Summary
इस पांडुलिपि ctDNA, एर-Seq में कम आवृत्ति के उत्परिवर्तनों का पता लगाने के लिए एक तकनीक का वर्णन । इस विधि दो के अपने अद्वितीय उपयोग-दिशात्मक त्रुटि सुधार, एक विशेष पृष्ठभूमि फिल्टर, और कुशल आणविक अधिग्रहण से अलग है ।
Abstract
परिचालित ट्यूमर डीएनए का विश्लेषण (ctDNA) अगली पीढ़ी के अनुक्रमण का उपयोग (NGS) नैदानिक ऑन्कोलॉजी के विकास के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण बन गया है. हालांकि, इस विधि के आवेदन रक्त में ctDNA की ट्रेस मात्रा का विश्लेषण करने में अपनी कम संवेदनशीलता के कारण चुनौतीपूर्ण है । इसके अलावा, विधि झूठी सकारात्मक और नकारात्मक परिणाम इस अनुक्रमण और बाद के विश्लेषण से उत्पन्न हो सकता है । व्यवहार्यता और क्लिनिक में ctDNA का पता लगाने की विश्वसनीयता में सुधार करने के लिए, यहाँ हम अनुक्रमण के लिए दुर्लभ उत्परिवर्तनों को समृद्ध करती है, जो एक तकनीक मौजूद है, दुर्लभ उत्परिवर्तन अनुक्रमण (एर-Seq) को समृद्ध. एर Seq 1 x 107 वंय प्रकार न्यूक्लियोटाइड है, जो यह एक आशाजनक उपकरण के लिए अत्यंत कम आवृत्ति आनुवंशिक परिवर्तन का पता लगाने और इस प्रकार के अध्ययन में बहुत उपयोगी हो जाएगा से बाहर एक एकल उत्परिवर्तन भेद कर सकते है रोग heterogenicity । अद्वितीय sequencing एडाप्टर के बंधाव के आधार पर, इस विधि से ctDNA अणुओं की एक कुशल वसूली सक्षम बनाता है, जबकि एक ही समय में त्रुटियों के लिए सुधारना-द्विता (भावना और antisense). हमारा चयन १०२१ kb जांच के लक्ष्य क्षेत्रों है कि 12 ट्यूमर में ट्यूमर से संबंधित चालक उत्परिवर्तनों के ९५% से अधिक कवर की माप को समृद्ध करता है । इस लागत प्रभावी और सार्वभौमिक विधि आनुवंशिक डेटा का एक अनूठा सफल संचय सक्षम बनाता है । के बाद कुशलता से बाहर पृष्ठभूमि त्रुटि फ़िल्टरिंग, एर seq ठीक दुर्लभ उत्परिवर्तनों का पता लगा सकते हैं । एक मामले का अध्ययन का उपयोग करना, हम एक विस्तृत जांच डिजाइन, पुस्तकालय निर्माण का प्रदर्शन प्रोटोकॉल वर्तमान, और लक्ष्य डीएनए कैप्चर के तरीके, जबकि भी डेटा विश्लेषण कार्यप्रवाह शामिल है । इस विधि को ले जाने के लिए प्रक्रिया सामान्यतया 1-2 दिन लेता है ।
Introduction
अगली पीढ़ी के अनुक्रमण (NGS), जीनोम के रहस्यों की जांच करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण, आनुवंशिक परिवर्तन प्रकट हो सकता है, जो जानकारी की एक बड़ी मात्रा में प्रदान कर सकते हैं । क्लिनिक में NGS विश्लेषण के आवेदन विशेष रूप से व्यक्तिगत चिकित्सा के लिए, अधिक आम हो गया है । NGS की सबसे बड़ी सीमाओं में से एक, तथापि, एक उच्च त्रुटि दर है । हालांकि यह विरासत में मिला उत्परिवर्तनों के अध्ययन के लिए उपयुक्त समझा जाता है, दुर्लभ उत्परिवर्तनों के विश्लेषण बहुत1,2सीमित है, खासकर जब एक "तरल बायोप्सी" से प्राप्त डीएनए का विश्लेषण ।
ट्यूमर डीएनए (ctDNA) परिचालित ट्यूमर कोशिकाओं से बहाया जाता है कि रक्त में सेल मुक्त डीएनए (cfDNA) है । ज्यादातर मामलों में, ctDNA की मात्रा बेहद कम है, जो इसका पता लगाने और विश्लेषण बहुत चुनौतीपूर्ण बनाते हैं । हालांकि, ctDNA कई आकर्षक विशेषताएं हैं: इसका अलगाव न्यूनतम इनवेसिव है, यह ट्यूमर के विकास के प्रारंभिक दौर में पता लगाया जा सकता है, ctDNA स्तर चिकित्सकीय दक्षता को दर्शाता है, और ctDNA दोनों प्राथमिक और मेटास्टेटिक घावों में पाया डीएनए उत्परिवर्तनों शामिल 3 , 4 , 5. इसलिए, NGS तकनीक और विश्लेषण के तेजी से विकास को देखते हुए, ctDNA का पता लगाने के आवेदन और अधिक आकर्षक हो गया है ।
विभिन्न बड़े पैमाने पर समानांतर अनुक्रमण दृष्टिकोण ctDNA का पता लगाने के लिए उपयोग किया गया है लेकिन इन तरीकों में से कोई भी उनकी सीमाओं के कारण क्लीनिक में नियमित उपयोग के लिए स्वीकार किया गया है: कम संवेदनशीलता, बहुमुखी प्रतिभा की कमी है, और एक अपेक्षाकृत उच्च लागत6 ,7,8. उदाहरण के लिए, डुप्लेक्स अनुक्रमण, एक अनन्य पहचानकर्ता टैग (UID) के आधार पर, बार-बार आम सहमति में त्रुटियों को सुधारता है, अधिकांश sequencing त्रुटियों को सुधारने । हालांकि, इस पद्धति की व्यवहार्यता अपनी उच्च लागत और कम डेटा के उपयोग के कारण9,10खो दिया है । इसी प्रकार, छाया-Seq और इसके सुधारात्मक पुनरावृत्ति, छाया-इडस11,12, cfDNA डिटेक्शन में अधिक से अधिक व्यावहारिकता है, हालांकि इन पद्धतियों की सटीकता और सार्वभौमिकता में सुधार की आवश्यकता है ।
सटीक ctDNA का पता लगाने और विश्लेषण के लिए वर्तमान की जरूरत को पूरा करने के लिए, हम एक नई रणनीति विकसित, दुर्लभ उत्परिवर्तन अनुक्रमण (एर-Seq) को समृद्ध । यह प्रकिया निम्न को संयोजित करता है: अद्वितीय sequencing एडाप्टर ctDNA अणुओं को कुशलतापूर्वक पुनर्प्राप्त करने के लिए, द्वि-दिशा त्रुटि सुधार और & #62 से बाहर एक एकल उत्परिवर्तन को अलग करने की क्षमता के साथ; 1 × 107 वाइल्ड-टाइप न्यूक्लियोटाइड; १०२१ kb की जांच जो लक्ष्य क्षेत्रों है कि ट्यूमर से संबंधित उत्परिवर्तनों के ९५% से अधिक कवर के माप को समृद्ध 12 ट्यूमर, फेफड़ों के कैंसर सहित, कोलोरेक्टल कैंसर, गैस्ट्रिक कैंसर, स्तन कैंसर, गुर्दे के कैंसर, अग्नाशय के कैंसर, लीवर कैंसर, थायराइड कैंसर, गर्भाशय ग्रीवा के कैंसर, कैंसर, और एंडोमेट्रियल कार्सिनोमा (तालिका 1); और आधारभूत डाटाबेस यह कुशल और ठीक ctDNA में दुर्लभ उत्परिवर्तनों का पता लगाने के लिए आसान बनाने स्क्रीनिंग ।
एक आधारभूत डाटाबेस का निर्माण, एर द्वारा सभी जीन उत्परिवर्तनों-Seq नमूनों की एक ही प्रकार के एक नंबर से मिल (~ १००० शुरुआत में) । इन वास्तविक उत्परिवर्तनों कई अंय विश्वसनीय जांच तरीकों और विश्लेषण से सत्यापित किया जाना चाहिए । अगले, झूठी उत्परिवर्तनों और क्लस्टर सभी झूठी उत्परिवर्तनों के पैटर्न को संक्षिप्त करने के लिए प्रारंभिक आधारभूत डाटाबेस का निर्माण । झूठी उत्परिवर्तनों इस डाटाबेस को अनुवर्ती अनुक्रमण प्रयोगों से पाया जोड़ने जारी है । इसलिए, यह आधार रेखा डेटाबेस गतिशील विस्तारित डेटाबेस, जो काफी sequencing सटीकता में सुधार करता है हो जाता है ।
ट्यूमर निदान और निगरानी में प्रगति को बढ़ावा देने के लिए, हम वर्तमान एर-Seq, सार्वभौमिक डेटा के अधिग्रहण के लिए एक कम लागत और व्यवहार्य विधि । हम एक मामले का अध्ययन है जो ईआर-Seq विश्लेषण से गुजरा, क्लिनिक में उपयोग के लिए दुर्लभ उत्परिवर्तनों और व्यवहार्यता का पता लगाने के लिए अपनी सटीकता का प्रदर्शन ।
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Protocol
- एक संग्रह ट्यूब में परिधीय रक्त के 10 मिलीलीटर इकट्ठा, धीरे ऊपर और नीचे 6-8 बार मिश्रण करने के लिए पलटना । कोशिका कतरन से बचें । रक्त के नमूनों को संग्रह ट्यूब में 6-37 & #176; C पर ७२ घंटे तक के लिए संग्रहित किया जा सकता है ।
- १६०० पर 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर संग्रह ट्यूब केंद्रापसारक (& #177; १५०) x g.
- स्थानांतरण supernatant (प्लाज्मा) संग्रह ट्यूब से चार साफ करने के लिए 2 मिलीलीटर उचित बला ट्यूबों एक डिस्पोजेबल प्लास्टिक का उपयोग कर गोली परत परेशान बिना (सफेद रक्त कोशिकाओं).
- एक 2 मिलीलीटर उचित लेबल वाले केंद्रापसारक ट्यूब एक साफ डिस्पोजेबल प्लास्टिक का उपयोग कर कोशिकाओं के Transfer1 मिलीलीटर । कोशिकाओं पर संग्रहित किया जा सकता है-20 & #176; C या ठंडा करने से पहले चरण १.८.
- (चरण १.३ से) में 10 मिनट के लिए प्लाज्मा केंद्रापसारक 4 & #176; C, and १६००० (& #177; १५०) x g.
- के प्लाज्मा को साफ करने के लिए स्थानांतरण केंद्रापसारक ट्यूबों ठीक तरह से लेबल के रूप में & #34;p lasma & #34;, छोड़ ~ ०.१ अवशिष्ट मात्रा के नीचे में संक्रमण से बचने के लिए मिलीलीटर । पर प्लाज्मा स्टोर-८० & #176; C जब तक चरण १.७.
- cfDNA अलग करने के लिए १.६ कदम से प्लाज्मा के 3 मिलीलीटर का उपयोग करें (शामिल ctDNA) एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट का उपयोग कर, निर्माता & #39; s निर्देश का पालन.
- का उपयोग २०० & #181; एल चरण १.३ से सफेद रक्त कोशिकाओं के gDNA अलग करने के लिए एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट का उपयोग कर, निर्माता & #39; s निर्देश का पालन.
नोट: उपयोग करने से पहले cfDNA और gDNA दोनों को-20 & #176; C पर संग्रहित किया जा सकता है । - cfDNA और gDNA ( तालिका 2 ) के लिए विभिन्न गुणवत्ता नियंत्रण लागू होते हैं । नमूना क्षरण और/या gDNA संदूषण के स्तर को निर्धारित करने के लिए एक मानकीकृत विधि द्वारा गुणवत्ता नियंत्रण करने के लिए । पीक cfDNA निष्कर्षण की गुणवत्ता का विश्लेषण < सबल वर्ग के समान होना चाहिए = "xfig" > चित्रा १ .
नोट: cfDNA के चोटी आकार १७० बीपी के आसपास है । ध्यान दें कि डीएनए की मात्रा में वृद्धि cfDNA में दुर्लभ उत्परिवर्तनों का प्रभावी पता लगाने के लिए एक उच्च गुणवत्ता पुस्तकालय में परिणाम होगा । हम अनुशंसा करते है का उपयोग करते हुए ंयूनतम 30 एनजी cfDNA (३०,००० प्रतियां) ।
- 200-250 bp अंशों को प्राप्त करने के लिए नियंत्रण नमूना (gDNA) sonication द्वारा अंश ।
- तैयार 1 & #181; माम का gDNA नमूना १०० में & #181; एल के Tris-EDTA एक साफ sonication ट्यूब में बफर ।
- पर 30 एस के रूप में sonication कार्यक्रम सेट और 30 एस 12 मिनट की कुल के लिए 12 चक्र के लिए बंद
- sonication के बाद, उत्पाद (5 & #181; L) की पुष्टि करें 2% agarose जेल के साथ एक विश्लेषण चलाकर 200-250 बीपी के टुकड़े होते हैं ।
- एक नया १.५ एमएल ट्यूब और १५० & #181 के साथ मशीन के लिए सभी विखंडन उत्पादों हस्तांतरण; 5 मिनट के लिए चुंबकीय मोती के एल सही अंशों का चयन करने के लिए ।
- 30 एस के लिए एक चुंबकीय रैक पर ट्यूब डाल द्वारा supernatant निकालें
- धो के साथ मोतियों को २०० & #181; ८०% इथेनॉल के एल (ताजा तैयार) चुंबकीय रैक पर रहने ट्यूब के साथ । supernatant को हटाने से पहले 30 एस के लिए मशीन । एक बार दोहराएं ।
- हवा ट्यूब ढक्कन खुला के साथ मोतियों सूखी जबकि चुंबकीय रैक पर रह । सूखे मोतियों से बचें सुनिश्चित करें कि डीएनए लक्ष्य अच्छी तरह से ठीक करने के लिए । मोतियों से Elute डीएनए अंशों को जोड़कर ३२ & #181; एल के 10 मिमी Tris-एचसीएल (पीएच 8) के मोतियों को डीएनए अंशों को हल करने के लिए यूवी द्वारा ठहराव द्वारा पीछा स्पेक्ट्रोस्कोपी.
नोट: निंन प्रयोगों के लिए कम-से २०० एनजी की जरूरत है ।
- अंत प्रस्तुतीकरण प्रतिक्रिया
नोट: पालन निर्माता & #39; एस अनुदेश और आवश्यकतानुसार संशोधित । cfDNA के 30 एनजी का उपयोग करें; और 1 & #181; gDNA के g लए यथा नियंत्रण ।- add 7 & #181; रिएक्शन बफर, 3 & #181; एल ऑफ द एंजाइम मिक्स, 30 cfDNA के एनजी एक बाँझ nuclease-फ्री ट्यूब में, और जोड़ें ddH 2 O की कुल मात्रा को ६० & #181; L. एक अलग ट्यूब में उपरोक्त अवयव जोड़ें लेकिन 1 & #181; g with gDNA of cfDNA. मिश्रण को
- 20 & #176; ग के लिए 30 मिनट के बाद ६५ & #176; c के लिए 30 मिनट के लिए एक thermocycler में ढक्कन गरम बिना । अगले चरण के लिए तुरंत आगे बढ़ें ।
- एडेप्टर बंधाव
- Add 30 & #181; l द बंधाव मास्टर मिक्स, 1 & #181; l के बंधाव बढ़ाने, और 4 & #181; l के लिए अद्वितीय sequencing एडेप्टर से २.२ चरण से मिश्रण करने के लिए.
- में 20 & #176; सी के लिए 15 मिनट के लिए एक thermocycler में ढक्कन गर्म बिना ।
- भंवर चुंबकीय मोती reसस्पेंड करने के लिए और अगले कदम से पहले कमरे के तापमान पर कम से कम 30 मिनट के लिए मोतियों को छोड़ दें ।
- Add ८७ & #181; पहले उल्लेखित मिश्रण को reसस्पैंड चुंबकीय मोतियों की एल; ऊपर और नीचे pipetting और फिर 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर गर्मी में अच्छी तरह से मिश्रण ।
- धोने और हवा सूखी मोतियों के रूप में २.१ कदम में वर्णित है ।
- Elute से डीएनए टारगेट को जोड़कर मोतियों से 20 & #181; 10 एमएम Tris-एचसीएल (pH 8) के एल. डीएनए अंशों के
- संवर्धन एडेप्टर के साथ ligated
- Add 20 & #181; L एडेप्टर ligated डीएनए अंशों का, 5 & #181; l Index प्राइमरी/i7 (२.५ & #181; l प्राइमरी-P7 (10 बजे) और २.५ & #181; l प्राइमरी के एल-P5 (10 बजे), अनुक्रमण प्रयोजनों के लिए), 25 & #181; l के पुस्तकालय प्रवर्धन मास्टर मिक्स, और ddH 2 O को कुल मात्रा ५० & #181; L.
- पीसीआर निम्नानुसार एडाप्टर ligated डीएनए और थर्मल चक्र बढ़ाना: प्रारम्भिक विकार पर ९८ & #176; ग के लिए ४५ s, जिसके बाद 8 चक्र (cfDNA) या 4 चक्र (gDNA) के एनीलिंग & #176; ग फॉर 15 एस, ६५ & #176; ग फॉर 30 एस, ७२ & #176; सी फॉर 30 एस) , और एक अंतिम विस्तार पर ७२ & #176; ग के लिए ६० s, तो 4 & #176 पर तापमान पकड़े; c.
- Add ४५ & #181; निलंबित चुंबकीय मोतियों की पीसीआर-समृद्ध डीएनए को प्राप्त टुकड़े हासिल करने के लिए एल । एडाप्टर के साथ
- Elute डीएनए अंशों में 30 & #181; L 10 mM Tris-HCl (pH 8).
- पुस्तकालय गुणवत्ता नियंत्रण
- का पालन करें निर्माता & #39; एस प्रोटोकॉल वाणिज्यिक किट के लिए अनुकूलक ligated डीएनए एकाग्रता को मापने के लिए । डीएनए की गुणवत्ता निर्धारित करने के लिए विश्लेषक का उपयोग करें.
-
- जोड १.५ & #181; पूलिंग लायब्रेरीज़ के g (cfDNA के लिए पूल करने के लिए लाइब्रेरीज़ की अधिकतम संख्या 6 है, gDNA 20 है) से चरण 2, 8 & #181; P5 ब्लॉक (100P), 8 & #181; l का P7 ब्लॉक (100P), और 5 & #181; l की खाट-1 डीएनए (1 & #181; g/& #181; l) के एक बाँझ ट्यूब में. ६० पर सेट एक वैक्यूम ध्यानी का उपयोग कर ट्यूब की सामग्री को सूखा & #176; ग.
- संकरण पुस्तकालय के साथ डीएनए कैप्चर जांच की ।
- चरण से ट्यूब करने के लिए निम्न घटक जोड़ें ३.१:८.५ & #181; l of 2x संकरण बफर, २.७ & #181; l के संकरण बढ़ाने, और १.८ & #181; l के nuclease-इव ddH 2 ओ.
- मिश्रण pipetting ऊपर और नीचे और एक thermomixer & #160 में मशीन; पर ९५ & #176; ग के लिए 10 min.
- निंन मशीन, तुरंत कस्टम जांच के 4 & #181; L जोड़ें । ६५ & #17 में एक थर्मल साइकिल चालक में मशीन नमूने6; सी के साथ ढक्कन गरम करने के लिए ७५ & #176; ग के लिए 4 ज.
- डीएनए अंशों पर कब्जा
- streptavidin मोतियों के साथ संकरित लक्ष्य डीएनए को दूर करने के लिए असीम डीएनए को हटाने मोती धोने के बाद । के अनुसार वाणिज्यिक किट का प्रयोग करें निर्माता & #39; s को अंतिम 20 & #181 प्राप्त करने के निर्देश; छीना डीएनए अंशों के साथ reसस्पैंड मोतियों की L.
- प्रवर्धन डीएनए टुकड़े
- के साथ वाणिज्यिक किट का उपयोग कर पीसीआर प्रदर्शन 2 & #181; M रीढ़ oligonucleotides, के अनुसार निर्माता & #39; s निर्देश.
- जब पीसीआर रिएक्शन पूरा हो जाता है, तो ४५ & #181; निलंबित मोतियों की माला सीधे पीसीआर उत्पाद में जोड़कर और परिवर्धित लक्ष्य डीएनए अंशों को समृद्ध करने के लिए 30 & #181 के साथ रेफरेंस के साथ बंधे, 10 एमएम Tris-एचसीएल (pH 8) के एल.
- लायब्रेरी ठहराव किट के साथ डीएनए अंशों को बढ़ाता है और (< सबल वर्ग = "xfig" > आरेख 2 ) द्वारा औसत अंश लंबाई निर्धारित करता है ।
- अनुक्रम division पुस्तकालयों का उपयोग ७५ bp मीन्स-end के लिए एक benchtop sequencer पर चलाता है 18 h. कुल उत्पादित डेटा ६० गीगाबाइट तक है, 15जी के लिए रोगी के नमूने cfDNA और 1G के लिए आवश्यक है नियंत्रण नमूना gDNA.
- फ़िल्टर कम गुणवत्ता पढ़ता है और त्रुटियों और NCfilter.
का उपयोग कर UID का मास्किंग के लिए सही NCfilter (अपने)
NCfilter फ़िल्टर-l 5-q ०.५-n ०.१-T 3-G-1 fastq1-2 fastq2
realSeq (वयं)
अजगर bin/realRealSeq MaskUID-1 fq1-2 fq2-ओ आउटपुट dir-p उपसर्ग-u 4-s 7-m 3-i uidFile-f. - संदर्भित जीनोम hg19 (मानव जीनोम 19), BWA (संस्करण 0.7.12-r1039) मेम का उपयोग कर sequencing परिणाम की स्थिति जानें और जीनोम विश्लेषण टूलकिट (गटक) (संस्करण 3.4-46-gbc02625) के साथ फिर से संरेखित करें ।
bwa मेम-टी ३ hg19 fastq1 fastq2
जावा-d64-server-xx: + UseParallelGC-xx: ParallelGCThreads = 8-Xms2g-Xmx10g-
Djava. आयो. tmpdir =/tmp/-जार
GenomeAnalysisTK. जार-t RealignerTargetCreator-R hg19-L targetRegion-चचा dbsnp & #8212;
allowPotentiallyMisencodedQuals-nt 10-i cancerBam-i normalBam
java-d64-server-xx: + UseParallelGC-xx: ParallelGCThreads = 8-Xms2g-Xmx10g & #8212;
Djava. आयो. tmpdir =/tmp/-जार GenomeAnalysisTK. जार-T IndelRealigner-R hg19-ज्ञात dbsnp
-allowPotentiallyMisencodedQuals & #8212; targetIntervals अंतराल-i cancerBam-i normalBam - क्लस्टर के अनुसार डुप्लिकेट को UID और टेम्पलेट अंशों की स्थिति, जो पीसीआर द्वारा पेश त्रुटि ठिकानों को सही करेगा/अनुक्रमण और आधार गुणवत्ता को संशोधित करने के लिए ।
realSeq (अपने)
पायथन realSeq/बिन/realSeq क्लस्टर-b unmarkdup_sort_merge. bam-r chipRegion-o output_dir-p
उपसर्ग-m 6 - संकुल डुप्लिकेट्स को BWA मेम के द्वारा पुन: संरेखित करें ।
bwa मेम-टी 3 hg19 fastq1 fastq2 - गटक (संस्करण 3.4-46-gbc02625) का उपयोग कर बेस गुणवत्ता स्कोर के एक reअंशांकन के बाद एक स्थानीय पुनर्संरेखण करते हैं.
Loacal पुनर्संरेखण: जावा-d64-सर्वर-xx: + UseParallelGC-xx: ParallelGCThreads = 8-Xms2g-Xmx10g-Djava. io. tmpdir =/tmp/-जार GenomeAnalysisTK. जार-T RealignerTargetCreator-R hg19-L targetRegion-ज्ञात dbsnp-allowPotentiallyMisencodedQuals-nt 10 -मैं cancerBam-i normalBam
java-d64-server-xx: + UseParallelGC-xx: ParallelGCThreads = 8-Xms2g-Xmx10g-Djava. आयो. tmpdir =/tmp/-जार GenomeAnalysisTK. जार-T IndelRealigner-R hg19-चचा dbsnp-allowPotentiallyMisencodedQuals-targetIntervals अंतराल-मैं cancerBam-मैं normalBam
आधार गुणवत्ता स्कोर reअंशांकन: जावा-d64-सर्वर-xx: + UseParallelGC-xx: ParallelGCThreads = 8-Xms2g-Xmx10g-Djava. io. tmpdir =/tmp/-जार GenomeAnalysisTK. जार-T BaseRecalibrator-R hg19-L targetRegion- knownSites dbsnp-knownSites लौकिक-allowPotentiallyMisencodedQuals-एनसीटी 10-I bam-ओ जीआरपी जावा-d64-सर्वर-xx: + UseParallelGC-xx: ParallelGCThreads = 8-Xms2g-Xmx10g-Djava io. tmpdir =/tmp/-जार GenomeAnalysisTK. जार-T PrintReads-i bam-BQSR grp-o outbam-R hg19-एनसीटी 8-allowPotentiallyMisencodedQuals - के लिए SNV (सिंगल-न्यूक्लियोटाइड वैरिएंट) और INDEL (छोटे सम्मिलन या विलोपन) कॉलिंग, कम आवृत्ति उत्परिवर्तनों की सटीकता आगे GSR द्वारा पुष्टि की है (अच्छा समर्थन पढ़ता है) दोनों के साथ आगे और रिवर्स कतराना नियंत्रण समूह (germline उत्परिवर्तनों) और आधारभूत डाटाबेस के माध्यम से जोड़े और निस्पंदन पढ़ें ।
realDcaller (अपने)
अजगर realDcaller-च hg19-r chipRegion-C baselineDB-O-L 2 cancerBam normalBam-p 30 - आधारभूत नमूनों को CNV (प्रतिलिपि संख्या भिन्नता) के लिए नियंत्रण के रूप में उपयोग करना कॉलिंग.
NCcnv (अपने)
पायथन NCcnv-o cnvdir-t tmpdir-r chipRegion cnv--normgt normalBam--tumgt cancerBam--repdb repeatMarsk - डिग्रियों बिना मैप किए गए, क्लिप्स और बेताल जोड़ी को एसवी (संरचनात्मक रूपांतरों) को कॉल करने के लिए पढ़ता है ।
NCsv (अपने)
अजगर NCsv-t tmpdir-r hg19-o outputdir-x प्रतिलिपि-w bwapath-n 4 normalBam cancerBam
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Representative Results
१०२१ kb की जांच से समृद्ध लक्ष्य ईआर में प्रयुक्त क्षेत्रों-Seq तालिका 1है, जो 12 आम ट्यूमर में जीन उत्परिवर्तनों के ९५% से अधिक कवर में दिखाया जाता है । इन जांचों की विस्तृत श्रृंखला कैंसर रोगियों के बहुमत के लिए इस प्रक्रिया को लागू करता है । इसके अतिरिक्त, हमारे अद्वितीय अनुक्रमण एडेप्टर और आधारभूत डाटाबेस स्क्रीनिंग यह दुर्लभ उत्परिवर्तनों ठीक का पता लगाने के लिए संभव बनाते हैं ।
परिधीय रक्त से निकाले gDNA और cfDNA के विभिन्न गुणों के कारण, वहाँ डेटा गुणवत्ता की एक श्रृंखला है, जो विभिन्न उपकरणों और गुणवत्ता नियंत्रण तालिका 2में दिखाया गया द्वारा निर्धारित किया जाता है । सफलतापूर्वक निकाला cfDNA ~ १७० bp के एक चोटी के आकार प्रदर्शित करना चाहिए, के रूप में के रूप में reश्लेषित विश्लेषक QC और चित्रा 1में दिखाया गया । बड़े टुकड़े जीनोमिक डीएनए से संक्रमण का संकेत है, जो अंतिम उत्पाद में प्रकट नहीं होना चाहिए । डीएनए से निकाले गए इस मरीज का नमूना था पर्याप्त गुणवत्ता और ईआर के लिए मात्रा-Seq (cfDNA-४२.६ एनजी; gDNA-३.४२६ µ g) ।
टारगेट डीएनए कैप्चर एक कस्टम जांच का उपयोग कर फिर पीसीआर द्वारा परिलक्षित किया गया । औसत अंश आकार के द्वारा मूल्यांकन किया गया था और विश्लेषक के प्रतिनिधि डेटा में एक रोगी के cfDNA के लिए चित्रा 2a एक चोटी के आसपास दिखाया ~ ३२० bp और एक अद्वितीय बैंड पर agarose जेल । gDNA एक agarose जेल पर एक धब्बा के रूप में प्रकट होना चाहिए, के रूप में चित्रा bमें दिखाया गया है । बाद के अनुक्रमण के लिए दोनों पुस्तकालयों के गुण स्वीकार्य थे ।
अनुक्रमण के बाद, डेटा क्रम में चित्र बीमें काम के प्रवाह के अनुसार विश्लेषण किया गया था । पारंपरिक विधि बनाम हमारे एर-Seq के फायदों को समझाने के लिए, हमने एक ही नमूने का उपयोग करते हुए दोनों विश्लेषणों का प्रदर्शन किया । दोनों विश्लेषण से परिणाम तालिका 3 और तालिका 4में दिखाए जाते हैं । हमें पता चला है कि ईआर-Seq 23% द्वारा कवरेज गहराई में सुधार पारंपरिक विधि (तालिका 3, ३२१४.३ के साथ तुलना में पढ़ता है एर Seq बनाम २४७५ में पारंपरिक विश्लेषण में पढ़ता है), जो cfDNA अणुओं की अपनी कुशल वसूली के कारण था, इस प्रकार बहुत दुर्लभ उत्परिवर्तनों के विश्लेषण को बढ़ाने. यह भी स्पष्ट है कि एर-Seq में प्रयुक्त अद्वितीय sequencing एडाप्टर प्राकृतिक और पीसीआर-प्रेरित दोहरावों (तालिका 3, 0 पीसीआर प्रेरित डुप्लिकेट पढ़ें एर-Seq) के आसान विभेद को सक्षम करता है । इसके अतिरिक्त, हम कॉलिंग परिणामों में पाया कि ईआर-Seq के आधार पर विश्लेषण १००% EGFR p. L858R डिटेक्शन के लिए सुसंगत था और पता लगाने की आवृत्ति एक बिट उच्च (२.७% बनाम १.२%) जब पारंपरिक विश्लेषण (तालिका 4) के साथ तुलना की गई । महत्वपूर्ण बात, ईआर-Seq विश्लेषण EGFR p T790M सहित अन्य अपेक्षाकृत कम आवृत्ति उत्परिवर्तनों का पता लगाने के लिए सक्षम (भिन्नता आवृत्ति ०.५३%) (तालिका 4), और यह पारंपरिक उच्च पृष्ठभूमि शोर के कारण विश्लेषण द्वारा मांयता प्राप्त नहीं था ।
चित्र 1. सफलतापूर्वक पृथक cfDNA के प्रतिनिधि QC परिणाम
बाएँ रेखांकन के लिए, X अक्ष अंश आकार (bp) दिखाता है और Y अक्ष सापेक्ष प्रतिदीप्ति इकाई (फू) इंगित करता है । cfDNA के प्राथमिक आकार ~ १७० बीपी है और वहां कोई संक्रमण के बड़े टुकड़े कर रहे हैं । एक नकली ट्रो जेल सही पर दिखाया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 2. पुस्तकालयों का उदाहरण QC विश्लेषण किया ।
X अक्ष अंश आकार (bp) दिखाता है और Y अक्ष सापेक्ष प्रतिदीप्ति इकाइयों (फू) को इंगित करता है । एक नकली ट्रो जेल प्रत्येक ग्राफ के अधिकार पर दिखाया गया था । (ए) रोगी cfDNA नमूना एक तेज चोटी दिखाया के बाद यह एडेप्टर के साथ परिलक्षित किया गया था । (ख) नियंत्रण gDNA नमूना कोई तेज चोटी और एक पक्ष की ओर कोई पूर्वाग्रह के साथ समान रूप से वितरित टुकड़े दिखाया । अनुवर्ती sequencing के लिए दोनों नमूने स्वीकार्य थे । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 3. एर-Seq काम प्रवाह ।
(क) सामान्य कार्य प्रवाह. (B) डेटा विश्लेषण कार्य प्रवाह । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
| ७० जीन के सभी एक्सॉन क्षेत्र से २७३५ exons | |||||||||
| ABL1 | ABL2 | AKT1 | AKT2 | AKT3 | ALK | सुरक्ष | एआर | आरफ | एटीएम |
| एटीआर | औरका | AURKB | axl | BAP1 | BCL2 | BRAF | BRCA1 | BRCA2 | BRD2 |
| BRD3 | BRD4 | BTK | C11orf30 | C1QA | C1S | cbl | CCND1 | CCND2 | CCND3 |
| CCNE1 | CD274 | CDH1 | CDK13 | CDK4 | CDK6 | CDK8 | CDKN1A | CDKN1B | CDKN2A |
| CDKN2B | CHEK1 | CHEK2 | CRKL | CSF1R | CTNNB1 | DDR1 | ddr2 | DNMT3A | egfr |
| EPHA2 | EPHA3 | EPHA5 | ERBB2 | ERBB3 | ERBB4 | ERCC1 | एर्ग | ESR1 | EZH2 |
| FAT1 | FBXW7 | FCGR2A | FCGR2B | FCGR3A | FGFR1 | FGFR2 | FGFR3 | FGFR4 | FLCN |
| FLT1 | FLT3 | FLT4 | FOXA1 | FOXL2 | GAB2 | GATA3 | GNA11 | GNAQ | GNAS |
| HDAC1 | HDAC4 | एचजीएफ | hras | IDH1 | IDH2 | IGF1R | IL7R | ||
तालिका 1. १०२१ kb जांच समृद्ध लक्ष्य क्षेत्रों ।
इन क्षेत्रों में शामिल: १७० जीन से २७३५ exons; 24 जीन से introns, प्रवर्तक क्षेत्र और विराम बिंदु क्षेत्र; ८४७ संबंधित जीन से ११२२ exons. इन 12 सबसे आम ट्यूमर से संबंधित चालक उत्परिवर्तनों और लक्ष्य उत्परिवर्तन साइटों की ९५% से अधिक कवर (फेफड़ों के कैंसर, कोलोरेक्टल कैंसर, गैस्ट्रिक कैंसर, स्तन कैंसर, गुर्दे के कैंसर, अग्नाशय के कैंसर, लीवर कैंसर, थायराइड कैंसर, गर्भाशय ग्रीवा के कैंसर, कैंसर, और एंडोमेट्रियल कार्सिनोमा) ।
| डीएनए | परिणाम | संकेत | आदर्श श्रेणी |
| cfDNA | अंश आकार | डीएनए टुकड़ा वितरण की पहचान | 168bp ± त 20 (क) |
| एकाग्रता | अधिक सटीक डीएनए ठहराव | एकूण cfDNA ≥ 30ng (ब) | |
| gDNA | A260/A230 | रासायनिक संदूषणों की पहचान (उदा., इथेनॉल) | १.५० – २.२ |
| A260/A280 | प्रोटीन संदूषणों की पहचान | १.६० – २.२ | |
| एकाग्रता | डीएनए ठहराव | कुल gDNA & #62; 3ug |
तालिका 2. cfDNA और परिधीय रक्त से निकाले gDNA के गुणवत्ता विश्लेषण ।
cfDNA का पीक साइज 170Bp के आसपास है । गुणवत्ता नियंत्रण २१०० के लिए एक मानकीकृत विधि द्वारा किया जाना चाहिए के लिए नमूना क्षरण और/या gDNA संदूषण के स्तर का निर्धारण । पीक cfDNA निष्कर्षण की गुणवत्ता का विश्लेषण चित्र 1के समान दिखाई देना चाहिए । ध्यान दें कि बढ़ी हुई डीएनए राशि cfDNA में दुर्लभ उत्परिवर्तनों का प्रभावी पता लगाने के लिए एक उच्च गुणवत्ता के साथ एक पुस्तकालय में परिणाम होगा । हम अनुशंसा करते है का उपयोग कम से कम 30 एनजी cfDNA (३०,००० प्रतियां) ।
तालिका 3. के QC एर-Seq सूचना विश्लेषण और पारंपरिक जानकारी विश्लेषण ।
गहरे भूरे रंग के हाइलाइट एक कवरेज गहराई में वृद्धि हुई है इंगित करता है एर-Seq पारंपरिक तरीकों के साथ तुलना में; एक हल्के भूरे रंग के प्रकाश का संकेत नहीं पीसीआर प्रेरित दोहराया ईआर में पढ़ा-Seq । इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
| जीन | chr | शुरू | अंत | cHGVS | pHGVS | समारोह | caseAltIsHot | ईर-Seq var_freq | पारंपरिक var_freq |
| TP53 | 17 | ७५७७५३४ | ७५७७५३५ | c. 746G & #62; T | पी. R249M | बकवास | HighFreq | ०.०४०० | ०.०३७८ |
| egfr | 7 | ५५२५९५१४ | ५५२५९५१५ | प. 2573T & #62; छ | पी. L858R | बकवास | कार्रवाई | ०.०२७० | ०.०१२० |
| एटीएम | 11 | १०८२०३६१८ | १०८२०३६१९ | c. 7919delC | पृ. T2640Ifs * 6 | frameshift | एनडी | ०.०१६९ | ०.०१८० |
| PTCH1 | 9 | ९८२२१९१७ | ९८२२१९१८ | c. 2851G & #62; T | पी. D951Y | बकवास | एनडी | ०.०१५४ | ०.०२६० |
| egfr | 7 | ५५२४९०७० | ५५२४९०७१ | c. 2369C & #62; T | पी. T790M | बकवास | कार्रवाई | ०.००५३ | — — (०.००१३) |
| rb1 | 13 | ४९०३९१५१ | ४९०३९१५२ | c. 2230A & #62; T | पी. I744F | बकवास | एनडी | 0. ००३६ | — — (०.००१४) |
तालिका 4. ईआर-Seq सूचना विश्लेषण के कॉलिंग परिणामहै और पारंपरिक जानकारी विश्लेषण ।
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Discussion
परिसंचारी ट्यूमर डीएनए (ctDNA) के अस्तित्व से अधिक 30 साल पहले की खोज की थी, लेकिन ctDNA विश्लेषण के आवेदन अभी भी नैदानिक अभ्यास में नियमित नहीं है । ctDNA तरीकों के व्यावहारिक अनुप्रयोग में ब्याज ctDNA का पता लगाने और विश्लेषण के लिए प्रौद्योगिकियों के विकास के साथ बढ़ गया है । ctDNA के साथ ट्यूमर की निगरानी सूक्ष्म अवशिष्ट रोग के आकलन के लिए एक ंयूनतम इनवेसिव दृष्टिकोण प्रदान करता है, चिकित्सा के लिए प्रतिक्रिया, और ट्यूमर विकास और intratumoral विविधता13की पृष्ठभूमि के तहत आणविक प्रोफाइल ट्यूमर, 14. संवेदनशीलता और विश्लेषण की विशिष्टता में सुधार इन सभी आवेदनों15,16की सुविधा होगी ।
इस पांडुलिपि में, हम एर Seq, एक होनहार ctDNA का पता लगाने की संवेदनशीलता में सुधार लाने के उद्देश्य से विधि शुरू की, एक उदाहरण के रूप में एक NSCLC मामले का उपयोग कर । पारंपरिक विश्लेषण के साथ तुलना में, एर Seq में हमारे अद्वितीय sequencing एडेप्टर के आवेदन काफी अपनी संवेदनशीलता और विशिष्टता में सुधार, एक कवरेज गहराई में वृद्धि और एक क्षमता कम आवृत्ति उत्परिवर्तनों का पता लगाने के लिए द्वारा संकेत (जैसे EGFR पी. T790M (०.५३%)) । इस रोगी के नमूने में T790M के अस्तित्व Erlotinib प्रतिरोध करने के लिए एक योगदान कारक हो सकता है, और कैसे बेहतर इस मरीज का इलाज करने के लिए में अंतर्दृष्टि दिया, एक तीसरी पीढ़ी EGFR अवरोधक के उपयोग का सुझाव T790M के लिए विशिष्ट, जैसे AZD929117-20. एर में एक और महत्वपूर्ण बात Seq है कि अपनी संवेदनशीलता और विशिष्टता के लिए योगदान आधारभूत डाटाबेस स्क्रीनिंग, जो ctDNA में कम आवृत्ति उत्परिवर्तनों की सटीक पता लगाने की सुविधा से बाहर पृष्ठभूमि शोर फ़िल्टरिंग है ।
हालांकि ईआर-Seq के कई फायदे हैं जो इसे पारंपरिक तरीकों से बेहतर बनाते हैं, फिर भी कुछ चुनौतियां हैं, जिन्हें दूर करने की जरूरत है । ईआर-Seq के लिए प्रमुख चुनौतियों में से एक रक्त में मौजूद ctDNA का बेहद निम्न स्तर है । उन कम आवृत्ति उत्परिवर्तनों के लिए, पर्याप्त ctDNA टेंपलेट के अधिग्रहण महत्वपूर्ण है । हमारे अद्वितीय एडेप्टर काफी ctDNA की पुनरावृत्ति दर में वृद्धि, हालांकि वे अभी भी सुधार की जरूरत है । एर-Seq के लिए एक और चुनौती है, और सभी अंय अनुक्रमण तकनीकों के लिए, लक्ष्य क्षेत्रों के कवरेज की सीमा है । हमारे चयनित १०२१ kb जांच समृद्ध क्षेत्रों, जो ट्यूमर से संबंधित उत्परिवर्तनों के ९५% के बारे में कवर कर सकते हैं, अन्य छोटे विमान के तरीकों के साथ तुलना में अधिक व्यापक हैं21,22,23. हालांकि, के रूप में ट्यूमर विविधता अच्छी तरह से मांयता प्राप्त किया गया है और अधिक से अधिक ट्यूमर के निशान की खोज की गई है, हमारी जांच के सापेक्ष कवरेज दर समृद्ध क्षेत्रों में कमी आती है । बेहतर ट्यूमर रोगियों की जल्दी निदान और रोग की निगरानी के लिए एक उपकरण के रूप में सेवा करने के लिए, अधिक व्यापक अनुक्रमण और विश्लेषण तकनीक की जरूरत है । वर्तमान में, ईआर-Seq अभी भी कम आवृत्ति उत्परिवर्तनों का पता लगाने के लिए डेटा की एक उच्च मात्रा पर निर्भर करता है । ईआर-Seq के अनुप्रयोग के लिए डेटा उपयोग में और सुधार अनुकूल हो सकता है ।
के रूप में ऊपर चर्चा की, एर के साथ जुड़े कई सीमाएं-Seq मौजूद हैं । हालांकि, हमारे अद्वितीय विश्लेषण तकनीक अभी भी कई अंय शीर्ष रैंकिंग इस क्षेत्र में तरीकों के साथ तुलना में लाभ है । पेशेवरों और इस तकनीक की योग्यता के विचार आगे अनुसंधान । नियमित नैदानिक उपयोग के लिए ईआर-Seq की क्षमता नैदानिक चिकित्सकों के लिए बहुत महत्व का हो जाएगा, उन्हें ट्यूमर का निदान करने और चिकित्सा के लिए ट्यूमर गतिशीलता और प्रतिक्रिया की निगरानी करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण के साथ प्रदान. उपंयास पारंपरिक और लक्षित हमारे विश्लेषण से पाया चिकित्सा के लिए प्रतिरोध के साथ जुड़े उत्परिवर्तनों उंनत रोग के साथ कैंसर के रोगियों के लिए उपचार के नए रास्ते की पेशकश हो सकती है ।
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Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
इस काम Geneplus द्वारा समर्थित है-बीजिंग संस्थान ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit | Qiagen | 55114 | DNA Extraction from Peripheral Blood for cfDNA |
| QIAamp DNA Blood Mini Kit | Qiagen | 51105 | DNA Extraction from Peripheral Blood for gDNA |
| Quant-iT dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | Q32854 | Measure cfDNA concentration |
| Quant-iT dsDNA BR Assay Kit | Invitrogen | Q32853 | Measure library concentration |
| Agilent DNA 1000 Reagents | Agilent | 5067-1504 | Measure cfDNA and library fragments |
| The NEBNext UltraII DNA Library Prep Kit for Illumina | NEB | E7645L | Library Preparation |
| Agencourt SPRIselect Reagent | Beckman | B23317 | DNA fragment screening and purification |
| Tris-HCl (10 mM, pH 8.0)-100ML | Sigma | 93283 | Dissolution |
| xGen Lockdown Probes | IDT | —— | xGen Custom Probe |
| Human Cot-1 DNA | Life | 15279-011 | Targeted DNA capture |
| Dynabeads M-270 Streptavidin | Life | 65305 | Targeted DNA capture |
| xGen Lockdown Reagents | IDT | 1072281 | Targeted DNA capture |
| KAPA HiFi HotStart ReadyMix | KAPA | KK2602 | post-capture PCR enrichment libraries |
| KAPA Library Quantification Kit | KAPA | KK4602 | Measure library concentration |
| NextSeq 500 High Output Kit v2((150 cycles) | illumina | FC-404-2002 | Sequence |
| Centrifuge5810 | eppendorf | 5810 | |
| Nanodrop8000 | Thermo Scientific | 8000 | Measure gDNA concentration |
| Qubit 2.0 | Invitrogen | Quantify | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent | ||
| ThermoMixer C | eppendorf | Incubation | |
| 16-tube DynaMagTM-2 Magnet | Life | 12321D | |
| Concentrator plus | eppendorf | ||
| PCR | AB | simplyamp | |
| QPCR | AB | 7500Dx | |
| NextSeq 500 | illumina |
References
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