Summary
Представлен Роман технику для быстрого антигена отображения на бактериальных поверхности, которая включает поверхности biotinylation последующим воздействием протеинов интереса в fusion с мономерных авидин. Загрузка БЦЖ с выбранной антигены успешно улучшает его иммуногенность, предполагая, что поверхности украшения может заменить традиционные генетические подходы.
Abstract
Туберкулез (ТБ) является серьезных инфекционных заболеваний и доступны только вакцина M. bovis бациллы Кальметта-Герена (БЦЖ) является безопасным и эффективным для защиты от детей с тяжелой Туберкулезный менингит и некоторых форм распространения туберкулеза, но не может защитить против туберкулеза легких, которая является наиболее распространенной формой заболевания. Перспективные стратегии по улучшению БЦЖ в настоящее время опираются либо на ее преобразование с гены, кодирующие immunodominant микобактерий туберкулеза (Mtb)-специфических антигенов и/или дополнения с гены, кодирующие сопутствующие факторы, стимулирующие антигена Представляя клеток. Основные ограничения на эти подходы включают низкая эффективность, низкая стабильность и неопределенность уровня безопасности векторов выражения. В этом исследовании мы представляем альтернативный подход к улучшению вакцина, которая состоит из БЦЖ взаимодополняемости с экзогенной протеинов интереса на поверхности бактерий, вместо преобразования с плазмид кодирования соответствующих генов. Во-первых, протеинов интереса выражаются в fusion с мономерных авидин в стандартных E. coli системы выражения и затем используется для украшения поверхности биотинилированным БЦЖ. Эксперименты на животных с использованием поверхности БЦЖ, украшенные суррогатной овальбумина антигена продемонстрировать, что измененные бактерии полностью иммуногенность и способны индуцировать Т-клеток конкретных ответов. В целом данные, представленные здесь сильно поддержка Роман и эффективный метод меняет текущий вакцины БЦЖ, который заменяет трудоемкий подход обычных взаимодополняемости с экзогенной нуклеиновых кислот.
Introduction
Чтобы заменить текущий туберкулеза вакцины БЦЖ, включая белка адъювантной систем, вирусный векторной технологии, аттенуированные штаммы живой M.tb и генетически модифицированных штаммов БЦЖ, либо ввести гены были предложены различные стратегии чрезмерно выражая БЦЖ антигены, которые не выразили достаточно во время инфекции1 или Mtb-специфических антигенов не представляют в БЦЖ2. Генная инженерия, однако, сталкивается множество барьеров, включая неопределенность уровень безопасности, трудоемкий процесс и низкая эффективность выражения векторов4,5. Что касается улучшения БЦЖ, альтернативный подход необходима для повышения иммуногенности без необходимости неопределенной генетических изменений.
В этом исследовании мы представляем новую стратегию для отображения рекомбинантных протеинов интереса на поверхности клеток БЦЖ, которая основана на известной высокоспецифичные авидин взаимодействие с биотин. Этот подход позволяет быстрое и воспроизводимые вложение рекомбинантных авидин синтез белков на поверхности биотинилированным БЦЖ, который способствует широкий манипуляции БЦЖ для достижения максимального улучшения его эффективность при сохранении его отличную безопасность Запишите, что наблюдавшееся в течение десятилетий использования.
Авидин сродство для биотина чрезвычайно высока (Kd = 10−15 М) и после того, как сформирована, биотин авидин комплекс очень стабильна и может быть нарушена только под денатурации условия6. Однако для этого типа взаимодействия в качестве альтернативного метода передачи гена, требуется долгосрочный но обратимые отображения рекомбинантных белков. Таким образом, мы представили здесь низкого сродства мономерных авидин (Kd = 10−7 М) приводит к обратимым выпуска белка от поверхности украшены БЦЖ раз попадает внутрь антиген представляющих клеток. Для того, чтобы предоставить доказательство концепции, мы протестировали этот метод с помощью мономерных авидин химерных белка, соответствующий суррогат антигена, производный от овальбумина (OVA)7,8. Результаты показали, что БЦЖ клеточной поверхности могут быть легко и быстро украшены мономерных авидин синтез белков и что эта привязка к поверхности БЦЖ является стабильным и воспроизводимые без обнаружить изменения в бактериальных роста и выживания. Кроме того, мы обнаружили, что БЦЖ, украшенные мономерных авидин сливается с OVA (AviOVA) может вызвать иммунный ответ аналогичен индуцированных БЦЖ генетически выражая же антигена в пробирке и в естественных условиях. Эта технология реверсивные отображения протеинов интереса на поверхности бактериальной поэтому является эффективной заменой традиционных гена передачи подходов и может обеспечить платформу для широкого манипуляций БЦЖ и дальнейшего применения вакцины развития.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все животные были сохранены в соответствии с протоколами, утвержденных животных уход и использование комитетами в университете Британской Колумбии. Эксперименты были утверждены животное уход и использование комитетами и выполняется согласно Канадского совета по руководящим принципам ухода животных. Номер социального обеспечения животных гарантии — A11-0247.
1. поколение мономерных авидин синтез белков, выражая плазмиды
- Югу клонировать мономерных авидин последовательность12 в плазмиду pDEST17 между «КТК» и «ГАА» сайты, которые соответствует 133-134bp. (то есть, между 6-histag и pDEST17 сайта Attr1 рекомбинации) для получения p17-Avi.
Примечание: Последовательность ДНК мономерных авидин показана ниже. Три мутации в авидин одичал типа для получения мономерных авидин отображаются полужирным шрифтом.
gccagaaagtgctcg ctgactggga aatggaccaa cgatctgggc КТСУВДatga ccatcggggc tgtgaacagc
agaggtgaat tcacaggcac ctacatcaca gccgtaacag ccacatcaaa tgagatcaaa gagtcaccac tgcatgggac
ACAAGCTАКК atcaacaaga ggacccagcc cacctttggc ttcaccgtca attggaagtt ttcagagtcc accactgtct
tcacgggcca gtgcttcata gacaggaatg ggaaggaggt cctgaagacc atgtggctgc tgcggtcaag tgttaatgac
attggtgatg acАААaaagc taccagggtc ggcatcaaca tcttcactcg cctgcgcaca cagaaggagt га - Дизайн грунты с AttB1 и AttB2 сайты, соответствующие OVA полипептид757-1035 (b-A - и H-2_Kb-ограничено epitopes) последовательности ДНК. Грунтовка последовательности являются: Attb1-OVA
GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCCTTGAGCAGCTTGAGAGTAT и Attb2-OVA
GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTGTTACCCTACCACCTCTCTGC. (Attb1 и b2 последовательности Attвыделены жирным шрифтом).- ПЦР усиливают OVA полипептид757-1035 последовательность ДНК с праймерами выше с помощью pUC57-ЯЙЦЕКЛЕТКИ плазмида как шаблон.
- Клонировать продуктов ПЦР в pDONR-221 через участкам в vitro рекомбинации реакцию (например, BP Clonase) для получения pDONR-OVA.
- Перенос гена интереса в p17-Avi с помощью LR Clonase реакции для получения p17-Avi-OVA.
Примечание: Для деталей BP и LR рекомбинации клонирования, смотрите руководство изготовителя.
2. мономерные авидин синтез белков, очистки и складывая
- Трансформировать p17-Avi-ЯЙЦЕКЛЕТКИ плазмида в E. coli BL21 и побудить 250 мл E. coli BL21 культуры с IPTG (0,1 М) за 3 ч при 37 ° C.
-
Лизис бактерий и включение органы солюбилизация
- Пелле 250 мл индуцированных BL21 культуры 30 мин центрифугирования 4000 x g и при 4 ° C.
- Собирать окатышей в 10 мл буфера lysis (50 мм трис-HCL, 150 мм NaCl, 6 M гуанидина-HCL, рН 1,5-2,5) и Инкубируйте 15 мин при 95 ° C. Инкубируйте на ночь при комнатной температуре на ротатора.
- Центрифуга 30 мин на 15000 x g и 4 ° C и собирать супернатант.
-
Очищайте Avi-OVA от супернатант (растворимых включения органов фракция) с помощью Ni НТА столбцов.
- Развести органы включение 1:2 с буфера lysis.
- Используйте 4 мл Ni-НТА смолы на 250 мл культуры производные включения органов.
- Вымойте 3 x с 10 мл буфера lysis (рН 7,0).
- Элюировать с 10 мл буфера (лизис буфер рН 7.0 с 250 мм имидазола).
- Сворачивают eluted белка путем постепенного разбавления (1:10) и быстрое vortexing в трис-буфере (рН 7,5), содержащие 1 мм DTT, 200 мм NDSB256 (3-(Benzyldimethylammonio)propanesulfonate), 0.5 мм 80 анимации, аргинин 500 мм и 200 мм NaCl на 30 минут при комнатной температуре.
- Де Соль и буфера обмена сложил белка из буфера Tris в PBS с концентраторами белка по данным производителя протоколы.
- Удаление агрегатов центрифугированием 30 мин на 3500 x g и на 4 ° C и хранить аликвоты растворимого белка при-20 ° C.
3. Biotinylation БЦЖ клеточной поверхности
- Расти БЦЖ в Мидлбрук 7H 9 бульон с 10% OADC (олеиновая кислота, раствор альбумина и декстроза) и 0,05% 80 анимации при 37 ° C на платформе шейкер 50 об/мин до OD = 0,5-1.
Примечание: БЦЖ патогена 2-го уровня биобезопасности и все эксперименты, касающиеся БЦЖ должно быть сделано в области биобезопасности, кабинет с надлежащего личного защитного оборудования. - Вымойте 109 БЦЖ 3 раза с 500 мкл ледяной эндотоксина бесплатно PBS плюс 0,1% Tween80 (PBST) (рН 8,0). Приостановите Пелле БЦЖ в стерильных эндотоксина бесплатные PBS.
-
Непосредственно перед применением Подготовьте 1 мл 10 мм СС сульфогруппу-NHS биотина в стерильных фильтрованной воды.
- Инкубируйте бактерий с 1 мл 0,5 мм СС сульфогруппу-NHS биотина при комнатной температуре за 30 мин.
-
Вымойте помечены бактерий 3 раза с 500 мкл ледяной холодного PBST для удаления не отреагировал biotinylation реагента.
- Вновь приостановите Пелле в 1 мл PBST.
-
Для оценки эффективности biotinylation, пятно 108 биотинилированным БЦЖ с стрептавидина-FITC (1: 100, 25 мкл) при комнатной температуре в течение 20 мин.
- Инкубировать окрашенных бактерий в 1 мл 2% PFA для 20 мин при комнатной температуре и затем проверять уровни biotinylation путем анализа цитометрия потоков.
4. фенотип биотинилированным микобактерии: рост и выживание
-
Расти штаммов БЦЖ в Мидлбрук 7H 9 бульон с 10% OADC (олеиновая кислота, раствор альбумина и декстроза) и 0,05% 80 анимации при 37 ° C на платформе шейкер 50 об/мин.
- Запись оптической плотности (600OD) бактериальной культуры над 8-дневный период.
-
Использование БЦЖ-Люк (ранее описанных9) для обнаружения выживания бактерий в макрофагах.
- Заразить клетки RAW264.7 с биотинилированным БЦЖ-Люк (МВД 10:1) или необработанной БЦЖ-Люк (контроль) и инкубировали при 37 ° C в течение 48 часов периода времени.
- Вымойте монослои ячейки и затем лизируют с 0,025% SDS освободить организм бактерий.
- Мера биолюминесценции производство с системой Люцифераза пробирного и люминометра.
Примечание: Сигнал люминесценции является показателем бактериального жизнеспособности. Пожалуйста, обратитесь к руководству производителя для деталей Люцифераза пробирного.
5. Связывание мономерных авидин синтез белка биотинилированным БЦЖ поверхности
- Смешайте 5 x 108 биотинилированным БЦЖ с Avi белка (10 мкг/мл финал в PBS-T) за 1 ч при комнатной температуре на платформе шейкер.
- Бактерий мыть 3 раза с 500 мкл ледяной холодной PBST и пятно с кролик антитела анти авидин (Ab) (разбавления 1: 100, ранее описанных10) для 20 мин при комнатной температуре, а затем с FITC конъюгированных коза анти кролик IgG Ab в тех же условиях.
- Промойте бактерий 3 раза с 500 мкл PBST и анализировать подачей cytometry оценить степень поверхности украшения.
6. лиофилизация микобактерий
- Biotinylate бактерии согласно шаг 3.1-3.4 и пальто биотинилированным бактерий с Avi-OVA по шаг 5.1.
- Аликвота биотинилированным и покрытые бактерий (108), мыть с PBS и вновь приостановить в 0,5 мл лиофилизации СМИ (средний Sauton 25%, 75% H2O и 1,5% Na глутамата).
- Передача бактерий в стеклянных флаконах и заморозить в морозильной камере-80 ° C на ночь.
- Lyophilize заполненные и замороженные стеклянные пробирки на 24 часа, с использованием замораживания сушки.
- Хранить сушеные образцов при комнатной температуре и воссоздания в PBS при необходимости.
- Повторите шаг 3.5 для оценки biotinylation и поверхности покрытия стабильности.
7. фагоцитоз Assay
- Рост клеток макрофагального RAW 264.7 в 10 см диаметр культуры блюда в DMEM средних содержащие FCS 5%, 1% L-глютамин, HEPES, несущественные аминокислот и пенициллина и стрептомицина до 70-80% confluency.
- Семенной 2 x 106 RAW 264.7 макрофагов ячейки в пластине 6-хорошо. Позволяют клеткам присоединиться на ночь при 37 ° C и 5% CO2.
- Генерировать DsRed БЦЖ (ранее описанных9) украшены Avi-OVA (DsRed БЦЖ-Avi-OVA) согласно шаги 3.1-3.4 и 5.1.
- Заразить RAW клетки с DsRed БЦЖ-Avi-ЯЙЦЕКЛЕТКИ или необработанной DsRed БЦЖ в мои 20:1 в течение 24 ч при 37 ° C.
- Вымыть клетки три раза и trypsinize с помощью 1 мл 0,25% трипсина при 37 ° C 10 мин для удаления частично отдельностоящий бактерий.
- Исправить в 2,5% ПФА в PBS для 20 мин при комнатной температуре.
- Вымойте 3 x с PBS и анализировать проточной цитометрии.
8. внутриклеточных торговлей OVA оформленный биотинилированным БЦЖ в макрофагах
-
Микроскопии флуоресцирования
- Семя 3 x 105 RAW 264.7 макрофагов ячейки на coverslips в пластине 24-хорошо. Позволяют клеткам присоединиться на ночь при 37 ° C и 5% CO2.
- Заразить клетки макрофагального с микобактерий (МВД 10:1) в средствах массовой информации содержание без антибиотиков при 37 ° C и 5% CO2 для 4-24 ч.
- Вымыть клетки и trypsinize для удаления поверхности вложения, не в организм бактерии как шаг 7.5.
- Исправить зараженные клетки в 2,5% ПФА в PBS для 20 мин при комнатной температуре следуют 3 стирок с PBS.
- Разрушения клеток в буфере блокирование/permeabilization (0.1% тритон X-100, 3% BSA в PBS) для 20 мин при комнатной температуре.
- Использование специфическое антитело интерес (например, кролик анти авидин Ab) в 10 мкг/мл в permeabilization буфер для 20 мин при комнатной температуре после вторичного антитела (например, FITC-коза анти кролик IgG) за 20 мин.
- Вымыть клетки 3 x с PBS, один раз с водой и горе на слайды в 10 мкл водный монтажа среды к минимуму флуоресценции Фотообесцвечивание.
- Изучить слайды по цифровой confocal микроскопии с помощью эпифлуоресцентного микроскопа с 63 x / 1.4 план-Апохромат цель. Запись изображения с помощью цифровой камеры в сочетании Микроскоп программного обеспечения.
-
Immunogold окрашивание и электронной микроскопии
- Семенной 2 x 106 RAW 264.7 макрофагов ячейки в 6-ну пластины.
- Исправить БЦЖ зараженные макрофаги с 4% PFA для 4 ч при комнатной температуре.
- Стирайте образцы дважды с PBS.
- Внедрить образцы в 4% агарозном низкой температурой плавления и обезвоживанию в 70% этиловом спирте.
- Передача образцов акриловой смолы и полимеризации при 50 ° C.
- Вырезать из 60 Нм секции с микротом и собирать разделы на никель сетках.
- Ярлык образцы с 10 мкг/мл авидин антитела для 1 ч при комнатной температуре или 4 ° C на ночь в растворе инкубации (PBS и 0,1% BSA) и затем промойте инкубации решения золото конъюгированных F(ab')2 ультра-малых коза анти-кролика IgG (1/20) за 1 ч в комнате Температура инкубации решения.
- Вымойте секций в дистиллированной воде, пятно в низкотемпературном растворе глютаральдегида 2%, мыть, сухой воздух и изучить с микроскопом.
9. животных иммунизации и орган обработка
Примечание: Все шаги должно быть сделано в области биобезопасности кабинета.
- Перевал биотинилированным и белка покрытием бактерий через иглу 271/2G 10 раз сделать одну ячейку подвеска.
-
Возьмите 1 х 106 бактерий в 100 мкл бесплатно эндотоксина PBS и иммунизацию женщин C57BL/6 мышей (b-A, H - 2 Kb, 5-6 неделе старый) подкожно в загривок шеи.
- Внедрить контроль мышей с 100 мкл PBS одиночку.
-
Усыпить иммунизированной мыши 20 дней после иммунизации на CO2 ингаляции следуют шейки матки дислокации.
- Изолировать селезенки и перевести его в RPMI СМИ.
-
Маш селезенки через стрейнер ячейки 70 мкм с плунжером шприц 5 мл.
- Вымойте с 5 мл RPMI. Центрифуга (800 x g, 3 мин), чтобы изолировать одну ячейку подвеска.
- Разрушающим РБК с мыши биотина положительный выбор комплекта с биотин Ter119/эритроидные клетки Ab.
- Центрифуги и вновь приостановить клетки в 10 мл полной RPMI (10% FCS, 1% L-глютамина, 1% пенициллин, стрептомицин 1% и 50 мкм 2-ME).
10. я-Ab Тетрамер окрашивания для определения частоты антиген-специфические CD4+ Т-клеток и внутриклеточных цитокинов окрашивания по для определения частоты из антиген-специфические T клетки освобождения цитокинов в иммунизированных животных
-
Тетрамер пятнать
- Пятно splenocytes от контроля и иммунизированной мыши (~ 20 x 106 клеток) с PE-конъюгированных Ab-OVA323-339 тетрамера (1/12,5 разрежения) за 1 ч при 37 ° C в буфере привязки (PBS с FCS 2% и 0,1% НАН3).
- Добавьте AF647 CD4 Ab (1:25) и 7-AAD (для выявления мертвых клеток) в splenocytes 20 мин при комнатной температуре.
- Анализировать образцы проточной цитометрии.
- Приобрести 500000 события в регионе положительный CD4 для определения частоты Тетрамер позитивные события.
Примечание: Общая splenocytes определяются по помаркой точка SSC/FSC, живые клетки путем исключения 7-AAD позитивные события и CD4 подмножеств стробирования AF647 позитивные события.
-
Частота антигена конкретных внутриклеточных цитокинов, выпуская Т-клеток
- 7 splenocytes передачи примерно 1 × 10 в 4 мл полного RPMI среды в шести ну пластины с или без рекомбинантных OVA (10 мкг/мл) и инкубировать на 16 h.
- Лечить клетки с Brefeldin (1:1, 000) для дополнительных 5 h.
- Вымойте с PBS и при условии внутриклеточных цитокинов, окрашивание следующим образом:
- Пятно образцы клетки с PE-CD8 или PE-Cy7-CD4 Ab (1:50 в буфере привязки) при комнатной температуре за 30 мин.
- Исправить в 4% PFA при комнатной температуре в течение 20 мин.
- Разрушения с помощью permeabilization решение, в соответствии с инструкциями производителя.
- Вымойте клетки и этикетка с AF647-конъюгированных ИФН γ Ab (1:50) для 20 мин при комнатной температуре.
- Вымыть клетки и cytometry анализ потока как описано выше.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
С общие процедуры, описанной выше был рассмотрен возможности БЦЖ поверхности biotinylation и украшения с суррогатной антигена OVA. Иммуногенность модифицированных БЦЖ была затем испытания в естественных условиях. Поверхности бактериальной легко помечены биотина для быстрого отображения авидин химерных антигены без каких-либо обнаружить изменения в бактериальных фенотипов. Результирующее изменение БЦЖ эффективно заглатывается клетки презентации антигена и может вызвать иммунный ответ OVA-специфических мышей.
Поколение мономерных авидин фьюжн плазмидов и белков
Выражение плазмида p17-Avi был создан чтобы быть совместимым с методологией шлюза должен использоваться для производят протеины сплавливания мономерных авидин. OVA был клонирован в p17-Avi и выразили в E. coli, затем очищается и сложил как описано выше (рис. 1).
Биотин эффективно придает поверхности бактериальной и не влияет на рост бактерий или выживание
Бактерии были помечены различных концентраций (0-1 мм) биотина и окрашенных для изучения эффективности поверхности biotinylation согласно протоколам выше. Cytometry анализ потока показан общий сдвиг флуоресценции гистограммы в бактерии, помечены биотина 0,5 мм (рис. 2), и эта концентрация была использована на протяжении всего этого исследования для создания биотинилированным бактерий. Далее, мы исследовали эффект бактериальных модификации поверхности на бактериальных фенотипа и обнаружил, что биотинилированным и контроля лечения БЦЖ отображается профиль аналогичного роста над 8-дневный период (рис. 3A). БЦЖ, выражая Люцифераза (БЦЖ-люк)9 был использован для изучения бактериальных выживания в макрофагах. Свечения сигналов, свидетельствует о жизнеспособности бактериальной было зарегистрировано более 48 ч. полученные результаты показали аналогичные профили жизнеспособности постепенного снижения между биотинилированным и контроль бактерий (рисунок 3B). В заключение эти данные явно указывают, что бактериальные поверхности biotinylation не влияет на рост бактерий или выживание внутри макрофагов, который имеет важное значение, поскольку увеличение выживания в макрофагах может означать увеличение в бактериальных вирулентности.
Эффективность бактериальных поверхности украшения
Биотинилированным бактерии были покрыты с OVA антигена пептида в fusion с мономерных авидин, согласно протоколам выше. Потока cytometry анализ показал минимальный уровень OVA привязка к не биотинилированным бактерий (МФО = 8.31 ± 0.42, рис. 4A, верхней панели) и значительный уровень OVA привязка к биотинилированным бактерий (МРИ = ± 54.67 4,98) по сравнению с контроля бактерий (МФО = 5.92 ± 0,22, рис. 4A, Нижняя панель).
Стабильность БЦЖ поверхности украшения
Поскольку обычные живые вакцины БЦЖ сформулированы как сухих порошков, важный вопрос, который возник в ходе этого исследования было стабильности модифицированных БЦЖ после того, как паром для лиофильной сушки, воссоздание и хранения в холодильнике или комнатной температуры. Таким образом мы изучили поверхности отображения Avi-OVA в лиофилизированном БЦЖ Avi-OVA (Поверхность украшена Avi-OVA) и в свеже украшены бактериальных препаратов. Результаты (рис. 4B) показали, что уровни Avi-OVA на поверхности бактериальной оставалась стабильной и обнаружению один месяц после лиофилизации и хранения при комнатной температуре, по сравнению с свежий БЦЖ Avi-OVA препараты, которые доказали, что этой поверхности Метод украшения подходит для разработки вакцины.
Макрофагов фенотипа не подвержен бактериальных поверхности украшения
Чтобы увидеть ли эта методология поверхности украшения вмешивается бактериальных вступления в клетки хозяина, мы использовали RAW264.7 клеток и DsRed бактерий9 для выполнения пробирного фагоцитоза, указанных в протоколе выше. Рисунок 4 c показали, что бактериальные поверхности украшены БЦЖ не имеют значительного вмешательства с бактериальной вход (22,5 ± 1,57%), по сравнению с немелованной дикого типа БЦЖ (24.47 ± 1.18%), что указывает на поверхности украшения БЦЖ не влияет на макрофагов фенотип.
Протеины сплавливания авидин внутриклеточно путешествия и локализации совместно с молекулами MHC
Для изучения судьба Avi-OVA-оформленный БЦЖ внутри макрофагов, сторонником RAW клетки были инфицированных и рассмотрены микроскопии флуоресцирования, как описано в протоколе выше. Изображения, полученные (Рисунок 5A) показал, что Avi-OVA не только на поверхности бактериальной, но и частные и перемещен в цитоплазму далеких бактерий. Для дальнейшей проверки этот результат, мы провели immunogold пятнать эксперимент и изображения, полученные ясно показали, что Avi-OVA антигены присутствуют не только на поверхности БЦЖ, но можно также отделить от поверхности БЦЖ, крест phagosomal мембраны и путешествия сторону цитозоле (Рисунок 5B). Для дальнейшего изучения ли Avi-OVA оформленный бактерии были способны доставлять их поверхности белка грузовой путь презентации антигена, макрофаги были заражены Avi-OVA БЦЖ, как описано в протоколе и подвергается конфокальный анализы. Результаты (рис. 6A) показали, что colocalization Avi-яйцеклеток с молекулами A, предполагая, что белок авидин фьюжн отсоединяется и перемещен в отсеках презентации антигена, где они были загружены на молекулы MHC II. Результаты также показали, что Avi-OVA пептид локализует совместно с класса I молекулы внутри БЦЖ phagosomes когда витражи для H-2_kb (Рисунок 6B), который продемонстрировал, что существует потенциал Презентация антигена Avi-OVA для CD8 клетки+ T макрофагов. Эти данные показывают, что после того, как поверхности украшены бактерии войти макрофагов, антигены способны движения к пути презентации антигена.
Поверхности декорированные бактерии полностью иммуногенность
Для изучения ли поверхности декорированные БЦЖ способна индуцировать мышей C57BL/6 в vivo, специфический иммунный ответ были иммунизированы с PBS только (контроль), одичал тип БЦЖ, Avi-OVA оформленный БЦЖ и БЦЖ, генетически преобразована с плазмида выразить Подобные OVA антиген. Иммунизированной мыши были пожертвовать 20 дней спустя и частоты OVA-конкретных CD4+ T были обнаружены клетки и OVA-специфических Т-клетки, выпуская цитокинов, согласно протоколу. Результаты (рис. 7A-B) показали большую долю OVA-конкретных CD4+Т-клеток ответ в животных, иммунизированных с БЦЖ, покрытые Avi-OVA по сравнению с БЦЖ не менее БЦЖ генетически изменены выразить OVA, показали аналогичные иммунный ответ БЦЖ AVI-OVA (рис. 7). Эти данные показали, что метод бактериального поверхности украшения способны вызвать значительное расширение антиген конкретным CD4+ T клеток и степень Т-клеток ответ индукции сопоставима с БЦЖ, генетически выразить аналогичные OVA антиген.
Поскольку продукция внутриклеточных цитокинов также являются важными показателями антигена Т-клеток конкретных ответов, внутриклеточных цитокинов, окрашивание (ICS) эксперименты были проведены для дальнейшей оценки Т-клеток иммунной реакции путем определения выражения и частоты Эффектор цитокинов в животных, иммунизированных OVA-оформленный бактерий и бактерий, генетически преобразована с OVA, выражая плазмиды. Мы изучили уровни ИФН γ-релиз, который является известным показателем защитную реакцию против внутриклеточных бактерий11. Мы продемонстрировали, что мы смогли обнаружить сходные уровни OVA-конкретных ИФН γ выпускать CD4+ клетки животных, иммунизированных с поверхности бактерий, украшенные OVA (БЦЖ-Avi-OVA и БЦЖ p19-Avi-OVA) по сравнению с прививки с бактерий, животных генетически выражая OVA (БЦЖ p19-OVA) (рис. 8A). Важно отметить, что мы также были в состоянии обнаружить значительно более высокие частоты ИФН-γ производства CD8+ T-клеток в животных, прививки БЦЖ-Avi-OVA по сравнению с животными, иммунизированных с БЦЖ, генетически выражая OVA (Рисунок 8B-C) которая демонстрирует, что биотин авидин опосредованной поверхности дисплея антигена методологии можно эффективно заменить БЦЖ преобразования с нуклеиновыми кислотами.
Рисунок 1: строительство рекомбинации, клонирование плазмиды для производства авидин синтез белков. (A) сегмент гена, кодирование для мономерных авидин синтезировано с места ограничения NdeI и Ноти и subcloned в pDEST17 между 6 x гистидина и кассеты с шлюза для создания плазмида p17-Avi. OVA пептид252-345 ДНК последовательности, завершенной с attB сайтов были клонированы в pDONR221. После этого OVA гены были subcloned в p17-Avi. Изображение, редактировать и Перепечатано с разрешения PLOS ONE12. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: эффективность БЦЖ biotinylation. БЦЖ был биотинилированным с различной концентрации ГСЗ-SS-биотин 30 мин при комнатной температуре, затем помечены FITC-стрептавидина и анализируются проточной цитометрии. Результаты представлены в виде гистограммы зеленой флуоресценцией интенсивности и вставка граф представляет среднее ± SEM среднее флуоресценции интенсивностей (MFI) вычтены из 3 независимых экспериментов. * P < 0,05; ** P < 0,01; P < 0,001. Изображение, редактировать и Перепечатано с разрешения PLOS ONE12. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: Biotinylation поверхности БЦЖ не влияет на его рост или выживание в макрофага. (A) био-БЦЖ и управления без маркировки одичал тип БЦЖ были выращены в полной 7 H 9 СМИ, и репликации был контроль над 8-дневный период. Результаты выражаются как кривые роста, то есть, означает поглощение на 600 Нм как функция времени ± SEM от 3 независимых экспериментов. Макрофаги (B) были инфицированы с био-БЦЖ-Люк или управлять немеченого БЦЖ-люк для указанных периодов и затем ячейки лизатов были подготовлены и assayed для биолюминесценции для выявления жизнеспособных бактерий. Результаты выражаются как означает относительных единицах света (RLU) ± SEM от 3 независимых экспериментов. Изображение, редактировать и Перепечатано с разрешения PLOS ONE12. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: Avi-OVA привязка к био-БЦЖ и его стабильность. (A) био dsRed БЦЖ (бактерии, выражая красной флуоресценцией, описанных ранее9) и управления не биотинилированным dsRed БЦЖ были смешаны с Avi-OVA при комнатной температуре 1 h и степень OVA привязки оценивалась путем пятнать поверхности с антитела против авидин кролик и FITC-коза анти кролик IgG (значения параметров FL1). Образцы были вымыты и анализируемой проточной цитометрии. Результаты представлены в виде гистограммы зеленой флуоресценцией интенсивности, и значения среднее ± SEM от МФО из био-БЦЖ-AviOVA привязки трех независимых экспериментов. (B) лиофилизированный био-БЦЖ покрытием с Avi-OVA и свежеприготовленные Avi-OVA-Био-БЦЖ были помечены и анализируемой проточной цитометрии, как описано в а. Данные, приведенные представителем трех независимых экспериментов, и значения среднее ± SEM от МФО из Avi-OVA-Био-БЦЖ привязки трех независимых экспериментов. (C) RAW макрофаги были заражены DsRed БЦЖ-Avi-OOVA или DsRed-БЦЖ для 24 ч при 37 ° C. Образцы были затем промывают, относились с трипсином, фиксированной и проанализированы СУИМ. Результаты выражаются в виде красной флуоресценцией гистограммы, отражающие степень фагоцитоза. Значения указывают ± SEM средний процент клеток, глотая БЦЖ, полученные от трех независимых экспериментов. Изображение, редактировать и Перепечатано с разрешения PLOS ONE12. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5: Avi-OVA отсоединяется от поверхности БЦЖ и пересек phagosomal мембраны к цитозоль. (A) приверженца RAW клетки на обложке скользит были инфицированных в OVA-оформленный dsRed БЦЖ для 24 ч при 37 ° C и затем фиксированной/permeabilized и витражи с антитела анти авидин кролика и FITC-коза анти кролик IgG. Образцы были смонтированы на скольжениях микроскопа и проанализированы цифровой confocal микроскопии. Красные сигналы указывают положение БЦЖ и зеленый сигналов отражают локализации Avi-OVA. Пунктирная линия указывает границы клетки макрофагального и внизу справа, что группа является 4 X увеличением вставки, отображаемые в левой панели. (B) шлифов БЦЖ-AviOVA инфицированных клеток и сырье были исправлены с параформальдегида и последовательно инкубировали с анти авидин антитела и золото конъюгированных коза анти кролик IgG визуализации Avi-OVA и изучены с помощью электронного микроскопа. Показано увеличение 12000 X. Стрелки указывают Avi-OVA в отрыве от поверхности БЦЖ и экспортируется за пределы фагосомы мембраны. Изображения показаны являются представителями двух независимых экспериментов. Изображение, редактировать и Перепечатано с разрешения PLOS ONE12. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 6: авидин фьюжн антиген совместно локализованы с MHC класса II и класса I молекулы. Приверженцами BMA3.1A7 клетки, линии клеток макрофагального мыши, были заражены OVA оформлены GFP-БЦЖ (выражая Зеленый флуоресцентный, ранее описанных9) за 4 ч и затем стимулируется с ИФН γ для 24 h. клетки были затем фиксированной/permeabilized и витражи с Кролик антитела анти авидин, Alexa 594 анти кролик IgG и Alexa 647 крысы мыши анти-A (A) или Alexa 647 крыса анти мыши H-2_kb (B). Образцы были смонтированы на скольжениях микроскопа и проанализированы цифровой confocal микроскопии. Зеленый сигнал указывает положение БЦЖ-GFP и красный сигналы отражают локализации Avi-OVA. Синий сигналы указывают положение MHC класса II или класса я молекул. Пунктирная линия показывает области интересов. Стрелки указывают Avi-OVA colocalization с молекулами MHC. Изображения показаны являются представителями двух независимых экспериментов. Изображение, редактировать и Перепечатано с разрешения PLOS ONE12. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 7: В vivo CD4 Т-клеток ответ OVA-оформленный БЦЖ+ . Мышей C57BL/6 были вводят подкожно с поверхностью БЦЖ, украшенные OVA, неизмененное БЦЖ одичал тип, PBS (управления), БЦЖ, генетически преобразован выразить OVA (БЦЖ p19-РАВНИНА), или преобразованы с контролем плазмиды и поверхности украшены Avi-OVA () BCG-p19-AviOVA). После 20-дневного периода, splenocytes были подготовлены из селезенки Усыпленных животных и витражи с PE-конъюгированных Ab-OVA323-339 тетрамера (A) следуют AF647-CD4 антитела и 7-AAD. Затем образцы были проанализированы проточной цитометрии. Результаты выражаются в виде двух параметр точка участки, которые показывают средние частоты ± SEM Тетрамер позитивные события в CD4+ населения из двух животных/группы. Данные представляют три независимых экспериментов (в общей сложности шесть мышей были изучены образцы клеток от каждой мыши, оценены в трех экземплярах). Данные в диаграммы (B) выражаются как означает значение ± SEM (в общей сложности 500 000 событий) абсолютное количество ЯЙЦЕКЛЕТОК Тетрамер конкретных CD4+ клетки в двух животных/группы и три независимых экспериментов. * P < 0,05; ** P < 0,01; P < 0,001. Изображение, редактировать и Перепечатано с разрешения PLOS ONE12. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 8: частоты Т-клеток, выпуская цитокинов в ответ на Avi-OVA покрытием БЦЖ иммунизации. Splenocytes от мышей иммунизированных с PBS, БЦЖ одичал-тип, БЦЖ WT поверхности украшены Avi-OVA, БЦЖ p19-OVA и БЦЖ p19-AviOVA были стимулируется с рекомбинантным белком OVA для 16 h следуют 5 h период лечения с Brefeldin а. клетки были затем промывают и Сначала окрашивали PE-Cy7 анти CD4 (A) или PE антитела анти CD8 (B), то AF647 антитела анти IFN-γ. Клетки были затем промывают и проанализированы проточной цитометрии. Результаты выражаются как два параметра точка участков Показать средней частоты ± SEM подмножеств ИФН γ производства клеток CD4+ и CD8+ населения из двух животных/группы. Данные представляют три независимых экспериментов (в общей сложности шесть мышей были изучены образцы клеток от каждой мыши, оценены в трех экземплярах). Данные в диаграммы (C) выражаются как среднее абсолютное число ± SEM ИФН-γ+ T выпуская CD4 клеток (левый график) или ИФН γ выпускать CD8+ T клетки (правый график) от двух животных/группы и три независимых экспериментов. * P < 0,05; ** P < 0,01; P < 0,001. Изображение, редактировать и Перепечатано с разрешения PLOS ONE12. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Мы сообщали в этом исследовании Негенетические подход для быстрого и эффективного отображения внешних белков на поверхности БЦЖ добавить конкретные антигены или конкретных функциональных свойств, ожидается эффективного повышения иммуногенности бактерии. Мы продемонстрировали, что БЦЖ клеточной поверхности может быть легко биотинилированным для мгновенной поверхности украшения с белками авидином фьюжн. Общая процедура может быть выполнена в течение 2 ч, в то время как генетическая трансформация и подбор положительных клонов требует 2 до 3 месяцев времени запаздывания. Модификация поверхности не влияет на рост бактерий и выживания. Бактерии, украшенные суррогатной антигена OVA смогли доставить антигена в путь презентации антигена и индуцированных специфический иммунный ответ в естественных условиях, которая была оценена проточной цитометрии анализов, включая MHC Тетрамер окрашивание и внутриклеточных цитокинов, окрашивание (ICS). Что еще более важно в vivo исследований ясно показал, что оформлены поверхности бактерии смогли вызвать аналогичные уровни иммунного ответа, по сравнению с БЦЖ, генетически выразить аналогичные антигены.
Авидин биотина взаимодействие является сильнейшим non ковалентные взаимодействия, известных в природе с Kd 10−15 M13. Это не только полезный инструмент, широко используются в биологических исследований14, но также недавно было показано, чтобы применяться в терапии рака15,16. В этом исследовании, тройной мутация (N54A, W110K и N17I) был применен к авидин одичал тип для преобразования tetrameric авидин в форме мономерных авидин, что значительно снизило авидин биотин сродство (Kd= 10−7 М) и связывает обратимо к биотин. Это мономерных авидин был использован для разработки плазмида p17-Avi, который совместим с рекомбинацией шлюз клонирования (Invitrogen) в выражение быстрых одношаговый протеина интереса. Эта новая версия мономерных авидин имеет ряд преимуществ, включая предотвращение большой бактериальный комок агрегации и переходных/реверсивный бактериальных поверхности дисплея протеинов интереса. Таким образом после того, как попадает в клетки-хозяина, Avi синтез белков можно отсоединить от поверхности биотинилированным бактерий и трафика внутриклеточно. Наконец мутации преобразовать авидин в не гликозилированного форму, которая может применяться в дрожжи или трансгенных растений17,18 для производства большого количества авидин синтез белков в eukaryotic систем. Эта форма мономерных авидин был выбран вместо версии мономерных стрептавидина (mSA)19, которая имеет стрептавидина и rhizavidin последовательности и был выше сродство (Kd 10−9 M) по сравнению с mAvidin. С предварительного тестирования, mSA Химера белков пришлось биотинилированным бактерий, по сравнению с mAvidin Химера белка значительно ниже эффективность привязки. Это исследование, таким образом, был основан на mAvidin, но мономерных стрептавидина или других форм стрептавидина/авидин бы также возможность для других приложений.
Успешное осуществление описанных протоколов зависит качество созданного синтез белка и эффективности бактериальных поверхности biotinylation. Eluted Avi тегами белка должно быть снятие соленое и буфер обмена в PBS с помощью надлежащего низкомолекулярных белков концентратор. Осадков может произойти в высокой концентрации факторов для некоторых белков, таким образом, фактор концентрации должны быть проверены и определяется с помощью небольших объемов eluted белка на первом, например, 0,5 – 1 мл растворимых включение тела, разводят в 20 мл PBS и затем в основном. Это также важно для поддержания температуры белка около 4 ° C в течение всего процесса, чтобы избежать осадки.
Для повышения эффективности бактериальных поверхности biotinylation, биотин сульфогруппу-NHS СС должны храниться в его первоначальном контейнере в темноте при 4 ° C. Реагент является чрезвычайно влаги чувствительных; Таким образом флаконы, содержащие Реагент следует достижение равновесного уровня до комнатной температуры перед открытием. Кроме того биотин Стоковый раствор (10 мм) должен быть непосредственно перед использованием как остаток ГСЗ Эстер гидролизует и очень быстро стать неактивные. Стоковый раствор биотина могут храниться и повторно; новый флакон биотин необходим для каждого biotinylation эксперимент. Для достижения наилучших результатов рекомендуется свежий культур БЦЖ, свежие средства массовой информации, а также свежие буферы. Как указано в протоколе, биотинилированным и покрытые БЦЖ может лиофилизированные и сохранены для по крайней мере 30 дней без ущерба для качества поверхности покрытия. Это особенно полезно при отправке или передачи образцов из одного места в другое или при выполнении экспериментов длительный курс.
Этот метод поверхности украшения БЦЖ также предлагает другие интересные возможности для анализа и оценки иммуногенности недавно разработанных вакцин-кандидатов в быстрый и точный способ. Основная цель Роман ТБ вакцин является побудить TH1 типа клеток, таких как CD4+ и CD8 клетки+ T, играют важную роль в защите против ТБ. Авидин биотин система, разработанная в этом исследовании предлагает весьма полезным инструментом для оценки этих клеток T ответов. Этот роман технологии быстро отображать рекомбинантных белков/антигенов на поверхности БЦЖ представляет собой прекрасный инструмент для оценки быстро и точно защитной эффективности многих иммуногенных белков (например, секретируемых конкретных M.tb белки) и таким образом могут быть переведены на развитие эффективных вакцин.
Путем корректировки и различной концентрации Avi синтез белков на поверхности бактериальной, еще одно преимущество этого метода может быть одновременно отображать различные антигены интерес на поверхности бактериальной для максимизации эффективности вакцины. Поскольку исследования показали, что БЦЖ вмешивается важные макрофагов функций, таких как фагосомы созревания20,21 и презентации антигена21, одна из возможностей для дальнейшего улучшения БЦЖ может украшать БЦЖ поверхности с сочетание факторов, известных для ускорения созревания фагосомы наряду с антигенами интерес.
Некоторые ограничения этой технологии включают в себя требование о крупномасштабное производство рекомбинантных белков, которые могут быть сложным и дорогим в районах с низким доходом. Кроме того трудно производить для очистки белков потребует устранения неполадок и оптимизации. Однако эти ограничения могут избежаться с улучшением технологий производство рекомбинантных белков. Другое ограничение включает в себя возможность, что естественно происходя антитела анти авидин распространены в лабораторных животных и человека22 может затруднить использование авидин в терапевтических целях. Однако другие лаборатории проверили безопасность и эффективность терапии авидин и показали, что авидин безопасность и эффективность не были затронуты существенно ее иммуногенности23. Интересно, что преобразования tetrameric авидин одичал тип в односегментную форму значительно уменьшилась его иммуногенности24.
Короче говоря, этот роман технологии, используя авидин биотин системы для повышения иммуногенности БЦЖ в через быстрый и воспроизводимые Негенетические бактериальных модификации поверхности с белками интерес может успешно заменить традиционные преобразования БЦЖ с антиген кодирования плазмид. Кроме того этот новый метод может не только способствовать улучшение текущего вакцины БЦЖ, но также может обеспечить Роман платформу для быстрой оценки практически любых потенциальных антиген или белки, обычно трудно выразить генетически БЦЖ, с широкими применение в разработке вакцины против туберкулеза.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Мы благодарим д-р R Стоукс для штамма БЦЖ Пастер и Талал A. для технической поддержки. Мы также благодарим GenScript за помощь с Джин синтеза.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Endotoxin-free RPMI 1640 | StemCell Technologies | 36750 | |
| Sulfo-NHS SS biotin | Thermo Fisher | 21328 | |
| FITC-conjugated streptavidin | Sigma-Aldrich | S3762 | |
| Phycoerythrin (PE)-conjugated I-Ab-OVA323-339 tetramer | MBL International | TS-M710-1 | |
| 7-AAD | BD Pharmingen | 559925 | |
| TALON polyhistidine-Tag purification resin | Clontech | 635501 | |
| Alexa Fluor (AF) 647 conjugated rat anti-mouse CD4 | BD Bioscience | 557681 | |
| AF647 rat anti-mouse IFN-g | BD Bioscience | 557735 | |
| AF647 rat anti-mouse I-A/I-E | BD Bioscience | 562367 | |
| PeCy7 rat anti-mouse CD4 | BD Bioscience | 552775 | |
| PE rat anti-mouse CD8 Ab | BD Bioscience | 561095 | |
| AF 647 rat anti-mouse H-2kb | BD Bioscience | 562832 | |
| FITC-conjugated goat anti rabbit antibody | Thermo Fisher | 31635 | |
| AF 647 rat anti-mouse CD4 | BD Bioscience | 557681 | |
| Ultra-small gold-conjugated goat anti-rabbit IgG | Electron Microscopy Sciences | 25100 | |
| Middlebrook 7H9 broth | BD Diagnostic Systems | 271310 | |
| OADC | BD Diagnostic Systems | B11886 | |
| Tween 80 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| RAW 264.7 murine macrophage cell lines | American Type Culture Collection | ||
| pDEST17 plasmid | Invitrogen | 11803012 | |
| pUC57-OVA plasmid | GenScript | SD1176 | |
| BP clonase | Invitrogen | 11789020 | |
| LR clonase | Invitrogen | 11791043 | |
| pDONR221 plasmid | Invitrogen | 12536017 | |
| Ni-NTA columns | Qiagen | 31014 | |
| Pierce protein concentrators | Thermo Fisher | 88527 | |
| Flurosave | Calbiochem-Novabiochem | 345789 | |
| Axioplan II epifluorescence microscope | Carl Zeiss Inc | ||
| CCD digital camera | Retiga EX, QImaging | ||
| Tecnai G2 200kV electron microscope | FEI Company | G2 200Kv | |
| 70μm Falcon cell strainer | Thermo Fisher | 87712 | |
| EasyStep mouse biotin positive selection kit | StemCell | 18556 | |
| biotin-Ter119/Ertyroid cells antibody | BioLegend | 116203 | |
| Brefeldin A | BD Pharmingen | 555029 | |
| Cytofix/Cytoperm kit | BD Pharmingen | 554714 | |
| Bright-Glo Luciferase assay system | Promega | e2620 | |
| Turner Biosystem luminometer | Promega | TD-20/20 | |
| Leica EM UC6 microtome | Leica Microsystems | UC6 | |
| Novalyphe NL 500 freeze dryer | Savant Instruments | NL 50 | |
| Wheaton boroscilicate glass vials | Wheaton | VWR 66011-675 |
References
- Horwitz, M. A., Harth, G. A new vaccine against tuberculosis affords greater survival after challenge than the current vaccine in the guinea pig model of pulmonary tuberculosis. Infect. Immun. 71 (4), 1672-1679 (2003).
- Pym, A. S., et al. Recombinant BCG exporting ESAT-6 confers enhanced protection against tuberculosis. Nat Med. 9 (5), 548-553 (2003).
- Grode, L., et al. Increased vaccine efficacy against tuberculosis of recombinant Mycobacterium bovis bacille Calmette-Guerin mutants that secrete listeriolysin. The J Clin Invest. 115 (9), 2472-2479 (2005).
- Bastos, R. G., Borsuk, S., Seixas, F. K., Dellagostin, O. A.
- Mederle, I., et al. Plasmidic versus insertional cloning of heterologous genes in Mycobacterium bovis BCG: impact on in vivo antigen persistence and immune responses. Infect Immun. 70 (1), 303-314 (2002).
- Singh, N. P., et al. A Novel Approach to Cancer Immunotherapy Tumor Cells Decorated with CD80 Generate Effective Antitumor Immunity A Novel Approach to Cancer Immunotherapy Tumor Cells Decorated with CD80 Generate Effective Antitumor Immunity. Cancer Res. 63 (14), 4067-4073 (2003).
- Oizumi, S., Strbo, N., Pahwa, S., Deyev, V., Podack, E. R. Molecular and cellular requirements for enhanced antigen cross-presentation to CD8 cytotoxic T lymphocytes. J Immunol. 179 (4), 2310-2317 (2007).
- Sharif-Paghaleh, E., et al. Monitoring the efficacy of dendritic cell vaccination by early detection of (99m) Tc-HMPAO-labelled CD4(+) T cells. Eur J Immunol. 44 (7), 2188-2191 (2014).
- Sun, J., et al. A broad-range of recombination cloning vectors in mycobacteria. Plasmid. 62 (3), 158-165 (2009).
- Laitinen, O. H., et al. Rational design of an active avidin monomer. J. Biol. Chem. 278 (6), 4010-4014 (2003).
- Flynn, J. L., Chan, J., Triebold, K. J., Dalton, D. K., Stewart, T. A., Bloom, B. R. An essential role for interferon gamma in resistance to Mycobacterium tuberculosis infection. J Exp Med. 178 (6), 2249-2254 (1993).
- Liao, T. Y. A., Lau, A., Joseph, S., Hytonen, V., Hmama, Z. Improving the immunogenicity of the Mycobacterium bovis BCG vaccine by non-genetic bacterial surface decoration using the avidin-biotin system. PLoS ONE. 10 (12), e0145833 (2015).
- Green, N. M.
- Howarth, M., Takao, K., Hayashi, Y., Ting, A. Y. Targeting quantum dots to surface proteins in living cells with biotin ligase. PNAS. 102 (21), 7583-7588 (2005).
- Lesch, H. P., Kaikkonen, M. U., Pikkarainen, J. T., Yla-Herttuala, S.
- Paganelli, G., Bartolomei, M., Grana, C., Ferrari, M., Rocca, P., Chinol, M.
- Cummings, J. F., et al. Safety and immunogenicity of a plant-produced recombinant monomer hemagglutinin-based influenza vaccine derived from influenza A (H1N1)pdm09 virus: a Phase 1 dose-escalation study in healthy adults. Vaccine. 32 (19), 2251-2259 (2014).
- Kolotilin, I., et al. Plant-based solutions for veterinary immunotherapeutics and prophylactics. Vet Res. 45, 114-117 (2014).
- Demonte, D., Drake, E. J., Lim, K. H., Gulick, A. M., Park, S. Structure-based engineering of streptavidin monomer with a reduced biotin dissociation rate. Proteins. 81 (9), 1621-1633 (2013).
- Deghmane, A. E., et al. Lipoamide dehydrogenase mediates retention of coronin-1 on BCG vacuoles, leading to arrest in phagosome maturation. J Cell Sci. 120 (19), 3489-3489 (2007).
- Soualhine, H., et al. Mycobacterium bovis bacillus Calmette-Guerin secreting active cathepsin S stimulates expression of mature MHC class II molecules and antigen presentation in human macrophages. J Immunol. 179 (8), 5137-5145 (2007).
- Bubb, M. O., Green, F., Conradie, J. D., Tchernyshev, B., Bayer, E. A., Wilchek, M. Natural antibodies to avidin in human serum. ImmunolLett. 35 (3), 277-280 (1993).
- Petronzelli, F., et al. Therapeutic use of avidin is not hampered by antiavidin antibodies in humans. Cancer Biother Radiopharm. 25 (5), 563-570 (2010).
- Bigini, P., et al. In vivo fate of avidin-nucleic acid nanoassemblies as multifunctional diagnostic tools. ACS Nano. 8 (1), 175-187 (2014).
