Summary
Komplexa rörelsemönster i naturalistiska miljöer som kräver noggrann samordning av benen innebär regioner av parietala cortex. Följande protokoll beskriver användningen av reversibel kylning-inducerad avaktivering att demonstrera rollen av parietala område 5 i minne-guidad hinder skatteundandragande i walking katt.
Abstract
På komplexa, naturalistiska terräng, kan sensorisk information om miljömässiga hinder användas att snabbt justera rörelseapparaten rörelser för att undvika. Till exempel i katten, kan visuell information om ett förestående hinder modulera kliva för undvikande. Rörelseapparaten anpassning kan också uppstå oberoende av vision, som plötslig taktil ingångar till benet av ett förväntade hinder kan ändra kliva av alla fyra ben för att undvika. Sådan komplex motorisk samordning innebär supraspinal strukturer, såsom parietala cortex. Det här protokollet beskriver användningen av reversibel, kyla-inducerad kortikala avaktivering att utvärdera parietala cortex bidrag till minne-guidad hinder locomotion i katten. Liten kylning loopar, känd som cryoloops, är speciellt formad för att avaktivera diskret regioner av intresse att utvärdera deras bidrag till en overt beteende. Sådana metoder har använts för att belysa rollen av parietala område 5 i minne-guidad hinder skatteundandragande i katten.
Introduction
Sensorisk information om ett hinder, som kan förvärvas via vision eller touch, kan snabbt ändra locomotion för undvikande på naturalistisk, ojämn terräng. Denna noggrann samordning av stegmotor rörelser involverar flera kortikala regioner1,2. Till exempel har områden av motoriska cortex3,4 och parietala cortex5,6,7 varit inblandade under komplexa rörelseapparaten uppgifter såsom undvika hinder. Fyrbent djur, måste steg modulationer krävs för att undvika hinder omfatta både framben och hindlegs. Om framåt locomotion försenas mellan framben och hindleg hinder clearance (som kan uppstå som ett djur trampar försiktigt genom en komplex, naturalistiska miljö stalking byte), används information om hindret underhålls i minnet för att vägleda den hindleg kliva över hindret en gång promenader återupptas.
Experimentella tekniker syftar till att avaktivera diskret kortikala områden kan användas för att studera kortikala bidrag till minne-guidad hinder förflyttning. Kylning-inducerad kortikala inaktivering ger en reversibel, tillförlitliga och reproducerbara metod för bedömning av kortikala bidrag till en overt beteende8. Cryoloops tillverkad av rostfria stålrör är formade specifika för det kortikala området av intresse, säkerställa mycket selektiv och diskret avaktivering loci. När implanteras, kylda metanol pumpas genom lumen av en cryoloop kyler regionen i cortex direkt under slingan till < 20 ° C. Under denna kritiska temperaturen hämmas synaptisk transmission i regionen i cortex direkt under slingan. Sådan avstängning kan vändas genom att helt enkelt upphör flödet av metanol. Denna metod har använts för att studera kortikala bidrag till sensorisk bearbetning och beteenden9,10,11,12,13,14,15 , 16 , 17, samt motorisk kontroll av saccadic öga rörelser18 och minne-guidad hinder locomotion19.
Syftet med detta protokoll är att använda reversibla kylning-inducerad avaktiveringar för att bedöma medverkan av de parietala kortikala områdena för motorisk samordning i katten. Minne-guidad hinder locomotion undersöktes specifikt, med eller utan aktiva parietala cortex. Dessa metoder har använts framgångsrikt Visa rollen av parietala område 5 i minne-guidad hinder skatteundandragande i walking katt19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla förfaranden genomfördes i enlighet med National Research Council's Guide för skötsel och användning av försöksdjur (åttonde upplagan; 2011) och kanadensiska rådet på Animal Care's Guide till vård och användning av försöksdjur (1993), och var godkänd av University of Western Ontario djurs användning underkommittén universitet rådets djur vård.
Följande procedur kan tillämpas på experiment studera kortikala bidrag till motorisk kontroll i walking katt.
1. apparatur
- Konstruera de apparater som används för att bedöma hinder minne.
Obs: Apparaten består av en 2.43 m lång, 29 cm bred gångbana inhägnad med 18 cm hög klar akryl väggar (figur 1). En smal slot halvvägs längs apparaten tillåter ett 25,8 cm bred x 3 mm tjocka hinder upp till eller tas bort från gångvägen med en spak som monteras under promenader yta. - För att säkerställa att uppmärksamhet av djuret upprätthålls på att äta, undvika att använda handen att höja eller sänka hindret. Istället hindret kan höjas eller sänkas med de experimenter's ben för att flytta spaken under gångvägen, att låta försöksledaren att fortsätta mata djur.
- Ordentligt underhåll spaken systemet för att säkerställa att hindret kan höjas eller sänkas ljudlöst.
- Använd en liten förhöjd plattform (23 cm lång x 23 cm brett x 16 cm hög) på vilken mjuk mat placeras, för att styra rörelser av djuret.
- Spela in alla prövningar med hjälp av en Ethernet-kamera (54 bildrutor/s) monterad på ett stativ 1,85 m från mittlinjen av gångvägen.
2. utbildning förfaranden
Obs: För framgångsrika datainsamling, en period av träning föregår beteendemässiga testning garanterar att varje djur är korrekt acklimatiserad till testning rummet och apparater. Upprepad exponering för en roman miljö kommer att bidra till att minska häpnadsväckande eller andra stressande beteenden. Acklimatisering kan variera mellan djur och kan kräva 1-2 månaders träning. Inledande acklimatisering sessioner kan vara upp till 5 min i längd beroende på fokus och motivation av djur att äta. Efterföljande sessioner bör sträva efter att öka varaktigheten av tid som djuret är motiverade att arbeta (vanligtvis runt 20-25 min).
- Förvärva mogen (> 6 månaders ålder) inhemska kort hår katter från en kommersiell laboratorium uppfödare av vikt eller kön.
Obs: Motivation att arbeta för mat och en kooperativ disposition omfattar urvalskriterier när man överväger vilka djur bör ingå i studien. - Acklimatiserar sig varje djur att bära en sele som 1 m långa koppel är kopplad. Ankare i koppel till en hylla ovanför gångvägen över mittpunkten på gångvägen.
Obs: Detta tillåter djuret att promenera längs den centrala delen av apparaten utan någon spänning, således uppmuntra djuret att förbli inom denna del av apparaten. Upprättandet av sådana avgränsningar är bra för att arbeta med en glidande testpersonen. - Placera djuret på gångvägen, gör det möjligt att äta från den plattform på vilken mjuk mat är placerad.
Obs: Ett syfte med denna inledande utbildning är att se till att djuret lätt följer mat plattformen när flyttas framåt, och promenerar bekvämt med sele och koppel. Användningen av mjuk mat som positiv förstärkning uppmuntrar djuret att förbli fokuserad under varje utbildning eller test session, och främjar en bekväm arbetsmiljö. - Se till att djuret är bekväm hantering, inklusive instanser där djuret måste flyttas till startområdet för gångvägen.
3. beteendevetenskaplig utbildning och test protokoll
Obs: Hinder minnet bedöms i två paradigm: en visuellt-beroende hinder minne aktivitet, och en taktil-beroende hinder minne. Båda paradigm bör användas under inledande utbildning och efterföljande testning.
-
Visuella hinder minne
- För att bedöma visuella hinder minnet, höja hindret på Gångbordet (figur 2A). Placera plattformen på den bortre sidan av hindret. Placera djuret i startområdet för gångvägen.
- Låt djuret att närma sig maten, kliva över hindret med endast dess frambenen för att äta från plattformen.
- Som djuret fortsätter att äta, sänk hindret så att det blir jäms med gångvägen att förhindra någon ytterligare visuell eller taktil ingångar.
- Efter en variabel fördröjningstid, driva mat framåt igen för att uppmuntra djuret att återuppta promenader; Denna försening kan vara mindre än 1 s till uppemot 2 min.
- Ännu viktigare, utföra prövningar där hindret är frånvarande för att undvika tillvänjning till hinder och utvecklingen av ett inlärt undvikande svar. I sådana visuella hinder-frånvarande prövningar, säkerställa att hindret inte höjs på gångvägen innan du placerar djuret i startområdet för gångvägen.
- Observera hindleg kliva i hinder-nutid och hinder-frånvarande prövningar att verifiera typiska rörelseapparaten beteenden och intakt visuella hinder minne före kylning. Se till att djuret kan rensa hindret utan kontakt och att kliva av alla fyra ben är avsevärt förhöjd i hinder-nutid prövningar.
Obs: Titta på videor av utbildning prövningar kan bistå i denna kontroll.
-
Taktila hinder minne
- För att bedöma taktil hinder minnet, se till att hindret inte höjs på gångvägen innan du placerar djuret i startområdet för gångvägen (figur 2B).
- Låt djuret gå mot mat plattformen placeras på den bortre sidan av hindret slot.
- När djuret äter, höja hindret på gångvägen under mat skålen, förhindra någon visuell input av hindret.
- Maten flyttas framåt, konstatera att djuret bör kontakta hindret med sina framben innan kliva över den.
- Låt djuret att fortsätta äta medan gränsöverskridande hindret mellan deras fore- och hindlegs. Under denna tid, sänk hindret så att det blir jäms med gångvägen att förhindra någon ytterligare visuell eller taktil ingångar.
- Efter en variabel fördröjningstid, driva mat framåt igen för att uppmuntra djuret att återuppta promenader.
- Ännu viktigare, utför prövningar där hindret är frånvarande och inga framben kontakt uppstår för att förhindra tillvänjning till hinder och utvecklingen av ett inlärt undvikande svar.
- I dessa taktila hinder-frånvarande prövningar, har metoden med djur och äter från mat plattform, som beskrivs i steg 3.2.1. Dock höja och sänka hindret (steg 3.2.2) innan du flyttar maten framåt i steg 3.2.3. Se till att en liknande fördröjningstid där djuret får fortsätta äta (steg 3.2.4) föregår den slutliga fortsatt locomotion (steg 3.2.5).
- Iaktta de hindleg som kliver in hinder-nutid och hinder-frånvarande försöken att kontrollera normal rörelseapparaten beteenden och intakt visuella hinder minne före kylning.
4. video analyser
Obs: För att bedöma hinder minne, analyser under inledande utbildning och efterföljande testning efter kylning loop implantation innebär kvantifiera topp steghöjd, steg clearance och det horisontella avståndet mellan tå och hinder på toppen av varje steg för både visuella och taktila paradigm (figur 2 c).
- Analysera videor med anpassade skriftliga skript.
- För varje prov, spår varje fot genom att markera positionen för tån närmast kameran under varje steg.
- Mätning av peak steghöjd som det vinkelräta avståndet mellan tån och ytan av gångvägen på den högsta punkten i varje steg bana (figur 2 c).
- I prövningar hinder-nu mäta steg clearance som steghöjd direkt ovanför hindret kortplatsen dras av höjden på hindret.
- Dessutom Mät det horisontella avståndet mellan tån och hindret på toppen av varje steg i hinder-nutid prövningar.
- Bekräfta att hinder minne kapacitet är intakt före kylning loop implantation genom att verifiera att peak steghöjd är förhöjda i hinder-nutid prövningar i jämförelse med kliva i hinder-frånvarande prövningar.
5. kylning Loop (Cryoloop) Implantation
- Implantatet cryoloops bilateralt över områden 5 och 7 enligt tidigare rapporterade kirurgiska ingrepp8 (figur 3).
- I korthet för varje halvklotet, utföra en kraniotomi och durotomy från Horsley-Clarke koordinater20 A15 till A25 att exponera mellan den ansate och laterala sulci.
- Placera enskilda kylning slingor formade från 23-gauge rostfritt stål hypodermic slangar med slingan i direkt kontakt med kortikala ytan av parietala område 5 eller 7.
- Säkra basen av varje cryoloop till skallen med dental akryl förankrad till de rostfria skruvarna.
- Stäng craniotomies med ytterligare tandvård akryl; Rita upp huden marginalerna upp till akryl kanter och sutur grupp.
6. kortikala kylning protokoll
-
Experimentellt ställa in
Obs: Innan djuret in i testing rummet, på kylkretsen är beredd och testat. På kylkretsen består av en metanol reservoar med en insugningsröret (3,2 mm ytterdiameter, 1,6 mm I.D.), fram-och återgående kolvpump och torr-is bad ansluten via polytetrafluoreten slangar (1,6 mm ytterdiameter, 0,5 mm I.D.; (Se figur 4). Dessutom krävs en digital termometer.- Lägga till 500 cc torr-is 200 mL metanol i isbadet. Passar slangar avslutar tätt över in- och utlopp av en dummy cryoloop att slutföra på kylkretsen.
- Bifoga i termoelement kontakten till en digital termometer för kontinuerlig temperaturövervakning med en kabel som består av två manliga termoelement kontakter och en termoelement tråd. Se till att längden på denna kabel är tillräckligt för att nå huvudet av djuret när ena änden är ansluten till termometern.
- Slå på kolv pumpen med växeln.
Obs: Metanol bör upprättas från reservoaren, passerade genom pumpen till torr-is bad där flödande metanol i slangen kommer kylas till-75 ° C. Kylda metanol kommer sedan avsluta isbadet och kör genom den bifogade cryoloop innan han återvände till reservoaren metanol. - Säkerställa att pumpen fastställande, längd på slang inom isbadet och längden på slangen från isbadet overksam slingorna är optimal sådana att overksam cryoloop temperaturen kan nå steady-state runt -5,0 ° C.
Obs: Sådana temperaturer uppnås under denna grundinställning är ofta tillräckligt för att uppnå temperaturer på 3,0 ± 1,0 ° C när samma system används för att kyla en implanterad cryoloop. Svårigheter att uppnå tillräcklig kylning kan lösas genom att justera hastigheten på pumpen, öka längden på slangar nedsänkt inom isbadet och/eller att minimera längden på slangen från isbadet cryoloop. - Om nödvändigt, förlänga ett avsnitt av slangar genom gängning i slutet av röret genom en tube ändbeslag och fläns i slutet av röret med en flank verktyg. Fäst slangen i önskad längd med en likaså flänsade änden med en kontakt.
- Kontrollera att alla anslutningar är ombonad och inga läckor finns. När nöjd med installationen, stänga av pumpen och ta bort den dummy cryoloop; kretsen är nu beredd för ett försöksdjur.
-
Beteendemässiga testning
- Placera djuret på testning apparaten. Dra selen över huvudet och säkra den remmen tätt runt djuret. Bifoga kopplet.
- Ta av skyddslocket av den implanterade cryoloop att exponera inlopp och utlopp rören. Passar slangar avslutar tätt över in- och utlopp rör av cryoloop. Anslut termoelement till digitala termometern.
- Påbörja den test session med en visuell (steg 3.1) eller taktil (steg 3,2) hinder minne rättegång. Följ med ytterligare prövningar av alla fyra typer (visuella hinder-nutid, visuella hinder-frånvarande, taktila hinder-nutid, taktila hinder-frånvarande) på ett slumpmässigt sätt.
Obs: En typisk provning session består av en 'varm' block av prövningar, där undvika minne-guidad hinder observeras i avsaknad av kyla för att upprätta baseline åtgärder. - Slå på pumpens kolv, och vänta för cryoloop att anta en temperatur på 3,0 ± 1,0 ° C (1-2 min). Kör sedan ett 'cool' block av prövningar efter pumpens kolv har slagits på. Under detta block av prövningar, bedöma om det behövs bidrag från området kyls till minne-guidad. Säkerställa att temperaturen hos cryoloop upprätthålls på 3,0 ± 1,0 ° C genom hela hela blocket.
Obs: Alla fyra prov typer bör intersperseds slumpmässigt i hela blocket. - Köra ett sista 'rewarm' block av prövningar efter pumpens kolv har stängts av, och cryoloop har återvänt till sin ursprungliga temperatur.
Obs: Baseline stegmotor beteende har återupprättats under detta block. Igen, alla fyra prov typer bör intersperseds slumpmässigt i hela blocket.
-
Städa upp
- När beteendemässiga testning ingås, ta bort slangen från inlopp och utlopp rör. Vara medvetna om kvarstående metanol som kan droppa från slangar ändar och kan irritera djuret.
- Säkerställa att skyddslocket ersätts. Ta bort koppel och sele innan han återvände djuret till kolonin. Trimma slangar ändarna (3-4 mm) med hjälp av en slang fräs för att förhindra läckande anslutningar på nästa test dag.
7. Kontrollera omfattningen av kyla
- I slutet av beteendemässiga testning, bekräfta att omfattningen av inaktivering är begränsade till regionen i cortex direkt under varje cryoloop med tidigare rapporterade tekniker8.
Obs: Detta kan kontrolleras med språngskikt mappning12 eller med en termisk imaging camera13,14,19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Detta protokoll har framgångsrikt använts för att undersöka parietala cortex bidrag till hinder minne i walking katt19. I denna studie var cryoloops implantat bilateralt över parietala områden 5 och 7 i tre vuxen (> 6 månaders ålder) kvinnliga katter (figur 5A). Djur bedömdes i taktil hinder minne paradigm i avsaknad av kylning (varm, kontroll skick), eller när området 5 eller 7 var bilateralt inaktiverade.
De representativa resultat från denna studie visar att när området 5 kyldes bilateralt, hindleg kliva var betydligt försvagat i hinder-nutid prövningar (figur 5 d, blå). I varmt tillstånd var medelfrekvensen steghöjd för inledande och avslutande hindlegs 9,5 ±2.2 cm 8,0 ±2.1 cm, respektive. En enkelriktad multivariat ANOVA visade att när området 5 kyldes, sänktes avsevärt topp steghöjd för inledande och avslutande hindlegs till 4.3 ±2.2 cm (p < 0,0001) och 3,4 ±1.4 cm (p < 0,0001), respektive. Topp steghöjd av frambenen i hinder-nutid prövningar eller något ben i hinder-frånvarande prövningar påverkades inte av område 5 avaktivering. Likaså skilde topp steghöjd för eventuella ben i antingen hinder-present eller hinder-frånvarande prövningar sig inte från det varmt tillståndet när område 7 var inaktiverat.
Hindleg steg clearance påverkades dessutom på samma sätt när området 5 var inaktiverat. I jämförelsen till både varm och område 7 kyls förhållanden, minskade steg clearance till 4,7 ±2.2 cm i ledande hindleg steg (p < 0,0001, Figur 5 g) och −5.6 ±1.4 cm i det avslutande hindleg steget (p < 0,0001). Dessutom påverkades steg banan för den avslutande hindleg av område 5 avaktivering, som toppen inträffade innan hindret, till skillnad från kliva i både varm och området 7 kylda villkor (figur 5 g).
Sammantaget anges sådana förändringar i topp steghöjd, steg clearance och steg bana djupgående hinder minne underskott när området 5 var inaktiverat. Allt som området 5 avaktiveringen endast ändras kännetecknen av hindleg kliva i hinder-nutid prövningar och inte försämrar förmågan att göra stegmotor rörelser, reflekterar dessa observerade förändringar i locomotion minne, inte motor underskott. Dessutom bekräftade värmekameror som utförs vid ingående av beteendemässiga testning att kyla var begränsad till området 5 eller 7 när varje slinga kyldes individuellt för varje halvklotet (figur 6). Därmed Sammantaget visar dessa resultat bidragen av parietala område 5 till minne-guidad hinder förflyttning i katten.
Figur 1: Diagram skildrar kameran, kylutrustning och promenader apparater som används för att bedöma hinder minne i cat. En 2.43 m lång, 29 cm bred gångbana omsluts av 18 cm hög tydlig plexiglasvägg. Halvvägs längs gångvägen, ett 25,8 cm bred 3 mm tjock hinder kan höjas på gångvägen genom en smal slot med en spak som monteras under gångvägen. För varje rättegång placeras djuret ett par steg från hinder i startområdet av gångvägen. Livsmedlet har släppts ut på en liten förhöjd plattform (23 cm lång x 23 cm brett x 16 cm hög) på den bortre sidan av hindret slot motsatsen till startområdet. Alla prövningar registreras via en Ethernet-kamera monterad på ett stativ och sparas på en bärbar dator. Denna siffra har ändrats från Wong et al. 19 Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Diagram skildrar både visuella och taktila hinder minne aktiviteter och steg mätningarna används för att bedöma hinder minne i den vandrande cat. (A) för att bedöma visuella hinder minne, hindret höjs på gångvägen när djuret närmar sig mat plattformen. Efter kliva över hindret med bara sina framben, är djuret tillåtet att äta från plattformen, som hindret sänks hemlighet blir jäms med ytan av gångvägen. Efter en variabel fördröjningstid, maten flyttas framåt till uppmuntra djuret att återuppta promenader. (B) för att bedöma taktil hinder minne, hindret höjs inte på gångvägen när djuret närmar sig mat plattformen. När djuret äter, höjs hindret tyst på gångvägen direkt under mat plattformen. Maten flyttas framåt orsakar frambenen djurets kontakta hindret innan kliva över den. Djuret får fortsätta äta från mat plattformen medan gränsöverskridande hindret mellan dess framben och hindlegs. Under denna tid sänks hemlighet hindret från gångvägarna. Maten flyttas fram en gång uppmuntra djuret att återuppta promenader. Hindleg steg mäts för att bedöma hinder minne. (C) kliva bedöms i både visuella och taktila hinder minne paradigm genom att mäta höjden topp steg, steg clearance och det horisontella avståndet mellan toppen av varje steg och hindret. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Schematisk av cryoloop. Cryoloop består av en skyddande mössa, som passar över inlopp och utlopp rören. Dessa rör kör genom en gängad post och bildar öglan som sitter i direkt kontakt med kortikala ytan över regionen av intresse. En microthermocouple är lödda på union av slingan att mäta cryoloop temperatur. Dess trådar köra tillbaka upp genom Värmekrympande slangen (som också wraps rostfritt stål slangen) och är kopplade till en kontakt. Hela församlingen är säkrade till skallen med dental akryl. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: på kylkretsen. På kylkretsen består av metanol reservoar, fram-och återgående kolvpump, isbad, termometer och cryoloop. Cool, utarbetar pumpen metanol från reservoaren genom insugningsröret (1,6 mm I.D.). Metanol avslutar pumpen genom polytetrafluoreten slangen (0.5 mm I.D.) och pumpas genom att torr-is badet, där den flödande metanolen i slangen kyls till-75 ° C. Kylda metanol sedan avslutar isbadet och går genom den bifogade cryoloop innan han återvände till reservoaren metanol. Denna cryoloop kan vara en dummy loop (inte implanteras) används under installationen, eller kan vara en implanterad cryoloop i ett försöksdjur. Cryoloop är också ansluten till en digital termometer att registrera slinga temperatur genom hela beteendemässiga testning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: reversibel, kyla-inducerad avaktivering av parietala område 5 resulterar i hinder minne underskott. (A) laterala vy av den högra hjärnhalvan av katt storhjärnan visar cryoloops implanteras direkt över parietala områden 5 (blå) och 7 (grön) undersökte i Wong et al. 19 D: dorsala, A: främre. (B–E) Bar tomter som skildrar menar steg höjd ± SD för hinder-närvarande (B, D) och hinder-frånvarande prövningar (C, E) för framben (B, C) och hindlegs (D, E) för varm (röd), område 5 kyls (blå), och området 7 kylda villkor ( grön). Steghöjd minskade avsevärt i båda de inledande och avslutande hindlegs i hinder-nutid prövningar när området 5 var inaktiverat. (F) Bar tomt föreställande medelvärdet hindleg steg clearance ± SD för varje kylande villkor. Område 5 avaktivering resulterade i minskad clearance för både inledande och avslutande hindleg steg. (G) Bar tomt föreställande genomsnittlig vågräta avståndet mellan toppen av varje steg och hindret för varje kylande villkor. När området 5 kyldes, steg banor var mer variabel och skilde sig avsevärt från varma och området 7 kylda villkor. p < 0,005, **p < 0,0001, n.s.: inte betydande. Denna siffra har ändrats från Wong et al. 19 Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: värmekameror används för att bekräfta begränsad avaktivering av område 5 eller 7 under kylningen. (A) fotografi föreställande cryoloops i kontakt med parietala områden 5 och 7 i den högra hjärnhalvan. Toppen är dorsala är höger främre. Streckad linje representerar gränsen mellan parietala områden 5 och 7. (B–C) Värmebilder av parietala kortikala ytan fotograferade när den cryoloop över område 5 (B) eller område 7 (C) kyldes till 3 ° C. Denna siffra har ändrats från Wong et al. 19 Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den beskrivna paradigmen sysselsätter kylning-inducerad avaktiveringar diskret kortikala områden använder cryoloop för att studera minne-guidad hinder locomotion i katten. Visuella och taktila hinder minne paradigm är ganska enkel för djuren att utföra eftersom de utnyttjar naturalistiska rörelseapparaten problem som uppstår med minimal ansträngning när ett djur är motiverade att följa ett rörligt näringskälla. Således, majoriteten av utbildningstiden ägnas åt acclimating djuret testning rum och kylutrustning. De flesta djur kräver upprepad exponering för bär selen och att vara uppbundna via kopplet före gående bekvämt och naturligt på apparaten. Dessutom under provande, kan ljudet av pumpens kolv distrahera eller skrämma djuret. Att fylla på kylkretsen med den dummy cryoloop och kör pumpen under grundutbildning kan tillåta djuret att acklimatisera till ljudet av pumpen. Trots tillräcklig utbildning före provning, kommer det sannolikt att en begränsad tid för att testa innan djuret blir rastlös. Därför gott om tid ägnas åt för att säkerställa korrekt installation och felsökning innan djuret in i testing rummet kommer att optimera efterföljande datainsamling.
Svårigheter att uppnå tillräcklig kylning kan åtgärdas genom att justera pumpens varvtal. Dock bör uppmärksammas att det ökande trycket som kan uppstå med slangen tvingas bort inlopp eller utlopp rören av cryoloop. Längden på slangen nedsänkt i isbadet kan alternativt ökas för att möjliggöra mer tid att kyla flödet av metanol i rören. Dessutom att säkerställa att längden på slangen från poängen med utgång från isbadet till cryoloop är så korta som möjligt kommer att minimera förlust av kyla. Detta avstånd måste dock också vara tillräckligt långa för att tillräcklig mängd locomotion för ett visst beteende paradigm. Slangen kan isoleras med flexibelt skum omslag att optimera kylningen effektivitet. Sådan förpackning kan också förhindra droppar kondens som bildas kring slangen från att falla på djuret, som kan irritera eller skrämma djuret. Under provningen, säkerställa en trivsam passa på slang över inloppet och utlopp rör av cryoloop kan göra ansluta cryoloop svårt. Nitril-eller latex handske kan ge ett bättre grepp på slang. Se till att djuret är bekväma och patienten medan experimenter fäster slangen är viktigt. Mat kan användas för att hålla djuret stilla och innehåll.
Cryoloops kan kylas rutinmässigt ger mycket reproducerbara förändringar i beteende när ett visst område är inaktiverat. Genom att bedöma samma uppgift i närvaro och frånvaro av kortikala avaktivering inom samma djur, minskas det totala antalet djur som används. Dessutom kan omfattningen av kyla manipuleras för att ytterligare specificera kortikala bidrag till ett specifikt beteende. Exempelvis kan både unilateral och bilateral avaktiveringar utföras i samma djur att undersöka möjliga lateralization effekterna av ett beteende. Graden av kyla kan dessutom varieras för att undersöka laminar bidrag. Genom att kyla cryoloops vid kortikala ytan till 3,0 ±1.0 ° C, alla sex lager av cortex direkt under varje slinga kyls till < 20 ° C, att hämma nervcellernas tillsatta aktivitet22. Alternativt kan cryoloops kylas till 8,0 ±1.0 ° C, som selektivt kyler bara supragranular kortikala lager under denna kritiska temperaturen 20 ° c. Bedömningen av beteenden med sådana ytliga kortikala inaktivering samt full kortikala avaktivering får tillåta translaminär dissociations kortikal funktion21.
Trots sådan mångsidighet övervägas följande begränsningar under experimentell design. Kylning är en utmärkt strategi för att avaktivera alla celltyper i en viss kortikala region, ge inte det ett medel för avaktivering cellulära specificitet som kan uppnås med tekniker för inaktivering av optogenetic. Dessutom kylning kräver minst 45 s innan cryoloop temperaturer stabiliseras på den kritiska temperaturen 3.0 ±1.0 ° C för funktionella avaktivering. Överväganden för den tidsrymd som krävs för att uppnå funktionell avaktivering bör således införlivas i experimentell protokollet av val.
Sammantaget kräver kylsystemet minimalt underhåll. Slangar och kopplingar av på kylkretsen bör kontrolleras regelbundet för läckor. Metanol inom reservoaren bör bytas varje vecka för att säkerställa att metanol är fri från partiklar. Implanterade cryoloops också kräver minimalt underhåll. Marginalerna städas regelbundet med en 3% väteperoxid-lösning som följt av en kirurgisk scrub lösning. Med korrekt användning och omsorg, kan inopererad cryoloops kylas rutinmässigt under många år. Dessa kortikal kylande förfaranden kan anpassas till andra beteendemässiga paradigm10,11,12 eller elektrofysiologiska inspelning preparat13,14 i alternativa djurmodeller 15,17,18,22.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Vi erkänner tacksamt stöd av den kanadensiska institut för hälsa forskning, naturvetenskap och Engineering Research rådet av Kanada (NSERC) och Kanada Stiftelsen för Innovation. C.W. stöddes av en Alexander Graham Bell Canada Graduate stipendium (NSERC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Camera | IDS Imaging Development Systems GmbH | Model: UI-5240CP-C-HQ | |
| Intake tubing | Restek | 25306 | Unflanged end is submerged in the methanol reservoir while the flanged end is connected to the pump |
| Pump | Fluid Metering, Inc. | Model: QG 150 | |
| Nalgene Dewar vacuum flask | Sigma-Aldrich | F9401 | |
| Teflon tubing | Ezkem | A051754 | |
| Microprobe thermometer | Physitemp | Model: BAT-12 | |
| Flanged tube end fittings | Valco Instruments Co. Inc. | CF-1BK | Assorted colours available for colour coding. Packages include the same number of washers as fittings |
| Washers | Valco Instruments Co. Inc. | CF-W1 | Extra washers |
| Flanging kit | Pro Liquid GmbH | 201553 | |
| Tubing connector | Restek | 25323 | |
| Tubing cutter | Restek | 25069 | |
| Male thermocouple connector | Omega | SMPW-T-M | Used to make cable connection to thermometer |
| Thermocouple wire | Omega | PP-T-24S | Used to make cable connection to thermometer |
| MATLAB | MathWorks | n/a |
References
- Drew, T., Marigold, D. S. Taking the next step: cortical contributions to the control of locomotion. Curr. Opin. Neurobiol. 33, 25-33 (2015).
- Takakusaki, K. Neurophysiology of gait: From the spinal cord to the frontal lobe. Mov. Disord. 28, 1483-1491 (2013).
- Drew, T. Motor cortical activity during voluntary gait modifications in the cat. I. cells related to the forelimbs. J. Neurophysiol. 70, 179-199 (1993).
- Beloozerova, I. N., Sirota, M. G. The role of the motor cortex in the control of accuracy of locomotor movements in the cat. J. Physiol. 461, 1-25 (1993).
- McVea, D. A., Taylor, A. J., Pearson, K. G. Long-lasting working memories of obstacles established by foreleg stepping in walking cats require area 5 of the posterior parietal cortex. J. Neurosci. 29, 9396-9404 (2009).
- Lajoie, K., Andujar, J. -E., Pearson, K. G., Drew, T. Neurons in area 5 of the posterior parietal cortex in the cat contribute to interlimb coordination during visually guided locomotion: a role in working memory. J. Neurophysiol. 103, 2234-2254 (2010).
- Beloozerova, I. N., Sirota, M. G. Integration of motor and visual information in the parietal area 5 during locomotion. J. Neurophysiol. 90, 961-971 (2003).
- Lomber, S. G., Payne, B. R., Horel, J. A. The cryoloop: An adaptable reversible cooling deactivation method for behavioral or electrophysiological assessment of neural function. J. Neurosci. Methods. 86, 179-194 (1999).
- Lomber, S. G., Cornwell, P., Sun, J., Macneil, M. A., Payne, B. R. Reversible inactivation of visual processing operations in middle suprasylvian cortex of the behaving cat. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 91, 2999-3003 (1994).
- Lomber, S. G., Payne, B. R. Contributions of cat posterior parietal cortex to visuospatial discrimination. Vis. Neurosci. 17, 701-709 (2000).
- Lomber, S. G., Malhotra, S. Double dissociation of 'what' and 'where' processing in auditory cortex. Nat. Neurosci. 11, 609-616 (2008).
- Lomber, S. G., Meredith, M. A., Kral, A. Cross-modal plasticity in specific auditory cortices underlies visual compensations in the deaf. Nat. Neurosci. 13, 1421-1427 (2010).
- Kok, M. A., Stolzberg, D., Brown, T. A., Lomber, S. G. Dissociable influences of primary auditory cortex and the posterior auditory field on neuronal responses in the dorsal zone of auditory cortex. J. Neurophysiol. 113, 475-486 (2015).
- Carrasco, A., Kok, M. A., Lomber, S. G. Effects of core auditory cortex deactivation on neuronal response to simple and complex acoustic signals in the contralateral anterior auditory field. Cereb. Cortex. 25, 84-96 (2015).
- Coomber, B., et al. Cortical inactivation by cooling in small animals. Front. Syst. Neurosci. 5, 53 (2011).
- Malmierca, M. S., Anderson, L. A., Antunes, F. M. The cortical modulation of stimulus-specific adaptation in the auditory midbrain and thalamus: a potential neuronal correlate for predictive coding. Front. Syst. Neurosci. 9, 19 (2015).
- Antunes, F. M., Malmierca, M. S. Effect of auditory cortex deactivation on stimulus-specific adaptation in the medial geniculate body. J. Neurosci. 31, 17306-17316 (2011).
- Peel, T. R., Johnston, K., Lomber, S. G., Corneil, B. D. Bilateral saccadic deficits following large and reversible inactivation of unilateral frontal eye field. J. Neurophysiol. 111, 415-433 (2014).
- Wong, C., Wong, G., Pearson, K. G., Lomber, S. G. Memory-guided stumbling correction in the hindlimb of quadrupeds relies on parietal area 5. Cereb. Cortex. , (2016).
- Horsley, V., Clarke, R. H. The structure and function of the cerebellum examined by a new method. Brain Behav Evol. 31, 45-124 (1908).
- Lomber, S. G., Malhotra, S., Hall, A. J. Functional specialization in non-primary auditory cortex of the cat: areal and laminar contributions to sound localization. Hear. Res. 229, 31-45 (2007).
- Johnston, K., Koval, M. J., Lomber, S. G., Everling, S. Macaque dorsolateral prefrontal cortex does not suppress saccade-related activity in the superior colliculus. Cereb. Cortex. 24, 1373-1388 (2014).
