Summary
Brosk och hud analoger var bioprinted med en nanocellulosa-alginat baserat bioink. Bioinks var cellularized före utskrift via ett enda steg passiva skakningsenheten. Konstruktioner visades vara enhetligt cellularized, har hög lönsamhet och uppvisar goda markörer för differentiering.
Abstract
Bioprinting är en kraftfull teknik för snabba och reproducerbara tillverkning av konstruktioner för vävnad tekniska tillämpningar. I denna studie var både brosk och hud analoger fabricerade efter bioink pre-cellularization utnyttja en roman passiv enhet blandningsteknik. Denna teknik utvecklades i syfte att förenkla de olika stegen i blandning av en cellsuspension i en mycket trögflytande bioink. Resolution av filament deponeras genom bioprinting nödvändiggör försäkran om enhetlighet i cell distribution innan du skriver ut att undvika nedfall av regioner utan celler eller kvarhållande av stora cell klumpar som kan täppa till nålen. Vi visa förmåga att snabbt blanda en cellsuspension med en bioink före bioprinting av både brosk och hud analoger. Båda vävnad analoger kunde vara odlade i upp till 4 veckor. Histologisk analys visat både cellernas viabilitet och nedfall av vävnad specifika extracellulär matrix (ECM) markörer såsom glykosaminoglykaner (GAG) och kollagen jag respektive.
Introduction
Under de senaste åren, har tredimensionella (3D) bioprinting tekniken blivit mer tillgängliga för forskare, så att tekniken blir mer allmänt utnyttjade för tillverkning av vävnad analoger. Bioprinting lovar att revolutionera biomedicinsk forskning genom att underlätta snabba och repeterbar tillverkning av mångfacetterade vävnad konstruktioner. Den springande punkten i den bioprinting tekniken lägger i förmågan att exakt kontrollera nedfall av biomaterial (känd som bioinks) i tre dimensioner. Detta tillåter generationen av komplexa ställningar med distinkta regioner av matrix kompositioner, bioaktiva faktorer och celler som kan mer exakt recapitulate infödda vävnadsstrukturen.
Bioprinting har använts för tillverkning av konstruktioner för många vävnad program inklusive brosk1, hud2, muskel3och ben4. Dessa vävnader är attraktiva för bioprinting på grund av deras inneboende tvärstrimmig mikro-arkitekturer som är lämpliga för rekapitulation via lager-för-lager nedfall. Särskilt äger huden en väldefinierad mångbottnat struktur5, som passar för tillverkning genom lager-för-lager nedfall tekniker såsom bioprinting. Dessutom bioprinting kan utnyttjas för att skapa konstruktioner som besitter de nödvändiga anatomiska dimensionerna och former att reparera vävnad defekt. Förmågan att generera biomaterial med patientspecifika storlek och form6 kan börja möta efterfrågan för partiell reparationer av många vävnader inklusive men begränsat inte till ben defekter, broskskador och hudlesioner vars omfattning varierar från patient-till-patient.
I denna studie var två vävnad analoger (ledbrosk och hud) fabricerade genom bioprinting av pre-cellularized bioinks. Säkerställa adekvat blandning av en bioink med cellsuspension som kan säkerställa enhetliga cell fördelning medan bevara cellviabilitet kan vara en utmaning. Bioinks lämpar sig för bioprinting via extrudering är ofta mycket trögflytande och kräver därför omfattande blandning för att säkerställa en homogen blandning. Mekaniska skador på celler kan uppstå under hård blandning och negativt påverka livskraft. Studier har visat att de flesta celldöd under inkjet utskriften sker under beredning såsom blandning7,8. Medan traditionell blandning med agitation9 kan räcka för låg viskositet bioinks lämplig för inkjet utskrifter10, är blandning av celler i en hög viskositet bioink mer lämplig för extrudering bioprinting svårare. Att möta detta behov, har användning av blandning munstycken blivit mer populärt för blandning av bioinks under utskrift processen11. Dessa blandare har också använts allmänt i mikrofluidik forskning där blandning av vätskor med låga Reynoldstal är viktigt12. Utnyttjandet av en kontinuerlig blandning process att smälta en cellsuspension in en bioink skulle möjliggöra enhetlighet under tryckprocessen. Men sedan cellsuspensioner äger låg viskositet jämfört med en bioink, kommer uppstår svårigheter att förhindra sedimentering av celler under utskrift processen9,13,14. Alternativt, blandning av celler i en bioink före utskrift kan lösa problemet.
För att minimera celldöd under blandning i en bioink, utvecklat vi en teknik som bygger på en passiv skakningsenheten till smälta celler in i en bioink i det minimala antalet steg. Kaotisk blandning genereras genom flödet av material genom skakningsenheten räcker till reproducibly blandning två komponenter tillsammans15,16. Denna metod utvecklades främst för att förenkla blandning av någon cellsuspension med någon bioink som passar för extrudering bioprinting. Antalet steg i blandningen var minimeras för att eliminera användare-till-användare variation i blandning. Överdriven blandande steg kan vara tidskrävande och inte gäller för alla bioinks, särskilt när celler är inblandade. Sekundära, syftar vi till att utveckla en blandande process som var fristående att både bevara sterilitet och minimera prov förlust.
I detta manuskript visar vi att blanda en cellsuspension med en bioink som använder en passiv enhet blandningsteknik som minimerar hanteringen och resulterar i hög cell livskraft och enhetlig fördelning. Dessa pre-cellularized bioinks utnyttjas sedan till bioprint brosk eller hud konstruera med en eller två celltyper, respektive som odlas för upp till 6 veckor. Den bioink som utnyttjas är en alginat-nanocellulosa blandning, som tidigare visat lämplighet för bioprinting1.
Protocol
Detta protokoll följer riktlinjerna i Chalmers Universitys mänskliga forskningsetisk kommitté.
Obs: Alla steg skall utföras inom en steril biosäkerhet skåp.
1. beredning av förbrukningsmaterial, Bioink och celler
- Få två sprutor, en spruta (figur 1en) är för cellsuspensionen, medan den andra sprutan är för bioink (figur 1b).
- Skaffa en steril passiva skakningsenheten (figur 1c) som kan kopplas till dubbla sprutor via en Luer lock anslutning.
- Skaffa en fördelarenheten (figur 1d) som kan pressa en volym från två sterila sprutor samtidigt i en kontrollerad takt.
Obs: Mixningsförhållandet utnyttjas i denna studie är 10:1. Använd därför en 12 mL spruta och en 1 mL spruta som krävs enligt 10:1 skakningsenheten. - Skaffa en steril kassett (figur 1e) och en steril hona-hona Luer lock kontakt för direkt blandas bioink och cell suspensionen till.
- Skaffa eller förbereda bioink för blandning med en cellsuspension.
Obs: I detta protokoll utnyttjades en nanocellulosa/alginat baserat bioink. Denna bioink är korslänkad genom tillägg av en steril 100 mM CaCl2 lösning efter utskrift. - Lossa cellerna med en 0,5% trypsin/EDTA-lösning och räkna det totala antalet celler med hjälp av trypan blå utslagning metod17.
Obs: I detta protokoll utnyttjades mänskliga fibroblaster. - Avgöra vilken cell densiteten önskas i den slutliga tryckta konstruktion. Beräkna med hjälp av följande ekvationer koncentrationen av de skördade celler som måste spädas för att uppnå detta mål sista cell densiteten.
Obs: I detta protokoll utnyttjades en sista cell densiteten på 5 x 106 celler/mL.- Välj en önskad cell koncentration för experiment: Cceller (celler/mL).
- Beräkna mängden bioink nödvändigt, Vbioink, baserat på det totala antalet konstruktioner som önskas:
Vbioink = Vkonstruera × NContructs
Obs: volymen av bioink per konstruktion är exempelvis 100 µL. Om 30 konstruktioner skrivs ut, då är den bioink volym som krävs 3 mL. - Beräkna antalet celler som behövs:
Nceller = C-cell (1,1 × Vbiolink) - Att resuspendera cellerna (Nceller) i 1/10th volymen av bioink:
Vcellsuspension = 0,1 × Vbiolink
Obs: till exempel, om Vbioink = 3 mL, då Vcellsuspension = 0,1 × 3 mL = 0,3 mL
2. blandning av cellsuspensionen och Bioink
- Överföra cellsuspensionen i cell suspension sprutan.
- Överföra bioink till en annan spruta eller få en spruta som innehåller bioink.
- Dra ut kolven med bioink i sprutan och sätt in sprutan i fördelarenheten. Placera enheten vertikalt med Luer lås kontakten uppåt (figur 1f1).
- Dra ut kolven cell sprutan till samma längd som bioink sprutan och sätt i fördelarenheten (figur 1f2).
- Fäst både sprutor skakningsenheten genom att vrida Luer lås kontakterna (figur 1f3).
- Prime blandande systemet genom att trycka på fördelarenheten att pressa luften i sprutan. Stoppa grundningen innan lösningen når den luerlock (figur 1g4).
- Efter grundning, fästa fyllning patronen i slutet av skakningsenheten via Luer lås kontakten (figur 1g5). Se till att kolven i fyllning patronen längst före fastsättning.
- Långsamt komprimera (figur 1h6) fördelarenheten för att blanda bioink och cell suspensionen in i kassetten (figur 1i7).
- Tryck kolven i fyllning kassetten nedåt med en steril Pipettera tips att kontakta bioink-cell blandningen efter blandning. Håll munstycket tills komprimerade för att säkerställa cell/bioink blandningen inte extruderas tillbaka till skakningsenheten.
- Cap patronen och knacka försiktigt på ytan med arbete att flytta eventuella luftbubblor till toppen av patronen (kolv slutet).
Obs: Vid denna punkt, cell/bioink blandningen är redo för utskrift. Följande avsnitt kommer att beskriva specifika applikationer och utskrift förfaranden.
3. bestämning av cellernas viabilitet använder en skakningsenheten jämfört med manuell spatel blandning
- Lossa mänskliga fibroblaster (avsnitt 7) med en 0,5% trypsin/EDTA-lösning på 80% confluence, räkna antalet och återsuspendera i odlingsmedium på tillräcklig cell densiteten att uppnå en slutlig koncentration efter blandning med bioink (1:10 baserat på cell: bioink) på 5 x 10 6 celler/mL.
- Blanda celler in i den bioink som använder antingen passiv enhet blandningsteknik (steg 2) eller via spateln för att utvärdera effekten av båda teknikerna på cellernas viabilitet.
- Blanda cellerna i den bioink som använder passivummen blandningsteknik för enhet 1, 2 eller 3 gånger innan dispenseras i en mögel för cross-linking med 100 mM CaCl2.
Obs: För att utföra ytterligare blandningar, blanda den cell/bioink direkt i en spruta i stället för en patron. Sedan remix blandningen genom skakningsenheten efter det tidigare protokollet men utan komponenten cell spruta. - Blanda cellerna i en separat bioink med manuell mekanisk blandning via en spatel för löptider på 30, 60 eller 90 s. överföring blandningar (för varje blandningstid) i en form för cross-linking med 100 mM CaCl2.
- Överföra proverna till en väl platta efter slutförandet av cross-linking och kultur under standart villkorar.
- Efter 1 dag med kultur, tvätta konstruktioner (n = 3-4 per grupp) i serumfritt cellodlingsmedium för 30 min. färga cellerna i konstruktioner med en färglösningen (4 µM Calcein AM, 1 µM etidiumbromid homodimer-1) i 30 min.
- Tvätta två ytterligare gånger och inkubera proverna i serumfritt cellodlingsmedium för sammanlagt 1 h vid 37 ° C.
4. Bioprinting av brosk analoger med en enda celltyp
- Rita en 3D-modell av önskad vävnad analoga. Konvertera till en Gcode fil för bioprinting och läsa in Gcode filen på bioprinter1.
Obs: I detta protokoll, en fyrkantig struktur med dimensioner 4,8 x 4,8 x 0,9 mm3 exporterades som en STL-fil. En Gcode fil genererades av galler struktur med följande inställningar: skiktets tjocklek, 0,3 mm; utfyllnad mönster, rätlinjig; utfyllnad densitet, 25%. hastighet, 10 mm/s. - Isolera och frysa primära mänskliga nasal kondrocyter (hNC) från patienter efter det refererade protokoll nr1.
- Tina och expandera frysförvarade hNCs och en gång i enskiktslager kultur använder standard odlingsmedium vid 37 ° C. Lossa cellerna på 80-90% sammanflödet med en 0,5% trypsin/EDTA-lösning och räkna med ett trypan blå utslagning protokoll. Alla experiment utfördes i hNCs på passage 2.
- Återsuspendera hNCs på 100 x 106 celler/mL inom 300 µL av odlingsmedium som kompletteras med 10% fetalt bovint serum, 1% penicillin-streptomycin och 50 µg/mL askorbinsyra, förberedelse för blandning med bioink.
- Blandning hNC cellsuspensionen i en nanocellulosa/alginat baserat bioink följande passivummen blandning enheten protokoll i förhållandet 10:1 bioink:cell fjädring att få en sista cell koncentration av 9 x 106 celler/mL.
- Se till att bioprinter är steriliserad via UV-exponering och torka ner med 70% etanol. Upprätthålla sterilitet genom att placera i en laminär skåp.
- Tillmäter de patroner som innehåller de bioink/cell suspension blandningarna sterila utskrift munstycken och infoga i bioprinter.
- Kalibrera bioprinter antingen manuellt eller genom protokoll som är specifika för skrivaren.
- Bioprint galler-strukturerade, cell-lastad konstruktioner med följande utskrift parametrar: 25G koniskt munstycke vid ett tryck på 25 kPa. Bioprint cellfria konstruktioner (blandas med cell medium som innehåller inga celler) som en kontroll.
- Tvärbinda konstruktioner genom att lägga till en jonisk lösning 100 mm CaCl2 för 5 min. Skölj konstruktioner och inkubera i odlingsmedium villkor standard kultur (37 ° C, 5% CO2och 95% relativ fuktighet). Ändra media varje andra eller tredje dagen.
- Samla in prover för histologisk analys vecka 2 och 4. Fläcken proverna för GAG produktion med hjälp av en Alcian blå fläck18.
5. Bioprinting av huden analoger med två celltyper
- Rita en 3D-modell av önskad vävnad analoga och konvertera till en Gcode fil för bioprinting. Läsa in Gcode filen på bioprinter.
Obs: I detta protokoll, en fyrkantig struktur med dimensioner 4,8 x 4,8 x 0,9 mm3 exporterades som en STL-fil. Sedan en Gcode fil genererades av galler struktur med följande inställningar: skiktets tjocklek, 0,3 mm; utfyllnad mönster, rätlinjig; utfyllnad densitet, 25%. hastighet, 10 mm/s. - Förbereda cellerna för att blanda i bioink för bioprinting. För tillverkning av huden analoger utnyttjades två celltyper. De två celltyper var blandas in i bioink och bioprinting.
- Erhålla primära HDF. Upprätthålla dessa celler DMEM tillväxt medier kompletteras med 10% fetalt bovint serum, 1% penicillin-streptomycin och 50 µg/mL askorbinsyra. Lossa cellerna på 80-90% sammanflödet med 0,5% trypsin/EDTA-lösning och greve.
- Isolera och frysa primära hNC från patienter efter det refererade protokoll nr1. Tina och expandera frysförvarade hNCs i enskiktslager kultur. Lossa cellerna på 80-90% sammanflödet med 0,5% trypsin/EDTA-lösning och greve.
- Återsuspendera båda celltyper på 100 x 106 celler/mL inom tillväxt medier. Blanda cellsuspensioner tillsammans i förhållandet 1:1 att uppnå en slutlig total koncentration på 100 x 106 celler/mL i 300 µL av media.
- Blandning 50: 50 cellsuspension av HDF och hNC in en nanocellulosa/alginat baserat bioink följande passivummen blandning enheten protokoll i förhållandet 10:1 bioink:cell fjädring att få en sista cell koncentration av 9 x 106 celler/mL.
- Säkerställa att bioprinter är steriliserad eller placeras i en laminär skåp att upprätthålla sterilitet.
- Tillmäter de patroner som innehåller de bioink/cell suspension blandningarna sterila utskrift munstycken och infoga i bioprinter.
- Kalibrera bioprinter antingen manuellt eller protokoll som är specifika för skrivaren.
- Bioprint galler-strukturerade, cell-lastad konstruktioner med följande utskrift parametrar: 25G koniskt munstycke vid ett tryck på 25 kPa. Bioprint cellfria konstruktioner (blandas med cell medium som innehåller inga celler) som en kontroll.
- Tvärbinda konstruktioner genom att lägga till en jonisk lösning 100 mm CaCl2 för 5 min. Skölj konstruktioner och inkubera i odlingsmedium villkor standard kultur (37 ° C, 5% CO2och 95% relativ fuktighet). Ändra media varje andra eller tredje dagen.
- Samla in prover för histologisk analys vecka 2 och 4. Fläcken proverna för kollagen I produktion med hjälp av en Masson trikrom fläcken19.
Representative Results
Resultat i detta manuskript är indelade i två sektioner. Först, cellviabiliteten analyserades efter blandning med mekaniska metoden eller passiv skakningsenheten. Nästa, brosk och hud konstruktioner var odlade och analyseras för relevanta histologiska markörer.
Cell distribution verkade homogen i båda fallen. Åtgärden att blanda för hand med en spatel (figur 2b) har dock mer varians än blandning med en passiv skakningsenheten (figur 2en). Utsträckning, hastighet och blandning teknik med en spatel är starkt beroende av användaren. Men att blanda celler i en bioink med en passiv skakningsenheten standardiserar blandning och minimerar variationen över batchar. Dessutom 30, 60 och 90 s blandning tid maj inte vara tillräckligt för blandning av en stor mängd celler i en stor mängd bioink. Strängare blandning genom blandning med en spatel kan vara nödvändigt. I jämförelse, utnyttja en passiv skakningsenheten bättre underhåller mixningsförhållandet av celler, som bioink under blandning och säkerställer att en homogen blandning utförs. Dessutom finns prov förlust, som är ett bekymmer med traditionella blandande tekniker där bioink kan lämnas kvar i petriskålar, rör och blanda verktyg på grund av deras höga viskositet. Cellviabiliteten var hög för blandning med en skakningsenheten (> 90%) 1, 2 eller 3 gånger. När passiva skakningsenheten utnyttjades, tog blandning ca 1 min i en långsam stadig blending takt. Medan blandning med en spatel uppvisade hög lönsamhet efter blandning för 30 och 60 s, större än 90 s blanda resulterade i en betydande minskning av lönsamheten jämfört med de andra grupperna (77,9 ± 14%, p < 0,05) (figur 2c). Detta kan bero på överdriven blandning som orsakar skada i cellerna. Långsiktiga live/dead färgning efter 14 dagar och 28 dagar av kultur visas i kompletterande Figur1. Cellerna börjar sprida genom dag 14, är mycket spridda vid dag 28 och visar god lönsamhet.
Efter kultur analyserades både brosk och hud vävnad analoger genom histologi. Analys av brosk konstruktioner dagar 0, 14 och 28 visar en ökning i mängden och täckning av GAGs som visat genom en Alcian blå fläck (figur 3a-3_c). Avsaknad av fläcken är märkt vid dag 0, medan vid dag 14 färgning är begränsad till platser proximala till cellerna. Dag 28 av kultur finns dock den Alcian blå i hela den bygga, demonstrera bildandet av en chondrocytic ECM. Bioprinted hud konstruktioner analyserades genom histologiska färgning av kollagen jag utnyttja en Masson trikrom fläcken (figur 3d-3f). Liknar brosk konstruktioner, dag 0 prover uppvisade inga kollagen nedfall. Dag 14 av kultur noterades betydande fyndigheter av kollagen runt celler och längs ytan av konstruktionen. Detta förstärktes ytterligare av dag 28, som tät kollagen lager hittades på konstruera ytan och inom huvuddelen.
Figur 1 : Passiv blandning UNITsystem. (en) 1 mL spruta för cellsuspension, (b) 12 mL spruta med bioink, (c) fördelarenheten, (d) passiv skakningsenheten, (e) fylla patronen, (f) bioink spruta (1) och cell församling suspension spruta (2) i fördelarenheten, fastsättning av passiv skakningsenheten till slutet av både sprutor (3), (g) fastsättning av hona-hona Luer lås kontakten (4) och fastsättning av fyllning patronen (5) avslutar den församlingen, (h ) komprimera fördelarenheten för att prime den blandande enhet (6), (jag) fortsätta att pressa ned på fördelarenheten att blanda cellsuspension med bioink och fördela i fyllning patronen (7). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Cell livskraft bilder och analys. Representativa bilder visar live (grön) och döda (röd) mänskliga fibroblaster efter blandning med passivummen blandning enhet 1, 2 eller 3 gånger (en) eller spatel för 30, 60, eller 90 sekunder (b) och 3D kultur för 1 dag. Bilder på 4 X förstoring visas. Skala staplarna visar 200 µm. (c) procent genomsnittlig lönsamhet av mänskliga fibroblaster efter blandning med passivummen blandning enhet eller spatel och 3D kultur för 1 dag. Felstaplar visar standardavvikelsen för medelvärdet, * 0,005. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: vävnad specifika extracellulärmatrix nedfall. Bioprinted brosk konstruktioner färgas för glycosaminoglycans utnyttja Alcian blå på (en) dag 0, (b) 14, och (c), 28. Bilder tagna med 5 X förstoring. Bioprinted hud konstruktioner färgas för kollagen jag använder Masson's Trichrome (d) dag 0, (e), 14, och (f), 28. Bilder tagna med 5 X förstoring. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande bild1: cellviabiliteten på dag 14 (en), och dag 28 (b). Skalstapeln är 200 µm, grön refererar till levande celler, röda refererar till döda celler. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Som visat i detta manuskript, var pre-cellularized bioinks bioprinted att tillverka antingen brosk eller hud analoger som odlades för upp till 4 veckor. Cellernas viabilitet efter blandning med passivummen blandningsteknik enhet var högre än de traditionella blanda metoderna. Dessutom en förenkling av blandning processen med skakningsenheten minimerar antalet hantering steg och möjliggör bättre enhetlighet i omfattningen av blandning. Slutligen, detta resulterar i bättre reproducerbarhet i båda cell fördelning inom bioink, och över konstruktioner och experimentella grupper. Nedfall av vävnad specifika ECM komponenter såsom GAGs och kollagen jag observerades för både brosk och hud analoger, respektive efter 4 veckor av kultur. Detta indikerar flexibilitet både blandning tekniken och valt konstruera geometri att fabricera olika vävnad mål. Tillverkning av både brosk och hud analoger utställda flexibiliteten i både användningen av en nanocellulosa-alginat bioink och bioprinting teknik för distinkta bakåtkompilerade vävnad mål. Vi kommer att diskutera två komponenter i studien nedan: (1) passiv blandning enhet teknik och (2) beteendet hos celler inom brosk och hud analoger.
Utveckling och optimering av en teknik för blandning av en cellsuspension till en bioink var avgörande för tillverkning av dessa konstruktioner. Till skillnad från traditionella låg viskositet hydrogel material resulterade av bioinks höga viskositet i svårigheter i pre-cellularization av en bioink före utskrift. Som ett alternativ till den traditionella metoden att cellen införlivande i en bioink, ett protokoll för one-step blandning av en cellsuspension i en trögflytande bioink utvecklades och diskuterade. Dessutom utvärderades den praktiska tillämpningen av denna blandning teknik vid tillverkning av vävnad konstruktioner. Detta one-step blandande tillvägagångssätt har flera fördelar jämfört med traditionella tekniker ingår kontrollerad blandning blandningsförhållandet, minimering av hög och oregelbundna skjuvspänningar, och ett slutet system att eliminera prov Stäng i blandning fartyg. Dock finns det flera kritiska steg i denna teknik för att säkerställa dess fördelar jämfört med traditionella metoder för cell/bioink blandning. Det är viktigt att säkerställa att cellerna i cell sprutan är upphängd och väl blandade innan man blandar. Alltför stor av en tidslucka mellan lyft och överföring av cellerna i sprutan och börjar blandningen kan orsaka cellerna att sediment, som kommer att resultera i ojämn blandning och fördelning i en tryckt glödtråd. Om sedimentering är observerade, enkla inversion (2 - 3 gånger) av är sammansättningen för passiv enhet för blandande omedelbart före blandning tillräcklig för att resuspendera cellerna och säkerställa en enhetlig fördelning innan man blandar. Det är också viktigt att luftbubblor i sprutorna elimineras eller minimeras före så att mixningsförhållandet förblir konstant. Om stora luftbubblor kvar i bioink tonerkassetten innan man blandar, rekommenderas det att lösningen kan köras genom skakningsenheten en ytterligare tid för att säkerställa omsorgsfull blandning. Om luftbubblor finns kvar, kan mild avlyssning av utskrift patron/sprutan förskjuta kvarvarande luftbubblor. Dessutom, om flera material blandning (flera blandande enheter eller material) är nödvändigt för mer komplexa konstruktioner, måste koncentrationerna av de bioinks/cellsuspensioner blandas justeras för att säkerställa att efter spädning genom blandning, rätt slutlig koncentration uppnås ändå.
I jämförelse med andra blandningstekniker är passiv skakningsenheten en ny metod för cellularize bioinks. Till skillnad från andra blandande tekniker såsom dubbla spruta blandning, eller omrörning med en spatel eller annat verktyg, tillåter passiv skakningsenheten mer konsekvens att blanda över partier och användare. Arten av manuell blandande tekniker, såsom en spatel blandning, resulterar i större användare-till-användare variation i omfattningen av och graden av blandning. Dessutom har slutna system såsom passiv blanda enhet och dubbla spruta blandning lite till ingen prov förlust jämfört med manuell blandning i en petriskål eller tub.
Båda vävnad analoger fabricerade i denna manuskriptet bestod av en enda typ av bioink och en eller två celltyper. Bioprinting av vävnad analoger som består av arkitekturer som innehåller regioner av olika bioinks med olika celltyper kan dock vara nödvändiga för tillverkning av mer fysiologiska vävnad konstruktioner20,21, 22. Mer specialiserade bioinks med unika kompositioner eller funktioner kan genereras genom en blandning av flera typer av befintliga bioinks för att skapa multimaterial bioinks som har distinkta kompositioner eller funktioner23, 24. Detta kan vara särskilt viktigt på vävnad övergångsregioner såsom huden för subkutan lager eller brosket till ben regionen av en vävnad där en gradient av bioink sammansättning25,26 kan vara nödvändiga för att säkerställa utvecklingen av dessa kritiska regioner hittade i native vävnader27. Dessutom skulle en skakningsenheten kunna utnyttjas för att blanda i tillväxtfaktorer och morphogens in bioinks före bioprinting. Eliminering av prov förlust med stängda blandande system är attraktiv för användning av dyra och låg koncentration bioaktiva faktorer, där prov förlust kan leda till en förändring till deras slutliga koncentration inom den bioprinted konstruktionen, särskilt när lutningar är inblandade.
En begränsning med någon blandning teknik, inklusive den passiva blandarenhet utnyttjas i denna studie, är risken för skador på mekaniskt känsliga celltyper. Exempelvis isolerade sådana stamceller från benmärg eller embryot, eller inducerade pluripotenta stamceller är mer mottagliga för mekaniska skador28,29. Handlingen att blanda förmedlar onormala mekaniska spänningar i celler på grund av de skeva styrkorna involverade i processen blandning, och de måste vara balanserade för att bevara livskraften30. Användning av primära fibroblaster och kondrocyter i denna studie resulterade i bra lönsamhet (figur 2), är fler studier nödvändiga för att fastställa säkra blandning priser och kvoter för känsligare celltyper. Tills dess rekommenderas det att blandning utförs under stadig långsamt att maximera lönsamheten. Dessutom bestämdes cell densiteten valt i denna studie baserat på tidigare studier1. Denna cell densiteten kan inte vara perfekt för alla celltyper.I synnerhet kan blandning celler vid en högre koncentration resultera i ökad cell-cell kontakter som kan förbättra cellernas viabilitet och vävnad formation31,32. På liknande sätt kunna passiv skakningsenheten tillämpas att blanda cell spheroids eller andra cell aggregat33 i bioinks.
Som föreslås och visat i denna studie en passiv blandning enhet systemet kan snabbt blanda en cellsuspension till en trögflytande bioink. Medan risken för mekaniska skador på cellerna fortfarande, tillåter metoden mer konsekvens i blandning inom en enda studie och över användare. Pre-cellularized bioinks utnyttja denna metod användes för att tillverka både brosk och hud analoger som var odlade för upp till 4 veckor, och visat nedfall av vävnad specifika ECM markörer. Framtida studier kommer att fokusera på användningen av den passiva blandning enhet systemet för att blanda specialiserade bioinks från standardiserade bioinks för tillverkning av mer komplexa vävnad analoger.
Disclosures
Författarna till detta manuskript är anställda av CELLINK LLC.
Acknowledgments
Författarna har inga bekräftelser.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| STARTINK Kit | CELLINK | SK0001 | Kit that contained all the elements for the CELLMIXER procedure |
| Live/Dead Kit | Life Technologies | L3224 | Kit for the analysis of cell viability after mixing |
| Masson's Trichrome | Sigma Aldrich | HT15-1KT | Kit for the analysis of collagen I deposition in the skin constructs |
| Alcian Blue | Sigma Aldrich | B8438-250ML | Kit for the analysis of glycosaminoglycan deposition in the skin constructs |
| INKREDIBLE+ bioprinter | CELLINK | Gen1+ | Printer utilized in the study |
| DMEM with Glutamax | Thermofisher | 10566016 | Media for culture of the cells |
| 10% fetal bovine serum | Thermofisher | A3160402 | Media supplement |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15070063 | Media supplement |
| live cell imaging solution | thermofisher | A14291DJ | component utilized using live/dead imaging |
| inverted microscope | Olympus | IX73 | microscope utilized |
| a digital color camera | Olympus | XC10 | microscope camera utilized |
| cellSens imaging software | Olympus | n/a | stock software with the microscope |
| ImageJ | NIH | n/a | open source image analysis software |
| GraphPad Prism 7 | GraphPad | n/a | software for statistical analysis |
| Slic3r software (v1.2.9) | Slic3r | n/a | open-source software to convert .stl file to gcode |
| primary adult human dermal fibroblasts | ATCC | PCS-201-012 | cell source for fibroblasts |
References
- Avila, H. M., Schwarz, S., Rotter, N., Gatenholm, P. 3D bioprinting of human chondrocyte-laden nanocellulose hydrogels for patient-specific auricular cartilage regeneration. Bioprinting. 1, 22-35 (2016).
- Lee, V., et al. Design and fabrication of human skin by three-dimensional bioprinting. Tissue Eng Part C Methods. 20 (6), 473-484 (2013).
- Costantini, M., et al. Microfluidic-enhanced 3D bioprinting of aligned myoblast-laden hydrogels leads to functionally organized myofibers in vitro and in vivo. Biomaterials. 131, 98-110 (2017).
- Fedorovich, N. E., et al. Biofabrication of Osteochondral Tissue Equivalents by Printing Topologically Defined, Cell-Laden Hydrogel Scaffolds. Tissue Eng Part C Methods. 18 (1), 33-44 (2011).
- Vijayavenkataraman, S., Lu, W. F., Fuh, J. Y. H. 3D bioprinting of skin: a state-of-the-art review on modelling, materials, and processes. Biofabrication. 8 (3), 032001 (2016).
- Peltola, S. M., Melchels, F. P. W., Grijpma, D. W., Kellomäki, M. A review of rapid prototyping techniques for tissue engineering purposes. Ann Med. 40 (4), 268-280 (2008).
- Xu, T., Jin, J., Gregory, C., Hickman, J. J., Boland, T. Inkjet printing of viable mammalian cells. Biomaterials. 26 (1), 93-99 (2005).
- Cui, X., Dean, D., Ruggeri, Z. M., Boland, T. Cell damage evaluation of thermal inkjet printed Chinese hamster ovary cells. Biotechnol Bioeng. 106 (6), 963-969 (2010).
- Parsa, S., Gupta, M., Loizeau, F., Cheung, K. C. Effects of surfactant and gentle agitation on inkjet dispensing of living cells. Biofabrication. 2 (2), 025003 (2010).
- Derby, B. Inkjet printing of functional and structural materials: fluid property requirements, feature stability, and resolution. Annu Rev Mater Res. 40, 395-414 (2010).
- Colosi, C., et al. Microfluidic Bioprinting of Heterogeneous 3D Tissue Constructs Using Low-Viscosity Bioink. Adv Mater. 28 (4), 677-684 (2016).
- Ober, T. J., Foresti, D., Lewis, J. A. Active mixing of complex fluids at the microscale. Proc Natl Acad Sci. 112 (40), 12293-12298 (2015).
- Shabnam, P., Madhuja, G., Frédéric, L., Karen, C. C. Effects of surfactant and gentle agitation on inkjet dispensing of living cells. Biofabrication. 2 (2), 025003 (2010).
- Chahal, D., Ahmadi, A., Cheung, K. C. Improving piezoelectric cell printing accuracy and reliability through neutral buoyancy of suspensions. Biotechnol Bioeng. 109 (11), 2932-2940 (2012).
- Niu, X., Lee, Y. -K. Efficient spatial-temporal chaotic mixing in microchannels. J Micromech Microeng. 13 (3), 454 (2003).
- Liu, R. H., et al. Passive mixing in a three-dimensional serpentine microchannel. J Microelectromech Syst. 9 (2), 190-197 (2000).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr protoc immunol. , A3. B. 1-A3. B (2001).
- Scott, J., Dorling, J. Differential staining of acid glycosaminoglycans (mucopolysaccharides) by alcian blue in salt solutions. Histochem Cell Biol. 5 (3), 221-233 (1965).
- Garvey, W. Modified elastic tissue-Masson trichrome stain. Stain technol. 59 (4), 213-216 (1984).
- Xu, T., Zhao, W., Zhu, J. -M., Albanna, M. Z., Yoo, J. J., Atala, A. Complex heterogeneous tissue constructs containing multiple cell types prepared by inkjet printing technology. Biomaterials. 34 (1), 130-139 (2013).
- Kolesky, D. B., et al. 3D bioprinting of vascularized, heterogeneous cell-laden tissue constructs. Adv Mater. 26 (19), 3124-3130 (2014).
- Kolesky, D. B., Homan, K. A., Skylar-Scott, M. A., Lewis, J. A. Three-dimensional bioprinting of thick vascularized tissues. Proc Natl Acad Sci. 113 (12), 3179-3184 (2016).
- Rutz, A. L., Hyland, K. E., Jakus, A. E., Burghardt, W. R., Shah, R. N. A multimaterial bioink method for 3D printing tunable, cell-compatible hydrogels. Adv Mater. 27 (9), 1607-1614 (2015).
- KÖpf, M., Campos, D. F. D., Blaeser, A., Sen, K. S., Fischer, H. A tailored three-dimensionally printable agarose-collagen blend allows encapsulation, spreading, and attachment of human umbilical artery smooth muscle cells. Biofabrication. 8 (2), 025011 (2016).
- Gurkan, U. A., et al. Engineering anisotropic biomimetic fibrocartilage microenvironment by bioprinting mesenchymal stem cells in nanoliter gel droplets. Mol Pharm. 11 (7), 2151-2159 (2014).
- Ma, Y., Ji, Y., Huang, G., Ling, K., Zhang, X., Xu, F. Bioprinting 3D cell-laden hydrogel microarray for screening human periodontal ligament stem cell response to extracellular matrix. Biofabrication. 7 (4), 044105 (2015).
- Lu, H. H., Thomopoulos, S. Functional attachment of soft tissues to bone: development, healing, and tissue engineering. Annu Rev Biomed Eng. 15, 201-226 (2013).
- Aguado, B. A., Mulyasasmita, W., Su, J., Lampe, K. J., Heilshorn, S. C. Improving viability of stem cells during syringe needle flow through the design of hydrogel cell carriers. Tissue Eng Part A. 18 (7-8), 806-815 (2011).
- Parisi-Amon, A., Mulyasasmita, W., Chung, C., Heilshorn, S. C. Protein-Engineered Injectable Hydrogel to Improve Retention of Transplanted Adipose-Derived Stem Cells. Adv Healthc Mater. 2 (3), 428-432 (2013).
- Qiu, X., De Jesus, J., Pennell, M., Troiani, M., Haun, J. B. Microfluidic device for mechanical dissociation of cancer cell aggregates into single cells. Lab Chip. 15 (1), 339-350 (2015).
- Cukierman, E., Pankov, R., Yamada, K. M. Cell interactions with three-dimensional matrices. Curr Opin Cell Biol. 14 (5), 633-640 (2002).
- Loessner, D., et al. Bioengineered 3D platform to explore cell-ECM interactions and drug resistance of epithelial ovarian cancer cells. Biomaterials. 31 (32), 8494-8506 (2010).
- Lin, R. Z., Chang, H. Y. Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research. Biotechnol J. 3 (9-10), 1172-1184 (2008).
