Summary
이 원고 ctDNA, 응급실이에서 낮은 주파수의 돌연변이 검출 하는 기술을 설명 합니다. 이 메서드는 두 방향 오류 수정, 특별 한 배경 필터 및 효율적인 분자 신안의 독특한 사용에 의해 분화 된다.
Abstract
차세대 시퀀싱 (NGS)를 사용 하 여 종양 DNA (ctDNA) 순환의 분석 임상 종양학의 개발을 위한 유용한 도구가 되고있다. 그러나,이 방법의 응용 프로그램 때문에 혈액에 있는 ctDNA의 양을 추적 분석에서 낮은 감도 도전 이다. 또한, 메서드는이 시퀀싱 및 이후 분석에서 거짓 긍정 및 부정적인 결과 생성할 수 있습니다. 타당성과 병원에서 ctDNA 검색의 신뢰성을 개선 하기 위해, 여기 선물이 시퀀싱, 풍요롭게 드문 돌연변이 시퀀싱 (ER-Seq) 드문 돌연변이 풍요롭게 하는 기술. ER-Seq 유망한 도구 매우 낮은 주파수 유전 변경 감지를 하 게 하 고 따라서 질병 heterogenicity 공부에 매우 도움이 될 것입니다 1 x 107 야생-타입 뉴클레오티드에서 단일 돌연변이 구분할 수 있습니다. 고유한 시퀀싱 어댑터의 결 찰, 덕이 메서드 동안 오류 양방향으로 (감각과 antisense)에 대 한 동일한 시간 수정에 ctDNA 분자의 효율적인 복구를 수 있습니다. 덮어 대상 영역의 측정을 풍요롭게 하는 우리의 다양 한 1021 kb 프로브 12 종양에서 종양 관련 드라이버 돌연변이의 95%. 비용 효율적이 고 보편적인 방법이 유전자 데이터의 유일 하 게 성공적인 축적 수 있습니다. 효율적으로 배경 오류 필터링, 후 응급실-seq 정확 하 게 희귀 변이 검색할 수 있습니다. 사례 연구를 사용 하 여, 상세한 프로토콜 프로브 디자인, 도서관 건설, 대상 DNA 캡처 방법론, 데이터 분석 워크플로 포함 하는 동안에 시연 선물이. 일반적으로이 메서드를 수행 하는 과정 1-2 일 소요 됩니다.
Introduction
차세대 시퀀싱 (NGS), 강력한 도구, 게놈의 신비를 조사 하는 유전 변경을 드러낼 수 있는 정보의 대량을 제공할 수 있습니다. 병원에서 NGS 분석의 응용 프로그램은 특히 맞춤된 의학에 대 한 더 일반적인 되고있다. 그러나 NGS의 가장 큰 한계 중 하나는, 높은 오류 비율입니다. 공부 상속 된 돌연변이 적합 하다, 비록 드문 돌연변이의 분석은 크게 제한1,2, 특히 "" 액체 생 검에서 얻은 DNA를 분석.
종양을 순환 DNA (ctDNA) 종양 세포에서 헛간 혈액 세포 무료 DNA (cfDNA) 이다. 대부분의 경우, ctDNA의 수량에서는 매우 낮은 하 게 하는 그것의 탐지 및 분석 매우 도전입니다. 그러나, ctDNA는 많은 매력적인 기능: 그것의 고립은 최소한 침략 적, 종양 성장의 초기 단계에서 검출 될 수 있다, 치료 효율성을 반영 하는 ctDNA 수준 및 ctDNA 기본 및 전이성 병 변에서 발견 DNA 변이 포함 3 , 4 , 5. 따라서, NGS 기술과 분석의 급속 한 발전을 감안할 때, ctDNA 검출 응용 되고있다 더 매력적.
다른 대규모 병렬 시퀀싱 방법 ctDNA 탐지를 위해 이용 되었습니다 있지만 이러한 방법 중 누구도 클리닉 그들의 제한 때문에 일상적인 사용 하기 위해 허용: 낮은 감도, 다양성의 부족 및 상대적으로 높은 비용6 ,,78. 예를 들어 이중 시퀀싱, 고유 식별자 (UID), 태그에 따라 반복적으로 대부분의 시퀀싱 오류 조정 합의 양방향으로에서 오류를 수정 합니다. 그러나,이 방법의 타당성은 그것의 높은 비용 및 낮은 데이터 활용9,10손실. 마찬가지로, CAPP-Seq 및 그것의 향상 된 반복, CAPP IDE11,12에 있는 큰 실용성 cfDNA 탐지 정확성과 이러한 방법의 개선이 필요 하지만.
정확한 ctDNA 탐지 및 분석에 대 한 현재 필요를 충족 시키기 위해 우리는 풍요롭게 드문 돌연변이 시퀀싱 (ER-Seq)는 새로운 전략을 개발 했다. 이 방법은 다음 결합: ctDNA 분자, 양방향 오류 수정와 중 단일 변이 구별 하는 기능을 효율적으로 복구 하 고유 시퀀싱 어댑터 > 1 × 107 야생-타입 뉴클레오티드; 1021 kb 프로브 커버 대상 영역의 측정의 질을 높일 12 종양, 폐암, 대 장 암, 위 암, 유방암, 신장 암, 췌장암, 간 암, 갑 상선 암 등 종양 관련 돌연변이의 95% 자 궁 경부 암, 식도 암 및 자궁내 막 암 (표 1). 그리고 초기 데이터베이스 심사 하기가 효율적이 고 정확 하 게 ctDNA에 드문 돌연변이 검출 하기 쉽다.
초기 데이터베이스를 구축, 샘플 (처음 ~ 1000)의 같은 종류의 숫자에서 응급실-Seq에 의해 모든 유전자 돌연변이 찾아. 이 진짜 돌연변이 다른 여러 신뢰할 수 있는 검출 방법 및 분석 하 여 확인 해야 합니다. 다음, 거짓 변이의 패턴을 요약 하 고 초기 기준선 데이터베이스 구축 모든 거짓 돌연변이 클러스터. 계속이 데이터베이스에 후속 시퀀싱 실험에서 발견 하는 거짓 변이 추가 합니다. 따라서,이 기준선 데이터베이스 동적 확장된 데이터베이스, 시퀀싱 정확도 크게 향상 됩니다.
진행을 촉진 하 종양 진단 및 모니터링에서 우리는 응급실-Seq, 유니버설 데이터의 수집에 대 한 저비용이 고 실현 가능한 방법 제시. 우리 병원에서 희귀 한 돌연변이 및 사용에 대 한 타당성을 탐지 하기 위한 그것의 정확도 보여주는 수술 응급실-Seq 분석, 사례 연구를 제시.
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Protocol
북경 대학 사람들의 윤리 위원회에 의해 승인 하는 프로토콜에 따라 종양 표본과 혈액 샘플을 가져온 ' s 병원. 서 면된 동의 그들의 샘플을 사용 하 여 환자 로부터 얻은 했다. 참가자는 다음 기준에 따라 상영 했다: 여성, 고급 비 작은 세포 폐암, EGFR p.L858R 돌연변이 질병 진행 EGFR의 두 세션을 다음 타겟으로 Erlotinib, 치료 이전 생어 시퀀싱, 표시 및 저항의 원인을 분석 하 여 새로운 대상 약물을 찾을 ctDNA에 적용 된 응급실-Seq.
1. cfDNA 및 genomic DNA (gDNA) 주변 혈액에서 DNA 추출
- 주변 혈액 컬렉션 튜브에서의 10 mL를 수집, 반전 부드럽게 위아래로 6-8 번을 혼합. 셀 전단 하지 마십시오. 혈액 샘플 컬렉션 튜브 6-37 ° C에서 최대 72 시간까지 저장할 수 있습니다.
- 1600 ()에서 10 분 동안 실내 온도에 컬렉션 튜브 원심 g. x
- 컬렉션 튜브에서 원심 분리기 튜브 일회용 피펫으로 펠 릿 레이어 (백혈구)를 방해 하지 않고 사용 하 여 적절 하 게 표시 4 청소 2 mL 상쾌한 (플라즈마)를 전송.
- Transfer1 mL 2 mL를 깨끗 한 일회용 피펫으로 적절 하 게 사용 하 여 셀의 원심 분리기 관 이라는. 셀 또는 단계 1.8 전에 추운-20 ° C에서 저장 될 수 있습니다.
- 4 ° C에서 10 분 및 16000 () (1.3 단계)에서 플라즈마 원심 g. x
- 전송으로 제대로 표시 하는 원심 분리기 튜브 청소 플라즈마 " 플라즈마 ", 오염을 피하기 위하여 하단에 잔여 볼륨의 ~0.1 mL를 두고. 1.7 단계까지-80 ° C에서 플라즈마를 저장.
- 단계 1.6에서에서 플라즈마의 3 mL cfDNA (ctDNA 포함)을 사용 하 여 제조 업체에 따라 상용 키트를 사용 하 여 ' s 지침.
- GDNA 제조 업체에 따라 상용 키트를 사용 하 여 분리 단계 1.3에서에서 백혈구의 사용 200 µ L ' s 지침.
참고: 모두 cfDNA 및 gDNA를 사용 하기 전에-20 ° C에 저장할 수 있습니다. - 는 CfDNA 및 gDNA (표 2)에 대 한 다른 품질 컨트롤을 적용합니다. 샘플 저하 및 gDNA 오염 수준을 결정 하는 bioanalyzer에 대 한 표준화 된 방법으로 품질 관리를 수행 합니다. CfDNA 추출의 품질의 피크 분석 그림 1과 유사한 표시 되어야 합니다.
참고: cfDNA의 최대 크기는 약 170 bp.는 DNA의 양을 증가 귀 착될 것 이다 cfDNA에 드문 돌연변이의 효과적인 탐지에 대 한 높은 품질 라이브러리 참고. 적어도 30 ng cfDNA (3만 부)를 사용 하는 것이 좋습니다.
2. 도서관 준비
참고: 조각난된 DNA에 기본 라이브러리 건설에 관한 cfDNA 피크 크기 ~ 170 bp와 조각에 존재 하 고 따라서 조각화 될 필요가 없습니다.
- 조각 컨트롤 샘플 (gDNA) 의해 얻을 200-250 bp 파편을 쥡니다.
- 트리 스-EDTA 청소 쥡니다 튜브에 버퍼의 100 µ L에서 gDNA 샘플의 준비 1 µ g.
- 30으로 쥡니다 프로그램 설정 s 12 분의 총 12 사이클에 대 한 해제 및 30 s
- 쥡니다, 후 (5 µ L) 제품 2 %agarose 젤 분석을 실행 하 여 200-250 bp 파편을 포함 하는 것을 확인.
- 새로운 1.5 mL 튜브에 모든 조각화 제품을 전송 하 고 올바른 조각을 선택 하 5 분에 대 한 자석 구슬의 150 µ L로 품 어.
- 는 상쾌한 30 자석 선반에 튜브를 넣어 제거 s.
- 자석 선반에 머물고 튜브 80% 에탄올 (갓 준비)의 200 µ L와 구슬 씻어. 30 알을 품는 상쾌한을 제거 하기 전에 s. 한번 반복.
- 공기 튜브 뚜껑 자석 선반에 머무는 동안 오픈 비즈 건조. Overdried 구슬을 DNA 대상 복구 잘 다는 것을 확인 하지 마십시오. UV/Vis 분광학에 의해 정량화 다음 DNA 파편을 해결 하려면 구슬에 10 mM Tris HCl (pH 8)의 32 µ L을 추가 하 여 구슬에서 DNA 파편을 elute.
참고: 적어도 200 ng 다음 실험에 필요한.
- 끝 준비 반응
참고: 따라 제조 업체 ' s 명령 및 필요에 따라 수정. CfDNA;의 사용 30 ng 그리고 컨트롤과 gDNA의 1 µ g입니다. 살 균 nuclease 무료 튜브에 cfDNA의- 반응 버퍼, 효소 혼합, 30의 3 µ L의 추가 7 µ L ng ddH 2 O 60 µ L의 전체 볼륨에 추가. 별도 튜브에 위의 구성 요소를 추가 하지만 1 µ g의 cfDNA 대신 gDNA.
- 믹스 고 65 ° C는 thermocycler에서 30 분가 열 하는 뚜껑 없이 다음 30 분 동안 20 ° C에 혼합물을 품 어. 다음 단계로 바로 진행.
- 어댑터 결 찰
- 결 찰 마스터 믹스의 추가 30 µ L, 결 찰 증강의 1 µ L 및 단계 2.2에서에서 혼합물에 독특한 시퀀싱 어댑터 4 µ L.
- 열 뚜껑 없이 thermocycler에 15 분 동안 20 ° C에서 품.
- 자석 구슬 resuspend을 다음 단계 전에 적어도 30 분 동안 실내 온도에 비즈를 두고 소용돌이.
- 이전에 언급 한 혼합물에 resuspended 자석 구슬의 87 µ L 추가; 아래로 pipetting으로 잘 혼합 하 고 5 분에 대 한 실 온에서 품 어
- 단계 2.1에 설명 된 대로 세척 및 공기 건조 구슬.
- 10 mm Tris HCl (pH 8) 20 µ L을 추가 하 여 구슬에서 DNA 대상 elute.
- 농축의 DNA 파편 어댑터 출혈
- 추가 20 µ L 어댑터 출혈 DNA의 파편, 인덱스 뇌관/i 7의 5 µ L (2.5 µ L 뇌관-P7 (10 분) 및 시퀀싱을 위해 뇌관-P5 (10 분)의 2.5 µ L), 25µL의 라이브러리 증폭 마스터 믹스, 그리고 ddH 2 O 50 µ L의 총 볼륨.
- PCR 증폭 어댑터 출혈 DNA 및 열 주기 다음과 같습니다: 98 ° C 45에서 초기 변성 뒤 8 사이클 (cfDNA) 또는 4 사이클 (gDNA) 15 ° C에 어 닐 링의 s s, 30 위한 65 ° C s, 72 ° C 30에 대 한 s) 그리고 60 72 ° C에서 최종 확장 s, 다음 4에 온도 들고 ° c.
- 일시 자석 구슬 획득된 파편을 PCR 농축 DNA의 추가 45 µ L.
- 10 mM Tris HCl (pH 8)의 30 µ L에서 어댑터와 함께 elute DNA 조각.
- 라이브러리 품질 관리
- 제조 업체에 따라 ' 어댑터를 측정 하는 상업 키트에 대 한 s 프로토콜 출혈 DNA 농도. DNA 품질을 결정 하는 bioanalyzer를 사용 하 여.
3. 타겟 DNA 캡처
참고: 대상 농축 1021 kb 대상 농축 지역 12에서 알려진된 종양 관련 드라이버 돌연변이 취재에 대 한 특별히 설계 된-프로브 사용자 지정 시퀀스 캡처를 사용 하 여 수행한 종양의 종류입니다. 제조 업체에 대 한 수정 ' s 프로토콜 다음 단계에 자세히 나와 있습니다.
- 풀링 라이브러리의 차단
- 추가 1.5 µ g (cfDNA에 대 한 풀으로 라이브러리의 최대 수는 6, gDNA 20) 8 µ L P5 Block(100P), P7 Block(100P)의 8 µ L 및 침대 1 DNA의 5 µ L의 2 단계에서 (1 µ g / µ L) 무 균 튜브에. 60에서 설정 진공 집중 장치를 사용 하 여 튜브의 내용을 건조 ° c.
- DNA 캡처 라이브러리 조사 Hybridize.
- 3.1: 8.5 µ L 2 X 교 잡 버퍼, 교 잡 증강, 그리고 nuclease 무료 ddH 2 오의 1.8 µ L의 2.7 µ L의 단계에서 튜브를 구성 하는 다음 요소를 추가 하는
- 믹스를 위아래로 pipetting으로 하 고 10 분 동안 95 ° C에 thermomixer에서 품 어
- 인큐베이션, 다음 즉시 사용자 정의 프로브의 4 µ L을 추가. 65 & # 17에서 열 cycler에서 샘플을 품 어6; 뚜껑이 있는 C 4 헤에 75 ° C에가 열
- DNA 조각 캡처
- streptavidin 구슬 구슬 언바운드 DNA를 제거 세척 뒤 교배 대상 DNA를 품 어. 제조 업체에 따라 상업 키트를 사용 하 여 ' resuspended 구슬 캡처된 dna의 최종 20 µ L을 s 지침 조각.
- 캡처된 DNA의 확대 조각
- 상업을 사용 하 여 수행 PCR 키트 2 µ M 백본 oligonucleotides, 제조 업체에 따르면 ' s 지침.
- 때에 PCR 반응 완료, PCR 제품에 직접 정지 구슬의 45 µ L을 추가 하 고 10 mM Tris HCl (pH 8)의 30 µ L로 차입 하 여 구슬에 바인딩된 증폭된 대상 DNA 파편을 풍요롭게.
- 라이브러리 정량화 키트와 함께 DNA 파편을 계량 하 고 Bioanalyzer ( 그림 2)에 의해 평균 조각 길이 결정.
4. 시퀀싱
- 시퀀스 다중화 18 h. 총 데이터 생산은 최대 60 기가바이트 75 bp 짝 끝에서 실행 되는 벤치탑 시퀀서를 사용 하 여 라이브러리, 15 G는 컨트롤 샘플 gDNA 환자 샘플 cfDNA 및 1 G에 대 한 필요.
5. 데이터 분석 워크플로
참고: 그림 3 일반 작업 흐름 및 데이터 분석 프로세스를 표시 합니다. 데이터 분석 매개 변수 및 명령을 다음과 같습니다.
- 고품질 읽기를 필터링 하 고 오류 및 NCfilter를 사용 하 여 UID의 수정.
NCfilter(own)
NCfilter 필터-l 5-q 0.5-0.1 n-T 3-G-1 fastq1-2 fastq2
realSeq(own)
파이썬 빈/realRealSeq MaskUID-1 fq1-2 fq2-o 출력 dir-p 접두사-u 4-s 7-m 3-i uidFile-f. - 참조 게놈 hg19 (인간 게놈 19), BWA (버전 0.7.12-r1039) 메모리를 사용 하 여 시퀀싱 결과 찾아서 게놈 분석 툴킷 (GATK) (버전 3.4-46-gbc02625)로 다시 맞춥니다.
bwa mem t-3 hg19 fastq1 fastq2
자바-d64-서버-XX: + UseParallelGC-XX: ParallelGCThreads = 8-Xms2g-Xmx10g-
Djava.io.tmpdir=/tmp/-jar
GenomeAnalysisTK.jar-T RealignerTargetCreator-R hg19-L targetRegion-dbsnp 알려진 —
allowPotentiallyMisencodedQuals-nt 10-난 cancerBam-난 normalBam
자바-d64-서버-XX: + UseParallelGC-XX: ParallelGCThreads = 8-Xms2g-Xmx10g —
Djava.io.tmpdir=/tmp/-병 GenomeAnalysisTK.jar-T IndelRealigner-R hg19-dbsnp 알려져
-allowPotentiallyMisencodedQuals — targetIntervals 간격-난 cancerBam-난 normalBam - UID와 기지 PCR/시퀀싱에 의해 도입 된 기본 품질 수정 오류 해결 서식 파일 조각의 위치에 따라 중복 클러스터.
realSeq(own)
파이썬 realSeq/빈/realSeq 클러스터-b unmarkdup_sort_merge.bam-r chipRegion-o output_dir-p
-m 6를 접두사 - 다시 정렬 BWA mem.에 의해 클러스터 중복
bwa mem t-3 hg19 fastq1 fastq2 - GATK (버전 3.4-46-gbc02625)를 사용 하 여 기본 품질 평가 점수에의 한 재 다음 로컬 재배치 수행.
Loacal 재배치: 자바-d64-서버-XX: + UseParallelGC-XX: ParallelGCThreads = 8-Xms2g-Xmx10g-Djava.io.tmpdir=/tmp/-병 GenomeAnalysisTK.jar-T RealignerTargetCreator-R hg19-L targetRegion-알려진 dbsnp-allowPotentiallyMisencodedQuals-nt 10 -CancerBam-난 normalBam
자바-d64-서버-XX: + UseParallelGC-XX: ParallelGCThreads = 8-Xms2g-Xmx10g-Djava.io.tmpdir=/tmp/-병 GenomeAnalysisTK.jar-T IndelRealigner-R hg19-알려진 dbsnp-allowPotentiallyMisencodedQuals-targetIntervals 간격-난 cancerBam-난 normalBam
기본 품질 점수 재: 자바-d64-서버-XX: + UseParallelGC-XX: ParallelGCThreads = 8-Xms2g-Xmx10g-Djava.io.tmpdir=/tmp/-GenomeAnalysisTK.jar-T 병 BaseRecalibrator-R hg19-L targetRegion- knownSites dbsnp-knownSites 우주 allowPotentiallyMisencodedQuals-nct 10-나 bam-o grp 자바-d64-서버-XX: + UseParallelGC-XX: ParallelGCThreads = 8-Xms2g-Xmx10g-Djava.io.tmpdir=/tmp/-GenomeAnalysisTK.jar-T 자 PrintReads-난 bam-BQSR grp-o outbam-R hg19-nct 8-allowPotentiallyMisencodedQuals - SNV (단일 뉴클레오티드 변형) 및 INDEL (작은 삽입 또는 삭제) 전화, 낮은 주파수 변이의 정확도 추가 확인 (좋은 지원 읽습니다) 발사 잔여물에 의해 둘 다 정방향 및 역방향 가닥 읽기 제어 그룹 (생식 돌연변이)와 초기 데이터베이스를 통해 여과 및 쌍.
realDcaller(own)
파이썬 realDcaller-f hg19-r chipRegion-C baselineDB-O L-2 cancerBam normalBam-p 30 - CNV (복사 번호 유사) 호출에 대 한 초기 샘플 컨트롤 사용.
NCcnv(own)
파이썬 NCcnv-o cnvdir-t tmpdir-r chipRegion cnv-normgt normalBam-tumgt cancerBam-repdb repeatMarsk - Realigned 매핑되지 않은, 클립 및 SV (구조적 변화) 전화를 귀에 거슬리는 쌍 읽기.
NCsv(own)
파이썬 NCsv-t tmpdir-r hg19-o outputdir x-사본-w bwapath n-4 normalBam cancerBam
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Representative Results
ER-Seq에 사용 되는 풍부한 대상 지역 표 1에 나와 있습니다 1021 kb 프로브는 커버 12 일반적인 종양의 유전자 돌연변이의 95% 이상. 이러한 프로브의 광범위 암 환자의 대다수에 적용이 프로세스를 만든다. 또한, 우리의 독특한 시퀀싱 어댑터 및 기준선 데이터베이스 검사 가능 하 게 그것은 드문 돌연변이 정확 하 게 감지 하.
GDNA 및 주변 혈액에서 추출한 cfDNA의 다른 속성으로 인해 다른 악기 및 표 2에 표시 된 품질 컨트롤에 의해 결정 되는 데이터 품질의 범위가 있다. 성공적으로 추출 된 cfDNA ~ 170 bioanalyzer QC에 의해 분석으로 혈압과 그림 1에 표시 된의 피크 크기를 표시 됩니다. 큰 조각에서 최종 제품에 표시 되지 한다 genomic DNA 오염을 나타냅니다. ER-Seq에 대 한 충분 한 양과 품질의이 환자 샘플에서 추출 된 DNA는 (cfDNA-42.6 ng; gDNA-3.426 µ g).
대상 DNA 캡처 사용자 정의 프로브를 사용 하 여 다음 PCR에 의해 증폭 되었다. 평균 조각 크기 약 320 ~ 피크를 보였다 그림 2A 에서 환자의 cfDNA에 대 한 bioanalyzer 및 대표 데이터에 의해 평가 되었다 bp와 agarose 젤에 독특한 밴드. 그림 2B와 같이 gDNA agarose 젤에 얼룩으로 표시 됩니다. 두 라이브러리의 자질 후속 시퀀싱에 대 한 허용 했다.
시퀀싱, 후 데이터는 그림 3B에서 작업 흐름에 따라 순서 대로 분석 했다. 전통적인 방법에 비해 우리의 응급실-Seq의 장점을 설명 하기 위해 우리는 같은 예제를 사용 하 여 두 분석 수행. 두 분석 결과 표 3 및 표 4에 나와 있습니다. 우리 응급실 Seq 전통적인 방법 (표 3, 전통적인 분석에서 응급실 Seq vs 2475 읽기에서 3214.3 읽기), 이렇게 크게 때문에 cfDNA 분자의 효율적인 복구 되었다에 비해 23% 범위 깊이 향상 했다 희귀 한 돌연변이의 분석을 강화. 그것은 또한 분명 응급실 Seq에 사용 되는 독특한 시퀀싱 어댑터 자연과 PCR을 이용한 중복의 쉽게 차별화를 사용 (표 3, 0 PCR 유도 중복 응급실 Seq에 읽기). 또한, 우리가 발견 호출 결과에 응급실-Seq에 따라 분석은 100% EGFR p.L858R 탐지에 대 한 일관 된 전통적인 분석 (표 4)에 비해 탐지의 주파수는 때 조금 높은 (2.7% 대 1.2%). ER-Seq 분석 EGFR p.T790M (변화 주파수 0.53%)를 포함 한 다른 상대적으로 낮은-주파수 변이의 탐지를 사용 하는 중요 한 것은, (표 4), 그리고이 높은 배경 잡음으로 인해 전통적인 분석에 의해 인식 되지 않았다.
그림 1입니다. 대표 QC 결과의 성공적으로 격리 된 cfDNA
왼쪽된 그래프 조각 크기 (bp)를 표시 하는 X 축 및 Y 축 상대 형광 단위 (FU)을 나타냅니다. CfDNA의 기본 크기는 170 ~ 혈압 고 오염의 큰 조각 없습니다. 시뮬레이션 된 전기 이동 법 젤 오른쪽에 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2입니다. 라이브러리 QC 분석의 예입니다.
X 축 조각 크기 (bp)를 표시 하 고 Y 축 상대 형광 단위 (FU)을 나타냅니다. 시뮬레이션 된 전기 이동 법 젤 각 그래프의 오른쪽에 표시 했다. (A) 환자 cfDNA 샘플 어댑터와 증폭 되었다 후 날카로운 피크를 보여주었다. (B) 제어 gDNA 샘플 보여 없는 날카로운 피크와 아무 편견이 한쪽 방향으로 균등 하 게 분산 된 조각. 두 샘플 후속 시퀀싱에 대 한 허용 했다입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3입니다. ER-Seq 작업 흐름입니다.
(A) 일반 작업 흐름입니다. (B) 데이터 분석 작업 흐름. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 2735 exons 70 유전자의 엑손 지역에서 | |||||||||
| ABL1 | ABL2 | AKT1 | AKT2 | AKT3 | 해 봐 | APC | AR | ARAF | 현금 지급기 |
| ATR | AURKA | AURKB | 액 슬 | BAP1 | BCL2 | BRAF | BRCA1 | BRCA2 | BRD2 |
| BRD3 | BRD4 | BTK | C11orf30 | C1QA | C1S | CBL | CCND1 | CCND2 | CCND3 |
| CCNE1 | CD274 | CDH1 | CDK13 | CDK4 | CDK6 | CDK8 | CDKN1A | CDKN1B | CDKN2A |
| CDKN2B | CHEK1 | CHEK2 | CRKL | CSF1R | CTNNB1 | DDR1 | DDR2 | DNMT3A | EGFR |
| EPHA2 | EPHA3 | EPHA5 | ERBB2 | ERBB3 | ERBB4 | ERCC1 | 르 그 | ESR1 | EZH2 |
| FAT1 | FBXW7 | FCGR2A | FCGR2B | FCGR3A | FGFR1 | FGFR2 | FGFR3 | FGFR4 | FLCN |
| FLT1 | FLT3 | FLT4 | FOXA1 | FOXL2 | GAB2 | GATA3 | GNA11 | GNAQ | 그 나 스 |
| HDAC1 | HDAC4 | HGF | HRA | IDH1 | IDH2 | IGF1R | IL7R | ||
표 1입니다. 1021 kb 프로브 농축된 대상 지역 합니다.
이 지역 포함: 2735 exons에서 170 유전자; introns, 발기인 지구 및 중단점 영역에서 24 유전자; 847 관련된 유전자에서 1122 exons입니다. 이러한 덮어 12 가장 일반적인 종양 (폐암, 대 장 암, 위 암, 유방암, 신장 암, 췌장암, 간 암, 갑 상선 암, 자 궁 경부 암, 종양의 95% 관련 드라이버 돌연변이 및 대상 변형 사이트 식도 암, 그리고 자궁내 막 암)입니다.
| DNA | 결과 | 표시 | 이상적인 범위 |
| cfDNA | 조각 크기 | DNA 파편 분포의 식별 | 168bp±20(a) |
| 농도 | 더 정확한 DNA 정량화 | 총 cfDNA ≥30ng(b) | |
| gDNA | A260/A230 | 화학 오염 (예: 에탄올) 물질의 식별 | 1.50-2.2 |
| A260/A280 | 단백질 오염 물질의 식별 | 1.60-2.2 | |
| 농도 | DNA의 정량화 | 총 gDNA > 3ug |
표 2입니다. CfDNA 및 gDNA 추출 주변 혈액에서 품질 분석.
CfDNA의 최대 크기는 170Bp. 품질 관리 샘플 저하 및 gDNA 오염의 수준을 결정 하는 2100 Bioanalyzer에 대 한 표준화 된 방법으로 수행 되어야 합니다. CfDNA 추출의 품질의 피크 분석은 그림 1과 유사한 표시 되어야 합니다. DNA 양을 증가 하는 cfDNA에서 드문 돌연변이의 효과적인 탐지에 대 한 높은 품질로 라이브러리 발생 합니다. 적어도 30 ng cfDNA (3만 부)를 사용 하는 것이 좋습니다.
표 3입니다. ER-Seq 정보 분석 및 전통적인 정보 분석의는 QC
어두운 회색 강조 범위 깊이 증가 나타냅니다 응급실-Seq 전통적인 방법;와 비교에서 밝은 회색 강조 나타냅니다 없습니다 PCR 유도 응급실이 중복된 읽기 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 유전자 | Chr | 시작 | 끝 | cHGVS | pHGVS | 함수 | caseAltIsHot | ER-Seq var_freq | 전통적인 var_freq |
| TP53 | 17 | 7577534 | 7577535 | c.746G > T | p.R249M | Missense | HighFreq | 0.0400 | 0.0378 |
| EGFR | 7 | 55259514 | 55259515 | c.2573T > G | p.L858R | Missense | 실용적인 | 0.0270 | 0.0120 |
| 현금 지급기 | 11 | 108203618 | 108203619 | c.7919delC | p.T2640Ifs*6 | frameshift | ND | 0.0169 | 0.0180 |
| PTCH1 | 9 | 98221917 | 98221918 | c.2851G > T | p.D951Y | Missense | ND | 0.0154 | 0.0260 |
| EGFR | 7 | 55249070 | 55249071 | c.2369C > T | p.T790M | Missense | 실용적인 | 0.0053 | ——(0.0013) |
| RB1 | 13 | 49039151 | 49039152 | c.2230A > T | p.I744F | Missense | ND | 0입니다. 0036 | ——(0.0014) |
표 4입니다. ER-Seq 정보 분석가의 호출 결과전통적인 정보 분석.
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Discussion
그러나 순환 종양 DNA (ctDNA)의 존재는 ctDNA 분석의 응용 프로그램은 여전히 하지 일상적인 임상 연습에 30 여 년 전, 발견 되었다. CtDNA 검출 및 분석을 위한 기술 개발의 ctDNA 방법의 실용적인 응용 프로그램에 대 한 관심 증가 했다. 미세한 잔여 질병, 치료, 그리고 종양 진화와 intratumoral이13의 배경 아래 종양 분자 프로 파일에 대 한 응답의 평가 대 한 최소한-침략 적 접근을 제공 종양 모니터링 ctDNA 14. 향상 된 감도와 특이성 분석의 모든 이러한 응용 프로그램15,16을 촉진할 것 이다.
이 원고에 응급실-Seq, ctDNA 검출의 감도 향상을 목적으로 유망한 방법 예를 들어 NSCLC 케이스를 사용 하 여 시행 했습니다. 그것의 감도 및 특이성, 범위 깊이 증가 (예: EGFR p 낮은 주파수 변이 검출 하는 능력에 의해 표시 된 크게 개선 응급실-Seq에 우리의 독특한 시퀀싱 어댑터의 응용 프로그램 전통적인 분석에 비해. T790M (0.53%)). 이 환자 샘플에서 T790M의 존재 Erlotinib 저항, 기여 요인이 될 수 있습니다 그리고 더 나은 T790M, AZD929117-20 등에 대 한 특정 한 제 3 세대 EGFR 억제제의 사용을 제안 하는이 환자를 치료 하는 방법에 대 한 통찰력을 했다. 그것의 감도 및 특이성에 기여-Seq 응급실에에서 또 다른 중요 한 포인트 기준 데이터베이스 심사, 배경 소음을 필터링 하 여 ctDNA에서 낮은 주파수 변이의 정확한 탐지를 용이 하 게 하는.
응급실-Seq는 전통적인 방법에 우수한 있도록 많은 이점이 있다, 비록 지금도 극복 될 필요가 있는 몇몇 도전이 있다. ER-Seq에 대 한 주요 과제 중 하나는 혈액에 존재 ctDNA의 매우 낮은 수준입니다. 그 낮은 주파수 변이 대 한 충분 한 서식 파일 ctDNA의 취득은 중요 합니다. 비록 그들은 여전히 향상 시킬 필요가 우리의 독특한 어댑터 크게 ctDNA의 재활용 비율을 증가. 또 다른 도전 응급실-Seq, 그리고 모든 다른 시퀀싱 기법, 대상 영역의 적용의 제한 사항입니다. 우리의 선택된 1021 kb 프로브 종양 관련 돌연변이의 약 95%를 커버 할 수 있다, 다른 작은 비행기 방법21,,2223에 비해 더 포괄적인는 지역 농축. 그러나, 종양이 잘 인식 되 고 점점 더 많은 종양 마커 발견 되었습니다, 우리의 프로브 상대 범위 속도 농축 지역 감소. 조기 진단 및 종양 환자의 질병 모니터링 툴으로 서 보다 나은 서비스 제공, 더 포괄적인 시퀀싱 및 분석 기술이 필요 합니다. 현재, 응급실-Seq는 여전히 낮은 주파수 변이 검출에 대 한 데이터의 높은 볼륨에 의존 합니다. 데이터 활용의 더 개선 응급실-이 응용 프로그램에 대 한 유리한 될 수 있습니다.
위에서 설명 했 듯이, 응급실-Seq와 관련 된 많은 한계가 존재 한다. 그러나, 우리의 고유한 분석 기술을 여전히이 분야에서 다른 일류 방법에 비해 많은 이점이 있다. 이 기술은의 찬 부 양론 장점을 더 연구. 일상적인 임상 사용을 위한 ER-Seq의 잠재적인 종양 및 모니터 종양의 역학과 치료에 응답을 진단 하는 강력한 도구를 제공 하는 임상 의사에 대 한 매우 중요 될 것입니다. 우리의 분석에 의해 발견 하는 전통과 타겟 치료에 저항 관련 새로운 돌연변이 고급 질병으로 암 환자에 대 한 치료의 새로운도 제공할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 작업은 Geneplus-베이징 연구소에 의해 지원 됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit | Qiagen | 55114 | DNA Extraction from Peripheral Blood for cfDNA |
| QIAamp DNA Blood Mini Kit | Qiagen | 51105 | DNA Extraction from Peripheral Blood for gDNA |
| Quant-iT dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | Q32854 | Measure cfDNA concentration |
| Quant-iT dsDNA BR Assay Kit | Invitrogen | Q32853 | Measure library concentration |
| Agilent DNA 1000 Reagents | Agilent | 5067-1504 | Measure cfDNA and library fragments |
| The NEBNext UltraII DNA Library Prep Kit for Illumina | NEB | E7645L | Library Preparation |
| Agencourt SPRIselect Reagent | Beckman | B23317 | DNA fragment screening and purification |
| Tris-HCl (10 mM, pH 8.0)-100ML | Sigma | 93283 | Dissolution |
| xGen Lockdown Probes | IDT | —— | xGen Custom Probe |
| Human Cot-1 DNA | Life | 15279-011 | Targeted DNA capture |
| Dynabeads M-270 Streptavidin | Life | 65305 | Targeted DNA capture |
| xGen Lockdown Reagents | IDT | 1072281 | Targeted DNA capture |
| KAPA HiFi HotStart ReadyMix | KAPA | KK2602 | post-capture PCR enrichment libraries |
| KAPA Library Quantification Kit | KAPA | KK4602 | Measure library concentration |
| NextSeq 500 High Output Kit v2((150 cycles) | illumina | FC-404-2002 | Sequence |
| Centrifuge5810 | eppendorf | 5810 | |
| Nanodrop8000 | Thermo Scientific | 8000 | Measure gDNA concentration |
| Qubit 2.0 | Invitrogen | Quantify | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent | ||
| ThermoMixer C | eppendorf | Incubation | |
| 16-tube DynaMagTM-2 Magnet | Life | 12321D | |
| Concentrator plus | eppendorf | ||
| PCR | AB | simplyamp | |
| QPCR | AB | 7500Dx | |
| NextSeq 500 | illumina |
References
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