Summary
Här beskriver vi en lättköpt beredning av kitosan-baserat injicerbara hydrogels använder dynamisk Imin kemi. Metoder för att justera den hydrogel mekanisk styrka och dess tillämpning i 3D cellodling presenteras.
Abstract
Det presenteras en lättköpt, effektiv och mångsidig metod för att förbereda chitosan-baserade hydrogels använder dynamisk Imin kemi i protokollet. Hydrogel är beredd genom att blanda lösningar av glykol chitosan med en syntetiserade bensaldehyd avslutas polymer gelator och hydrogels erhålls effektivt i flera minuter vid rumstemperatur. Genom olika nyckeltal mellan glykol kitosan, polymeren gelator och vatteninnehåll erhålls mångsidig hydrogels med olika gelation gånger och stelhet. När skadade, kan hydrogel återställa sina framträdanden och modulus, på grund av reversibilitet av dynamiska Imin obligationer som crosslinkages. Denna själv healable egenskap kan hydrogel vara injicerbara eftersom det kan vara själv helade från pressade bitar till en integrerad bulk hydrogel efter injektionsprocessen. Hydrogel är också flera lyhörd för många bio-aktiva stimuli på grund av olika Jämviktstiden statusen för obligationerna som dynamiska Imin. Detta hydrogel bekräftades som bio-kompatibel, och L929 mus fibroblast celler var inbäddade följande standardförfaranden och cellproliferation bedömdes enkelt genom en 3D cell odling process. Hydrogel kan erbjuda en justerbar plattform för olika forskning där en fysiologisk härma en 3D miljö för celler är gagnade. Tillsammans med dess flera lyhörd, själv healable och injicerbara egenskaper, kan hydrogels potentiellt tillämpas som flera bärare för droger och celler i framtida bio-medicinska tillämpningar.
Introduction
Hydrogeler är tvärbundna polymermaterial med stora mängder vatten och mjuk mekaniska egenskaper, och de har använts i många bio-medicinska applikationer1,2. Hydrogels kan erbjuda en mjuk och fuktig miljö, som är mycket lik de fysiologiska omgivningarna för celler i vivo. Hydrogeler har därför blivit en av de mest populära ställningar för 3D cell kultur3,4. Jämfört med 2D petriskål cellkultur, har 3D cellkultur avancerade snabbt för att erbjuda en extracellulär matrix (ECM) härmade närmiljön för celler att kontakta och montera för proliferation och differentiering ändamål5. Hydrogeler innehållande naturliga polymerer kan dessutom erbjuda biokompatibla och främja miljöer för celler för att föröka sig och differentiera3. Hydrogeler härrör från syntetiska polymerer är att föredra för sin enkla och tydliga komponenter, som utesluter komplexa influenser som djur-ursprung proteiner eller virus. Bland alla hydrogel kandidater för 3D cellkultur föredras alltid hydrogels som tillagas enkelt och har en konsekvent egendom. Möjlighet att justera den hydrogel egenskaper för att passa olika forskningsbehov är viktigt som väl6.
Här presenterar vi en lättköpt beredning av en glykol chitosan-baserade hydrogel med hjälp av dynamiska Imin kemi, som blir en mångsidig hydrogel plattform för 3D cell kultur7. Den här metoden används välkända biokompatibla glykol chitosan att upprätta ramar av hydrogel's nätverk. Dess amino grupper är reagerade med en bensaldehyd avslutas polyetylenglykol som den polymer gelator forma dynamiska Imin band som crosslinkages av hydrogels8. Dynamiska Imin obligationer kan bilda och förmultnar reversibelt och responsivt till omgivning, förse hydrogels med mekaniskt justerbar tvärbundna nätverk9,10,11. På grund av dess höga vatteninnehåll, biokompatibla material och justerbara mekaniska styrka används framgångsrikt av hydrogel som en byggnadsställning för L929 celler i 3D cell kultur12,13. Protokollet här specificerar de förfaranden, inklusive gelator polymersyntes, hydrogel förberedelse, cell inbäddning och 3D cell odling.
Hydrogel visar också flera andra funktioner på grund av dess dynamiska Imin crosslinkages, inklusive dess flera lyhörd för olika bio-stimuli (syra/pH, vitamin B6 härledda pyridoxal, protein papain, etc.), vilket indikerar att hydrogel inducerad sönderdelas under fysiologiska betingelser8. Hydrogel är också själv healable och injicerbara, vilket innebär hydrogel kan administreras via en minimal invasiv injektion metod och få en fördel i drog- och cell leveranser14,15. Genom att lägga till funktionella tillsatser eller specifika fördesignade polymer gelators, hydrogel är kompatibel att få specifika egenskaper som magnetiska, temperatur, pH lyhörd, etc.16,17, som kunde fullgöra en brett utbud av forskningsbehov. Dessa egenskaper avslöjar den hydrogel potentiella förmågan att vara ett injicerbart flera bärare för droger och celler i både in vitro och i vivo biomedicinsk forskning och tillämpningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
försiktighet: Läs alla relevanta säkerhetsdatablad (MSDS) före användning. Använd lämpliga säkerhetsrutiner när du utför kemiska experiment, inklusive användning av en spiskåpa och personlig skyddsutrustning (skyddsglasögon, skyddshandskar, laboratorierock, etc.). Protokollet kräver standard cellen hantering tekniker (sterilisering, cell återhämtning, cell passaging, cell frysning, cell färgning, etc.).
1. beredning av Hydrogels
- syntes av bensaldehyd avslutas di-functionalized polyetylenglykol (DF PEG)
- före torkning av PEG polymer
- väger 4.00 g PEG (4 000 MW, 1.00 mmol) överföra den till en rund botten mätkolv (250 mL) och lägga till toluen (100 mL).
Obs: Andra pinnar med olika molekylvikter kan arbeta för hydrogel bildandet men kommer att leda till olika styvhet. - Värm lösningen av en värmepistol (eller en värmeplatta runt 40 ° C) milt för att upplösa alla polymerer. Efter alla polymerer lös, ta en förångare bort alla lösningsmedel. Upprepa detta lösas upp och torr process två gånger för att göra torkade PEG polymerer.
Varning: Detta bör utföras i dragskåp med extrem försiktighet. Toluen är brandfarligt.
- väger 4.00 g PEG (4 000 MW, 1.00 mmol) överföra den till en rund botten mätkolv (250 mL) och lägga till toluen (100 mL).
- Bensaldehyd uppsägning reaktion av PEG
- lägga till en magnetisk omrörare och tetrahydrofuran (THF, 100 mL) i kolven och upplösa PEG med en omrörare. Lägga till 4-carboxybenzaldehyde (0,90 g, 6,0 mmol) och 4-dimethylaminopyridine (0,07 g, 0,6 mmol) sekventiellt lösningar att upplösa alla fasta helt.
- Lägg till N, N '-dicyclohexylcarbodiimide (DCC, 1,25 g, 6,0 mmol) till lösningen, och lägga till en torkröret som är fylld med vattenfri CaCl 2 till kolven. Förvara reaktionen under omrörning i rumstemperatur (~ 20 ° C) för runt 12 h.
- Efter reaktion process
- filtrera bort de vita fasta genereras i lösningen av vakuum när reaktionen är klar. Häll över lösningen i kalla dietyleter (500 mL) under omrörning för att fälla ut de vita fasta. Samla alla de vita fasta genom filtret och torka fasta i ett dragskåp.
- Lös de vita fasta till THF igen, filtrera bort olösligt vit fasta partiklar, Häll lösningen i färskt kallt dietyleter utfällning de vita fasta och torka den. Upprepa detta två till tre gånger, och sedan placera de vita partiklar i vakuumtorkning ugn (20 ° C, 0,1 mbar) torka dem helt. Samla in det vita pulvret som slutprodukt: bensaldehyd avslutas DF PEG.
- före torkning av PEG polymer
- Beredning av hydrogels
- väga olika mängder DF PEG (0,11 g, 0,028 mmol 0.22 g, 0,055 mmol; 0,44 g, 0.110 mmol) i ett rör (10 mL), Tillsätt avjoniserat vatten (5,0 mL) och använda en vortex eller magnetomrörare för att Lös upp polymern.
- Upplösa glykol chitosan (0,495 g, 6,18 x 10 -3 mmol) i avjoniserat vatten (15,0 mL) i ett rör (50 mL), och använda en virvel i några minuter för att homogenisera chitosan lösningen (3 wt %).
- Tillsätt glykol chitosan lösning (0,2 mL, 3 wt %) och DF PEG lösningar (0,2 mL) sekventiellt i en tub (2,0 mL). Använda en virvel för att blanda lösningarna homogeneously till formuläret hydrogels i flera minuter. Följa nyckeltal i tabell 1 att göra hydrogeler av olika mekaniska styrka.
Obs: Använd metoden tube-Invertera för att avgöra huruvida hydrogel har redan bildat.
- Reologi analyser
- genomföra reologi analyser på en roterande reometer med en parallell stålplåt (diameter: 20 mm). För gelation test, sprids glykol chitosan lösning (0,2 mL, 3 wt %) på en nedre plattan. Lägg DF PEG vattenlösningar (0,2 mL, 2 wt %) jämnt droppvis på chitosan lösning ytan sedan och blanda med en pipett snabbt. Lägre ner den övre plattan och börja test.
- För hydrogel ' s stelhet test, skär en hydrogel i en cirkel (diameter: 20 mm) och mäta lagring modulus (G ') värden kontra frekvens analyser på 1% stam. Typiska G ' värden på 6,3 rad s − 1 listas i tabell 1.
Obs: Göra reologi analyser av hydrogel 0,5 h efter hydrogel bildandet att säkerställa dynamiska bond stabilisering av hydrogel. - För hydrogel ' s själv healable boende testa, tillskurna bitar en hydrogel och samla bitar att självläka till en integrerad bit. Sedan skär de hydrogel bit för att göra en cirkel (diameter: 20 mm) och lägga den på den reometer att utföra analysen reologi.
2. 3D Cell odling i Hydrogels
- beredning av hydrogel gelation lösningar
- väger DF PEG (0,44 g, 0,11 mmol) i ett sterilt rör (4,0 mL), Lägg i cell kultur media (RPMI-1640, 2.0 mL), och använda en vortex eller omrörare för att upplösa polymeren för att skaffa polymer lösning (20 wt %). Läsa in lösningen i en spruta (10,0 mL) och sedan sterilisera det genom passering genom en mikron bakterier-glans filter (0,22 µm).
- Väger den glykol chitosan (0,165 g, 2.06 x 10 -3 mmol) i ett sterilt rör (15,0 mL), Lägg i cell kulturmassmedia (RPMI-1640, 4,0 mL) och vortex att upplösa polymeren för att skaffa glykol chitosan lösning (4.0 wt %). Läsa in lösningen i en spruta (10,0 mL) och filtrera det med 0,22 µm bakterier-glans filter.
- Cell odling i hydrogels
försiktighet: utföra alla cell relaterade förfaranden i vävnadsodling huva. Grundläggande kunskaper i steril teknik förväntas.- Beredning av cellsuspensionen
- kultur L929 celler i RPMI-1640 medium kompletteras med 10% FBS, 5% penicillin (10 mL) i en Petri skålen (diameter 10 cm), och inkubera vid 37 ° C, 5% CO 2. Ändra på medellång varje dag innan användning.
- Skörda L929 cellerna med PBS som innehåller trypsin (0,025 w/v %) och EDTA (0,01% w/v), sedan Centrifugera (70 x g, 5 min) och Slamma upp cellerna på RPMI-1640 medellång (1,0 mL). Utföra den cell som räknar med normal drift av blod-räknar styrelsen. Slamma upp cellerna om du vill justera cellkoncentrationen till ~ 3,75 × 10 6 celler/mL.
- Cell inkapsling i hydrogels
- blanda de L929 cellsuspensioner (0,4 mL, 3,75 x 10 6 celler mL -1) med glykol chitosan lösning (0,4 mL) i ett rör (4,0 mL) av virvel. Pipettera L929 glykol chitosan lösningen (0,8 mL) in i centrera av en confocal petriskål (diameter 2,0 cm). Pipettera DF PEG lösningarna (0,2 mL) i samma skålen och Pipettera försiktigt för att blanda lösningen och framkalla hydrogel bildas.
Obs: Bedöma hydrogel bildandet av luta petriskål. - För direkt cellkultur, lägga till ytterligare mängder RPMI-1640 kultur media (1,0 mL) ovanpå hydrogel. Sätta den cell inbäddade hydrogels (1,0 mL, 1,5 wt % glykol chitosan, 4.0 wt % DF PEG, 1,5 × 10 6 celler mL -1) i en inkubator (37 ° C, 5% CO 2) och ändra mediet varje dag. Förbereda för cell avbildning på dag 1, 3, 5 och 7 efter cell inkapsling.
- blanda de L929 cellsuspensioner (0,4 mL, 3,75 x 10 6 celler mL -1) med glykol chitosan lösning (0,4 mL) i ett rör (4,0 mL) av virvel. Pipettera L929 glykol chitosan lösningen (0,8 mL) in i centrera av en confocal petriskål (diameter 2,0 cm). Pipettera DF PEG lösningarna (0,2 mL) i samma skålen och Pipettera försiktigt för att blanda lösningen och framkalla hydrogel bildas.
- För 3D efter cellkulturen i hydrogels efter injektion, förbereda cell laddad hydrogel (1,0 mL, se steg 2.2.2) i en spruta (10,0 mL, 48 G nål). Efter de hydrogel formerna, injicera hydrogel långsamt i en petriskål för confocal avbildning. Lägga till en ytterligare mängd kultur media (1,0 mL) ovanpå hydrogel och ändra den varje dag. Försätta petriskål i en inkubator (37 ° C, 5% CO 2) och förbereda för imaging efteråt.
FÖRSIKTIGHET: Kontrollera och följ protokollet säkerhet drift av en spruta.
- Beredning av cellsuspensionen
- Cell livskraft analys
- Confocal observation
- Spola hydrogels med PBS (1,0 mL) två gånger. Färga hydrogels med Fluorescein diacetat (FDA, 0,5 mL, 0,05 mg/mL) och propidium jodid (PI, 0,5 mL, 0,08 mg/mL) lösningar för 15 min. Efter färgning, ta bort alla lösningsmedlen.
- Observera den hydrogels med confocal Mikroskop under magnetisering våglängder av 488 nm och 543 nm att visualisera live och döda celler, respektive. Ta z-stackar genom varje 2 µm djup av den hydrogeler att validera en jämn fördelning av celler i hela.
Obs: FDA fläckar levande celler medan PI fläckar döda celler.
- Försämra hydrogel (1,0 mL) med ättiksyra (HAc, 3 v %, 1,0 mL) för 5 min och pipett i ett rör (4,0 mL). Samla celler genom centrifug (70 x g, 5 min) och Slamma upp cellerna i RPMI-1640 cellodlingsmedium (1,0 mL). Utföra cell räknar med en blod räknar styrelsen.
- Confocal observation
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En schematisk presentation av detta protokoll hydrogel utarbetning och dess användning som 3D cellkultur erbjuds i figur 1. Information hydrogel innehållsförteckning och nyckeltal utarbetats med olika mekaniska styrkor sammanfattas i tabell 1. Hydrogel's egen healable och reologi boende presenterar den hydrogel stelhet genom lagring modulus kontra frekvens test i figur 2. Cell confocal bilder och cell nummer med dagar av kultur i hydrogels presenteras i figur 3, bekräftar cellernas viabilitet och cellproliferation via 3D cellodling. Figur 4 presenterar mikroskopi, confocal bilder och analys av cell spridning priser för celler inbäddade i hydrogels som lidit injektion och efter kultur. Hög cellernas viabilitet och cellproliferation visar att cellerna inbäddad i hydrogel lidit ingen destruktiva skada och kunde återhämta sig efter kultur, som anger den hydrogel inmatningskapacitet.
Figur 1 : Förberedelse av hydrogel och dess användning som 3D cellkultur. (A) Hydrogel förberedelse; (B) Cell suspension förberedelse; (C) 3D cellkultur i hydrogels med eller utan injektion. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Hydrogel stelhet. Lagring modulus G' kontra frekvens (A) ursprungliga och (B) egenföretagare läkta hydrogels. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : 3D cellkultur i hydrogel. (A) 3D confocal bilder av L929 celler inbäddade i hård styrka hydrogel (Green: levande celler; Röd: döda celler); (B) Cell räkna resultaten av L929 celler inbäddade i hydrogel efter cell inkapsling betecknas som helst. Skalstapeln = 300 µm. Data presenteras som medelvärde ± SD. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 4 : 3D cell efter kultur i hydrogel efter injektion. (A) A Schematisk bild av injektion och efter kulturen i en cell-loaded hydrogel. Infoga: Mikroskopi bilder av celler inbäddade i hydrogels före injektion (vänster) och efter cell efter kultur i 7 dagar (mitten och höger). Skalstapeln = 100 µm; (B) Confocal bilder av L929 celler inbäddade i en hård styrka hydrogel och efter odlade efter injektion (Green: levande celler; Röd: döda celler), skalstapeln = 300 µm; (C) en jämförelse av andelen spridning av celler odlade i hydrogels med eller utan injektion efter inkapsling. Data presenteras som medelvärde ± SD. (anpassad från referens12; Copyright © 2017 Elsevier). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Hydrogel stelhet | Mjuk | Medium | Stiff |
| Glykol chitosan (mg) | 6.6 | 6.6 | 6.6 |
| DF PEG (mg) | 4.4 | 8,8 | 17,6 |
| Polymer gelator innehåll (wt %) | 1 | 2 | 4 |
| Avjoniserat vatten (mL) | 0,4 | 0,4 | 0,4 |
| Gelaion tid (min) | 7.5 | 5 | 3.5 |
| G' (Pa)* | 900 | 2100 | 4700 |
| * testad under frekvens 6,3 rad s-1, sila 1% använder en parallell tallrik (diameter 20 mm) på en roterande reometer. |
Tabell 1: Information hydrogels beredd med olika mekaniska styrkor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den hydrogel som presenteras i detta protokoll (figur 1) har två huvudkomponenter: den naturliga polymeren glykol chitosan och en syntetisk bensaldehyd avslutas polymer gelator DF PEG, som är både biokompatibla material. Syntesen av DF PEG presenteras med hjälp av en one-step modifiering reaktion. PEG med molekylvikt 4,000 valdes detta protokoll i oro löslighet, modifiering effektivitet, samt hydrogel stelhet. En rad hydrogels med olika mekaniska styrkor var förberedda med olika fast innehåll och nyckeltal glykol chitosan och DF PEG. Homogen hydrogels bildades snabbt i minuter genom att blanda gelation lösningar under rumstemperatur, men gelation hastigheten kan också bromsa av utspädda lösningar. Reologi test användes för att utvärdera de mekaniska styrkorna i olika hydrogels. De lagring moduli (G') av dessa hydrogels hittades cirka skiljer sig från 900 Pa (soft), 2,100 Pa (medium) till 4.700 Pa (stiff) (tabell 1 och figur 2A). Detta är bidragit till högre crosslinking tätheten genom att lägga till fler polymer gelators i hydrogel nätverket, vilket resulterar i högre lagring modulus (större styvhet). Egenskapen själv healable bekräftas också av återvinning av hydrogel's modulus (figur 2B). Det är känt att ECM stelhet varierar för olika vävnader, således hydrogel kan erbjuda justerbara mekaniska signaler och uppfylla olika krav av varierad nyckeltal mellan glykol chitosan och DF PEG polymer gelators18.
L929 celler, en typisk mus fibroblast cellinje med i vivo miljö vävnad stelhet i ~ 5600 pa19, användes som en cell modell för att bäddas in i hydrogel. Efter cell inkapsling i hydrogels, det kan lätt konstateras att cellerna i hydrogels visade extremt hög lönsamhet (> 99%) under hela kultur, bekräftar den utmärkt biokompatibiliteten av den chitosan-baserade hydrogel. En anmärkningsvärd ökning av cell densiteten i hydrogel underförstått att detta hydrogel kan stödja spridningen av L929 cellerna även utan extra-lade tillväxtfaktorer (figur 3A). Efter 7 dagar i kultur i hydrogel ökat cell 300% (figur 3B). Det rapporteras att celler odlade i ställningar kunde skilja efter mekaniska signaler20,21, som kan innebära ytterligare forskning här 3D hydrogel kultur metoden.
Implantera celler med injicerbara hydrogels vunnit ojämförliga fördelar för att kraftigt öka den leverans effektiviteten och genomförbarheten av de implanterade celler14. Inom en dynamisk Imin tvärbundna nätverk kunde hydrogel självläka efter injektion. Egenskapen själv healable aktiverar hydrogel vara injicerbara, vilket innebär potentiella tillämpningar för hydrogels som injicerbara flera transportföretag. För att ytterligare utvärdera detta hydrogel som en injicerbara cell bärare, utfördes en injektion-härma och efter odling. Den cell inbäddade hydrogel lastades i en spruta och pressas ut genom en 48 G nål i en petriskål, följt av en 7-dagars efter odling process med livskraft och spridning cellhastighet som studerade.
Som visas i figur 4A, kan squished hydrogel bitar självläka för att reformera en integrerad hydrogel ca 1 h efter injektion, vilket är praktiskt när cellen leverans. För celler i hydrogel, jämfört med tog bilden precis efter inkapsling (figur 4A, vänster infoga), cell densiteten ökade dramatiskt efter 7 dagar (figur 4A, mellersta infoga). I den utvidgade visionen, en mer detaljerad cell-fissional process i vilken vissa celler finns för att delas in i två (figur 4A, rätt infoga), bekräftas direkt av 3D cellproliferation i hydrogel. Figur 4B visar confocal bilderna av de levande döda cell analyserna efter injektion och efter kultur experiment. Tätheten av injicerade cellerna ökade naturligtvis med en hög cellviabilitet (> 99%), visar den framgångsrika cellproliferation i den 3D hydrogel efter injektionen. Att lära sig om injektionen påverkas andelen cell spridning, en jämförelse av kvantitativ statistik analys för de cell spridning i hydrogels med eller utan injektion var utföras (figur 4 c). Cell varit spridning efter injektion, trots minskade något, i en hög (~ 75%) och antalet cell ökad 145% relativt efter 7 dagar i kultur i den hydrogel, vilket indikerar att den klippning kraften under injektion har en observerbar begränsade negativa inverkan på cellproliferation.
Vi beskrivs en typisk procedur här hydrogel-programmet men forskare kan ändra protokollet för att passa specifika forskningsbehov. Polymer gelators har betydande påverkan på hydrogel och lätt modifierbara. Styvheten i denna hydrogel kan exempelvis lätt manipuleras av olika nyckeltal glykol chitosan och DF PEG gelator. Samtidigt kan användningen DF PEG av andra molekylvikter också uppfylla detta mål. Vi använde PEG 4K i detta protokoll, men PEG 2K till 10K kan också fungera. När du använder andra pinnar, är det viktigt att övervaka gelation tid och stelhet specifikt. Andra funktionella polymer gelators kan också fungera om forskarna har syntes färdigheter att förbereda specifika funktionella bensaldehyd-avslutad polymerer17.
Detta protokoll har flera begränsningar. För det första på grund av dynamisk struktur är styvheten i denna hydrogel begränsad jämfört med en kovalent bindning tvärbundna hydrogel. Man kan stöta på misslyckanden att förbereda hydrogels med för hög modulus design. För det andra, denna hydrogel är biologiskt nedbrytbar, vilket begränsar långsiktig cellkulturen inom hydrogel. För det tredje erbjuder hydrogel en 3D tvärbundna odling miljö som har diffusion oro. Hittills har bygger de flesta av de bio-analyserna på 2D kultur. 3D-strukturen kan hindra ytterligare cell med in vivo-studier.
När du använder det här protokollet finns det flera kritiska steg att följa. För det första, under syntes av den polymera gelator DF PEG, uttorkning är mycket viktigt. För det andra, när du utför cell-relaterade förfaranden, sterila drift är kritisk. För det tredje, färgning tiden ska vara väl kontrollerat i den hydrogeler att få fina confocal bilder.
Sammanfattningsvis infört protokollet en lättköpt beredning av kitosan-baserat injicerbara hydrogels, som används som en plattform för 3D cellkultur och kunde erbjuda justerbara mekaniska signaler för olika undersökningar. Det har redan tillämpats i områden gällande drug delivery, cellterapi och tumör kemoterapi, som inte bara är ett bevis på dess prestanda, men också ökar dess potential för biomedicinsk apkonstruktioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Denna forskning stöddes av National Science Foundation av Kina (21474057 och 21604076).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glycol chitosan | Wako Pure Chemical Industries | 39280-86-9 | 90% degree of deacetylation |
| 4-Carboxybenzaldehyde | Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co.,LTD | 619-66-9 | 99% |
| N, N'-dicyclohexylcarbodiimide | Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co.,LTD | 538-75-0 | 99% |
| Calcium chloride anhydrous | Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co.,LTD | 10043-52-4 | 96% |
| 4-dimethylamiopryidine | Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co.,LTD | 1122-58 | 99% |
| Polyethyleneglycol | Sino-pharm Chemical Reagent | 5254-43-7 | 99% |
| Tetrahydrofuran | Sino-pharm Chemical Reagent | 109-99-9 | 99% |
| Toluene | Sino-pharm Chemical Reagent | 108-88-3 | 99% |
| Ethyl ether | Sino-pharm Chemical Reagent | 60-29-7 | 99% |
| Acetic acid | Sino-pharm Chemical Reagent | 64-19-7 | 99% |
| Anhydrous CaCl2 | Sino-pharm Chemical Reagent | 10043-52-4 | 99% |
| Fluorescein diacetate | Sigma | 596-09-8 | 99% |
| Propidium iodide | Sigma | 25535-16-4 | 94% |
| RPMI-1640 culture media | Gibco | ||
| Fetal bovine serum | Gibco | ||
| Trypsin-EDTA | Gibco | 0.25% | |
| PBS | Solarbio | 0.01 M | |
| Penicillin streptomycin solution | Hyclone | 10,000 U/mL | |
| Rheometer | TA Instrument | AR-G2 | |
| Confocal microscope | Zeiss | 710-3channel | |
| L929 Cells | ATCC | NCTC clone 929; L cell, L929, derivative of Strain L | |
| Evaporator | EYELA | N-1100 | |
| 48 guage needle | ShanghaiZhiyu Medical Material Co., LTD | 48-guage | |
| Microscope | Leica | DM3000 B | |
| Microscope software | Imaris | ||
| Heat gun | Confu | KF-5843 | |
| Petri dish | NEST |
References
- Hoffman, A. S.
- Seliktar, D. Designing cell-compatible hydrogels for biomedical applications. Science. 336 (6085), 1124-1128 (2012).
- Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture. Biotechnol. Bioeng. 103 (4), 655-663 (2009).
- Sawicki, L. A., Kloxin, A. M. Light-mediated Formation and Patterning of Hydrogels for Cell Culture Applications. J. Vis. Exp. (115), (2016).
- Haycock, J. W. 3D cell culture: a review of current approaches and techniques. 3D Cell Culture: Methods and Protocols. , 1-15 (2011).
- Breslin, S., O’Driscoll, L. Three-dimensional cell culture: the missing link in drug discovery. Drug. Discov. Today. 18 (5), 240-249 (2013).
- Yang, B., et al. Facilely prepared inexpensive and biocompatible self-healing hydrogel: a new injectable cell therapy carrier. Polym. Chem. 3 (12), 3235-3238 (2012).
- Zhang, Y., Tao, L., Li, S., Wei, Y. Synthesis of multiresponsive and dynamic chitosan-based hydrogels for controlled release of bioactive molecules. Biomacromolecules. 12 (8), 2894-2901 (2011).
- Cao, L., et al. An injectable hydrogel formed by in situ cross-linking of glycol chitosan and multi-benzaldehyde functionalized PEG analogues for cartilage tissue engineering. J. Mater. Chem. B. 3 (7), 1268-1280 (2015).
- Ding, F., et al. A dynamic and self-crosslinked polysaccharide hydrogel with autonomous self-healing ability. Soft Matter. 11 (20), 3971-3976 (2015).
- Wei, Z., et al. Self-healing gels based on constitutional dynamic chemistry and their potential applications. Chem. Soc. Rev. 43 (23), 8114-8131 (2014).
- Li, Y., et al. Modulus-regulated 3D-cell proliferation in an injectable self-healing hydrogel. Colloid. Surface. B. 149, 168-173 (2017).
- Tseng, T. C., et al. An Injectable, Self‐Healing Hydrogel to Repair the Central Nervous System. Adv. Mater. 27 (23), 3518-3524 (2015).
- Yu, L., Ding, J. Injectable hydrogels as unique biomedical materials. Chem. Soc. Rev. 37 (8), 1473-1481 (2008).
- Yang, L., et al. Improving Tumor Chemotherapy Effect by Using an Injectable Self-healing Hydrogel as Drug Carrier. Polym. Chem. , (2017).
- Zhang, Y., et al. A magnetic self-healing hydrogel. Chem. Commun. 48 (74), 9305-9307 (2012).
- Zhang, Y., et al. Synthesis of an injectable, self-healable and dual responsive hydrogel for drug delivery and 3D cell cultivation. Polym. Chem. 8 (3), 537-534 (2017).
- Yang, C., Tibbitt, M. W., Basta, L., Anseth, K. S. Mechanical memory and dosing influence stem cell fate. Nat. Mater. 13 (6), 645-652 (2014).
- Geerligs, M., Peters, G. W., Ackermans, P. A., Oomens, C. W., Baaijens, F. Linear viscoelastic behavior of subcutaneous adipose tissue. Biorheology. 45 (6), 677-688 (2008).
- Banerjee, A., et al. The influence of hydrogel modulus on the proliferation and differentiation of encapsulated neural stem cells. Biomaterials. 30 (27), 4695-4699 (2009).
- Benoit, D. S., Schwartz, M. P., Durney, A. R., Anseth, K. S. Small functional groups for controlled differentiation of hydrogel-encapsulated human mesenchymal stem cells. Nat. Mater. 7 (10), 816-823 (2008).
