Summary
Dette manuskript beskriver en teknik til at påvise mutationer af lav frekvens i ctDNA, ER-FF. Denne metode er differentieret ved sin unikke brug af bidirektionelle fejlkorrektion, speciel baggrund filter og effektiv molekylære tilegnelse.
Abstract
Analyse af cirkulerende tumor DNA (ctDNA) ved hjælp af næste generation sequencing (NGS) er blevet et værdifuldt redskab for udvikling af klinisk onkologi. Anvendelsen af denne metode er dog udfordrende på grund af sin lav følsomhed til at analysere spor mængden af ctDNA i blodet. Derudover kan metoden generere falske positive og negative resultater fra denne sekvensering og efterfølgende analyse. For at forbedre gennemførligheden og pålideligheden af ctDNA påvisning i klinikken, præsenterer her vi en teknik, som beriger sjældne mutationer til sekvensering, berige sjældne Mutation sekventering (ER-Seq). ER-Seq kan skelne en enkelt mutation fra 1 x 107 vildtype nukleotider, hvilket gør det et lovende redskab til at afsløre ekstremt lavfrekvente genetiske ændringer og dermed vil være meget nyttige i at studere sygdom heterogenicity. I kraft af den unikke sekventering adapter ligatur, denne metode giver mulighed for en effektiv inddrivelse af ctDNA molekyler, samtidig med at korrigere for fejl begge veje (fornuft og antisensstoffer). Vores udvalg af 1021 kb sonder beriger måling af målområder, der dækker over 95% af de tumor-relaterede driver mutationer i 12 tumorer. Denne omkostningseffektive og universel metode giver et unikt vellykket akkumulering af genetiske data. Efter effektivt frafiltrere baggrund fejl, kan ER-seq præcist afsløre sjældne mutationer. Ved hjælp af en case study, præsenterer vi en detaljeret protokol demonstrere sonde design, bibliotek konstruktion og mål DNA fange metoder, mens også herunder data analyse arbejdsproces. Processen med at gennemføre denne metode typisk tager 1-2 dage.
Introduction
Next generation sequencing (NGS), et kraftfuldt værktøj til at undersøge mysterier af genomet, kan give en stor mængde af oplysninger, som kan afsløre genetiske ændringer. Anvendelsen af NGS analyse i klinikken er blevet mere almindelige, især for personlig medicin. En af de største begrænsninger af NGS, er imidlertid en høj fejlprocent. Selv om det anses for egnet til at studere nedarvede mutationer, er analyse af sjældne mutationer stærkt begrænset1,2, især når analyserer DNA fremstillet af en "flydende biopsi".
Cirkulerende tumor er DNA (ctDNA) fri for celle DNA (cfDNA) i blodet, der er udgydt fra tumorceller. I de fleste tilfælde er mængden af ctDNA meget lav, hvilket gør dens detektion og analyse meget udfordrende. Men ctDNA har mange attraktive funktioner: isolationen er minimalt invasiv, det kan blive opdaget i de tidlige stadier af tumorvækst, ctDNA niveauet afspejler terapeutisk effektivitet og ctDNA indeholder DNA mutationer findes i både primær og metastatisk læsioner 3 , 4 , 5. derfor, i betragtning af den hurtige udvikling af NGS teknik og analyse, anvendelse af ctDNA påvisning er blevet mere attraktive.
Forskellige massivt parallel sekventering metoder har været udnyttet til registrering af ctDNA, men ingen af disse tilgange er blevet accepteret til rutinemæssig brug i klinikker på grund af deres begrænsninger: lav følsomhed, manglende alsidighed og en forholdsvis høj pris6 ,7,8. For eksempel, korrigerer duplex sekventering, baseret på et entydigt id tag (UID), gentagne gange fejl i konsensus begge veje, afhjælpe de fleste sekventering fejl. Gennemførligheden af denne metode er dog tabt på grund af dens høje pris og lav data udnyttelse9,10. Ligeledes har CAPP-FF. og dens forbedrede iteration, CAPP-IDES11,12, større funktionalitet i cfDNA opdagelse, selvom nøjagtighed og universalitet i disse metoder skal forbedres.
For at imødekomme de aktuelle behov for nøjagtig ctDNA detektion og analyse, udviklet vi en ny strategi, berige sjældne Mutation sekventering (ER-Seq). Denne metode kombinerer følgende: unikke sekventering adaptere til effektivt at inddrive ctDNA molekyler, med tovejs fejlkorrektion og evnen til at skelne mellem en enkelt mutation af > 1 × 107 vildtype nukleotider; 1021 kb sonder, som beriger måling af målområder, der dækker over 95% af de tumor-relaterede mutationer fra 12 tumorer, herunder lungekræft, kolorektal cancer, mavekræft, brystkræft, nyrekræft, kræft i bugspytkirtlen, leverkræft, kræft i skjoldbruskkirtlen, livmoderhalskræft, esophageal kræft og endometrie carcinom (tabel 1). og baseline database screening gør det effektivt og nemt at præcist registrere sjældne mutationer i ctDNA.
For at opbygge en baseline database, skal du finde alle genmutationer af ER-Seq fra en række af den samme type prøver (~ 1000 i begyndelsen). Disse virkelige mutationer skal verificeres af flere andre pålidelige påvisningsmetoder og analyse. Næste, opsummere mønster af falske mutationer og klynge alle de falske mutationer for at bygge den første grundlinje database. Fortsæt med at tilføje falsk mutationer har fundet fra efterfølgende sekventering eksperimenter til denne database. Derfor, denne oprindelige database bliver en dynamisk udvidet database, som væsentligt forbedrer sekventering nøjagtighed.
For at fremme fremskridt i tumor diagnose og overvågning, præsenterer vi ER-FF., en lav pris og realistisk metode til erhvervelse af universal data. Vi præsenterer en case study, som gennemgik ER-Seq analyse, demonstrere dets nøjagtighed til påvisning af sjældne mutationer og muligheden for brug i klinikken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
tumor prøver og blodprøver blev opnået efter en protokol, der er godkendt af etiske udvalg af Peking University folk ' s Hospital. Skriftligt informeret samtykke blev opnået fra patienterne til at bruge deres prøver. Deltagerne blev screenet efter følgende kriterier: kvinde, avanceret Non-Small Cell lungekræft, EGFR p.L858R mutation indiceret ved tidligere Sanger sekventering, sygdomsprogression efter to session af EGFR målrettet terapi med Erlotinib, og ER-FF., som blev anvendt til ctDNA til at analysere årsagen til modstand og finde nye målet narkotika.
1. DNA-ekstraktion fra perifert blod for cfDNA og genomisk DNA (gDNA)
- indsamle 10 mL af perifert blod i en collection tube, vend forsigtigt op og ned 6 - 8 gange til at blande. Undgå celle klipning. Blodprøver kan opbevares i collection tube på 6-37 ° C i op til 72 timer.
- Centrifugeres collection tube ved stuetemperatur i 10 min ved 1600 (±150) x g.
- Overføre supernatanten (plasma) fra collection tube til fire rene 2 mL mærkes centrifugeglas ved hjælp af en engangs afpipetteres uden at forstyrre pellet lag (hvide blodlegemer).
- Transfer1 mL af celler ved hjælp af en ren engangsbrug pipette til en 2 mL behørigt mærket centrifugeglas. Cellerne kan opbevares ved-20 ° C eller koldere før trin 1.8.
- Centrifugeres plasma (fra trin 1.3) for 10 min. ved 4 ° C, og 16000 (±150) x g.
- Overføre plasma for at rense centrifugeglas korrekt mærket som " plasma ", forlader ~0.1 mL af residualvolumen i bunden for at undgå kontaminering. Gemme plasma ved-80 ° C indtil trin 1.7.
- Anvendes 3 mL af plasma fra trin 1,6 for at isolere cfDNA (indeholder ctDNA) ved hjælp af et kommercielt tilgængeligt kit, efter fabrikanten ' s instruktioner.
- Brug 200 µL af hvide blodlegemer fra trin 1.3 at isolere gDNA ved hjælp af et kommercielt tilgængeligt kit, efter fabrikanten ' s instruktioner.
Bemærk: Både cfDNA og gDNA kan opbevares ved-20 ° C inden brugen. - Anvend forskellige kvalitetskontrol for cfDNA og gDNA (tabel 2). Udføre kvalitetskontrol af en standardiseret metode til bioanalyzer at bestemme niveauer af prøve nedbrydning og/eller gDNA forurening. Peak analyse af kvaliteten af cfDNA udvinding bør vises svarende til figur 1.
Bemærk: Den maksimale størrelse af cfDNA er omkring 170 bp. Bemærk at øge mængden af DNA vil resultere i en højere kvalitet bibliotek til effektiv påvisning af sjældne mutationer i cfDNA. Vi anbefaler at bruge mindst 30 ng cfDNA (30.000 eksemplarer).
2. Biblioteket forberedelse
Bemærk: vedrørende base bibliotek byggeri på fragmenterede DNA, cfDNA findes i fragmenter med et peak størrelse ~ 170 bp og dermed ikke behøver at være fragmenteret.
- Fragment kontrol prøven (gDNA) ved ultralydbehandling at opnå 200-250 bp fragmenter.
- Forberede 1 µg gDNA prøve i 100 µL af Tris-EDTA buffer i en ren sonikering tube.
- Indstille programmet sonikering som 30 s på og 30 s off til 12 cykler for et samlet beløb på 12 min.
- Efter ultralydbehandling, bekræfte produkt (5 µL) indeholder 200-250 bp fragmenter ved at køre en analyse med 2%-agarosegel.
- Overføre alle fragmentering produkter til en ny 1,5 mL tube og inkuberes med 150 µL af magnetiske perler i 5 min at vælge de korrekte fragmenter.
- Fjern supernatanten ved at lægge røret på en magnetisk rack for 30 s.
- Vaske perlerne med 200 µL 80% ethanol (frisklavet) med røret opholder sig på den magnetiske rack. Inkuber i 30 s før fjernes supernatanten. Gentag engang.
- Luft tørre perler med tube låg åbent mens de opholder sig på den magnetiske rack. Undgå overdried perler for at sikre, at DNA target genopretter godt. Elueres DNA fragmenter fra perlerne ved at føje 32 µL af 10 mM Tris-HCl (pH 8) til perler til at løse DNA fragmenter efterfulgt af kvantificering af UV/Vis spektroskopi.
Bemærk: mindst 200 ng er nødvendige for de følgende eksperimenter.
- Ende Prep reaktion
Bemærk: Følg fabrikantens ' s instruktion og ændre efter behov. Brug 30 ng af cfDNA; og 1 µg gDNA som kontrol.- Tilføje 7 µL af reaktion buffer, 3 µL af enzymet mix, 30 ng af cfDNA i en steril nukleasen-fri rør, og tilføje ddH 2 O til samlede volumen af 60 µL. I en separat rør, tilføje de ovenstående komponenter, men med 1 µg gDNA i stedet for cfDNA.
- Blandes og inkuberes blanding ved 20 ° C i 30 min. efterfulgt af 65 ° C i 30 min i en thermocycler uden låg opvarmes. Fortsæt til næste trin, straks.
- Adapter ligatur
- tilføje 30 µL af ligatur master mix, 1 µL af ligatur enhancer og 4 µL af den unikke sekventering adaptere til blandingen fra trin 2.2.
- Incubate ved 20 ° C i 15 min i en thermocycler uden låg opvarmes.
- Vortex resuspend de magnetiske perler og lade perlerne ved rumtemperatur i mindst 30 min før det næste skridt.
- Tilføje 87 µL af de resuspenderede magnetiske perler til tidligere nævnte blandingen, bland godt af pipettering op og ned og derefter inkuberes ved stuetemperatur i 5 min.
- Vask og luft tør perler som beskrevet i trin 2.1.
- Elueres DNA målet fra perlerne ved at tilføje 20 µL af 10 mM Tris-HCl (pH 8).
- Berigelse af DNA fragmenter forbundet med adapter
- tilføje 20 µL af adapter forbundet DNA fragmenter, 5 µL af indeks Primer/i7 (2,5 µL Primer-P7 (10 pM) og 2,5 µL af Primer-P5 (10: 00), til sekvensering formål), 25µL af biblioteket forstærkning master mix, og Hedeselskabet 2 O til en samlet maengde paa 50 µL.
- PCR forstærke adapter forbundet DNA og varmecyklus som følger: indledende denaturering på 98 ° C til 45 s, efterfulgt af 8 cyklusser (cfDNA) eller 4 cyklusser (gDNA) af udglødning ° C i 15 s, 65 ° C i 30 s, 72 ° C i 30 s) , og en sidste udvidelse ved 72 ° C i 60 s, så holder en temperatur på 4 ° C.
- Tilføje 45 µL af suspenderede magnetiske perler til PCR-beriget DNA til at få erhvervet fragmenter.
- Elueres DNA fragmenter med adaptere i 10 mM Tris-HCl (pH 8) 30 µL.
- Bibliotek kvalitetskontrol
- Følg fabrikantens ' s protokol for den kommercielle kit til at måle adapter forbundet DNA koncentration. Brug bioanalyzer til at bestemme DNA kvalitet.
3. Målrettet DNA capture
Bemærk: Target berigelse blev udført ved hjælp af en brugerdefineret rækkefølge capture-sonde, som er specielt designet til en 1021 kb target berigelse regionen dækker kendt tumor-associerede driver mutationer fra 12 forskellige typer af tumorer. Ændringer til fabrikanten ' s protokol er nærmere beskrevet i de følgende trin.
- Blokering
- tilføje 1,5 µg af pooling biblioteker (maksimale antal biblioteker til pulje for cfDNA er 6, gDNA er 20) fra trin 2, 8 µL af P5 Block(100P), 8 µL af P7 Block(100P) og 5 µL af Cot-1 DNA (1 µg/µL) i sterile rør. Tørre indholdet af røret ved hjælp af et vakuum koncentrator sat til 60 ° C.
- Hybridize DNA capture sonder med biblioteket.
- Tilføje følgende komponenter til rør fra trin 3.1: 8,5 µL af 2 X hybridisering buffer, 2,7 µL af hybridisering enhancer, og 1,8 µL af nukleasen-fri ddH 2 O.
- Mix af pipettering op og ned og inkuberes i en thermomixer på 95 ° C i 10 min.
- Efter inkubation, straks tilføje 4 µL af Custom sonde. Inkuber prøver i et termisk cycler på 65 & #176; C med låg opvarmes til 75 ° C i 4 h.
- DNA fragmenter capture
- Inkuber den hybridiserede target-DNA med streptavidin perler efterfulgt af vaske perlerne til at fjerne ubundne DNA. Bruge den kommercielle kit ifølge producenten ' s instruktioner til at få en sidste 20 µL af resuspenderede perler med erobrede DNA fragmenter.
- Forstærkning af den erobrede DNA fragmenter
- udføre PCR ved hjælp af kommercielle kit med 2 µM rygraden oligonukleotider, ifølge producenten ' s instruktioner.
- Når the PCR reaktion er afsluttet, tilføje 45 µL af suspenderede perler direkte til PCR produkt og berige de forstærkede target DNA fragmenter bundet til perlerne ved eluering med 30 µL af 10 mM Tris-HCl (pH 8).
- Kvantificere DNA-fragmenter med biblioteket kvantificering kit og bestemme den gennemsnitlige fragment længde af Bioanalyzer ( figur 2).
4. sekventering
- sekvens multipleksede biblioteker benytter 75 bp parret ende løber på en benchtop sequencer til 18 h. samlede data produceret er op til 60 gigabyte, 15 G er påkrævet for patientens prøve cfDNA og 1G for kontrol prøve gDNA.
5. data analyse arbejdsprocessen
Bemærk: figur 3 viser den generelle arbejde flow og data analyse proces. Data analyseparametre og kommandoer er vist nedenfor.
- Filtrere lav kvalitet læsninger og korrigere for fejl og maskering af UID ved hjælp af NCfilter.
NCfilter(own)
NCfilter filter -l 5 - q 0,5 -n 0,1 -T 3 - G -1 fastq1-2 fastq2
realSeq(own)
python bin/realRealSeq MaskUID -1 fq1-2 fq2 -o output dir -p præfiks -u 4 -s 7 - m 3 -i uidFile-f. - Referering genom hg19 (human genom 19), Find sekventering resultater ved hjælp af BWA (version 0.7.12-r1039) mem og justere med genom Analysis Toolkit (GATK) (version 3.4-46-gbc02625).
BWA mem -t 3 hg19 fastq1 fastq2
java-d64-server - XX: + UseParallelGC - XX: ParallelGCThreads = 8-Xms2g - Xmx10g -
Djava.io.tmpdir=/tmp/-jar
GenomeAnalysisTK.jar -T RealignerTargetCreator -R hg19 -L targetRegion-kendt dbsnp —
allowPotentiallyMisencodedQuals -nt 10 - jeg cancerBam-jeg normalBam
java-d64-server - XX: + UseParallelGC - XX: ParallelGCThreads = 8-Xms2g-Xmx10g —
Djava.io.tmpdir=/tmp/-jar GenomeAnalysisTK.jar -T IndelRealigner -R hg19-kendt dbsnp
- allowPotentiallyMisencodedQuals — targetIntervals mellemrum-jeg cancerBam-jeg normalBam - Cluster dubletter UID og placeringen af skabelonen fragmenter, som vil rette fejl baser indført ved PCR-sekventering og ændre den base kvalitet.
realSeq(own)
python realSeq/bin/realSeq CLUSTER -b unmarkdup_sort_merge.bam - r chipRegion -o output_dir -p
præfiks -m 6 - at tilpasse de grupperede dubletter af BWA mem.
BWA mem -t 3 hg19 fastq1 fastq2 - udføre en lokal kursjustering efterfulgt af en rekalibrering af base kvalitetsresultat ved hjælp af GATK (version 3.4-46-gbc02625).
Loacal kursjustering: java-d64-server - XX: + UseParallelGC - XX: ParallelGCThreads = 8-Xms2g-Xmx10g-Djava.io.tmpdir=/tmp/-jar GenomeAnalysisTK.jar -T RealignerTargetCreator -R hg19 -L targetRegion-kendt dbsnp - allowPotentiallyMisencodedQuals -nt 10 -Jeg cancerBam-jeg normalBam
java-d64-server - XX: + UseParallelGC - XX: ParallelGCThreads = 8-Xms2g-Xmx10g-Djava.io.tmpdir=/tmp/-jar GenomeAnalysisTK.jar -T IndelRealigner -R hg19-kendt dbsnp - allowPotentiallyMisencodedQuals - targetIntervals mellemrum-jeg cancerBam-jeg normalBam
base kvalitetsresultat rekalibrering: java-d64-server - XX: + UseParallelGC - XX: ParallelGCThreads = 8-Xms2g-Xmx10g-Djava.io.tmpdir=/tmp/ - jar GenomeAnalysisTK.jar -T BaseRecalibrator -R hg19 -L targetRegion - knownSites dbsnp - knownSites kosmiske - allowPotentiallyMisencodedQuals - nct 10 - jeg bam -o grp java-d64-server - XX: + UseParallelGC - XX: ParallelGCThreads = 8-Xms2g-Xmx10g-Djava.io.tmpdir=/tmp/-jar GenomeAnalysisTK.jar -T PrintReads-jeg bam - BQSR grp -o outbam -R hg19 - nct 8 - allowPotentiallyMisencodedQuals - til SNV (enkelt-nukleotid variant) og INDEL (små indrykninger eller sletninger) kald, nøjagtigheden af lavfrekvent mutationer er yderligere bekræftet ved GSR (god støtte læser) med begge frem og bak strand Læs par og filtrering gennem kontrolgruppen (kønscelleoverførsel mutationer) og den oprindelige database.
realDcaller(own)
python realDcaller -f hg19 - r chipRegion - C baselineDB - O -L 2 cancerBam normalBam -p 30 - bruge baseline prøver som en kontrol til CNV (copy number variation) kald.
NCcnv(own)
python NCcnv -o cnvdir -t tmpdir - r chipRegion cnv--normgt normalBam--tumgt cancerBam--repdb repeatMarsk - Realigned ikke-tilknyttede, klip og uharmonisk par læser at kalde SV (strukturelle variationer).
NCsv(own)
python NCsv -t tmpdir - r hg19 -o outputdir - x udskrift -w bwapath -n 4 normalBam cancerBam
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
1021 kb sonder beriget destinationsområderne bruges i ER-Seq er vist i tabel 1, som dækker over 95% af genmutationer i 12 almindelige tumorer. Den brede vifte af disse sonder gør denne proces gælder for et flertal af kræftpatienter. Derudover gør vores unikke sekventering adaptere og baseline database screening det muligt at påvise sjældne mutationer netop.
På grund af de forskellige egenskaber af gDNA og cfDNA udvundet af perifert blod, er der en vifte af datakvalitet, som bestemmes af de forskellige instrumenter og kvalitetskontrol, der er vist i tabel 2. Med held udpakkede cfDNA skal vise en peak størrelse ~ 170 bp, som analyseret af bioanalyzer QC og vist i figur 1. Store fragmenter indikerer forurening fra genomisk DNA, som ikke bør vises i det endelige produkt. DNA ekstraheret fra denne patient prøven var af tilstrækkelig kvalitet og mængde for ER-Seq (cfDNA - 42,6 ng; gDNA - 3.426 µg).
Target DNA capture ved hjælp af en brugerdefineret sonde blev derefter forstærkes ved PCR. Den gennemsnitlige fragment størrelse blev evalueret af de bioanalyzer og repræsentative data for en patients cfDNA i figur 2A viste et højdepunkt omkring ~ 320 bp og en unik band på agarosegel. gDNA skal vises som et udstrygningspræparat på en agarosegel, som vist i figur 2B. Kvaliteter af begge biblioteker var acceptable for den efterfølgende sekvens.
Efter sekvensering, blev dataene analyseret i rækkefølge efter arbejdsflow i figur 3B. For at illustrere fordelene ved vores ER-Seq versus den traditionelle metode, udføres vi begge analyser ved hjælp af den samme prøve. Resultaterne fra begge analyser er vist i tabel 3 og tabel 4. Vi viste, at ER-Seq forbedrer dækning dybde 23% sammenlignet med den traditionelle metode (tabel 3, 3214.3 læser i ER-Seq vs 2475 læsninger i traditionelle analyse), som var på grund af dens effektiv inddrivelse af cfDNA molekyler, således stærkt forbedre analysen af sjældne mutationer. Det er også klart, at de unikke sekventering adaptere bruges i ER-Seq aktiverer let differentiering af naturlige og PCR-induceret gengangere (tabel 3, 0 PCR induceret duplikeres læse i ER-Seq). Derudover fandt vi i de kaldende resultater at analyse baseret på ER-Seq var 100% konsekvent for EGFR p.L858R påvisning og at hyppigheden af opdagelse var lidt højere (2,7% vs 1,2%) når sammenlignet med traditionelle analyse (tabel 4). Vigtigere aktiveret ER-Seq analyse påvisning af andre relativt lav-frekvens mutationer, herunder EGFR p.T790M (variation frekvens 0,53%) (Tabel 4), og dette blev ikke genkendt af traditionel analyse på grund af høj baggrundsstøj.
Figur 1. Repræsentative QC resultatet af korrekt isolerede cfDNA
Til venstre graferne, X-aksen viser Fragmentets størrelse (bp) og Y-aksen angiver relativ fluorescens enheder (FU). Den primære cfDNA er ~ 170 bp og der er ingen større glassplinter forurening. En simuleret elektroforese-gel er vist til højre. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Eksempel på biblioteker QC analyseret.
X-aksen viser størrelsen fragment (bp) og Y-aksen angiver relative fluorescens enheder (FU). En simuleret elektroforese-gel var vist til højre for hver graf. (A) Patient cfDNA prøven viste en skarp peak efter det blev forstærket med adaptere. (B) gDNA kontrolprøve viste jævnt fordelte fragmenter med ingen skarp top og ingen bias mod én side. Begge prøver var acceptable for efterfølgende sekvensering. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Skadestuen-Seq arbejdsflow.
(A) generelle arbejdsflow. (B) Data analyse arbejdsflow. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| 2735 exons fra alle exon regionen 70 gener | |||||||||
| ABL1 | ABL2 | AKT1 | AKT2 | AKT3 | ALK | APC | AR | ARAF | ATM |
| ATR | AURKA | AURKB | AXL | BAP1 | BCL2 | BRAF | BRCA1 | BRCA2 | BRD2 |
| BRD3 | BRD4 | BTK | C11orf30 | C1QA | C1S | CBL | CCND1 | CCND2 | CCND3 |
| CCNE1 | CD274 | CDH1 | CDK13 | CDK4 | CDK6 | CDK8 | CDKN1A | CDKN1B | CDKN2A |
| CDKN2B | CHEK1 | CHEK2 | CRKL | CSF1R | CTNNB1 | DDR1 | DDR2 | DNMT3A | EGFR |
| EPHA2 | EPHA3 | EPHA5 | ERBB2 | ERBB3 | ERBB4 | ERCC1 | ERG | ESR1 | EZH2 |
| FEDT1 | FBXW7 | FCGR2A | FCGR2B | FCGR3A | FGFR1 | FGFR2 | FGFR3 | FGFR4 | FLCN |
| FLT1 | FLT3 | FLT4 | FOXA1 | FOXL2 | GAB2 | GATA3 | GNA11 | GNAQ | GNAS |
| HDAC1 | HDAC4 | HGF | HRAS | IDH1 | IDH2 | IGF1R | IL7R | ||
Tabel 1. 1021 kb sonder beriget målområder.
Disse regioner medtages: 2735 exons fra 170 gener; introns, promotor og breakpoint regioner fra 24 gener; 1122 exons fra 847 relaterede gener. Disse dækker over 95% af tumor relaterede driver mutationer og målwebsteder mutation fra de 12 mest almindelige tumorer (lungekræft, kolorektal cancer, mavekræft, brystkræft, nyrekræft, kræft i bugspytkirtlen, leverkræft, kræft i skjoldbruskkirtlen, livmoderhalskræft, kræft i spiserøret, og endometrie carcinom).
| DNA | Resultat | Indikation | Ideel område |
| cfDNA | Fragmentets størrelse | Identifikation af DNA Fragment distribution | 168bp±20(a) |
| Koncentration | Mere præcis DNA kvantificering | Samlede cfDNA ≥30ng(b) | |
| gDNA | A260/A230 | Identifikation af kemiske forurenende stoffer (fx ethanol) | 1,50-2.2 |
| A260/A280 | Identifikation af protein forurenende stoffer | 1.60-2.2 | |
| Koncentration | DNA kvantificering | Samlede gDNA > 3ug |
Tabel 2. Kvalitet analyse af cfDNA og gDNA ekstraherede fra perifert blod.
Den maksimale størrelse af cfDNA er omkring 170Bp. kvalitetskontrol skal udføres af en standardiseret metode til 2100 Bioanalyzer at bestemme prøve nedbrydning og/eller gDNA forureningsniveauer. Peak analyse af kvaliteten af cfDNA udvinding bør vises svarende til figur 1. Bemærk, at øget DNA beløb vil resultere i et bibliotek med en højere kvalitet til effektiv påvisning af sjældne mutationer i cfDNA. Vi anbefaler at bruge mindst 30 ng cfDNA (30.000 eksemplarer).
Tabel 3. QC Skadestuen-Seq informationsanalyse og traditionelle informationsanalyse.
Mørk grå højdepunktet angiver en dækning dybde stigning fandt sted i ER-Seq sammenlignet med traditionelle metoder; en lys grå fremhævning angiver ingen PCR induceret duplikerede Læs i ER-FF. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Gen | Chr | Start | Udgangen | cHGVS | pHGVS | Funktion | caseAltIsHot | ER-Seq var_freq | Traditionel var_freq |
| TP53 | 17 | 7577534 | 7577535 | c.746G > T | p.R249M | Missense | HighFreq | 0.0400 | 0.0378 |
| EGFR | 7 | 55259514 | 55259515 | c.2573T > G | p.L858R | Missense | Handlingsrettede | 0.0270 | 0.0120 |
| ATM | 11 | 108203618 | 108203619 | c.7919delC | p.T2640Ifs*6 | frameshift | ND | 0.0169 | 0.0180 |
| PTCH1 | 9 | 98221917 | 98221918 | c.2851G > T | p.D951Y | Missense | ND | 0.0154 | 0.0260 |
| EGFR | 7 | 55249070 | 55249071 | c.2369C > T | p.T790M | Missense | Handlingsrettede | 0.0053 | ——(0.0013) |
| RB1 | 13 | 49039151 | 49039152 | c.2230A > T | p.I744F | Missense | ND | 0. 0036 | ——(0.0014) |
Tabel 4. Kald resultatet af Skadestuen-Seq oplysninger Analyser og traditionelle informationsanalyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Eksistensen af cirkulerende tumor DNA (ctDNA) blev opdaget mere end 30 år siden, men anvendelsen af ctDNA analyser er stadig ikke rutinemæssig i klinisk praksis. Interesse i den praktiske anvendelse af ctDNA metoder er steget med udvikling af teknologier til registrering af ctDNA og analyse. Tumor kontrol med ctDNA tilbyder en minimalt invasiv metode til vurdering af mikroskopisk residual sygdom, svar til terapi og tumor molekylære profiler under baggrund af tumor udvikling og intratumoral heterogenitet13, 14. Forbedringer i følsomheden og specificiteten af analyse vil lette alle disse programmer15,16.
I dette manuskript indførte vi ER-FF., en lovende metode til formål at forbedre følsomheden af påvisning af ctDNA, ved hjælp af en NSCLC sagen som et eksempel. Sammenlignet med traditionelle analyse, forbedret anvendelsen af vores unikke sekventering adaptere i ER-Seq væsentligt sin følsomhed og specificitet, angivet med en dækning dybde stigning og en evne til at detektere lavfrekvente mutationer (som EGFR p. T790M (0,53%)). Eksistensen af T790M i denne patient prøve kan være en medvirkende faktor til Erlotinib modstand, og gav indsigt i, hvordan man bedre behandling af denne patientgruppe, at foreslå brugen af en tredje generation EGFR hæmmer bestemt til T790M, som AZD929117-20. Et andet kritisk punkt i ER-FF., der bidrager til dens følsomhed og specificitet er baseline database screening, som muliggør en præcis opdagelse af lavfrekvente mutationer i ctDNA ved at filtrere baggrundsstøjen.
Selv om ER-Seq har mange fordele, der gør det bedre end traditionelle metoder, er der stadig nogle udfordringer, der skal overvindes. En af de største udfordringer for ER-Seq er det ekstremt lave niveau af ctDNA i blodet. For disse lavfrekvente mutationer er erhvervelse af tilstrækkelig skabelon ctDNA kritisk. Vores unikke adaptere betydeligt øge genbrug af ctDNA, selvom de stadig skal forbedres. En anden udfordring for ER-FF., og alle de andre sekventering teknikker, er begrænsningen af dækning af målområder. Vores valgte 1021 kb sonde beriget regioner, som kan dække ca. 95% af tumor-relaterede mutationer, er mere omfattende sammenlignet med andre små-plane metoder21,22,23. Men som tumor heterogenitet er blevet godt anerkendt og flere og flere tumor markører er blevet opdaget, relative dækningsgrad af vores sonder beriget regioner mindskes. At bedre tjene som et redskab til tidlig diagnose og sygdomsovervågning af tumor patienter, der er behov for mere omfattende sekvensering og analyse teknikker. I øjeblikket afhængig ER-Seq stadig af en stor mængde data til påvisning af lavfrekvente mutationer. Yderligere forbedring af data udnyttelse kan være gunstige for anvendelsen af ER-FF.
Som omtalt ovenfor, findes mange begrænsninger i forbindelse med ER-Seq. Vores unikke analyse teknik har imidlertid stadig mange fordele sammenlignet med andre top-ranking metoder i dette felt. Fordele og ulemper ved denne teknik fortjener yderligere forskning. ER-Seq potentiale for rutinemæssig klinisk anvendelse vil være af stor betydning for kliniske læger, at give dem et kraftfuldt værktøj til at diagnosticere tumorer og monitor tumor dynamics og respons på terapi. Nye mutationer i forbindelse med resistens over for konventionelle og målrettet terapi fundet af vores analyse kan tilbyde nye veje til behandling for kræftpatienter med fremskreden sygdom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde støttes af Geneplus – Beijing Institute.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit | Qiagen | 55114 | DNA Extraction from Peripheral Blood for cfDNA |
| QIAamp DNA Blood Mini Kit | Qiagen | 51105 | DNA Extraction from Peripheral Blood for gDNA |
| Quant-iT dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | Q32854 | Measure cfDNA concentration |
| Quant-iT dsDNA BR Assay Kit | Invitrogen | Q32853 | Measure library concentration |
| Agilent DNA 1000 Reagents | Agilent | 5067-1504 | Measure cfDNA and library fragments |
| The NEBNext UltraII DNA Library Prep Kit for Illumina | NEB | E7645L | Library Preparation |
| Agencourt SPRIselect Reagent | Beckman | B23317 | DNA fragment screening and purification |
| Tris-HCl (10 mM, pH 8.0)-100ML | Sigma | 93283 | Dissolution |
| xGen Lockdown Probes | IDT | —— | xGen Custom Probe |
| Human Cot-1 DNA | Life | 15279-011 | Targeted DNA capture |
| Dynabeads M-270 Streptavidin | Life | 65305 | Targeted DNA capture |
| xGen Lockdown Reagents | IDT | 1072281 | Targeted DNA capture |
| KAPA HiFi HotStart ReadyMix | KAPA | KK2602 | post-capture PCR enrichment libraries |
| KAPA Library Quantification Kit | KAPA | KK4602 | Measure library concentration |
| NextSeq 500 High Output Kit v2((150 cycles) | illumina | FC-404-2002 | Sequence |
| Centrifuge5810 | eppendorf | 5810 | |
| Nanodrop8000 | Thermo Scientific | 8000 | Measure gDNA concentration |
| Qubit 2.0 | Invitrogen | Quantify | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent | ||
| ThermoMixer C | eppendorf | Incubation | |
| 16-tube DynaMagTM-2 Magnet | Life | 12321D | |
| Concentrator plus | eppendorf | ||
| PCR | AB | simplyamp | |
| QPCR | AB | 7500Dx | |
| NextSeq 500 | illumina |
References
- Kennedy, S. R., et al. Detecting ultralow-frequency mutations by Duplex Sequencing. Nat. Protoc. 9, 2586-2606 (2014).
- Shendure, J., Ji, H.
- Bettegowda, C., et al. Detection of circulating tumor DNA in early- and late-stage human malignancies. Sci. Transl. Med. 6, (2014).
- Bratman, S. V., Newman, A. M., Alizadeh, A. A., Diehn, M. Potential clinical utility of ultrasensitive circulating tumor DNA detection with CAPP-Seq. Expert Rev. Mol. Diagn. 15, 715-719 (2015).
- Diaz, L. A. Jr, Bardelli, A. Liquid biopsies: genotyping circulating tumor DNA. J. Clin. Oncol. 32, 579-586 (2014).
- Crowley, E., Di Nicolantonio, F., Loupakis, F., Bardelli, A. Liquid biopsy: monitoring cancer-genetics in the blood. Nat. Rev. Clin. Oncol. 10, 472-484 (2013).
- Su, Z., et al. A platform for rapid detection of multiple oncogenic mutations with relevance to targeted therapy in non-small-cell lung cancer. J. Mol. Diagn. 13, 74-84 (2011).
- Kukita, Y., et al. High-fidelity target sequencing of individual molecules identified using barcode sequences: de novo detection and absolute quantitation of mutations in plasma cell-free DNA from cancer patients. DNA Res. 22, 269-277 (2015).
- Schmitt, M. W., et al. Sequencing small genomic targets with high efficiency and extreme accuracy. Nat. Methods. 12, 423-425 (2015).
- Schmitt, M. W., et al. Detection of ultra-rare mutations by next-generation sequencing. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 109, 14508-14513 (2012).
- Newman, A. M., et al. An ultrasensitive method for quantitating circulating tumor DNA with broad patient coverage. Nat. Med. 20, 548-554 (2014).
- Newman, A. M., et al. Integrated digital error suppression for improved detection of circulating tumor DNA. Nat Biotechnol. 34 (5), 547-555 (2016).
- Alix-Panabières, C., Schwarzenbach, H., Pantel, K. Circulating tumor cells and circulating tumor DNA. Annu. Rev. Med. 63, 199-215 (2012).
- Dawson, S. J., et al. Analysis of circulating tumor DNA to monitor metastatic breast cancer. N. Engl. J. Med. 368, 1199-1209 (2013).
- Li, H., Durbin, R. Fast and accurate short-read alignment with Burrows- Wheeler transform. Bioinformatics. 25, 1754-1760 (2009).
- Youn, A., Simon, R. Identifying cancer driver genes in tumor genome sequencing studies. Bioinformatics. 27, 175-181 (2011).
- Forshew, T., et al. Noninvasive identification and monitoring of cancer mutations by targeted deep sequencing of plasma DNA. Sci. Transl. Med. 4, (2012).
- Kobayashi, S., et al. EGFR mutation and resistance of non-small-cell lung cancer to gefitinib. N. Engl. J. Med. 352, 786-792 (2005).
- Kuang, Y., Rogers, A., Yeap, Y., Wang, L., Makrigiorgos, M., Vetrand, K., Thiede, S., Distel, R. J., Jänne, P. A. Noninvasive detection of EGFR T790M in gefitinib or erlotinib resistant non-small cell lung cancer. Clin. Cancer Res. 15, 2630-2636 (2009).
- Taniguchi, K., Uchida, J., Nishino, K., Kumagai, T., Okuyama, T., Okami, J., Higashiyama, M., Kodama, K., Imamura, F., Kato, K. Quantitative detection of EGFR mutations in circulating tumor DNA derived from lung adenocarcinomas. Clin. Cancer Res. 17, 7808-7815 (2011).
- Leary, R. J., et al. Development of personalized tumor biomarkers using massively parallel sequencing. Sci. Transl. Med. 2, (2010).
- Forshew, T., et al. Noninvasive identification and monitoring of cancer mutations by targeted deep sequencing of plasma DNA. Sci. Transl. Med. 4, (2012).
- Bratman, S. V., Newman, A. M., Alizadeh, A. A., Diehn, M. Potential clinical utility of ultrasensitive circulating tumor DNA detection with CAPP-Seq. Expert Rev. Mol. Diagn. 15, 715-719 (2015).
