus, for Aedes aegypti mosquitoes. Journal of invertebrate pathology. 68, 299-309 (1996).
- Liu, P., et al. Development of non-defective recombinant densovirus vectors for microRNA delivery in the invasive vector mosquito, Aedes albopictus. Scientific reports. 6, 20979 (2016).
- Ortega, M. M., Bouamar, H. Guidelines on Designing MicroRNA Sponges: From Construction to Stable Cell Line. Methods in molecular biology. 1509, Clifton, N.J. 221-233 (2017).
- BLOCKiT RNAi Designer. , Available from: http://rnaidesigner.lifetechnologies.com/rnaiexpress/ (2017).
- GE Dharmacon siDesign Center siRNA design tool. , Available from: dharmacon.gelifesciences.com/design-center/ (2017).
- Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. Journal of visualized experiments : JoVE. , e253 (2007).
- Afanasiev, B. N., Kozlov, Y. V., Carlson, J. O., Beaty, B. J. Densovirus of Aedes aegypti as an expression vector in mosquito cells. Experimental parasitology. 79, 322-339 (1994).
- Hu, H. Y., et al.
- Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74, 5463-5467 (1977).
- Dalby, B., et al. Advanced transfection with Lipofectamine 2000 reagent: primary neurons, siRNA, and high-throughput applications. Methods (San Diego, Calif). 33, 95-103 (2004).
- Gu, J. B., Dong, Y. Q., Peng, H. J., Chen, X. G. A recombinant AeDNA containing the insect-specific toxin, BmK IT1, displayed an increasing pathogenicity on Aedes albopictus. The American journal of tropical medicine and hygiene. 83, 614-623 (2010).
- Hou, Y., Zhang, H., Miranda, L., Lin, S. Serious overestimation in quantitative PCR by circular (supercoiled) plasmid standard: microalgal pcna as the model gene. PloS one. 5, 9545 (2010).
- Ding, J., et al. Preparation of rAAV9 to Overexpress or Knockdown Genes in Mouse Hearts. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2016).
