Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

מדידת רמות ה-mRNA לאורך זמן במהלך שמרים ס' cerevisiae ובשפתיים התגובה

Published: August 10, 2017 doi: 10.3791/56226
Automatic Translation
1, 2, 2, 2
1Department of Molecular Biology, Rowan School of Osteopathic Medicine, 2Department of Biological Sciences, Rowan University

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול בעזרת RNA-seq לנטר את רמות ה-mRNA לאורך זמן במהלך התגובה שתקבעו של cerevisiae ס תאים. בשיטה זו ניתן להתאים לנתח ביטוי גנים במהלך כל תגובה תאית.

Abstract

מתחם שינויים בביטוי הגנים מתווכים בדרך כלל חלק גדול של תגובה תאית. כל הגן עשויים להשתנות הביטוי קינטיקה ייחודי כמו הגן מוסדר על ידי עיתוי מסוים אחד של גירויים רבים, איתות המסלולים או השפעות משניות. כדי לתפוס את הגן כולו ביטוי בתגובה היפוקסיה ב שמרים cerevisiae ס, ניתוח ה-RNA-seq שימש כדי לנטר את רמות ה-mRNA של כל הגנים במועדים ספציפיים לאחר חשיפה היפוקסיה. היפוקסיה הוקמה על ידי גידול תאי גז2 ~ 100% N. חשוב, בניגוד מחקרים אחרים שתקבעו, ergosterol, חומצות שומן בלתי רוויות לא נוספו לכלי התקשורת כי מטבוליטים אלה משפיעים על ביטוי גנים. נקודות זמן נבחרו בטווח של 0 - 4 שעות לאחר היפוקסיה כי תקופה זו לוכדת את השינויים העיקריים בביטוי הגנים. בכל נקודה בזמן, היו תאים ובשפתיים יומן אמצע במהירות מסונן, קפוא, הגבלת החשיפה O2 ו הנלווה שינויים בביטוי הגנים. RNA הכולל היה שחולצו מן התאים, משמש כדי להעשיר את ה-mRNA, אשר לאחר מכן הוסב cDNA. CDNA זו, נוצרו ספריות מולטיפלקס, דגימות 8 או יותר היו וסודרו בנתיב אחד של ברצף הדור הבא. צינור שלאחר רצף מתואר, אשר כוללת חיתוך בסיס איכות, לקרוא מיפוי וקביעת מספר קריאות לכל הגנים. DESeq2 סביבת סטטיסטי של R שימשה לזיהוי גנים לשנות באופן משמעותי בכל אחד של נקודות זמן שתקבעו. ניתוח של משכפל ביולוגי שלושה גילה הפארמצבטית גבוהה, הגנים של קינטיקה שונות ומספר רב של ציפה O2-מוסדר גנים. שיטות אלה שניתן להשתמש כדי ללמוד כיצד התאים של אורגניזמים שונים מגיבים היפוקסיה לאורך זמן ו הותאם ללמוד ביטוי גנים במהלך תגובות אחרים התאית.

Introduction

אורגניזמים רבים מגיבים היפוקסיה או O נמוך2, על ידי שינוי גנטי ביטוי 1,2,3. תגובה זו מסייעת להתמודד עם חוסר קריטי עבור נשימה אירובית, כמה תגובות biosynthetic הוחלף נגזר מצע, אלא גם עם מצב חמצון-חיזור המשתנים 4תאים. מספר מחקרים microarray הופיעה cerevisiae ס מראים כי רמות ה-mRNA של מאות גנים שינוי בתגובה היפוקסיה 5,6,-7,-8,-9 , 10 , 11 , 12. לאחרונה, ה-RNA-seq שימש לאפיין שינויים בביטוי הגנים לאורך זמן במהלך היפוקסיה 13. כאן מוצגים הפרטים ניסיוני ודן.

היפוקסיה יכול להיעשות בדרכים שונות, כל אחת לייצר רמה שונה של O2. . הנה, היפוקסיה הוקמה על ידי זורם באופן רציף אולטרא-גבוה-טוהר N2 לתוך מבחנות, אשר מוריד את [O2] התפרקה באופן מיידי עם קינטיקה לשחזור 10. זה אפשרי כי ישנם כמה O2 מולקולות נוכח שתורמים ביטוי חילוף החומרים, ג'ין אבל סביבה זו נחשבת מאוד קרוב אנאירובית. בהיעדר O2, תאי שמרים לא biosynthesize heme, ergosterol, חומצות שומן בלתי רוויות 4,12,14. לכן, מחקרים קודמים כללו מטבוליטים אלה כאשר גדל שמרים ללא חמצן 5,10,15. עם זאת, תגובות ובשפתיים רבים הם מתווכת על ידי דלדול של מטבוליטים אלה, ובכך חידוש אותם מפלות 12,16תגובות ביטוי גנים ובשפתיים. כדי לחקות היפוקסיה טבעי, מטבוליטים אלה לא נוספו לכלי התקשורת. בזמן הקצר כי תאים נחשפו היפוקסיה ללא הנוכחות של מטבוליטים חיוניים אלה, היה ללא עלייה ניכרת מוות תאי (נתונים לא מוצג) ולא של מתח ממושך בתגובה 13.

התגובה היא גם תלויה במתח, גנוטיפ שלה. חשוב במיוחד הם אללים של הרגולטורים הידוע של תגובות ובשפתיים 2. רקע המתח S288C רצוי מאוד כך ניתן להשוות תוצאות המחקרים גנומית אחרים עם זן זה. עם זאת, S288C מכיל של אלל אובדן-של-פונקציה חלקית מתוך HAP1 ג'ין 17, הרגולטור תעתיק קריטיים על התגובה ובשפתיים. אלל הזה תוקן ב- S288C באמצעות wildtype העתק מן Σ1278b זן רקע 11.

ביטוי גנים הוא תלוי מאוד הסביבה התאית. לפיכך, בעת ביצוע ניתוח mRNA הגנום כולו, חשוב לשמור על סביבה מתמדת תוך שינוי פרמטר נוסף כגון זמן, גירוי או גנוטיפ. כדי להשיג תוצאות מאוד לשחזור, שקול שיטות עבודה מומלצות שלושה אלה לצורך המחקר ואת כל שלה ביולוגי או טכנית משכפל. קודם כל, experimenter(s) אותו צריך לבצע את המחקר, מאז שיטות טכניות עשויים להשתנות על פני ניסויים. שנית, מאותה אצווה של מרכיבים אמור לשמש בתקשורת צמיחה כמו כל אצווה יש קומפוזיציה שונה במקצת, אשר יכולים להשפיע על ביטוי גנים. שלישית, כדי למזער את ההשפעות מחזור התא, כל נקודת זמן צריכה להכיל תאים אסינכרוני בשלב אמצע יומן של צמיחה (1-2 x 107 תאים/mL).

כאשר אפיון תגובה מורכבים כמו התגובה ביטוי גנים היפוקסיה, קורס זמן הוא יתרון בקביעת את קינטיקה של אירועים שונים. נקודות זמן מסוים צריך להיבחר כי ללכוד את השינויים העיקריים של התגובה. במחקר זה, נצפו נקודות זמן בין 0 ל- 4 שעות, כי ניסויים קודמים חשפו נרחבת שינויים בביטוי הגנים במהלך תקופה זו, 13.

כדי למדוד ביטוי גנים גלובלית, RNA-seq היה בשימוש 18,19. שיטה זו משתמשת הדור הבא רצפי כדי לקבוע שפע יחסי התעתיק של ג'ין כל. לעומת ניתוח microarray DNA, RNA-seq תערוכות רגישות גבוהה יותר (כדי לזהות תעתיקים פחות בשפע), טווח דינמי גדול (למדוד שינויים קיפול גדול), הפארמצבטית סופריור (לעקוב במדויק ביטוי גנים לאורך זמן). בדרך כלל, רנ א ביותר הסלולר היא ribosomal RNA שפותחו שיטות רבות להעשרת RNA ספציפיים מינים 20. . פולי-T חרוזים שימשו לטיהור poly-A-המכיל mRNA תעתיקים, למרות השונות מסחרית - ערכות דלדול rRNA זמינים גם יכול להיות יעיל ב- mRNA העשרה.

כאן, התאפיינה התגובה ביטוי cerevisiae ס גנים היפוקסיה. התאים היו חשופים היפוקסיה, ואז לטעום-8 נקודות זמן (0, 5, 10, 30, 60, 120, 180, 240 דקות). כדי לאשר הפארמצבטית וכדי לזהות תעתיקים סטטיסטית שהשתנו, משכפל ביולוגי שלוש בוצעו. RNA היה שחולצו על ידי הפרעה מכנית וטיהור עמודה ולאחר מכן מעובד לניתוח RNA-seq. הצינור שלאחר רצף מתואר, תכנות סקריפטים ניתנים לאפשר שכפול מדויק של הניתוחים שבוצעו. באופן ספציפי, Trimmomatic 21, TopHat2 22, HTseq 23, את הסביבה סטטיסטי R 24, ו DESeq2 חבילה 25 שימשו כדי לעבד את הנתונים RNA-seq לזיהוי גנים ועוד 607 חסימות לשנות באופן משמעותי במהלך היפוקסיה. ניתוח גורמים ראשיים (PCA), ביטוי גנים של משכפל ציינו את הפארמצבטית של הטכניקה. שירות האשכולות, heatmaps גילה ביטוי נרחב קינטיקה, בעוד מפענוח אונטולוגיה (קדימה) הראה כי תהליכים תאיים רבים, כמו נשימה אירובית, מועשרים בערכה של גנים מוסדר חמצן.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. גרימת היפוקסיה

  1. יום אחד או יותר לפני הקורס זמן היפוקסיה: הכנת החממה, תא הסינון מערכת ואקום, מיכל הדלק, מבחנות, פקקים, צינורות זכוכית, אבובים, כמו שולחן חומרים.
  2. הנח את N2 טנק, חממה, ואקום ומערכת סינון בסמיכות, כדי לאפשר עיבוד מהיר של תאים.
  3. הכן סטרילי מדיה YPD נוזלי (1% תמצית שמרים, peptone 2%, 2% גלוקוז) על ידי ערבוב המרכיבים בקבוק זכוכית, autoclaving.
  4. תכנון הפריסה של מבחנות בחממה.
    הערה: ממיכל2 N, הבקבוק הראשון תהיה מלכודת מים, הבקבוקון השני תהיה הנקודה בפעם האחרונה, הבקבוק השלישי יהיה נקודת זמן ברגע האחרון וכן הלאה עד הבקבוק האחרון אשר הוא מלכודת מים הסופי. איור 1 מציג את סדר והקשרים בין המבחנות.
  5. יום לפני זמן הקורס לחסן מושבה שמרים לתוך תרבות של 5 מ ל נוזל YPD בתוך מבחנה סטרילית. באופן ספציפי, להרים מושבה מלא מצלחת באמצעות מקל המוליך סטרילי. מקם את המקל לתוך YPD נוזלי ומנערים את המקל עד רוב התאים ההשעיה.
  6. לסובב את הצינורות ב 30 מעלות צלזיוס למשך הלילה (h ~ 16).
    הערה: אחרי ה' 16, wildtype תאים ישתפרו רוויה (~ 2 x 108 תאים למ"ל), המצוין על-ידי תרבות מעונן מאוד. זנים אחרים עשויה להימשך זמן רב להגיע רוויה, צריך להיבדק על ידי מדידת ריכוז תא עם ספקטרופוטומטרים, כפי שמצוין בשלב 1.9.4.
  7. ביום של מסלול הזמן, לאחר 16 h של דגירה, לדלל את התרבות רווי 1:50 על-ידי שימוש של pipet מ למקום 4 מיליליטר לילה תרבות לתוך 196 מ של YPD נוזלי בתוך בקבוקון סטרילי 500 מ"ל. לגדול עם טלטול-~ 200 סל ד במשך 4 שעות ב- 30 ° C.
    הערה: לאחר 4h, תרבות wildtype תגיע ריכוז יומן אמצע של ~ 1-2 x 107 תאים/מ ל....
  8. במהלך 4 שעות, תווית המבחנות (ממלכודות היפוקסיה ומים), 50 מ ל אוסף צינורות. אם החממה בשלב 1.7 לעיל אינו בשימוש עבור הקורס זמן היפוקסיה, להפעיל את חממה אחרים ולהגדיר 30 ° C.
  9. לפני העמדת תאים היפוקסיה:
    1. להוסיף שתי המבחנות סטרילי 250 מ ל אשר ישמש המלכודות מים ~ 50 מ ל מים.
    2. ממלאים 1/3 של קרח דלי עם חנקן נוזלי ויציפו מתלה פוליסטירן מוקצף להחזיק 50 מ ל צנטריפוגה צינורות.
    3. להגדיר את מערכת סינון עבור איסוף תאים. להוסיף דיסק מסנן סטרילי אל יחידת התחתון של מערכת סינון באמצעות פינצטה סטרילי, נזהר רק לגעת קצות התקליטור מסנן. למקם את יחידת מסנן העליון על גבי יחידת התחתון מסנן ולאבטח עם המלחצות מסופק עם המערכת. ודא כי היחידות תחתון ועליון מיושרים, שהוא חותם צר, אין נזילה.
    4. מודדים את ריכוז תא עם ספקטרופוטומטרים. לדלל תאים כך הם ניתן למדוד טווח ספקטרופוטומטרים-OD600 בין ~0.2 - 0.6, בהתאם ספקטרופוטומטרים ליניארי.
      הערה: יחידה אחת של600 יתר היא ~ 3 x 107 תאים למ"ל, בהתאם ספקטרופוטומטרים ומורפולוגיה של תא. ריכוז של ~ 1-2 x 107 תאים למ"ל צפוי, המתאים OD600 של ~0.33 - 0.66.
    5. להשיג במהירות את דוגמת הזמן 0.
      1. להתחבר למערכת מסנן ואקום חזק (~ 10 mbar) דרך צינורות ואקום מלכודת הבקבוק 1,000 מ. הפעל את שואב האבק. שופכים את התרבות (בדרך כלל ~ 20 מ"ל) לתוך יחידת העליון ולחכות נוזלי להילקח דרך המסנן (~ 10 s, סומך על כוחו של שואב האבק).
      2. בזהירות הסר את התקליטור מסנן עם פינצטה נקייה ומניחים לתוך שפופרת צנטרפוגה 50 מ. מיד למקם את צינור צנטריפוגה המדף שקועים חנקן נוזלי. חשוב לציין, לא מראש מקררים הצינורות לפני הוספת המסנן את כל הצינורות תתפוצץ.
      3. לאחר > 30 s, במקום הצינור בפריזר-80 ° C לחילוץ RNA מאוחר יותר. לאחר כל סינון, לנקות ולהרכיב מערכת סינון. לשטוף את המערכת על ידי משיכת מים 10 s ללא דיסק מסנן. לבסוף, לנגב היבש המערכת עם מגבת נייר.
    6. לדלל את התרבות 4 שעות לתוך מבחנות שונות על הנקודות זמן שונים, כך כל הבקבוק מגיע באמצע יומן ריכוז (~ 1-2 x 107 תאים/mL) בנקודת הזמן המצוין של היפוקסיה.
      הערה: טבלה 1 מציגה דילולים ששימשו המתח הפלואידי פראי-סוג S288C HAP1+ . מומלץ לבחון כל הזנים בתנאים אלו תרבות ובשפתיים ולהתאים את דילולים בהתאם.
    7. ברגע תאים ומדיה מתווספים מבחנות, החלף את רדיד האלומיניום המכסה את הבקבוק עם פקק המכיל שני צינורות זכוכית מוכנס.
    8. הצב המבחנות בחממה בפריסה נקבע קודם לכן.
    9. להתחבר באופן מאובטח לאורך צינור כמוצג באיור1.
    10. בדוק כל פקקים יידחפו בחוזקה לתוך הפתחים הבקבוק.
  10. בזמן 0, פתח את השסתום הרגולטור. לאחר מכן הגדר את מד זרימה 3 L/min.
    הערה: מבעבעים יתקיימו בשני בקבוקי מים, המציינת את זרימת הגז המתאים. אם זה לא המקרה, בדוק כי כל פקקים הדוקות אבובים מחובר כראוי.
  11. סגירת החממה ולהגדיר את מהירות חזק ~ 200 סל"ד. להפעיל טיימר.
  12. לפני כל נקודת זמן, להגדיר את מערכת הסינון כפי שמתוארות למעלה בשלב 1.9.3.
  13. בכל פעם נקודה (למשל, 5 דקות, 10 דקות, וכו '), יש שני אנשים לעבד במהירות את התאים כדלקמן:
    1. האדם הראשון: להסיר את הבקבוק המתאים ממחזיק ולהוציא את הפקק (עם צינורות זכוכית מצורף).
      הערה: זה לא ישברו את הזרימה של N2 לכל המבחנות תרבות שנותרו אך זמנית ישבור את זרימת למלכודת המים האחרון.
    2. המשתמש השני: Pipet 1 מ"ל של תרבות ונותנות לתוך cuvette. חבר מחדש את הצנרור מן הבקבוק תרבות זה עכשיו בסוף השורה האחרונה מלכודת מים (שפופרת אחת ווויל פקק אחד ניתן להסיר בתהליך.). לאחר מכן, למדוד ריכוז תא cuvette, כפי שתואר לעיל בשלב 1.9.4.
    3. האדם הראשון: שופכים את השארית של התרבות לתוך מערכת סינון אבק, ולאחר מכן לבצע הקפאה כמתואר לעיל בשלב 1.9.5 וסינון.
  14. לאחר סיום כל נקודות זמן, לכבות את הגז2 N. תחילה סגור הרגולטורים ולא לחכות הלחץ לשחרר, ולאחר מכן כבות מד זרימה. לבסוף, לפרק את המערכת ולנקות כל החומרים עם מים, ולאחר מכן 70% אתנול.

2. RNA החילוץ

  1. להכין מאגר RLT RNA עמודות טיהור, כפי שמתואר בטבלה חומרים.
  2. להכין הפתרון עובד של DNase על-ידי הוספת 10 µL של הפתרון מניות DNase µL 70 מאגר לקט לבוא איתך לכל דגימה (ראה טבלת חומרים).
  3. להסיר את הצינורות 50 מ ל המכיל מסנני ותאים מהמקפיא-80 ° C ומניחים על הקרח להפשיר (~ 15 דקות). בצע את השלבים הבאים עם צינורות על קרח.
  4. תווית 2 mL צינורות כובע בורג ומניחים אותם על קרח, שפופרת אחת עבור כל דגימה. להוסיף ~0.6 מ"ל של חרוזים המחומצנים כל שפופרת, באמצעות צינור microcentrifuge 1.5 mL סקופ ולמדוד את החרוזים.
  5. להוסיף 0.6 מ"ל של מאגר RLT קר הצינורות 50 מ.
  6. Pipet למעלה ולמטה כדי להסיר תאים ממסנן והשהה לתוך פתרון. הימנע נותן את המסנן נשארים בתמיסה כפי המסנן לספוג את הפתרון. להסיר כל פתרון נספג את המסנן על-ידי שימוש בקצה pipet לסחוט את המסנן הקיר של הצינור.
  7. העברה כל הנוזל מהצינור 50 מ ל הצינורות בורג-כיפה המכילה חרוזים.
  8. למקם את הצינורות בורג-קאפ מהמגן מיל חרוז ולרוץ מין אחד.
    מיד במקום הצינורות על קרח למשך שלוש דקות. שוב, למקם את הצינורות מהמגן ולרוץ מין אחד.
  9. הסר את הצינורות מהמגן והמקום בקרח במשך 5 דקות. החרוזים יסדר לתחתית של הצינורות.
  10. בצע את שאר השלבים בטמפרטורת החדר.
  11. עם pipet, להעביר רק את lysate (~ 350 µL), הימנעות את החרוזים, אל צינור 1.5 מ ל microcentrifuge.
  12. Microcentrifuge למשך 2 דקות מהירות מקסימלית, ואז העברת תגובת שיקוע צינור 1.5 מ ל microcentrifuge.
  13. להוסיף נפח 1 של 70% אתנול (ייוצרו מאתנול הוכחה לביולוגיה מולקולרית כיתה 200). מערבבים היטב בעזרת pipetting.
  14. להעביר את הפתרון וכל precipitate לעמודה ה-RNA הושם בתוך צינור אוסף 2 מ"ל.
  15. צנטריפוגה 15 s-≥12, 000 x g , להשליך הזרימה דרך (הנוזל בצינור).
  16. µL 350 מאגר RW1 להוסיף העמודה. צנטריפוגה 15 s-≥12, 000 גרם x, להשליך הזרימה דרך.
  17. להוסיף 80 µL DNase אני הדגירה מיקס למוח עמודה (לא לעלות על צידי הצינור) מאפשרים לשבת למשך 15 דקות.
  18. להוסיף 350 µL מאגר RW1 עמודה. Microcentrifuge s-≥12 15, 000 x g , להשליך הזרימה דרך.
  19. להוסיף 500 µL מאגר RPE העמודה. Microcentrifuge s-≥12 15, 000 x g ו להשליך זרימה דרך.
  20. להוסיף 500 µL מאגר RPE העמודה. Microcentrifuge למשך 2 דקות ב≥12, 000 x g.
  21. בזהירות להסיר את העמודה, למקם את צינור אוסף 2 מ"ל. Microcentrifuge במלוא המהירות עבור 1 דקות (כדי הקרום יבש לחלוטין).
  22. למחוק את הצינור אוסף ולמקם את העמודה לתוך צינור microcentrifuge 1.5 mL. להוסיף 30 µL של מים נטולי RNase קרום עמודה.
  23. Elute את הרנ א מן העמודה על-ידי microcentrifuging עבור 1 דקות ב≥12, 000 x g. בעת טעינת העמודים לתוך microcentrifuge, ודא שהמכסים של הצינור אוסף פונות לכיוון לצנטריפוגה ספינים, כדי למנוע את המכסים מנתק מגע.
  24. להוסיף עוד 30 µL של מים נטולי RNase ממברנה עמודה, תוך שמירה על העמודה בצינור microcentrifuge אותו.
  25. Microcentrifuge עבור 1 דקות ב≥12, 000 x g, כך שאמצעי האחסון eluate הסופי 60 µL.
  26. לאחסן כל שפופרת 1.5 mL המכיל 60 µL של RNA במקפיא-80 ° C.

3. קביעת ריכוז ה-RNA ואיכות

  1. למדוד את הריכוז של RNA ו- DNA בכל מדגם ה-RNA, באמצעות fluorometer (a), צבע (b) DNA ו RNA-ספציפי פלורסנט וצינורות assay (ג), כפי שמפורט בטבלה חומרים. בצע את ההוראות של fluorometer ושל הצבעים.
  2. לחלופין, מודדים את ריכוז חומצת גרעין עם ספקטרופוטומטרים UV שוכן בגובה 260 ננומטר.
    הערה: קריאת260 A של 1.0 הוא שווה ערך ל RNA חד-גדילי ~ 40 µg/mL.
  3. מבחן RNA איכות על ידי הפעלת את הרנ א על מנתח מסחרי חומצת גרעין (ראה טבלת חומרים) או על תקן פורמלדהיד/agarose ג'ל 26.

4. RNA-seq ניתוח

  1. מן המלאי RNA הכולל, לפצות µL 21 של 100 ng/µL RNA במים נטולי RNase. השתמש µL 1 של זו µL 21 כדי לבדוק את ריכוז ה-RNA כמפורט לעיל. שלח את הנותרים 20 µL (2 µg) הכולל רנ א רצף חיצוני מרכז העשרה mRNA, הכנת ספריה ספציפית סטרנד (עם 8 או יותר ברקודים עבור ריבוב) ורצף (ראה טבלת חומרים). לחלופין, לבצע באופן מקומי mRNA העשרה והכנה ספריה, ולאחר מכן לשלוח לספרייה. רצף.
  2. בריכת 8 או יותר דוגמאות מרובבת ואת רצף בנתיב אחד של ברצף הדור הבא.
  3. הורד את הקובץ FASTQ המכיל את כל הקריאות רצף וקורא האינדקס המתאים. כמו כן, הורד את קובץ הטקסט המכיל את מולטיפלקס ברקודים.
    הערה: קריאות אינדקס עשוי להיות נוכח קובץ נפרד FASTQ. מקם את כל הקבצים האלה לתוך ספרייה אחת.
  4. במקום ה-script של מעטפת שסופק כאן, "fastq_pipeline.sh", באותה ספריה. ערוך את התסריט הזה לפי הצורך את הניסוי וספריות המחשב.
    הערה: קובץ script זה מכיל הסברים נרחבים להסביר את הצעדים. בקצרה, איכות התסריט שמקצרת את הקריאות ממפה את הקריאות הגנום, יוצרת קובץ מופרד באמצעות טאב המכיל את מספר קריאות לפי ג'ין עבור כל דגימה.
  5. להפקיד את FASTQ קבצים ונתונים גולמיים ספירת קריאה לתוך Omnibus ביטוי גנים של NCBI לפני פרסום 27. בצע את ההוראות עבור "Submitting נתונים תפוקה גבוהה רצף גיאוגרפי": https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/info/seq.html.
  6. ייבוא נתוני ספירת קריאה לסביבת סטטיסטי של R ולבצע ניתוח סטטיסטי, שימוש ב- script של R שסופק כאן, "time_course_script. R". ערוך את התסריט הזה לפי הצורך את הניסוי וספריות המחשב.
    הערה: קובץ script זה מכיל הסברים נרחבים להסביר את הצעדים. בקצרה, קובץ script זה מייבא את הנתונים קריאה, מווסת את הקריאות, מזהה את הגנים לשנות בצורה משמעותית במהלך הזמן, מבצע ניתוח PCA וגרפים את הביטוי של גנים שנבחרו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

מסלול הזמן היפוקסיה וניתוח RNA-seq בוצעו באופן עצמאי שלוש פעמים. כדי לבחון את הפארמצבטית של משכפל שלוש, ג'ין ביטוי נתונים עבור כל הגנים היה נותחה באמצעות ניתוח הרכיב העיקרי (PCA). איור 2 מציג כיצד לשנות הדוגמאות על הרכיבים העיקריים שני הראשונים, אשר ביחד מייצגים 58.9% ההשתנות. ניתוח זה יצוין כי כל הזמן קורס נספחים שינויים דומים (כפי שמתואר על ידי הצורה דומה של כל עקומה). בנוסף, משכפל שני היו דומה יותר אחד לשני מאשר שכפול הראשון. . זה עקבי עם העובדה כי משכפל שתי האחרונות בוצעו על ידי אותו האדם באמצעות את אצוות זהה של רכיבי המדיה, בזמן שכפול הראשון בוצע על ידי אדם אחר, אצוות. ממצא זה מדגיש את העובדה כי העקביות של טכניקה וכימיקלים הוא גורם חשוב בקבלת הפארמצבטית גבוהה. לבסוף, PCA ניתוח יעיל בהערכת אם הנקודות שבחרת זמן ללכוד את השינויים העיקריים המתרחשים במהלך הזמן. התמקדות עקומת שכפל אחד, ישנם מרחקים גדולים בין הדגימות קודמות, המציין שינויים גדולים ביטוי גנים ב, מרחקים קטנים יותר בין הדגימות מאוחר יותר, המציין שינויים קטנים יותר ואולי בסוף המתג מהחלק אירובי כדי ביטוי גנים ובשפתיים.

בשלב הבא, החבילה DESeq2 R25 שימש לזיהוי גנים מציג שינוי משמעותי לעומת זמן 0 (p-ערכים משלימים טבלה 1). הגנים האלה משמעותיים, 607 השתנה יותר 4-fold (קיפול לשינויים משלים טבלה 1). דפוסי ביטוי של גנים אלו היו מקובצים, כך גנים מוסדר באופן דומה היו מקובצים יחד, הוצגו לאחר מכן heatmap (איור 3). איור זה מציג כי הביטוי שינויים הם מאוד לשחזור פני משכפל. כמו כן, הגנים התערוכה קינטיקה משתנה עם עליות וגם ירידות בביטוי. גנים רבים שהפגינו גידול שיא או להקטין ב- 30 דקות, ככל הנראה בגלל התגובה מתח ארעי 13.

איור 4 מתאר את הביטוי של שני downregulated, שני גנים upregulated בעבר מצאו להיות O2-מוסדר. הגנים לשנות את הביטוי reproducibly, עם עקומות דומה בין משכפל ביולוגי. הגן עם ההשתנות לפחות בין משכפל היא DAN1, עם חפיפה עקומות. הגן עם השתנות ביותר הוא CYC1, אולי כי הביטוי של גן זה הוא משתנה באופן טבעי. איור זה מדגים גם שינויים קיפול גדול (עד 1,024-fold) אותרו.

כדי לזהות את התהליכים הסלולר מועשר בערכת O ועוד 607 חסימות2-גנים מוסדר, המונח ללכת העשרה היה לבצע (משלים בטבלה 2). כצפוי, O רבים2-גנים מוסדר תפקיד בנשימה תאית, היבטים אחרים של חילוף חומרים, וב -תהליכים ribosomal 13.

לדוגמה # זמן היפוקסיה תרבות mL + mL YPD
2 5 דקות 20 מ ל + 0 מ
3 10 דקות 20 מ ל + 0 מ
4 30 דקות 20 מ ל + 0 מ
5 60 דקות 10 מ ל + 10 מ
6 120 דקות 10 מ ל + 10 מ
7 180 דקות 5 מ ל + 15 מ"ל
8 240 דקות 4 מ"ל + 16 מ"ל

טבלה 1. תא דילולים ביצע בזמן 0.
אלה דילולים השפעול שנקבע כתוצאה בריכוז יומן אמצע (1-2 × 107 תאים/mL) לאחר המועד המצוין N2.

משלים טבלה 1. נתונים סטטיסטיים עבור כל הגנים וביטוי.
טבלה זו מכילה שם שיטתית, ערכי p מנוכי עונתיות שבע בדיקות DESeq2 (כלומר, 5 דקות לעומת 0 דקות, 10 דקות לעומת 0 דקות, וכו '), המינימום מותאם ערך-p, והשינוי log2 המרבי הקיפול. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

משלים בטבלה 2. ללכת בטווח תוצאות העשרה.
טבלה זו מציגה ללכת תהליכים, וייצוגן בערכה של O ועוד 607 חסימות2-מוסדר גנים וייצוג שלהם הגנום. לאחר מכן, הבדיקה מתפלג שימש כדי לזהות תנאי קדימה היו באופן משמעותי יותר - או שאינם מיוצגים בערכה של גנים ועוד 607 חסימות. ללכת העשרה והניתוח נעשה באמצעות ממפה דק גו ב SGD 28. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

Figure 1
איור 1. היפוקסיה הגדרת נקודות זמן לקיחת מבלי לשבש את פעולת זרימת הגז לנקודות זמן מאוחר יותר.
חשוב כי כל חיבורי נשארים מאובטחת, כמפורט בפרוטוקול. שים לב למיקום קצר (9 ס מ) ואת זמן צינורות זכוכית (17 ס מ). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
באיור 2. המנהל ניתוח גורמים (PCA) מציג את קשרי הגומלין בין שלושה ביולוגי משכפל.
כל עקומה יש את דקות 0 ל- 240 דקות דוגמאות לפי סדר. בביטוי הגן log2 מנורמל עבור כל הגנים היה בשימוש PCA. PC1 חשבונות עבור 34.7% של סטיה הכולל ו- PC2 חשבונות עבור 24.2%. הקו השחור שכפול הראשון, הקו האדום הוא השני, הקו הכחול הוא השלישי. שימו לב כי נעשה שימוש בחצים כדי להצביע על מינימום 240 נקודות זמן בדגימות שונות. ניתוח גורמים ראשיים (PCA) בוצע ב- R באמצעות הפונקציה prcomp (Q-mode או פירוק ערך יחיד) על המטריקס טרנספורמציה-log2 המכיל גנים בעמודות ונקודות זמן שורות 29. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3. Heatmap מציג הבעת 607 הגנים המזוהה כ- O2-מוסדר.
גנים אלה היו משמעותיות לפחות אחת הבדיקות DESeq2 ושינתה את הביטוי על-ידי יותר מ 4-fold. המוצג הוא יומן2(ביטוי יחסי). אדום = ביטוי מוגבר. ירוק = ביטוי ירד. עוצמת הצבע הוא יחסי מידת השינוי. לפני יצירת את heatmap TreeView 30, ביטוי גנים היה k-אמצעי מקובצים באשכולות עם k = 10 אשכולות 3.0 31. המפתח מתחת heatmap מראה הסולם. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
באיור 4. רמות ה-mRNA היחסי של ארבעה גנים לאורך זמן בשלושת משכפל.
הקו השחור שכפול הראשון, הקו האדום הוא השני, הקו הכחול הוא השלישי. גן משותף/שיטתי שמות הם CYC1/YJR048W, ERG5/YMR015C, DAN1/YJR150Cו- NCE103/YNL036W. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

קובץ משלים 1. fastq_pipeline.sh
אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

קובץ משלים 2. time_course_script. R
אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

במחקר זה, רמות ה-mRNA של כל הגנים נמדדה במהלך היפוקסיה ב ס cerevisiaeהשמרים. המטרה הייתה לבחון שינויים בביטוי גנים איך כלליים עקב גדילה בסביבה מבוקרת ליד-אנאוקסיים. מספר פעולות נעשו כדי להבטיח כי השיטה המתוארת כאן היה מבוקר ובזהירות לשחזור. ראשית, תאים נחשפו לסביבה ובשפתיים מוגדרים במדויק: 99.999% N2 במדיה עשירים (YPD). מחקרים אחרים של היפוקסיה סגרה הבקבוק או צינור האווירית, 32, היה. היפוקסיה-מימטי קובלט כלוריד 33או מועסק בתדר היפוקסיה אנאירובית צ'יימברס או שקיות 34. כל השיטות האלה עלולים לגרום רמות משתנות של היפוקסיה או שינויים סביבתיים אחרים לא מכוונות. זה יהיה שימושי ללמוד ביטוי גנים בזמן משתנה באופן שיטתי את תערובת גז (למשל, 90% N2 ו 10% O2), כמו שמרים בטבע נוטות פחות חמורה תנאים ובשפתיים. שנית, ergosterol, חומצות שומן בלתי רוויות (למשל, Tween 80) לא נוספו לכלי התקשורת תרבות, מאז הם להשפיע על ביטוי גנים כפי שפורט במבוא. שלישית, כדי למזער את ג'ין ביטוי השינויים שנגרמו על ידי שלבים שונים של צמיחה, מדעית המוגדרות על-ידי דילולים בוצעו כך תרבות הגיעה נקודת זמן, זה היה בשלב אמצע יומן של צמיחה (~ 1-2 x 107 תאים/mL). הרביעי מהירה סינון, קפוא (~ 15 s) של תאים הוסרו ממנו היפוקסיה היא קריטית, כמו שינויים בביטוי הגנים יכול להתרחש < 5 דקות של חשיפה O2, כפי מתרחשת כאשר התאים נאספים על ידי צנטריפוגה (נתונים לא מוצג). הפעם שבה תאים נחשפים O2 יכול להיות מופחת על ידי ביצוע הגידול והקציר של תאים הוד אנאוקסיים או קאמרית. חמישית, זן המתאים נבחר במחקר זה; עולה בקנה אחד עם מחקרים אחרים גנומית, הועסק ברקע זן נפוץ של המעבדה S288C. אולם, זנים S288C מכיל של אלל mutant hap1 , ולכן היה לתיקון 11. פעולה זו מותרת המחקר של גנים כמו CYC1 להגיב לרמות2 O via פקטור שעתוק Hap1 11.

נקודות זמן נבחרו כי הם הציג שינויים ביטוי גנים גדולים בניסויים היפוקסיה הקודם. התוצאות המוצגות כאן ניתן ליידע ניסויים עתידיים. לדוגמה, זה יהיה מועיל להשתמש ברזולוציה גבוהה יותר של נקודות זמן במהלך מרווחי המראים שינויים גדולים (למשל, 0 כדי 30 דקות היפוקסיה) ללכוד יותר דק קינטיקה מגוונות. בנוסף, נקודות זמן מאוחר יותר, מעבר תקופת הזמן לבדיקה כאן (כלומר, 4 שעות של היפוקסיה) עלול לגלות עוד שינויים בביטוי.

RNA-seq שימש כדי למדוד את רמות ה-mRNA כי שלה הפארמצבטית ואת טווח דינמי רחב מאפשר מדידה של קיפול גדול שינויים 18,35. RNA היה שחולצו על ידי הפרעה מכנית של התאים באמצעות חרוזים נמרצות מזועזעת, מטוהרת על עמודה. שיטות טיהור אחרות RNA יכול לשמש, כגון פנול חם 36. באופן אידיאלי, ריכוז ה-RNA יהיה בטווח של 200 ng/µL - 1000 ng/µL מאז ריכוז ה-RNA לדלל כדי 100 ng/µL עבור שעתוק במהופך והכנת ספריית. יש למדוד את ריכוז ה-RNA עם fluorometer, צבען RNA ספציפיים; ספקטרופוטומטרים UV מוגבל כי היא מודדת ריכוז מוחלט של חומצות גרעין, המורכב של DNA ו- RNA. האיכות של RNA נקבעת על-ידי אלקטרופורזה בג'ל; להקות ribosomal RNA צריך להיות מוגדר היטב על הג'ל, מריחת המציין RNA השפלה. . הנה, mRNA התמלילים היו מועשר, אך קיימות שיטות מגוונות עבור בידוד שונות RNA סוגי 20 זה יכול להיות גם חשוב בתגובה.

כדי לחסוך במשאבים, בין 8 ל- 12 היו מרובב ודוגמאות וסודרו יחד בנתיב אחד, וכתוצאה מכך ממוצע הקריאות 693 לפחות לכל הגן עבור כל דגימה, מספיק reproducibly לקבוע את מספר הקריאות לכל הגנים. למעשה, יותר מ-12 דוגמאות יכול להיות מרובב בנתיב אחד, סביר להניח וכתוצאה מכך דגימה נאותה של רוב הגנים. על מנת לחשב שהממוצע קורא לכל גן, המספר הכולל של קריאות ממופה כדי גנים (בקובץ הפלט HTSeq) הייתה מחולקת לפי מספר גנים מסופקים HTSeq (במחקר זה, 7140). בעת הערכת המספר המרבי של דגימות זה יכול להיות מרובב בנתיב אחד, שקול הגנים של עניין, כי התערוכה הביטוי הנמוך (קרי, הנמוך ביותר מנורמל נחשב), באמצעות נתוני זה ומחקרים נוספים RNA-seq. אם הסעיפים קריאה מנורמלת עבור גן להשתנות באופן משמעותי על פני משכפל, ולאחר מכן מספר הקריאות עשוי להיות נמוך מדי, רומז כי דגימות פחות צריך להיות מרובב לכל רצף ליין.

הדור הבא רצפי יפיק FASTQ קבצים המכילים את הקריאות ומידע נוסף. במידה ובוצע ריבוב, ייתכן שיופקו ברקוד קובץ וקובץ FASTQ נוספים. ניתן להוריד קבצים אלה לצורך ניתוח מקומי, כמו פרוטוקול זה. לחלופין, יש מספר רצף הדור הבא באינטרנט כלי ניתוח לאלו שלא מכירים של פונקציות שורת הפקודה או R. בהקשר זה, אנו ממליצים על גלקסי (https://usegalaxy.org/) 37 ו- GenomeSpace (http://www.genomespace.org/). בפרוטוקול הנוכחי, שני תסריטים שנכתבו על-ידי המחברים משמשים לניתוח עיבוד והבעה FASTQ. קבצי ה-script המבואר היטב, ניתן לערוך עבור עיצובים מוטוריים שונים והתקנות המחשב. גם, קבצי ה-script שני ועל הטבלה "חומרים" לספק אתרי אינטרנט עבור הורדת הכלים המשמשים התסריטים האלה. התסריט הראשון, "fastq_pipeline.sh", תסריט מעטפת להתנהל בשורת הפקודה של מסוף UNIX/Linux. קובץ script זה ריבוב הקובץ המקורי FASTQ, המכיל את כל הקריאות המתקבל ליין אחד של הרצפים (sequencer), ובכך יצירת קובץ FASTQ אחד עבור כל דגימה נוכח בנתיב הזה. בשלב הבא, הקריאות בכל קובץ FASTQ הינם באיכות חיתוך באמצעות Trimmomatic עם הגדרות ברירת מחדל 21. קריאות החתוך ממופים ואז הגנום הפניה S288C cerevisiae ס (SGD R64-1-1_20110203) באמצעות TopHat2 עם הגדרות ברירת מחדל 22. קובץ ה-script משתמש סוף סוף HTSeq כדי לקבוע את מספר הקריאות הממפות כל תכונה המבואר 19.

בתסריט השני, "time_course_script. R", גם נכתב על ידי המחברים ולהפעיל בתוך הסביבה סטטיסטי R 24. קובץ ה-script בתחילה יבוא למסמך הן נתוני ספירת קריאה שנוצרו על-ידי HTSeq. כל מדגם ההנחה תהיה נקודת זמן ומאורגן וכך ביחס לנקודות זמן אחרים. ספירת קריאה גלם מיובאים ואז לתוך החבילה R, DESeq2 25, על מנת לזהות את הגנים באים לידי ביטוי באופן שונה בכל אחד של נקודות זמן יחסית הראשון (דהיינו, אירובי, זמן 0). בגלל הגמישות שלה, DESeq2 ניתן לבצע בדיקות סטטיסטיות אחרים, כגון ביטוי משתנה כפונקציה של הזמן 13. לחלופין, כלים אחרים העסקת פרמטרית, ללא פרמטרי סטטיסטיקה עבור ה-RNA-seq לקרוא ספירת נתונים יכול להיות בשימוש 20. קובץ ה-script ואז מווסת את ספירת קריאה כדי לשלוט על מידת רצף של כל דגימה, ומשנה log2 הסעיפים. קריאות מעובדים אלה משמשות לביצוע ניתוח PCA, כדי לקבוע את השינוי-הקיפול המרבי עבור כל ג'ין, וכדי ליצור הגרפים ביטוי באיור4.

נושא חשוב הוא כיצד עדיף להעסיק סטטיסטיקה לזיהוי גנים להגיב באופן משמעותי היפוקסיה. לפחות שלושה משכפל הביולוגי של מסלול הזמן נחוצים לחשב את ההשתנות הטבעי של כל הגנים ולקבוע ובכך גנים המגיבות היפוקסיה באופן משמעותי יותר מהצפוי במקרה. לחלופין, זה אפשרי לזיהוי גנים שמגיבים לאורך זמן, בלי משכפל ביולוגי 13,25,38,39בהצלחה. החיסרון העיקרי לשיטות אלו הוא שהם לא לקחת בחשבון את ההשתנות הביולוגי של כל הגן. עם זאת, אם ה-RNA-seq משכפל לא יבוצעו, שינויים בביטוי הגנים הבודדים היתה אפשרות לאמת על ידי ביצוע ש-RT-qPCR עם ביולוגית מרובים משכפל 13.

יש שתי יתרונות עיקריים כדי לבדוק מספר נקודות זמן תגובה. ראשית, כפי שפורט קודם לכן (במיוחד ב- איור 2), קורס זמן מזהה את המרווחים מפגין שינויים ביטוי גדול, להודיע האם נדרש כדי לשפר את הרזולוציה של קינטיקה או לצפות אירועים מאוחרים יותר של נקודות זמן נוסף תגובה. שנית, קורס זמן מאפשר את הבידול של קינטיקה של ג'ין כל ביטוי. זה עוזר עם זיהוי ייחודי איתות המסלולים שפועלים בזמנים מסוימים במהלך התגובה, מעניק תובנה העיתוי של חניכה והפסקתם איתות. באופן ספציפי, קיבוץ באשכולות של גנים על ידי דפוס ביטוי שבוצעה כאן הביאה קבוצות של גנים במשותף מוסדר. היזמים של קבוצת גנים עשויים לשתף אתר איגוד פקטור שעתוק, רומז כי הגורם שעתוק הופכת לפעילה בעת הגנים לשנות את הביטוי.

כשלומדים תגובה תאית, ההשתנות שנצפה הוא אידיאלי עקב הגירוי (למשל, היפוקסיה) ולא על המשתנים ניסיוני. עם זאת, כפי שניתן לראות באיור2, החוקר בודדים ו/או על קבוצות של רכיבי המדיה לבצע תרומות ההשתנות ביטוי גנים. לפיכך, פרמטרים אלה יש לקחת בחשבון על מנת להשיג הפארמצבטית גבוהה ולשינויים ניסיוני מינימלי. זמן מועט ככל האפשר צריך להפריד כל שכפול, כי משתנים ניסיוני נוטים יותר לשנות ככל שחולף הזמן.

לסיכום, בשיטה זו ניתן לעקוב במדויק אחר שינויים ברמת הגנום רמות ה-mRNA (או אירועים אחרים כגון שינויים היסטון או רמות החלבון) במהלך הזמן היפוקסיה. השיטה ניתן להתאים עבור אורגניזמים אחרים, במיוחד מיני חיידקים כי ניתן לגדל בתרבות נוזלי. ניתוח זמן-קורס כזה הגנום כולו ישלים מחקרים של מורפולוגיה תאים, פעילות החלבון ואת חילוף החומרים. יחד, נתונים אלה יוביל להבנה עשירה יותר של תגובה תאית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

אנו מודים מכון לואיס-סיגלר על מתקן הליבה רצף גנומיקה אינטגרטיבית ב אוניברסיטת פרינסטון עצות טכניות ועל הכנה ספריית ה-RNA ורצף. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מאוניברסיטת רוואן ו NIH NIGMS R15GM113187 M.J.H.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Enclosed dry incubator Thermo Scientific MaxQ 4000 Set at 30 °C. Modify the door to allow entry of one Tygon tube. Alternatively, use the New Brunswick G25 incubator, which contains a tube port. Do not use an open-air water shaker, as condensation will collect in the tubes between flasks, possibly cross-contaminating cultures.
Micro-analysis Filter Holder Millipore XX1002530 25mm diameter, stainless steel support, no. 5 perforated silicone stopper mounts in standard 125 mL filtering flask
Strong vacuum Edwards E-LAB 2 The “house” vacuum may be too weak. Alternatively, use an electric-power portable vacuum pump like the one listed here.
1,000 mL flask To act as vacuum trap.
~2 foot lengths of Heavy Wall Vacuum Tubing, inner diameter 3/8 in, outer diameter 7/8 in Tygon 38TT Two pieces: the first connects vacuum to trap, and the second connects trap to filter system.
High-pressure N2 gas tank 99.999% purity, >1,000 psi, with a regulator and gas flow controller
Autoclaved 500 mL flask Opening covered with aluminum foil. One for each yeast strain.
Autoclaved 250 mL flasks Openings covered with aluminum foil. One for each time point plus two for water traps.
Flask stoppers (size 6, two holes with 5 mm diameter) Sterilized with 70% ethanol. One for each flask.
Glass tubing, length 9 cm or 17 cm, inner diameter 2 mm, outer diameter 5 mm Sterilized with 70% ethanol. Two tubes for each flask. Place into the holes of each stopper. See Figure 1 for placement of 9- vs 17- cm tubes.
~25 cm lengths of plastic tubing, inner diameter 5 mm Tygon E-3603 One piece for each flask. Sterilized with 70% ethanol.
Sterile filter discs Millipore HAWP02500 25 mm diameter, 0.45 µm pore size, one for each time point
Sterile dH2O (~100 mL)
1 mL cuvettes For measuring OD600 (i.e., cell concentration)
50 mL sterile centrifuge tubes One for each time point
Clean and sterile tweezers
liquid nitrogen For freezing cells
acid-washed beads Sigma G8772 Keep at 4 °C for lysing cells
Qiagen RNeasy Mini Kit Qiagen 74104 For RNA column purification
Qiagen RLT buffer Prepare by adding 10 µL of β-Mercaptoethanol per 1 mL of RLT buffer, keep at 4 °C.
2 mL collection tubes Qiagen included in the Qiagen Rneasy Mini Kit
Buffer RPE Qiagen included in the Qiagen Rneasy Mini Kit
Buffer RW1 Qiagen included in the Qiagen Rneasy Mini Kit
DNase I stock and working solutions Qiagen 79254 The DNase I enzyme comes as lyophilized powder in a glass vial. Using a sterile needle and syringe, inject 550 µL of RNase-free water (provided in Qiagen kit) into the vial. Mix by gently inverting the bottle. To avoid denaturing the enzyme, do not vortex. Using a pipet, remove this stock solution from the vial and store in freezer (-20 °C) in single-use aliquots (80 µL each). The stock solution should not be thawed and refrozen.
Buffer RDD Qiagen included in the Qiagen DNase Kit
Ice cold 2 mL screw-cap tubes For lysing cells during RNA extraction
bead mill homogenizer Biospec Mini-Beadbeater-24 112011 Keep in cold room
Bacto Peptone BD DF0118 for liquid YPD media
Bacto Yeast Extract BD DF0886 for liquid YPD media
glucose Fisher D16 for liquid YPD media
Qubit assay tubes Thermo Fisher Q32856 for measuring nucleic acid concentration
Quant-iTTM dsDNA BR Assay Kit Thermo Fisher Q32853 for measuring nucleic acid concentration
Quant-iTTM RNA Assay Kit Thermo Fisher Q32855 for measuring nucleic acid concentration
Qubit Fluorometer Thermo Fisher Q33216 for measuring nucleic acid concentration
Commercial electrophoresis system Agilent Bioanalyzer 2100 for measuring nucleic acid quality
Next-generation sequencer Illumina HiSeq 2500 for sequencing libraries
automated liquid handling system Wafergen Apollo 324 for creating sequencing libraries
PrepX PolyA mRNA Isolation Kit Wafergen 400047 for isolating mRNA from total RNA
PrepX RNA SEQ for Illumina Library Kit Wafergen 400039 for creating strand-specific sequencing libraries from total RNA
Barcode Splitter https://toolshed.g2.bx.psu.edu/repository?repository_id=7119c4f7a89efa57&changeset_revision=e7b7cdc1834d
Samtools, which includes the gzip command http://www.htslib.org/download/
Trimmomatic http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic
Bowtie2 (installed before TopHat) http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml
TopHat https://ccb.jhu.edu/software/tophat/index.shtml
HTSeq http://www-huber.embl.de/HTSeq/doc/overview.html
R (installed before R Studio) https://cran.rstudio.com
R Studio (free version) https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Semenza, G. L. Oxygen sensing, homeostasis, and disease. New Eng. J Med. 365 (6), 537-547 (2011).
  2. Butler, G. Hypoxia and gene expression in eukaryotic microbes. Annu. Rev. Micro. 67, 291-312 (2013).
  3. Ratcliffe, P. J. Oxygen sensing and hypoxia signalling pathways in animals: the implications of physiology for cancer. J. Physiol. 591 (Pt 8), 2027-2042 (2013).
  4. Rosenfeld, E., Beauvoit, B. Role of the non-respiratory pathways in the utilization of molecular oxygen bySaccharomyces cerevisiae. Yeast. 20 (13), 1115-1144 (2003).
  5. Ter Linde, J. J., et al. Genome-wide transcriptional analysis of aerobic and anaerobic chemostat cultures of Saccharomyces cerevisiae. J. Bacteriol. 181 (24), 7409-7413 (1999).
  6. Ter Linde, J. J., Steensma, H. Y. A microarray-assisted screen for potential Hap1 and Rox1 target genes in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 19 (10), 825-840 (2002).
  7. Kwast, K. E., et al. Genomic analyses of anaerobically induced genes in Saccharomyces cerevisiae: functional roles of Rox1 and other factors in mediating the anoxic response. J. Bacteriol. 184 (1), 250-265 (2002).
  8. Becerra, M., et al. The yeast transcriptome in aerobic and hypoxic conditions: effects of hap1, rox1, rox3 and srb10 deletions. Mol. Microbiol. 43 (3), 545-555 (2002).
  9. Lai, L. -C., Kosorukoff, A. L., Burke, P. V., Kwast, K. E. Dynamical remodeling of the transcriptome during short-term anaerobiosis in Saccharomyces cerevisiae: differential response and role of Msn2 and/or Msn4 and other factors in galactose and glucose media. Mol. Cell. Biol. 25 (10), 4075-4091 (2005).
  10. Lai, L. C., Kosorukoff, A. L., Burke, P. V., Kwast, K. E. Metabolic-State-Dependent Remodeling of the Transcriptome in Response to Anoxia and Subsequent Reoxygenation in Saccharomyces cerevisiae. Euk. Cell. 5 (9), 1468-1489 (2006).
  11. Hickman, M. J., Winston, F. Heme levels switch the function of Hap1 of Saccharomyces cerevisiae between transcriptional activator and transcriptional repressor. Mol. Cell. Biol. 27 (21), 7414-7424 (2007).
  12. Hickman, M. J., Spatt, D., Winston, F. The Hog1 mitogen-activated protein kinase mediates a hypoxic response in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 188 (2), 325-338 (2011).
  13. Bendjilali, N., et al. Time-Course Analysis of Gene Expression During the Saccharomyces cerevisiae Hypoxic Response. G3. 7 (1), 221-231 (2017).
  14. Chellappa, R., et al. The membrane proteins, Spt23p and Mga2p, play distinct roles in the activation of Saccharomyces cerevisiae OLE1 gene expression. Fatty acid-mediated regulation of Mga2p activity is independent of its proteolytic processing into a soluble transcription activator. J. Biol. Chem. 276 (47), 43548-43556 (2001).
  15. Abramova, N. E., et al. Regulatory mechanisms controlling expression of the DAN/TIR mannoprotein genes during anaerobic remodeling of the cell wall in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 157 (3), 1169-1177 (2001).
  16. Hughes, A. L., Todd, B. L., Espenshade, P. J. SREBP Pathway Responds to Sterols and Functions as an Oxygen Sensor in Fission Yeast. Cell. 120 (6), 831-842 (2005).
  17. Gaisne, M., Bécam, A. M., Verdière, J., Herbert, C. J. A "natural" mutation in Saccharomyces cerevisiae strains derived from S288c affects the complex regulatory gene HAP1 (CYP1). Curr. Gen. 36 (4), 195-200 (1999).
  18. Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat. Rev. Gen. 10 (1), 57-63 (2009).
  19. Anders, S., Huber, W. Differential expression analysis for sequence count data. Genome Biol. 11 (10), R106 (2010).
  20. Conesa, A., et al. A survey of best practices for RNA-seq data analysis. Genome Biol. 17 (1), 13 (2016).
  21. Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinf. 30 (15), 2114-2120 (2014).
  22. Kim, D., Pertea, G., Trapnell, C., Pimentel, H., Kelley, R., Salzberg, S. L. TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions. Genome Biol. 14 (4), R36 (2013).
  23. Anders, S., Pyl, P. T., Huber, W. HTSeq--A Python framework to work with high-throughput sequencing data. Bioinf. 31 (2), 166-169 (2015).
  24. R Core Team. R: A Language and Environment for Statistical Computing. , R Foundation for Statistical Computing. Vienna. Available from: https://www.R-project.org (2015).
  25. Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biol. 15 (12), 550 (2014).
  26. Brown, T., Mackey, K., Du, T. Analysis of RNA by Northern and Slot Blot Hybridization. Curr. Prot. Mol. Biol. 74, 4.9.1-4.9.19 (2004).
  27. Edgar, R., Domrachev, M., Lash, A. E. Gene Expression Omnibus: NCBI gene expression and hybridization array data repository. Nuc. Acids Res. 30 (1), 207-210 (2002).
  28. Cherry, J. M., et al. Saccharomyces Genome Database: the genomics resource of budding yeast. Nuc. Acids Res. 40, D700-D705 (2012).
  29. Hothorn, T., Everitt, B. S. A Handbook of Statistical Analyses using R. , 3rd ed, CRC Press: Taylor & Francis Group. Boca Raton, FL. (2014).
  30. Saldanha, A. J. Java Treeview--extensible visualization of microarray data. Bioinformatics. 20 (17), 3246-3248 (2004).
  31. Eisen, M. B., Spellman, P. T., Brown, P. O., Botstein, D. Cluster analysis and display of genome-wide expression patterns. Proc. Nat. Acad. Sci. 95 (25), 14863-14868 (1998).
  32. Davies, B. S. J., Rine, J. A Role for Sterol Levels in Oxygen Sensing in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 174 (1), 191-201 (2006).
  33. Meena, R. C., Kumar, N., Nath, S., Chakrabarti, A. Homologous Recombination is Activated at Early Time Points Following Exposure to Cobalt Chloride Induced Hypoxic Conditions in Saccharomyces cerevisiae. Ind. J. Microb. 52 (2), 209-214 (2012).
  34. Snoek, I. S. I., Tai, S. L., Pronk, J. T., Yde Steensma, H., Daran, J. -M. Involvement of Snf7p and Rim101p in the transcriptional regulation of TIR1 and other anaerobically upregulated genes in Saccharomyces cerevisiae. FEMS Yeast Res. 10 (4), 367-384 (2010).
  35. Ellahi, A., Thurtle, D. M., Rine, J. The Chromatin and Transcriptional Landscape of Native Saccharomyces cerevisiae Telomeres and Subtelomeric Domains. Genetics. 200 (2), 505-521 (2015).
  36. Collart, M. A., Oliviero, S., et al. Preparation of yeast RNA. Curr. Prot. Mol. Biol. , (2001).
  37. Blankenberg, D., et al. Manipulation of FASTQ data with Galaxy. Bioinf. 24 (14), 1783-1785 (2010).
  38. Martini, P., et al. timeClip: pathway analysis for time course data without replicates. BMC Bioinf. 15, Suppl 5. (2014).
  39. Oh, S., Song, S., Grabowski, G., Zhao, H., Noonan, J. P. Time series expression analyses using RNA-seq: a statistical approach. BioMed Res. Int. 2013, 1-16 (2013).

Tags

גנטיקה גיליון 126 אנאירובית אירובי transcriptome הדור הבא זמן הקורס שמרים
מדידת רמות ה-mRNA לאורך זמן במהלך שמרים <em>ס' cerevisiae</em> ובשפתיים התגובה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Willis, S. D., Hossian, A. K. M. N., … More

Willis, S. D., Hossian, A. K. M. N., Evans, N., Hickman, M. J. Measuring mRNA Levels Over Time During the Yeast S. cerevisiae Hypoxic Response. J. Vis. Exp. (126), e56226, doi:10.3791/56226 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter