Summary
Dette manuskriptet beskriver en teknikk for å oppdage mutasjoner lavfrekvente i ctDNA, ER-Seq. Denne metoden skiller seg ut med sin unike bruk av toveis feilretting, spesielle bakgrunn filter og effektiv molekylær oppnåelse.
Abstract
Analyse av sirkulerende svulst DNA (ctDNA) med neste generasjons sekvensering (NGS) har blitt et verdifullt verktøy for utvikling av clinical onkologi. Anvendelsen av denne metoden er imidlertid utfordrende på grunn av sin lav sensitivitet i å analysere spor mengden ctDNA i blodet. Metoden kan videre generere falske positive og negative resultater fra denne sekvensering og påfølgende analyse. For å forbedre det gjennomførbarhet og pålitelig ctDNA gjenkjenning i klinikken, presenterer her vi en teknikk som beriker sjeldne mutasjoner for sekvensering, berike sjeldne mutasjon sekvensering (ER-Seq). ER-Seq kan skille en enkelt mutasjon av 1 x 107 vill-type nukleotider, som gjør det en lovende verktøyet å merker ekstremt lavfrekvente genetiske endringer og dermed vil være svært nyttig i å studere sykdom heterogenicity. I kraft av unike sekvensering kortets hemorroider gjør denne metoden en effektiv utvinning av ctDNA molekyler, mens på samme tid korrigerer for feil bidirectionally (følelse og antisense). Vårt utvalg av 1021 kb sonder beriker måling av Målrett mot regioner som dekker over 95% av svulst-relaterte driveren mutasjoner i 12 svulster. Dette kostnadseffektive og universelle gjør en entydig vellykket akkumulering av genetiske data. Etter effektivt filtrere ut bakgrunn feil, finner nettopp ER-seq sjeldne mutasjoner. Bruker en case-studie, presenterer vi en detaljert protokoll demonstrere sonde design, bibliotek konstruksjon og målet DNA fange metoder, mens også inkludert data analyse arbeidsflyten. Prosessen for å utføre denne metoden vanligvis tar 1-2 dager.
Introduction
Neste generasjons sekvensering (NGS), et kraftig verktøy for å undersøke mysterier genomet, kan gi en stor mengde informasjon som kan avsløre genetiske endringer. Programmet NGS analyse i klinikken er blitt mer vanlig, spesielt for personlige medisin. En av de største begrensningene av NGS, er imidlertid en høy feil. Selv om det anses egnet for studere arvet mutasjoner, er analyse av sjeldne mutasjoner sterkt begrenset1,2, spesielt når analysere DNA fått fra en "flytende biopsi".
Sirkulerende svulst er DNA (ctDNA) cellen gratis DNA (cfDNA) i blodet som er utgytt fra kreftceller. I de fleste tilfeller er antallet ctDNA ekstremt lav, som gjør sin deteksjon og analyse svært utfordrende. CtDNA har imidlertid mange attraktive funksjoner: isolasjonen er minimal invasiv, det kan påvises i de tidlige stadiene av tumor vekst, ctDNA nivået viser effektivitet og ctDNA inneholder DNA mutasjoner i både primær og metastatisk lesjoner 3 , 4 , 5. derfor gitt den raske utviklingen av NGS teknikk og analyse, programmet av ctDNA er blitt mer attraktiv.
Forskjellige massivt parallelle sekvenser tilnærminger har vært benyttet for ctDNA gjenkjenning, men ingen av disse metodene har blitt akseptert for rutinemessig bruk i klinikker på grunn av sine begrensninger: lav følsomhet, mangel på allsidighet og en relativt høy pris6 ,7,8. For eksempel dobbeltsidig sekvensering, basert på en unik identifikator kode (UID), gjentatte ganger retter opp feil i konsensus bidirectionally, rette opp de fleste sekvensering feil. Muligheten for denne metoden er imidlertid tapt på grunn av sin høye og lave utnyttelse9,10. Tilsvarende har større praktiske i CAPP-Seq og dens forbedret gjentakelse CAPP-IDES11,12, i cfDNA deteksjon, om nøyaktighet og universalitet av metodene må forbedres.
For å møte trenger til nøyaktig ctDNA deteksjon og analyse, utviklet vi en ny strategi, berike sjeldne mutasjon sekvensering det (ER-Seq). Denne tilnærmingen kombinerer følgende: unik sekvensering adaptere effektivt gjenopprette ctDNA molekyler, med toveis feilretting og muligheten til å skille en enkelt mutasjon av > 1 × 107 vill-type nukleotider; 1021 kb sonder som beriker måling av Målrett mot regioner som dekker over 95% av svulst-relaterte mutasjoner fra 12 svulster, herunder lungekreft, tykktarmskreft, magekreft, brystkreft, nyrekreft, bukspyttkjertelkreft, leverkreft, kreft i skjoldbruskkjertelen, livmorhalskreft, esophageal kreft og endometrial karsinom (tabell 1); og opprinnelige databasen screening gjør det effektivt og enkelt å nøyaktig oppdage sjeldne mutasjoner i ctDNA.
For å bygge en planlagt database, kan du finne alle genet mutasjoner av ER-Seq fra en rekke samme type prøver (~ 1000 i begynnelsen). Disse virkelige mutasjoner må bekreftes av flere pålitelig gjenkjenningsmetoder og analyse. Deretter oppsummere mønster av falske mutasjoner og klynge alle falske mutasjoner å bygge første opprinnelige databasen. Fortsett å legge til falske mutasjoner funnet fra påfølgende sekvensering eksperimenter til denne databasen. Derfor blir denne planlagte databasen en dynamisk utvidet database som betydelig forbedrer sekvensering nøyaktighet.
For å fremme fremgang i svulst diagnostikk og overvåking, presenterer vi ER-Seq, en lav kostnad og mulig metode for oppkjøpet av universelle. Vi presenterer en studie som gjennomgikk ER-Seq analyse, demonstrere nøyaktigheten for å oppdage sjeldne mutasjoner og muligheten for bruk i klinikken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
tumor eksemplarer og blodprøver ble innhentet etter en protokoll godkjent av etikk-komiteen av Peking University folk ' s sykehus. Skriftlig samtykke ble innhentet fra pasienter å bruke sine eksempler. Deltakerne ble vist i henhold til følgende kriterier: kvinne, avansert ikke-liten lungekreft, EGFR p.L858R mutasjon angitt av tidligere Sanger sekvensering, sykdomsprogresjon etter to økten EGFR målrettet terapi med Erlotinib, og ER-Seq som ble brukt til ctDNA å analysere årsaken til motstand og finne nye mål stoffer.
1. DNA utvinning fra perifert blod for cfDNA og genomisk DNA (gDNA)
- samle 10 mL av perifert blod i en samling rør, invertere forsiktig opp og ned 6 - 8 ganger å blande. Unngå celle klipping. Blodprøver kan lagres i samlingen røret ved 6-37 ° C i opptil 72 timer.
- Sentrifuge samling røret ved romtemperatur for 10 min på 1600 (±150) x g.
- Overføre nedbryting (plasma) fra samlingen røret til fire rene 2 mL riktig merket sentrifuge rør med en engangs Pipetter uten å forstyrre pellets laget (hvite blodlegemer).
- Transfer1 mL av celler ved hjelp av en ren disponibel Pipetter til en 2 mL riktig merket sentrifuge rør. Cellene kan være lagret på 20 ° C eller kaldere før trinn 1.8.
- Sentrifuge plasma (fra trinn 1.3) for 10 min på 4 ° C og 16000 (±150) x g.
- Overføre plasma å rengjøre sentrifuge rør riktig merket som " plasma ", la ~0.1 mL residualvolum nederst for å unngå forurensning. Lagre plasma ved-80 ° C til trinn 1.7.
- Bruker 3 mL plasma fra trinn 1.6 isolere cfDNA (inneholder ctDNA) ved hjelp av en kommersielt tilgjengelig kit, etter produsenten ' s instruksjoner.
- Bruk 200 µL av hvite blodceller fra trinn 1.3 isolere gDNA ved hjelp av en kommersielt tilgjengelig kit, etter produsenten ' s instruksjoner.
Merk: Både cfDNA og gDNA kan lagres på 20 ° C før bruk. - Gjelder forskjellige kvalitetskontroll for cfDNA og gDNA (tabell 2). Utføre kvalitetskontroll av en standardisert metode for bioanalyzer til å bestemme nivåer for eksempel fornedrelse og/eller gDNA forurensning. Topp analyse av kvaliteten på cfDNA utvinning skal ligne figur 1.
Merk: Den største størrelsen på cfDNA er rundt 170 bp. Merk at økende mengden av DNA vil resultere i en høyere kvalitet bibliotek for effektiv påvisning av sjeldne mutasjoner i cfDNA. Vi anbefaler å bruke minst 30 ng cfDNA (30.000 eksemplarer).
2. Biblioteket forberedelse
Merk: om base bibliotek konstruksjon på fragmentert DNA, cfDNA finnes i fragmenter med en topp størrelse ~ 170 bp og dermed trenger ikke fragmenteres.
- Fragment kontroll prøven (gDNA) ved sonication å få 200-250 bp fragmenter.
- Forberede 1 µg av gDNA prøve i 100 µL av Tris-EDTA buffer i en ren sonication tube.
- Sette sonication programmet idet 30 s på og 30 s av 12 sykluser for totalt 12 min.
- Etter sonication, bekrefte produktet (5 µL) inneholder 200-250 bp fragmenter ved å kjøre en analyse med 2% agarose gel.
- Overføre alle fragmentering produkter til en ny 1,5 mL tube og ruge med 150 µL av magnetiske perler for 5 min å velge riktig fragmenter.
- Fjerne nedbryting ved å sette røret på en magnetisk rack for 30 s.
- Vask perler med 200 µL av 80% etanol (nylagde) med røret på magnetiske stativet. Inkuber for 30 før fjerne nedbryting. Gjentas én gang.
- Lufttørke perler med rør lokk åpent mens du bor på magnetiske stativet. Unngå overdried perler å sørge for at DNA målet gjenoppretter også. Elute DNA fragmenter fra perler ved å legge til 32 µL av 10 mM Tris-HCl (pH 8) perler å løse DNA fragmenter etterfulgt av kvantifisering av UV/Vis spektroskopi.
Merk: minst 200 ng kreves for følgende eksperimenter.
- Slutten Prep reaksjon
Merk: Følg produsent ' s instruksjon og endre etter behov. Bruk 30 ng av cfDNA; og 1 µg av gDNA som kontrollen.- Legge til 7 µL reaksjon bufferen, 3 µL av enzymet miksen, 30 ng av cfDNA i et sterilt nuclease-fri rør, og legge ddH 2 O til totale volumet av 60 µL. Legg til de ovennevnte komponentene i en separat tube, men med 1 µg av gDNA i stedet for cfDNA.
- Blanding og Inkuber blandingen ved 20 ° C i 30 min etterfulgt av 65 ° C i 30 minutter i en thermocycler uten lokket oppvarmet. Videre umiddelbart til neste trinn.
- Adapter Ligation
- legge 30 µL av hemorroider master mix og 1 µL av hemorroider enhancer 4 µL av unike sekvensering kortene til blanding fra trinn 2.2.
- Incubate på 20 ° C i 15 min i en thermocycler uten lokket oppvarmet.
- Vortex resuspend magnetiske perler og la perler ved romtemperatur for minst 30 min før neste trinn.
- Legge til 87 µL av resuspended magnetiske perler til nevnte blandingen, bland godt pipettering opp og ned og deretter ruge ved romtemperatur for 5 min.
- Vask og luften tørr perler som beskrevet i trinn 2.1.
- Elute DNA målet fra perler ved å legge til 20 µL av 10 mM Tris-HCl (pH 8).
- DNA-berikelse fragmenter samskrevet med adapter
- legge til 20 µL av kortet samskrevet DNA fragmenter, 5 µL av indeks Primer/i7 (2,5 µL Primer-P7 (10 pM) og 2,5 µL av Primer-P5 (10 pM), sekvensering forbindelse), 25µL av biblioteket forsterkning master mix og ddH 2 O til et totalt volum på 50 µL.
- PCR forsterke kortet samskrevet DNA og termisk syklus som følger: første rødsprit ved 98 ° C i 45 s, etterfulgt av 8 sykluser (cfDNA) eller 4 sykluser (gDNA) av avspenning ° C for 15 s, 65 ° C for 30 s, 72 ° C for 30 s) , og en endelig utvidelse ved 72 ° C for 60 s, da holder temperaturen på 4 ° C.
- Legge til 45 µL av suspendert magnetiske perler til PCR-beriket DNA å få kjøpt fragmenter.
- Elute DNA fragmenter med kort i 30 µL av 10 mM Tris-HCl (pH 8).
- Bibliotek kvalitetskontroll
- følger produsentens ' s protokollen for kommersielle kit å måle kortet samskrevet DNA konsentrasjon. Bruk bioanalyzer å bestemme DNA kvaliteten.
3. Målrettet DNA fange
Merk: målet berikelse ble utført ved hjelp av en egendefinert rekkefølge fangst-sonde som er spesielt utformet 1021 kb målet berikelse regionens dekker kjent svulst-assosiert driveren mutasjoner 12 ulike typer av svulst. Endringer til produsenten ' s-protokollen er beskrevet i fremgangsmåten.
- Legge til 1,5 µg sperring av pooling biblioteker (maksimalt antall bibliotekene basseng for cfDNA er 6, gDNA er 20) fra trinn 2, 8 µL P5 Block(100P), 8 µL av P7 Block(100P) og 5 µL av Cot-1 DNA (1 µg/µL) i et sterilt rør. Tørr innholdet i røret med en vakuum konsentrator satt til 60 ° C.
- Hybridize DNA fange sonder med biblioteket.
- Legge til følgende komponenter til røret fra trinn 3.1: 8.5 µL av 2 X hybridisering buffer, 2,7 µL av hybridisering enhancer, og 1,8 µL av nuclease-gratis ddH 2 O.
- Blanding av pipettering opp og ned og Inkuber i en thermomixer på 95 ° C i 10 minutter
- Etter inkubasjon umiddelbart legge 4 µL av egendefinert sonde. Inkuber prøver en termisk cycler på 65 & #176. C med lokk oppvarmet til 75 ° C i 4 h.
- DNA fragmenter fange
- ruge hybridisert målet DNA med streptavidin perler etterfulgt av vaske perler for å fjerne ubundet DNA. Bruke kommersielle kit ifølge produsenten ' s instruksjoner å få en siste 20 µL av resuspended perler med fanget DNA fragmenter.
- Forsterkning av fanget DNA fragmenter
- utføre PCR bruke kommersielle kit med 2 µM ryggraden oligonucleotides, ifølge produsenten ' s instruksjoner.
- Når den PCR reaksjonen er fullført, legge til 45 µL av suspendert perler direkte PCR produktet og berike forsterket målet DNA fragmenter bundet til perler ved elueringsrør med 30 µL av 10 mM Tris-HCl (pH 8).
- Kvantifisere DNA fragmenter med biblioteket kvantifisering kit og avgjøre gjennomsnittlig fragment av Bioanalyzer ( figur 2).
4. sekvensering
- sekvens multiplekset biblioteker med 75 bp sammen-end kjører på en Borstemmaskin sequencer for 18 h. totaldata produsert opptil 60 GB, 15 G er nødvendig for pasienten utvalg cfDNA og 1G for kontroll prøven gDNA.
5. data analyse arbeidsflyt
Merk: Figur 3 viser generelle flyten og data analyse arbeidsprosessen. Data analyse parametere og kommandoer vises under.
- Filtrere lav kvalitet leser og korrigere feil og maskering av UID bruker NCfilter.
NCfilter(own)
NCfilter filtrere -l 5 - q 0,5 -n 0.1 -T 3 - G -1 fastq1-2 fastq2
realSeq(own)
python bin/realRealSeq MaskUID -1 fq1-2 fq2 -o utgang dir -p prefiks -u 4 -s 7 - m 3 -i uidFile-f. - Henvise genomet hg19 (menneskelige genom 19), Finn sekvensering resultatene med BWA (versjon 0.7.12-r1039) mem og justere med genom analyse verktøyet (GATK) (versjon 3.4-46-gbc02625).
BWA mem -t 3 hg19 fastq1 fastq2
java-d64-server - XX: + UseParallelGC - XX: ParallelGCThreads = 8-Xms2g - Xmx10g -
Djava.io.tmpdir=/tmp/-jar
GenomeAnalysisTK.jar -T RealignerTargetCreator -R hg19 -L targetRegion-kjent dbsnp —
allowPotentiallyMisencodedQuals -nt 10 - jeg cancerBam-jeg normalBam
java-d64-server - XX: + UseParallelGC - XX: ParallelGCThreads = 8-Xms2g-Xmx10g —
Djava.io.tmpdir=/tmp/-jar GenomeAnalysisTK.jar -T IndelRealigner -R hg19-kjent dbsnp
- allowPotentiallyMisencodedQuals — targetIntervals intervaller-jeg cancerBam-jeg normalBam - Cluster duplikater i henhold til UID og plasseringen av malen fragmenter, som vil rette feilen baser introdusert av PCR/sekvensering og endre base kvaliteten.
realSeq(own)
python realSeq/bin/realSeq KLYNGE -b unmarkdup_sort_merge.bam - r chipRegion -o output_dir -p
prefiks -m 6 - re-align gruppert duplikater av BWA mem.
BWA mem -t 3 hg19 fastq1 fastq2 - utføre en lokal omstilling etterfulgt av en rekalibrering av base kvalitetspoeng ved hjelp av GATK (versjon 3.4-46-gbc02625).
Loacal omstilling: java-d64-server - XX: + UseParallelGC - XX: ParallelGCThreads = 8-Xms2g-Xmx10g-Djava.io.tmpdir=/tmp/-jar GenomeAnalysisTK.jar -T RealignerTargetCreator -R hg19 -L targetRegion-kjent dbsnp - allowPotentiallyMisencodedQuals -nt 10 -Jeg cancerBam-jeg normalBam
java-d64-server - XX: + UseParallelGC - XX: ParallelGCThreads = 8-Xms2g-Xmx10g-Djava.io.tmpdir=/tmp/-jar GenomeAnalysisTK.jar -T IndelRealigner -R hg19-kjent dbsnp - allowPotentiallyMisencodedQuals - targetIntervals intervaller-jeg cancerBam-jeg normalBam
base kvalitetspoeng rekalibrering: java-d64-server - XX: + UseParallelGC - XX: ParallelGCThreads = 8-Xms2g-Xmx10g-Djava.io.tmpdir=/tmp/ - jar GenomeAnalysisTK.jar -T BaseRecalibrator -R hg19 -L targetRegion - knownSites dbsnp - knownSites kosmiske - allowPotentiallyMisencodedQuals - nct 10 - jeg bam -o grp java-d64-server - XX: + UseParallelGC - XX: ParallelGCThreads = 8-Xms2g-Xmx10g-Djava.io.tmpdir=/tmp/-jar GenomeAnalysisTK.jar -T PrintReads-jeg bam - BQSR grp -o outbam -R hg19 - nct 8 - allowPotentiallyMisencodedQuals - For SNV (enkelt-nukleotid variant) og INDEL (liten innsettinger eller slettinger) ringer, nøyaktigheten av den lavfrekvente mutasjoner blir ytterligere bekreftet av GSR (god støtte leser) med begge revers strand lese par og filtrering gjennom kontrollgruppen (germline mutasjoner) og den opprinnelige databasen.
realDcaller(own)
python realDcaller -f hg19 - r chipRegion - C baselineDB - O -L 2 cancerBam normalBam -p 30 - bruke planlagte prøver som en kontroll for CNV (copy number variasjon) ringer.
NCcnv(own)
python NCcnv -o cnvdir -t tmpdir - r chipRegion cnv - normgt normalBam - tumgt cancerBam - repdb repeatMarsk - Realigned kartlagte, klipp og uharmoniske par leser ringe SV (strukturelle variasjoner).
NCsv(own)
python NCsv -t tmpdir - r hg19 -o outputdir - x transkripsjon -w bwapath -n 4 normalBam cancerBam
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
1021 kb sonder beriket Målrett mot regioner i ER-Seq er vist i tabell 1, som dekker over 95% av genet mutasjoner i 12 vanlige svulster. Mangfoldet av disse sonder gjør denne prosessen gjelder for et flertall av pasienter. I tillegg gjør våre unike sekvensering adaptere og planlagte databasen screening det mulig å oppdage sjeldne mutasjoner nøyaktig.
På grunn av de forskjellige egenskapene til gDNA og cfDNA Hentet fra perifert blod, er det en rekke datakvalitet, som bestemmes av instrumenter og kvalitetskontroll vist i tabell 2. Vellykket utdraget cfDNA skal vise en topp størrelse på ~ 170 bp, som analysert av bioanalyzer QC og vist i figur 1. Store fragmenter angir forurensning fra genomisk DNA, som ikke vises i det endelige produktet. DNA Hentet fra denne pasienten prøven var tilstrekkelig kvalitet og antallet for ER-Seq (cfDNA - 42,6 ng, gDNA - 3.426 µg).
Målet DNA fange ved hjelp av en egendefinert sonde ble deretter forsterket av PCR. Gjennomsnittlig fragment størrelsen ble evaluert av bioanalyzer og representant for pasientens cfDNA i figur 2A viste en topp rundt ~ 320 bp og en enestående sammenbinding på agarose gel. gDNA skal vises som en smøre på en agarose gel, som vist i figur 2B. Kvaliteter av begge bibliotekene var akseptabel for den påfølgende sekvensering.
Etter sekvensering, ble dataene analysert i rekkefølge arbeidsflyten i figur 3B. For å illustrere fordelene med vår ER-Seq versus den tradisjonelle metoden, utført vi både analyser bruker samme prøven. Resultatene fra begge analyser vises i tabell 3 og tabell 4. Vi viste at ER-Seq forbedrer dekning dybde med 23% sammenlignet med den tradisjonelle metoden (tabell 33214.3 leser i ER-Seq vs 2475 leser i tradisjonelle analyse), som var på grunn av sin effektive utvinning av cfDNA molekyler, dermed sterkt styrke analyse av sjeldne mutasjoner. Det er også klart at unike sekvensering kortene brukes i ER-Seq aktivere enkel differensiering av naturlige og PCR-indusert duplikasjoner (tabell 3, 0 PCR indusert duplisert Les i ER-Seq). I tillegg fant vi i ringer resultatene at analyse basert på ER-Seq var 100% konsekvent for EGFR p.L858R gjenkjenning og at frekvensen av gjenkjenning var litt høyere (2,7% vs 1,2%) når sammenlignet med tradisjonelle analyse (tabell 4). Viktigere, aktivert ER-Seq analyse påvisning av andre relativt lav frekvens mutasjoner, inkludert EGFR p.T790M (variant frekvens 0.53%) (Tabell 4), og dette ble ikke gjenkjent av tradisjonelle analyse på grunn av høy bakgrunnsstøy.
Figur 1. Representant QC resultatet av med hell isolere cfDNA
For venstre grafene, X-aksen viser fragment størrelsen (bp) og Y-aksen angir relativ fluorescens enheter (FU). Den primære cfDNA er ~ 170 bp og det er ingen stor fragmenter av forurensning. En simulert geleelektroforese gel vises til høyre. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Eksempel på biblioteker QC analysert.
X-aksen viser fragment størrelsen (bp) og Y-aksen angir relative fluorescens enheter (FU). En simulert geleelektroforese gel ble vist til høyre for hvert enkelt diagram. (A) pasienten cfDNA eksempel viste en skarp topp etter det ble forsterket med kort. (B) kontroll gDNA prøven viste jevnt fordelte fragmenter med ingen skarpe peak og ingen skjevhet mot den ene siden. Begge eksemplene var akseptabelt for påfølgende sekvensering. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. ER-Seq arbeidsflyt.
(A) de generelle arbeidsflyt. (B) Data analyse arbeidsflyt. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| 2735 exons fra alle ekson regionen av 70 gener | |||||||||
| ABL1 | ABL2 | AKT1 | AKT2 | AKT3 | ALK | APC | AR | ARAF | ATM |
| ATR | AURKA | AURKB | AXL | BAP1 | BCL2 | BRAF | BRCA1 | BRCA2 | BRD2 |
| BRD3 | BRD4 | BTK | C11orf30 | C1QA | C1S | CBL | CCND1 | CCND2 | CCND3 |
| CCNE1 | CD274 | CDH1 | CDK13 | CDK4 | CDK6 | CDK8 | CDKN1A | CDKN1B | CDKN2A |
| CDKN2B | CHEK1 | CHEK2 | CRKL | CSF1R | CTNNB1 | DDR1 | DDR2 | DNMT3A | EGFR |
| EPHA2 | EPHA3 | EPHA5 | ERBB2 | ERBB3 | ERBB4 | ERCC1 | ERG | ESR1 | EZH2 |
| FAT1 | FBXW7 | FCGR2A | FCGR2B | FCGR3A | FGFR1 | FGFR2 | FGFR3 | FGFR4 | FLCN |
| FLT1 | FLT3 | FLT4 | FOXA1 | FOXL2 | GAB2 | GATA3 | GNA11 | GNAQ | GNAS |
| HDAC1 | HDAC4 | HGF | HRAS | IDH1 | IDH2 | IGF1R | IL7R | ||
Tabell 1. 1021 kb sonder beriket Målrett mot regioner.
Disse regionene inkludert: 2735 exons fra 170 gener; introns, formidler områder og stoppunkt regioner fra 24 gener; 1122 exons fra 847 beslektede gener. Dette dekker 95% av svulsten relatert driveren mutasjoner og målområder mutasjon fra 12 vanligste tumorer (lungekreft, tykktarmskreft, magekreft, brystkreft, nyrekreft, bukspyttkjertelkreft, leverkreft, kreft i skjoldbruskkjertelen, livmorhalskreft, Esophageal kreft, og endometrial karsinom).
| DNA | Resultatet | Indikasjon | Ideell utvalg |
| cfDNA | Fragment størrelse | Identifikasjon av DNA Fragment distribusjon | 168bp±20(a) |
| Konsentrasjon | Mer nøyaktig DNA kvantifisering | Totalt cfDNA ≥30ng(b) | |
| gDNA | A260/A230 | Identifikasjon av kjemisk forurens-Ning (f.eks etanol) | 1.50-2.2 |
| A260/A280 | Identifikasjon av protein forurensninger | 1,60-2.2 | |
| Konsentrasjon | DNA kvantifisering | Totalt gDNA > 3ug |
Tabell 2. Kvalitet analyse av cfDNA og gDNA utpakkede fra perifert blod.
Den største størrelsen på cfDNA er rundt 170Bp. kvalitetskontroll bør utføres av en standardisert metode for 2100-Bioanalyzer til å bestemme nivåer av prøven fornedrelse og/eller gDNA forurensning. Topp analyse av kvaliteten på cfDNA utvinning skal ligne figur 1. Merk at økt DNA beløpet vil resultere i et bibliotek med høyere kvalitet for effektiv påvisning av sjeldne mutasjoner i cfDNA. Vi anbefaler å bruke minst 30 ng cfDNA (30.000 eksemplarer).
Tabell 3. QC ER-Seq analyse og tradisjonelle analyse.
Mørk grå høydepunktet angir en dekning dybde økning i ER-Seq sammenlignet med tradisjonelle metoder; en lys grå utheving angir ingen PCR indusert duplisert lest i ER-Seq. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Gene | Chr | Start | Slutten | cHGVS | pHGVS | Funksjonen | caseAltIsHot | ER-Seq var_freq | Tradisjonelle var_freq |
| TP53 | 17 | 7577534 | 7577535 | c.746G > T | p.R249M | Eks. missense | HighFreq | 0.0400 | 0.0378 |
| EGFR | 7 | 55259514 | 55259515 | c.2573T > G | p.L858R | Eks. missense | Praktisk | 0.0270 | 0.0120 |
| ATM | 11 | 108203618 | 108203619 | c.7919delC | p.T2640Ifs*6 | frameshift | ND | 0.0169 | 0.0180 |
| PTCH1 | 9 | 98221917 | 98221918 | c.2851G > T | p.D951Y | Eks. missense | ND | 0.0154 | 0.0260 |
| EGFR | 7 | 55249070 | 55249071 | c.2369C > T | p.T790M | Eks. missense | Praktisk | 0.0053 | ——(0.0013) |
| RB1 | 13 | 49039151 | 49039152 | c.2230A > T | p.I744F | Eks. missense | ND | 0. 0036 | ——(0.0014) |
Tabell 4. Ringer resultatet av ER-Seq informasjon analysereer og tradisjonelle analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Eksistensen av sirkulerende svulst DNA (ctDNA) ble oppdaget mer enn 30 år siden, men anvendelsen av ctDNA analyser er fortsatt ikke rutinemessig i klinisk praksis. Interesse i praktisk anvendelse av ctDNA metoder har økt med utviklingen av teknologi for ctDNA deteksjon og analyse. Svulst avlytting med ctDNA tilbyr en minimal-invasiv tilnærming for vurdering av mikroskopiske gjenværende sykdom, svar på terapi, og svulst molekylær profiler under bakgrunn av svulst evolusjon og intratumoral heterogenitet13, 14. Forbedringer i den sensitivitet og spesifisitet av analysen vil lette alle disse programmene15,16.
I dette manuskriptet introdusert vi ER-Seq, en lovende metode for å bedre følsomheten til ctDNA oppdagelse, bruk en NSCLC som et eksempel. Sammenlignet med tradisjonelle analyse, forbedret anvendelsen av vår unike sekvensering kort i ER-Seq betydelig sin sensitivitet og spesifisitet, angitt av en dekning dybde økning og en evne til å oppdage lavfrekvente mutasjoner (for eksempel EGFR p. T790M (0.53%)). Eksistensen av T790M i eksempelfilen pasienten kan være en medvirkende faktor til Erlotinib motstand, og ga innsikt i hvordan å bedre behandle denne pasienten, antyder bruk av en tredje generasjons EGFR hemmer spesifikt for T790M, som AZD929117-20. En annen kritisk punkt i ER-Seq som bidrar til dens sensitivitet og spesifisitet er planlagt databasen screening, som muliggjør nøyaktig påvisning av lavfrekvente mutasjoner i ctDNA ved å filtrere bort bakgrunnsstøy.
Selv om ER-Seq har mange fordeler som gjør det bedre enn tradisjonelle metoder, er det fortsatt noen utfordringer som skal overvinnes. En av de største utfordringene for ER-Seq er svært lavt nivå av ctDNA i blodet. For de lavfrekvente mutasjonene er anskaffelse av tilstrekkelig mal ctDNA kritisk. Vår unike kort betydelig økning gjenvinne frekvensen av ctDNA, men de fortsatt trenger å forbedres. En annen utfordring ER-Seq og alle andre sekvensering teknikker, er begrensning av dekning av Målrett mot regioner. Våre valgte 1021 kb sonde beriket regioner, som kan dekke om lag 95% av svulst-relaterte mutasjoner, er mer omfattende sammenlignet med andre små-plane metoder21,22,23. Men som tumor heterogenitet har blitt godt anerkjent og flere og flere svulst biomarkers har blitt oppdaget, beriket den relative dekningsgrad av våre sonder områder reduseres. Å bedre tjene som et verktøy for tidlig diagnose og sykdommen overvåking av svulst pasienter, er mer omfattende sekvensering og analyse teknikker nødvendig. Foreløpig bruker ER-Seq fortsatt en stor mengde data for å oppdage lavfrekvente mutasjoner. Ytterligere forbedring av data utnyttelse kan være gunstig for bruk av ER-Seq.
Som drøftet over, finnes mange begrensninger knyttet ER-Seq. Imidlertid har våre unik analyse teknikken fortsatt mange fordeler sammenlignet med topp-ranking i dette feltet. Fordeler og ulemper med denne teknikken fortjener videre forskning. Potensialet av ER-Seq for rutinemessige klinisk bruk vil være av stor betydning for klinisk leger, gi dem et kraftig verktøy for å diagnostisere svulster og skjermen svulst dynamikk og respons på behandling. Romanen mutasjoner tilknyttet motstand mot konvensjonelle og målrettet terapi funnet av vår analyse kan tilby nye muligheter for behandling for pasienter med avansert sykdom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet er støttet av Geneplus-Beijing Institute.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit | Qiagen | 55114 | DNA Extraction from Peripheral Blood for cfDNA |
| QIAamp DNA Blood Mini Kit | Qiagen | 51105 | DNA Extraction from Peripheral Blood for gDNA |
| Quant-iT dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | Q32854 | Measure cfDNA concentration |
| Quant-iT dsDNA BR Assay Kit | Invitrogen | Q32853 | Measure library concentration |
| Agilent DNA 1000 Reagents | Agilent | 5067-1504 | Measure cfDNA and library fragments |
| The NEBNext UltraII DNA Library Prep Kit for Illumina | NEB | E7645L | Library Preparation |
| Agencourt SPRIselect Reagent | Beckman | B23317 | DNA fragment screening and purification |
| Tris-HCl (10 mM, pH 8.0)-100ML | Sigma | 93283 | Dissolution |
| xGen Lockdown Probes | IDT | —— | xGen Custom Probe |
| Human Cot-1 DNA | Life | 15279-011 | Targeted DNA capture |
| Dynabeads M-270 Streptavidin | Life | 65305 | Targeted DNA capture |
| xGen Lockdown Reagents | IDT | 1072281 | Targeted DNA capture |
| KAPA HiFi HotStart ReadyMix | KAPA | KK2602 | post-capture PCR enrichment libraries |
| KAPA Library Quantification Kit | KAPA | KK4602 | Measure library concentration |
| NextSeq 500 High Output Kit v2((150 cycles) | illumina | FC-404-2002 | Sequence |
| Centrifuge5810 | eppendorf | 5810 | |
| Nanodrop8000 | Thermo Scientific | 8000 | Measure gDNA concentration |
| Qubit 2.0 | Invitrogen | Quantify | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent | ||
| ThermoMixer C | eppendorf | Incubation | |
| 16-tube DynaMagTM-2 Magnet | Life | 12321D | |
| Concentrator plus | eppendorf | ||
| PCR | AB | simplyamp | |
| QPCR | AB | 7500Dx | |
| NextSeq 500 | illumina |
References
- Kennedy, S. R., et al. Detecting ultralow-frequency mutations by Duplex Sequencing. Nat. Protoc. 9, 2586-2606 (2014).
- Shendure, J., Ji, H.
- Bettegowda, C., et al. Detection of circulating tumor DNA in early- and late-stage human malignancies. Sci. Transl. Med. 6, (2014).
- Bratman, S. V., Newman, A. M., Alizadeh, A. A., Diehn, M. Potential clinical utility of ultrasensitive circulating tumor DNA detection with CAPP-Seq. Expert Rev. Mol. Diagn. 15, 715-719 (2015).
- Diaz, L. A. Jr, Bardelli, A. Liquid biopsies: genotyping circulating tumor DNA. J. Clin. Oncol. 32, 579-586 (2014).
- Crowley, E., Di Nicolantonio, F., Loupakis, F., Bardelli, A. Liquid biopsy: monitoring cancer-genetics in the blood. Nat. Rev. Clin. Oncol. 10, 472-484 (2013).
- Su, Z., et al. A platform for rapid detection of multiple oncogenic mutations with relevance to targeted therapy in non-small-cell lung cancer. J. Mol. Diagn. 13, 74-84 (2011).
- Kukita, Y., et al. High-fidelity target sequencing of individual molecules identified using barcode sequences: de novo detection and absolute quantitation of mutations in plasma cell-free DNA from cancer patients. DNA Res. 22, 269-277 (2015).
- Schmitt, M. W., et al. Sequencing small genomic targets with high efficiency and extreme accuracy. Nat. Methods. 12, 423-425 (2015).
- Schmitt, M. W., et al. Detection of ultra-rare mutations by next-generation sequencing. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 109, 14508-14513 (2012).
- Newman, A. M., et al. An ultrasensitive method for quantitating circulating tumor DNA with broad patient coverage. Nat. Med. 20, 548-554 (2014).
- Newman, A. M., et al. Integrated digital error suppression for improved detection of circulating tumor DNA. Nat Biotechnol. 34 (5), 547-555 (2016).
- Alix-Panabières, C., Schwarzenbach, H., Pantel, K. Circulating tumor cells and circulating tumor DNA. Annu. Rev. Med. 63, 199-215 (2012).
- Dawson, S. J., et al. Analysis of circulating tumor DNA to monitor metastatic breast cancer. N. Engl. J. Med. 368, 1199-1209 (2013).
- Li, H., Durbin, R. Fast and accurate short-read alignment with Burrows- Wheeler transform. Bioinformatics. 25, 1754-1760 (2009).
- Youn, A., Simon, R. Identifying cancer driver genes in tumor genome sequencing studies. Bioinformatics. 27, 175-181 (2011).
- Forshew, T., et al. Noninvasive identification and monitoring of cancer mutations by targeted deep sequencing of plasma DNA. Sci. Transl. Med. 4, (2012).
- Kobayashi, S., et al. EGFR mutation and resistance of non-small-cell lung cancer to gefitinib. N. Engl. J. Med. 352, 786-792 (2005).
- Kuang, Y., Rogers, A., Yeap, Y., Wang, L., Makrigiorgos, M., Vetrand, K., Thiede, S., Distel, R. J., Jänne, P. A. Noninvasive detection of EGFR T790M in gefitinib or erlotinib resistant non-small cell lung cancer. Clin. Cancer Res. 15, 2630-2636 (2009).
- Taniguchi, K., Uchida, J., Nishino, K., Kumagai, T., Okuyama, T., Okami, J., Higashiyama, M., Kodama, K., Imamura, F., Kato, K. Quantitative detection of EGFR mutations in circulating tumor DNA derived from lung adenocarcinomas. Clin. Cancer Res. 17, 7808-7815 (2011).
- Leary, R. J., et al. Development of personalized tumor biomarkers using massively parallel sequencing. Sci. Transl. Med. 2, (2010).
- Forshew, T., et al. Noninvasive identification and monitoring of cancer mutations by targeted deep sequencing of plasma DNA. Sci. Transl. Med. 4, (2012).
- Bratman, S. V., Newman, A. M., Alizadeh, A. A., Diehn, M. Potential clinical utility of ultrasensitive circulating tumor DNA detection with CAPP-Seq. Expert Rev. Mol. Diagn. 15, 715-719 (2015).
