Summary
यहां प्रस्तुत संवर्धन और photoetched coverslips पर सटीक reपोजिशनिंग के साथ कई हफ्तों से अधिक कुतर मस्तिष्क स्लाइस के आंतरायिक उच्च संकल्प इमेजिंग के लिए एक संशोधित रोलर ट्यूब विधि है । न्यूरॉन व्यवहार्यता और स्लाइस आकृति विज्ञान अच्छी तरह से बनाए रखे हैं. सेल-प्रकार विशिष्ट अभिव्यक्ति के लिए वायरस का उपयोग कर इस पूरी तरह से संलग्न प्रणाली के आवेदन प्रदान की जाती हैं ।
Abstract
कल्चरल कुतर ब्रेन स्लाइसर न्यूरॉन्स और glia के सेलुलर और आणविक व्यवहार के अध्ययन के लिए उपयोगी होते हैं जो एक ऐसे वातावरण में होते हैं जो वीवो इंटरैक्शन में उनके सामान्य से कई बनाए जाते हैं. ट्रांसजेनिक माउस लाइनों की एक किस्म या वायरल वैक्टर के उपयोग से प्राप्त स्लाइसें की अभिव्यक्ति के लिए फ्लोरोसेंट टैग प्रोटीन या रिपोर्टर जंगली प्रकार में मस्तिष्क स्लाइसें प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा उच्च संकल्प इमेजिंग के लिए अनुमति देते हैं । कई तरीकों इमेजिंग मस्तिष्क स्लाइस के लिए विकसित किया गया है, हालांकि लंबे समय अवधि के दौरान लाइव स्लाइस में विशिष्ट कोशिकाओं के दोहराव उच्च संकल्प इमेजिंग प्रदर्शन करने की क्षमता के साथ टुकड़ा संस्कृति के संयोजन समस्याओं उत्पंन है । यह विशेष रूप से सच है जब वायरल वैक्टर exogenous प्रोटीन की अभिव्यक्ति के लिए उपयोग किया जाता है के बाद से यह सबसे अच्छा एक बंद प्रणाली में किया जाता है उपयोगकर्ताओं की रक्षा और पार संक्रमण को रोकने के । सरल रोलर ट्यूब मस्तिष्क स्लाइस संस्कृति विधि है कि एक संलग्न प्रणाली में कई हफ्तों से अधिक स्लाइस के दोहराव उच्च संकल्प इमेजिंग के लिए अनुमति के लिए किए गए संशोधनों की सूचना दी है । photoetched coverslips पर संवर्धन स्लाइसें तेजी से और ठीक करने के लिए फिड्यूशियल के निशान का उपयोग परमिट समय से पहले और अलग उपचार के बाद छवि को समान क्षेत्र के लिए मंच की स्थिति । उदाहरण इस विधि के उपयोग के लिए विशिष्ट ंयूरॉंस धुंधला और अभिव्यक्ति के साथ संयुक्त हिप्पोकैम्पस स्लाइस वास्तुकला में परिवर्तन का पालन करने के लिए, फ्लोरोसेंट प्रोटीन की वायरल मध्यस्थता न्यूरॉन अभिव्यक्ति, और cofilin विकृति के विकास के लिए दिखाए जाते हैं, जो पहले oligomers amyloid-β (Aβ) पेप्टाइड के साथ स्लाइस उपचार के जवाब में अल्जाइमर रोग (AD) के हिप्पोकैंपस में मनाया गया था ।
Introduction
असंबद्ध ंयूरॉंस की प्राथमिक संस्कृति कुतर मस्तिष्क के क्षेत्रों से शोधकर्ताओं द्वारा प्रयोग किया जाता एक महत्वपूर्ण उपकरण रोग फंसा उत्तेजनाओं के लिए प्रतिक्रियाओं का पालन है । हालांकि, इस तरह के अध्ययनों से केवल 2d में और उनके glial समर्थन प्रणाली के बिना ंयूरॉंस में देखने का नुकसान है । इसके अलावा, जब तक बहुत उच्च घनत्व की शर्तों के तहत हो (६४० ंयूरॉंस/mm2 या सतह क्षेत्र के बारे में 16%) जिसमें यह एक dendrite या axon के यादृच्छिक वृद्धि का पालन करने के लिए अपने सेल शरीर से एक छोटी दूरी से अधिक के लिए असंभव हो जाता है, हिप्पोकैम्पस 4 सप्ताह से अधिक न्यूरॉन व्यवहार्यता काफी1गिरावट आती है, उम्र से संबंधित विकृतियों के विस्तारित अध्ययन के लिए असंबद्ध संस्कृतियों के उपयोग को सीमित. कुतर मस्तिष्क से तैयार स्लाइस की संवर्धन एक आकर्षक विकल्प है जो हफ्तों या महीनों के लिए एक संगठित सेल वास्तुकला और व्यवहार्यता को बनाए रखने के द्वारा इन सीमाओं पर काबू पाता है । स्लाइस संस्कृति में कुतर मस्तिष्क के कई विभिंन क्षेत्रों को बनाए रखने के लिए शर्तें2वर्णित किया गया है ।
दो प्रमुख तरीकों व्यापक रूप से मस्तिष्क स्लाइस की लंबी अवधि के संस्कृति के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं: हवा में झिल्ली पर संवर्धन-तरल इंटरफेस3 या सील ट्यूबों में coverslips पर संवर्धन को वातन4प्रदान करने के लिए एक रोलर मशीन में घुमाने की अनुमति दी । झिल्ली पर कल्चरित स्लाइसें सीधे उच्च संकल्प प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी एक ईमानदार माइक्रोस्कोप और पानी विसर्जन उद्देश्यों5का उपयोग कर के साथ imaged किया जा सकता है । वैकल्पिक रूप से, स्लाइस झिल्ली पर प्रसंस्कृत गिलास नीचे व्यंजन को हस्तांतरित किया गया है वृक्ष के अच्छे संकल्प को प्राप्त करने के लिए एक औंधा माइक्रोस्कोप का उपयोग कर स्पिन6. हालांकि, इमेजिंग झिल्ली पर हो स्लाइस के दोनों तरीकों खुले सिस्टम है कि मध्यम परिवर्तन की आवश्यकता होती है और अक्सर रोधी और/या एंटीबायोटिक दवाओं का उपयोग रोकने के लिए या दूषित5,6को कम । हवा मध्यम अंतरफलक पर एक झिल्ली पर स्लाइसें उत्कृष्ट आकृति विज्ञान और अस्तित्व को बनाए रखने, लेकिन उच्च आवर्धन पर दोहराव इमेजिंग के दौरान सटीक स्थानों के लिए लौटने अत्यंत कठिन है जब तक प्रयोग कोशिकाओं के केवल छोटे समूहों का पालन है एक फ्लोरोसेंट मार्कर व्यक्त । हालांकि झिल्ली पर बड़े हो गए transgenes के वायरल मध्यस्थता अभिव्यक्ति के साथ इस्तेमाल किया गया है5,6, एक संलग्न संस्कृति प्रणाली के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं कि कुछ वायरल वैक्टर के लिए नियोजित किया जा सकता है । फ्लोरोसेंट टैग प्रोटीन और सेल फिजियोलॉजी के पत्रकारों को व्यक्त । इसके अलावा, विसर्जन उद्देश्यों के नमूने है कि संस्कृति में5के बाद किया जाएगा के बीच संदूषण की आवश्यकता होती है । एक झिल्ली इंटरफेस संस्कृतियों के प्रमुख आवेदन उच्च संकल्प इमेजिंग इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी के साथ एक समय अंक7पर संयोजन है ।
प्लास्टिक ट्यूब के अंदर coverslips के साथ रोलर ट्यूब विधि coverslip को हटाने के बिना किसी भी इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी या उच्च संकल्प इमेजिंग की अनुमति नहीं है । इस प्रकार, यह विधि सबसे अधिक बार लंबी अवधि के अध्ययन के लिए लागू की गई है जिसमें पद-निर्धारण टिप्पणियों को८बनाया गया है. यहां वर्णित एक तरीका है कि रोलर ट्यूब संस्कृति तकनीक का इस्तेमाल लेकिन coverslips पर स्लाइस के साथ drilled बाहर ट्यूबों कि दोहराया जा सकता है के रूप में लंबे समय के रूप में संस्कृतियों बनाए रखा जाता है । संलग्न प्रणाली इमेजिंग के लिए कोई मध्यम परिवर्तन की आवश्यकता है और उपयोग photoetched coverslips फिड्यूशियल के निशान है कि उच्च आवर्धन पर इमेजिंग की अनुमति प्रदान करने के लिए, दिनों या हफ्तों के बाद, सटीक पहले imaged क्षेत्रों ।
हम इस विधि को कुतर हिप्पोकैंपस, स्मृति और सीखने में शामिल एक प्रमुख मस्तिष्क क्षेत्र में परिवर्तन की जांच करने के लिए लागू होते हैं । कुतर हिप्पोकैंपस अक्सर संज्ञानात्मक हानि के विकास के दौरान मनाया रोग या उम्र से संबंधित परिवर्तन के लिए एक मॉडल के रूप में अध्ययन किया जाता है9, जैसे कि विज्ञापन में होते हैं । हमारी विधि विशेष रूप से अच्छी तरह से रोग परिवर्तन है कि पर्यावरण परिवर्तन के जवाब में समय के साथ एक टुकड़ा के भीतर विकसित अध्ययन करने के लिए अनुकूल है, Aβ पेप्टाइड्स में वृद्धि के रूप में, जो विज्ञापन की विशेषता है8. मानव और मूषक विज्ञापन मस्तिष्क के साथ जुड़े एक विकृति cofilin-actin समुच्चय और छड़ की उपस्थिति है, जिसमें cofilin और actin एक 1:1 दाढ़ अनुपात में कर रहे है तंतुओं के बंडल युक्त उत्तरार्द्ध10,11, 12. छड़ Aβ उपचार के बाद चूहे हिप्पोकैंपस के निश्चित स्लाइस में मनाया गया है, साथ ही साथ एक जीवित कुतर मस्तिष्क टुकड़ा व्यक्त cofilin-GFP हाइपोक्सिया8के अधीन है, और वे विज्ञापन में देखा synaptic शिथिलता के लिए योगदान कर सकते है और स्ट्रोक । यहां हम इस नए संवर्धन विधि का उपयोग करने के लिए व्यक्त exogenous chimeric फ्लोरोसेंट प्रोटीन अलग वायरस द्वारा शुरू की स्लाइस के भीतर समय पाठ्यक्रम और वितरण का पालन करें । हम तो एक cofilin रिपोर्टर के ंयूरॉन विशिष्ट अभिव्यक्ति का उपयोग घुलनशील Aβ oligomers (Aβo) के साथ उपचार के जवाब में हिप्पोकैम्पस स्लाइस में cofilin रॉड और समग्र विकृति के विकास का पालन करने के लिए निर्माण ।
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Protocol
पशु उपयोग अनुमोदित प्रजनन और पशु उपयोग प्रोटोकॉल है कि पशु देखभाल और कोलोराडो राज्य विश्वविद्यालय के उपयोग के दिशा निर्देशों के अनुरूप इस प्रकार है ।
नोट: नीचे दिए गए प्रोटोकॉल का वर्णन करता है तैयारी और दीर्घकालिक मशीन और हिप्पोकैम्पस स्लाइस के आंतरायिक इमेजिंग के लिए संस्कृति विधि । एक एकल हिप्पोकैम्पस स्लाइस एक प्लाज्मा थक्का का उपयोग कर एक विशेष रूप से तैयार photoetched coverslip से जुड़ा हुआ है, और फिर coverslips एक रोलर मशीन में बनाए रखा है, जो एक ड्रिल आउट रोलर ट्यूब, के सपाट पक्ष पर बंद कर रहे हैं । प्लाज्मा थक्के फ्लोरोसेंट प्रोटीन अभिव्यक्ति और उच्च संकल्प इमेजिंग के लिए वायरल संक्रमण से पहले plasmin के साथ भंग कर रहे हैं । एक फ्लोरोसेंट ंयूरॉन महत्वपूर्ण डाई स्लाइस के भीतर छवि ंयूरॉंस के लिए प्रयोग किया जाता है ।
1. रोलर ट्यूब रैक की तैयारी
- स्केल पट्टी पर दिखाए गए आकार के लिए मुद्रित आरेख 1में दिखाए गए टेंपलेट का उपयोग करें । एक कील के साथ, पंच छोटे छेद (एक ठीक बिंदु मार्कर के लिए काफी बड़े) छेद पर केंद्रित टेंपलेट में ।
- एक 15 सेमी टिशू कल्चर डिश (14 सेमी की नाममात्र व्यास) के तल पर टेम्पलेट सेट और छेद की स्थिति को चिह्नित । एक दूसरे पकवान पर इस दोहराएं ।
- ड्रिल बिट्स के साथ प्लास्टिक पर उपयोग के लिए डिजाइन, एक षट्कोण सरणी (४.८ सेमी केंद्र के लिए केंद्र) में प्रत्येक डिश पर छह १.५ cm व्यास छेद ड्रिल डिश के किनारे से छेद केंद्रों २.५ सेमी के साथ । ड्रिल तीन छेद (व्यास में 3 मिमी) बढ़त है कि चित्रा 1एमें दिखाया के रूप में बड़े छेद में से दो के बीच equidistantly रखा जाता है से 12 मिमी.
- प्रत्येक डिश के नीचे से एक दूसरे का सामना करना पड़ के साथ, एक फ्लैट वॉशर के साथ एक २.५ इंच लंबी मशीन पेंच (3/16 इंच व्यास) एक दूसरे फ्लैट वॉशर, पॉलीथीन टयूबिंग (स्पेसर, ४.७ सेमी) का एक टुकड़ा के बाद छोटे छेद में से एक के माध्यम से जगह, एक और फ्लैट वॉशर , दूसरा ऊतक संस्कृति पकवान, एक फ्लैट वॉशर, एक ताला लगा वॉशर, और एक नट ।
- दोहराएं अंय दो मशीन शिकंजा पर १.४ कदम है, और केवल ढीला कस जब तक सभी मशीन शिकंजा जगह में हैं । फिर मेवे को सुरक्षित रूप से कस लें ।
- काम grommets (5/16 इंच मोटी, 5/8 इंच छेद व्यास) नीचे पकवान के छेद में अंतिम रोलर ट्यूब रैक प्राप्त करने के लिए (चित्रा 1बी; जगह में दो ट्यूबों के साथ दिखाया गया है) । एक अद्वितीय संख्या के साथ प्रत्येक रैक पर एक स्टीकर रखें ।
2. रोलर ट्यूबों और Coverslips की तैयारी
- बनाने के जिग के लिए ड्रिलिंग छेद में रोलर ट्यूबों
- ड्रिल एक १.५ cm छेद 8 सेमी एक 2 x 4 x ५.५ इंच लकड़ी के ब्लॉक के एक कोण पर इस तरह की है कि रोलर ट्यूब के फ्लैट के पक्ष में लगभग ब्लॉक जब डाला (चित्रा 2) के साथ समानांतर हो जाएगा के केंद्र की ओर ।
- छेद दोनों को चौड़ा करने के लिए एक गोल लकड़ी फ़ाइल का उपयोग विस्तार और छेद ट्यूब प्रविष्टि की अनुमति के लिए (रोलर ट्यूबों थोड़ा टोपी अंत के पास व्यास में बड़ा कर रहे हैं) (चित्रा 2बी) ।
- एक १.५ cm व्यास ऊर्ध्वाधर छेद, ब्लॉक के पक्ष से ५.५ सेमी ड्रिल, और साइड होल (चित्रा 2सी) पर केंद्रित ।
- जब पक्ष छेद काफी पतला है, एक रोलर ट्यूब है कि वांछित जगह पर चिह्नित करने के लिए टुकड़ा के लिए छेद केंद्र और ट्यूब की स्थिति तो चिह्नित जगह १.५ सेमी ऊर्ध्वाधर छेद में केंद्रित है डालें ।
- ट्यूब निकालें और ट्यूब के अंत करने के लिए घटनास्थल से दूरी को मापने । मार्क जिग में छेद के केंद्र से इस दूरी और एक कील डालने के लिए सही ढंग से ड्रिलिंग के लिए ट्यूब की स्थिति को रोकने के लिए ( चित्रा 2में तीरसी) ।
- एक hacksaw का उपयोग करने के लिए चोट को रोकने के लिए लकड़ी ब्लॉक की सतह के साथ फ्लश कील काट ।
- जिग के तल पर स्प्रिंग क्लिप्स जोड़ें अगर वहां स्लॉट के साथ एक ड्रिल प्रेस है कि यह लंगर डाले जाने की अनुमति (चित्रा 2डी काला तीर) । अंयथा, जिग को सुरक्षित रूप से ड्रिल प्रेस पर रखने के लिए सी-clamps का उपयोग करें ।
- ऊपर वर्णित जिग का उपयोग करने के लिए पकड़ और एक फ्लैट की स्थिति फ्लैट पक्ष के साथ 11 सेमी प्लास्टिक संस्कृति ट्यूब ऊपर (चित्रा 2ए), ड्रिल के नीचे से केंद्र १.० सेमी के साथ एक 6 मिमी व्यास छेद और ट्यूब के पक्षों के बीच केंद्रित ।
नोट: प्लास्टिक के लिए बनाया गया एक ड्रिल बिट इस्तेमाल किया जाना चाहिए । - एक कुंडा गड़गड़ाहट उपकरण के साथ, छेद के किनारों को चिकना (चित्रा 2ई) और छेद के अंदर किनारे पर 4 खांचे बनाने (चित्रा 2ई, इनसेट) रोटेशन के दौरान छेद के draining की सुविधा के लिए ।
- एक 12 मिमी छेद पंच के साथ, गैर विषैले डबल पक्षीय चिपकने वाला सिलिकॉन रबर शीट्स से 12 मिमी व्यास डिस्क में कटौती । एक मानक एक छेद कागज पंच (6 मिमी व्यास) का उपयोग करना, प्रत्येक डिस्क के केंद्र में एक छेद करते हैं ।
- ७०% इथेनॉल के साथ ड्रिल्ड ट्यूबों कुल्ला, हवा उंहें एक जैविक सुरक्षा कैबिनेट में शुष्क, और ट्यूब और यूवी लैंप के तहत ४० मिनट के लिए छिद्रित चिपकने वाला डिस्क निष्फल (30 डब्ल्यू ७० सेमी औसत दूरी पर) जैविक सुरक्षा मंत्रिमंडल में ।
- सभी उजागर सतहों निष्फल रहे हैं ताकि 20 मिनट के बाद ट्यूबों और डिस्क की स्थिति । बाँझ शर्तों के तहत, एक चिपकने वाला डिस्क से सफेद समर्थन छील और एक ट्यूब के बाहर करने के लिए सिलिकॉन रबर प्रत्यय, छेद संरेखित (चित्रा 2एफ) ।
चेतावनी: यूवी जोखिम से बचने के लिए, आंख संरक्षण पहनते हैं और यूवी चिराग पर मोड़ से पहले कैबिनेट बंद । - साफ 12 मिमी व्यास photoetched (१०० केंद्र गिने 1 मिमी चौकों) जर्मन ग्लास coverslips । संदंश और निरपेक्ष इथेनॉल में डुबकी के साथ धीरे coverslips पकड़ो, पानी के बाद, निरपेक्ष इथेनॉल फिर से पीछा किया, और अंत में एक लौ में coverslips डुबकी को बंद इथेनॉल जला । coverslips को शांत करने की अनुमति दें ।
- संदंश के साथ coverslips होल्डिंग, 2% 3 में डुबकी-aminopropyltriethoxysilane के लिए एसीटोन में 10 एस कुल्ला coverslips पानी के साथ ultrapure और हवा शुष्क करने की अनुमति ।
- एक जैविक सुरक्षा कैबिनेट के अंदर बाँझ फिल्टर कागज पर coverslips सेट और यूवी प्रकाश पर बारी. 20 मिनट के लिए coverslips के प्रत्येक पक्ष बेनकाब ।
चेतावनी: यूवी जोखिम से बचने के लिए, आंख संरक्षण पहनते हैं और यूवी चिराग पर मोड़ से पहले कैबिनेट बंद ।
३. हिप्पोकैम्पस स्लाईस वडा
- विच्छेदन शुरू करने से पहले, ऊतक हेलिकॉप्टर के लिए डबल धार उस्तरा ब्लेड के आधा तैयार करते हैं । ब्लेड लंबाई ध्यान से उंगलियों और आधे में तस्वीर के साथ गुना ।
- एसीटोन के साथ ब्लेड आधा कुल्ला उंहें साफ करने के लिए एक कपास झाड़ू का उपयोग कर, निरपेक्ष इथेनॉल और हवा सुखाने में धोने के बाद ।
नोट: मस्तिष्क स्लाइस संस्कृति प्रोटोकॉल माउस या चूहे तनाव या जीनोटाइप से स्वतंत्र है । विभिंन आनुवंशिक पृष्ठभूमि के साथ कई ट्रांसजेनिक माउस लाइनों का इस्तेमाल किया गया है ।
- संदंश के साथ, छंटनी मस्तिष्क पीछे की ओर पकड़ और स्थिरता के लिए पेट्री डिश के पक्ष के खिलाफ ventral पक्ष । धीरे sagittal midline के आसपास मेनिन्जेस दूर तंग और midbrain एक ठीक Dumont #5 संदंश (चित्रा 3सी, धराशाई सर्कल) का उपयोग कर ऊतक हटाने ।
- यह खुला (चित्रा 3सी, लाइनों डैश्ड) फैल करने के लिए मस्तिष्क के पक्ष के साथ दो कटौती बनाओ । एक बार मस्तिष्क पृष्ठीय पक्ष नीचे रखा और खुला फैल रहा है, हिप्पोकैम्पस विदर (चित्रा 3डी, तीर) दिखाई जानी चाहिए ।
- polychlorotrifluoroethylene प्लास्टिक की फिल्म का एक टुकड़ा करने के लिए प्रसार खुले मस्तिष्क हस्तांतरण और यह एक ऊतक हेलिकॉप्टर के मंच पर टुकड़ा करने की क्रिया के लिए स्थिति । GBSS/ग्लूकोज के साथ ब्लेड गीला और ~ ३०० µm मोटी स्लाइस में हिप्पोकैंपस काटना ।
- एक हस्तांतरण पिपेट के साथ, एक ताजा ६० mm GBSS/ग्लूकोज (चित्रा 3ई) युक्त पकवान में प्लास्टिक की फिल्म से कटा हुआ मस्तिष्क फ्लश । धीरे से चुटकी और दूर तंग, ठीक इत्तला दे दी संदंश के साथ, शेष मेनिन्जेस और अन्य गैर हिप्पोकैम्पस ऊतक (चित्रा 3एफ) स्लाइस से (चित्रा 3जी, एच).
4. स्लाइस चढ़ाना
- एक बार स्लाइस प्राप्त किया गया है, एक तैयार coverslip के photoetched पक्ष के केंद्र पर चिकन प्लाज्मा के 2 µ एल जगह है । एक 3-4 mm व्यास हाजिर प्राप्त करने के लिए थोड़ा प्लाज्मा फैला ।
नोट: photoetched पक्ष coverslip के ऊपर की ओर है जब एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के माध्यम से देखा ऐसी है कि संख्या सही ढंग से उंमुख हैं । - एक बाँझ संकीर्ण टिप रंग के साथ 1 मस्तिष्क टुकड़ा स्थानांतरण (चित्रा 4ए) प्लाज्मा स्थान (चित्रा 4बी) करने के लिए. GBSS/ग्लूकोज से स्लाइस उठाने के दौरान रंग टिप पर स्लाइस रखने के लिए बंद संदंश का उपयोग करें ।
- coverslip पर प्लाज्मा स्थान के लिए रंग स्पर्श, और बंद संदंश के साथ, coverslip पर टुकड़ा धक्का ।
- एक अलग ट्यूब में thrombin के २.५ µ l के साथ प्लाज्मा के २.५ µ l को मिलाएं । जल्दी से अधिक इस मिश्रण के २.५ µ एल जगह और टुकड़ा के आसपास और प्लास्टिक ऊपर और धीरे से इसे मिश्रण (चित्रा 4बी) ।
नोट: प्लाज्मा 10-15 एस के भीतर थक्का होगा, तो यह जल्दी से किया जाना चाहिए । स्लाइस आसंजन एक समस्या है, तो 5 µ एल thrombin के साथ 5 µ एल प्लाज्मा मिश्रण और टुकड़ा पर 4-5 µ एल का उपयोग करें, ताकि टुकड़ा coverslip पर फ्लैट झूठ है मिश्रण के बाद कुछ को हटाने । - पहले एक रोलर ट्यूब करने के लिए चिपका सिलिकॉन रबर चिपकने वाला के उजागर पक्ष से स्पष्ट प्लास्टिक को हटाने और छेद (चित्रा 4) के भीतर चिपकने वाला संरेखित स्लाइस पर मस्तिष्क टुकड़ा के साथ coverslip जगह है ।
- आसंजन को सुनिश्चित करने के लिए, नरम लागू, यहां तक कि coverslip नीचे समान रूप से दबाकर अंगूठे के साथ coverslip करने के लिए दबाव और के बारे में 1 मिनट के लिए पकड़ जबकि यह जैविक सुरक्षा कैबिनेट के लिए स्थानांतरित ।
- एक जैविक सुरक्षा कैबिनेट में, ०.८ मिलीलीटर पूरा Neurobasal के एक संस्कृति मध्यम (सामग्री की तालिका) प्रत्येक ट्यूब (चित्रा 4डी) के लिए जोड़ें ।
- एक बाँझ कपास के माध्यम से एक 5% सह2/९५% हवा मिश्रण प्रवाह-एक क्लैंप द्वारा सुरक्षित रूप से आयोजित पाश्चर पिपेट खामियों को दूर किया । गैस मिश्रण के साथ रोलर ट्यूब फ्लश और तेजी से ट्यूब टोपी के रूप में यह पिपेट चारों ओर से वापस ले लिया है ।
- लेबल टुकड़ा संख्या और रैक संख्या के साथ ट्यूबों । एक रोलर रैक में डालें ट्यूबों, यह सुनिश्चित करने के वे ज्यामितीय संतुलित कर रहे हैं । यदि ट्यूबों की एक विषम संख्या है, संतुलन के लिए ट्यूबों जोड़ें ।
- एक ३५ डिग्री सेल्सियस रोलर मशीन के बारे में 10-13 RPH में रोलर रैक मोड़ (चित्रा 4ई) के साथ रैक प्लेस । ट्यूबों के तल में मध्यम रखने के लिए, एक बोर्ड पर अपने सामने स्थापना द्वारा मशीन वापस लगभग 5 डिग्री झुकाव ।
- एक स्प्रेडशीट, जो टुकड़ा उपचार और प्रेक्षण तिथियों के सभी जानकारी रिकॉर्ड करने के लिए प्रयोग किया जाता है पर टुकड़ा और ट्यूब संख्या दर्ज करें ।
- संस्कृति में लगभग 6 दिन पर, प्रत्येक ट्यूब के लिए सक्रिय plasmin के 1 µ एल (०.००२ यू) जोड़ें ।
- थक्के पूरी तरह से भंग (आमतौर पर कुछ ही घंटों के भीतर) के बाद, मध्यम निकालें और plasmin बिना ताजा माध्यम से इसे बदलने के लिए । यदि आवश्यक हो, स्लाइसें रातोंरात plasmin के साथ मशीन और मध्यम अगले दिन बदल सकता है ।
- स्लाइस आमतौर पर प्रयोगों में उपयोग करने से पहले कम से 7-10 दिनों के लिए मशीन हैं । महाप्राण मध्यम और दिन पर यह जगह 3 या 4, फिर 7 दिन पर, और उसके बाद हर 7 दिन ।
5. Transgene अभिव्यक्ति के लिए वायरल वैक्टर की तैयारी
नोट: स्लाइस संस्कृतियों के न्यूरॉन्स में transgenes की अभिव्यक्ति या तो आनुवंशिक रूप से इंजीनियर कुतर से दिमाग का उपयोग करके या संयोजक प्रतिकृति की कमी वायरस के साथ संक्रमण द्वारा transgene शुरू करने से हासिल की है.एडिनोवायरस (ए वी), adeno-जुड़े वायरस (AAV), और संयोजक lentivirus वैक्टर सभी मस्तिष्क स्लाइस में विभिंन फ्लोरोसेंट प्रोटीन हिप्पोकैम्पस की अभिव्यक्ति के लिए हमारे chimeras स्लाइस संस्कृतियों में इस्तेमाल किया गया है ।
- 13,14कहीं वर्णित विधियों के अनुसार ब्याज की शाही सेना व्यक्त करने के लिए प्रतिकृति आपुर्ति AV तैयार करें । Titer एक वायरल व्यक्त प्रोटीन के रूप में एक एंटीबॉडी का उपयोग कर सीरियल कमजोर पड़ने विधि द्वारा संक्रामक U/एमएल के लिए वायरस के रूप में वर्णित14। cofilin समुच्चय और cofilin-actin रॉड गठन का निरीक्षण करने के लिए, cofilin-R21Q-mRFP सीडीएनए (प्लाज्मिड #51279)16का उपयोग ।
नोट: synapsin 1 प्रमोटर के लिए एक उत्कृष्ट विकल्प है ंयूरॉन विशिष्ट अभिव्यक्ति15, जबकि cytomegalovirus प्रमोटर कई सेल प्रकार में उच्च अभिव्यक्ति स्तर ड्राइविंग के लिए उपयोगी है13. - के साथ या एक सहायक प्लाज्मिड के बिना, HEK293 पैकेजिंग सेल, जो वायरल E1 जीन की आपूर्ति में, के रूप में पहले वर्णित17,18, ब्याज की जीन और एक प्रतिनिधि टोपी प्लाज्मिड, युक्त हस्तांतरण प्लाज्मिड के सह अभिकर्मक द्वारा AAV तैयार करें ।
नोट: संयोजक AAV भी मेजबान सेल जीनोम में लक्षित प्रविष्टि के लिए बनाया जा सकता है19। स्थानांतरण प्लाज्मिड के लिए, हम एक सी के साथ मानव cofilin 1 टर्मिनल mRFP1 प्रतिदीप्ति प्रोटीन टैग (प्लाज्मिड #50856) एक synapsin प्रवर्तक में क्लोन-AAV प्लाज्मिड बहाव से युक्त कैल्शियम सेंसर GCaMP5G20का उपयोग करें । P2A स्व-सट पेप्टाइड अनुक्रम एंकोडिंग डीएनए का एक टुकड़ा GCaMP5G और cofilin के बीच पीसीआर द्वारा डाला जाता है-आरएफपी स्थानांतरण प्लाज्मिड की तैयारी के दौरान एक एकल AAV प्रतिलिपि से दोनों प्रोटीन की अभिव्यक्ति प्रदान करने के लिए21। - सह द्वारा संयोजक lentivirus वैक्टर तैयार स्थानांतरण प्लाज्मिड जीन या ब्याज और एकीकरण संकेतों के सीडीएनए युक्त, साथ एक तीसरी पीढ़ी lentivirus पैकेजिंग मिश्रण है कि वायरल चुप, पोल, फिरना, और vsv-जी जीन विभाजित के साथ तीन अलग plasmids22,23.
- स्थानांतरण प्लाज्मिड के लिए, एक एकल कदम क्लोनिंग प्रणाली24 का उपयोग करने के लिए synapsin प्रवर्तक और cofilin-R21Q-mRFP सीडीएनए (प्लाज्मिड #51279) से pLKO. 1-GFP (प्लाज्मिड #30323), synapsin प्रमोटर और cofilin-R21Q-mRFP की जगह को इकट्ठा hPGK प्रवर्तक तथा GFP सीडीएनए क्रमशः ।
- Transfect कैल्शियम फॉस्फेट द्वारा HEK293T कोशिकाओं में अंतिम प्लाज्मिड के रूप में पहले वर्णित23।
- ४ १० मुख्यमंत्री व्यंजन से मध्यम ले लीजिए, 150K-cutoff केंद्रापसारक संकेन्द्रित का उपयोग कर ५०० µ एल करने के लिए ध्यान केंद्रित, और तरल नाइट्रोजन में त्वरित ठंड के बाद छोटे aliquots में-८० डिग्री सेल्सियस पर अंतिम lentivirus की दुकान. केवल एक बार कोशिकाओं को संक्रमित करने के लिए एक aliquot गल ।
- प्रत्येक वायरस के विभिंन संस्करणों के साथ संक्रमण के बाद transgenes की अभिव्यक्ति का पालन करने के लिए विभिंन स्लाइस संस्कृतियों की एक संख्या की स्थापना करके वांछित अभिव्यक्ति की डिग्री प्राप्त करने के लिए तैयार प्रकार की मात्रा को निर्धारित empirically का निर्धारण ।
नोट: सामान्यतया, 1-10 µ l वायरस का प्रति स्लाइस उपयोग किया जाता है ।
6. स्लाइस उपचार
- वायरस के साथ स्लाइस संक्रमण
- एक जैविक सुरक्षा के लिए मंजूरी दे दी जैविक सुरक्षा के स्तर पर वायरस के काम के लिए कैबिनेट में कार्य करना वेक्टर के लिए उपयुक्त, मिश्रण एक aliquot वायरस (आमतौर पर 1-10 µ l) के साथ ०.८ मिलीलीटर की पूर्ण माध्यम ।
- एक संग्रह जाल में एक बाँझ पाश्चर पिपेट का उपयोग कर स्लाइस से मध्यम महाप्राण ब्लीच युक्त. एक द्वितीयक ट्रैप हमेशा पहले ट्रैप और वैक्यूम स्रोत के बीच किया जाता है ।
- वायरस युक्त aliquot ऊपर तैयार के साथ इस माध्यम की जगह, एक रैक के लिए संस्कृति ट्यूबों वापसी, और मशीन में जगह है ।
- जैविक सुरक्षा कैबिनेट में वायरस के साथ स्लाइस की मशीन के 2-5 दिनों के बाद, एक बाँझ हस्तांतरण पिपेट के साथ वायरस युक्त माध्यम को हटाने और यह एक अनुमोदित एंटीवायरल एजेंट से युक्त बोतल में जगह वायरस को मारने के लिए ।
- महत्वपूर्ण डाई के साथ ंयूरॉंस की धुंधला
- तैयार और aliquots फ्लोरोसेंट ंयूरॉन महत्वपूर्ण डाई25 के त्वरित ठंड से 4 µ एल तरल नाइट्रोजन में aliquots की एकाग्रता में १०० µ मीटर और इन पर स्टोर-20 ° c. एक बार से अधिक डाई फ्रीज/
- प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा दृश्य के लिए न्यूरॉन्स लेबल करने के लिए, गल एक aliquot के ंयूरॉन महत्वपूर्ण डाई और पतला करने के लिए 4 मिलीलीटर में पूरा Neurobasal मध्यम (अंतिम डाई एकाग्रता है १०० एनएम).
- आकांक्षा द्वारा स्लाइस से मध्यम निकालें (या एक हस्तांतरण पिपेट के साथ अगर माध्यम वायरस होता है) और यह १०० एनएम ंयूरॉन महत्वपूर्ण डाई युक्त माध्यम के ०.८ मिलीलीटर के साथ बदलें । मशीन में रोलर उपकरण के लिए स्लाइसें लौटें ।
- 2 एच के लिए स्लाइसें मशीनिंग के बाद, डाई-युक्त माध्यम महाप्राण और यह एक जैविक सुरक्षा कैबिनेट में ताजा पूरा माध्यम के ०.८ मिलीलीटर के साथ प्रतिस्थापित ।
नोट: महत्वपूर्ण डाई के साथ स्लाइस में ंयूरॉंस की लेबलिंग मशीन के कई घंटे की आवश्यकता है । पहली छवियों आमतौर पर डाई उपचार के बाद 24 ज लिया जाता है । हालांकि न्यूरॉन्स विशेष रूप से लेबल कर रहे हैं, वहाँ पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति कि 2-3 दिनों में गिरावट आती है बेहतर न्यूरॉनिक इमेजिंग देने के लिए. ७२ एच के बाद महत्वपूर्ण डाई गिरावट की तीव्रता । - समय के साथ स्लाइस आकृति विज्ञान में परिवर्तनों का अनुसरण करने के लिए, स्लाइस को प्रत्येक 7 दिन में पुनर्लेबल करें.
7. स्लाइस इमेजिंग
- एक औंधा माइक्रोस्कोप पर स्लाइस देखें. प्रतिभाशाली प्रतिदीप्ति इमेजिंग के लिए, 24 में इमेजिंग से पहले ज, Phenol लाल पीएच संकेतक के बिना पूरा Neurobasal एक माध्यम के साथ विनिमय संस्कृति माध्यम ।
नोट: प्रयोगों के लिए यहाँ रिपोर्ट, स्लाइस एक औंधा कताई डिस्क फोकल प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप पीजो जेड नियंत्रण और एक संवेदनशील उच्च संकल्प डिजिटल कैमरा के साथ एक रैखिक इनकोडिंग एक्स, वाई स्टेज के साथ सुसज्जित पर देखा जाता है. - टुकड़ा संस्कृति के साथ ट्यूब हस्तांतरण करने के लिए रोलर ट्यूब उपकरण से कस्टम निर्मित ट्यूब धारक (चित्रा 5ए), जो मंच अनुकूलक (चित्रा 5बी) में रखा जाता है के लिए छवि बनाई जा करने के लिए सीधा coverslip रखने के लिए उद्देश्य और लंबे अंतराल पर दोहराए जाने वाले इमेजिंग सत्रों के दौरान समान ओरिएंटेशन में स्लाइस बनाए रखें ।
- स्थिति में ट्यूब पकड़ के लिए मंच एडाप्टर के खिलाफ तंग पर स्लाइडर पुश (चित्रा 5बी).
नोट: ट्यूब धारक, स्टेज एडेप्टर का विवरण, और हीटर पर पहुँचा जा सकता है: https://vpr.colostate.edu/min/custom-machining/roller-tube-holder/.
नोट: फिड्यूशियल चिह्न से इन ऑफ़-सेट स्थितियां समान coverslip स्थान की तुच्छता की अनुमति दें जब स्लाइस imaged है, भले ही फिड्यूशियल चिह्न की मूल x, y सेटिंग परिवर्तन जब ट्यूब या स्टेज एडाप्टर निकाल दिए जाते हैं और बदल दिया जाता है ।
नोट: छवि विमानों आमतौर पर ०.५ µm के अंतराल पर प्राप्त कर रहे है 2 µm, आकार और छवि सुविधाओं के वांछित संकल्प पर निर्भर करता है । एक गुणवत्ता 3 डी छवि के निर्माण की आवश्यकता है कि छवि सुविधाओं के अधिग्रहण के कई विमानों पर विस्तार, और इसलिए छोटे सुविधाओं कल्पना, छोटे अंतराल विमानों के बीच आवश्यक हैं ।
नोट: अधिकांश इमेजिंग सत्रों यहां रिपोर्ट 18 मिनट के तहत किया गया/ हालांकि, हम कुछ स्लाइस दस या उससे अधिक बार है, और यहां तक कि एक ही सत्र में ४० मिनट के रूप में लंबे समय तक टुकड़ा के अस्तित्व में स्पष्ट नुकसान के बिना, ।
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Representative Results
निर्धारित करने के लिए कैसे सही फिड्यूशियल मार्क्स समय के साथ एक ही क्षेत्रों के भीतर एक ही कोशिकाओं reimage करने के लिए उपयोग किया जा सकता है, हम photoetched coverslips (चित्रा 6ए) पर हो स्लाइस की जांच की । न्यूरॉन्स एक महत्वपूर्ण डाई (2 ज के लिए १०० एनएम के साथ धुंधला द्वारा visualized थे, नहीं दाग गैर-न्यूरॉन कोशिकाओं), जो समय पर न्यूरॉन्स से गायब हो जाता है कोशिकाओं को नुकसान पहुँचाए बिना25. हम एक एकल ग्रिड वर्ग में एक फिड्यूशियल निशान की पहचान की (चित्रा 6ए, ख), के एक क्षेत्र पाया महत्वपूर्ण डाई लेबल वाले ंयूरॉंस के बाद 24 ज, फिड्यूशियल निशान से x और y ऑफसेट पदों दर्ज (चित्रा 6बी), और एकत्र, एक 60X उद्देश्य, इस क्षेत्र के फोकल छवि स्टैक का उपयोग लगातार 4 दिनों पर इमेजिंग दोहरा । एक ही स्थान में लिया 30 µm छवि स्टैक की अधिकतम प्रक्षेपण छवियों (चित्रा 6सी-एफ) दिखाया गया है । 4 दिनों में क्षेत्र के भीतर कुछ रूपात्मक परिवर्तन होते हैं, हालांकि समान कोशिकाओं (जिनमें से कई चिह्नित कर रहे हैं) समय के साथ पालन किया जा सकता है. महत्वपूर्ण डाई की प्रतिदीप्ति तीव्रता समय पर गिरावट आई है, लेकिन न्यूरॉन्स अभी भी स्पष्ट रूप से पहचाने गए 4 दिनों के लेबल के बाद. हालांकि सबसे अधिक ंयूरॉन महत्वपूर्ण डाई प्रतिदीप्ति कोशिका के भीतर फैलाना था, कुछ कबरा धुंधला हमेशा मनाया गया था, जो पृष्ठभूमि के रूप में अधिक ध्यान देने योग्य बन गया प्रतिदीप्ति अस्वीकृत । अस्वस्थ स्लाइस में, गैर-न्यूरॉनी कोशिकाओं की एक कबरा धुंधला भी स्लाइस बिगड़ा के रूप में मनाया गया. ये परिणाम दर्शाते हैं कि स्लाइस में पहचाने गए कक्षों को दोहराए जाने वाले फिड्यूशियल चिह्नों का उपयोग करके उन्हें ढूँढने के लिए imaged किया जा सकता है.
लंबी अवधि की संस्कृति के दौरान स्लाइस के भीतर ंयूरॉन संगठन और व्यवहार्यता में समय पर निर्भर परिवर्तन की जांच करने के लिए, हम 5 सप्ताह से अधिक एक ही स्लाइस के बाद, फ्लोरोसेंट ंयूरॉन महत्वपूर्ण डाई के साथ लेबलिंग सप्ताह में एक बार 24 इमेजिंग से पहले एच । कई हफ्तों में इस महत्वपूर्ण डाई के साथ धुंधला के कई दौर समुच्चय के संचय में वृद्धि हुई । न्यूरॉन्स हौसले से मढ़वाया स्लाइस कि प्लाज्मा थक्के में अभी भी थे के भीतर डाई के साथ भरी हुई थी और एक दिन में imaged इन विट्रो (1 DIV) । एक ही स्लाइस फिर से 5 सप्ताह के लिए साप्ताहिक छवि थे । 4x उद्देश्य के साथ एक ही स्लाइस से प्राप्त छवियां (चित्रा 7ए-ई) दिखाया गया है । सीए और डीजी क्षेत्रों की पिरामिडीय कोशिका परतें चमकीले रूप में तब लेबल की जाती हैं जब ४८८ एनएम पर उत्तेजित होते हैं और प्रतिदीप्ति उत्सर्जन में मापा जाता है & #62; ६२० एनएम । 19 स्लाइसें देख के एक 5 सप्ताह की अवधि में, तीन स्लाइस बंद coverslip और दो दूसरों को अपने ठेठ आकृति विज्ञान खो दिया और अपारदर्शी, उनकी मौत का एक संकेत बन गया । इस प्रकार, प्रयोगों के बारे में ७०% की एक जीवित रहने की दर पर विचार किया जाना चाहिए, और अतिरिक्त के लिए विश्लेषण के लिए पर्याप्त संख्या आश्वासन तैयार स्लाइस । स्लाइस ३०० µm के टिशू हेलिकॉप्टर पर नाममात्र की मोटाई की सेटिंग में तैयार किए गए थे । संस्कृति में 5 हफ्तों के बाद, हम एक कताई डिस्क फोकल माइक्रोस्कोप पर एक 40X तेल उद्देश्य के साथ टुकड़ा के माध्यम से coverslip से इमेजिंग ंयूरॉन महत्वपूर्ण डाई-सना हुआ स्लाइस से स्लाइस मोटाई मापा । न्यूरॉन्स के ध्यान की हानि २५७ एनएम के एक औसत पर हुआ (n = 5 स्लाइस प्रति उपयोग कई स्थानों के साथ), का प्रदर्शन है कि बहुत कम स्लाइस के thinning चढ़ाना के समय से हुई थी । हम सही ढंग से चढ़ाना के समय प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा टुकड़ा मोटाई उपाय नहीं है क्योंकि प्लाज्मा थक्का में महत्वपूर्ण डाई फंस फैलाना यह मुश्किल सही स्थिति है जिस पर ध्यान केंद्रित की हानि के उपाय करने के लिए बना दिया था कर सकता है । हालांकि, प्लाज्मा थक्का हटाने के बाद स्लाइस के भीतर न्यूरॉन्स की 3d छवियाँ आसानी से स्लाइस में प्राप्त कर रहे हैं. 21 DIV स्लाइस, चित्रा 7एफमें कम आवर्धन पर दिखाया गया है, एक फोकल माइक्रोस्कोप पर एक 60X उद्देश्य (1 µm कदम) के साथ imaged था 3 दिन ंयूरॉन महत्वपूर्ण डाई के साथ लदान के बाद । एक ६० µm 3 डी छवि फोकल विमानों (चित्रा 7जी) से बनाया गया था । न्यूरॉन्स और उनके neurite प्रक्रियाओं है कि महत्वपूर्ण डाई के साथ लेबल कर रहे हैं 3 डी में पीछा किया जा सकता है. आकृति विज्ञान और 3 डी स्लाइस की संरचना कम से कम 3 महीने में अच्छी तरह से बनाए रखा गया था, और सबसे लंबे समय तक वर्तमान अध्ययन में इस्तेमाल किया गया ।
पहले से छवि की स्थिति की आकृति विज्ञान में बड़े परिवर्तन भी कुछ स्लाइस में हुई, coverslip पर टुकड़ा की है कि आंदोलन का सुझाव जगह ले सकता है. निश्चित रूप से, इमेजिंग के बीच अब अंतराल पर यह निश्चितता के साथ पता करने के लिए और अधिक कठिन हो गया है कि क्षेत्र में कोशिकाओं को पिछले इमेजिंग सत्र में मनाया लोगों के समान थे । इस प्रकार, महत्वपूर्ण डाई-लेबल वाले 60x उद्देश्य के साथ समान स्थान पर अधिग्रहीत स्लाइस के फोकल ढेर के अधिकतम प्रक्षेपण छवियों 4 सप्ताह फैले (चित्रा 8) दिखा कि ंयूरॉंस व्यवहार्यता अच्छी तरह से बनाए रखा है, लेकिन है कि यह है मुश्किल समय के साथ एक विशिष्ट ंयूरॉन की पहचान जब छवियों सत्र के बीच लंबे समय के अंतराल के साथ प्राप्त कर रहे हैं । संभवतः एकाधिक fluorophores के साथ लेबल कोशिकाओं के पैटर्न और अधिक आसानी से मांयता प्राप्त होगा, के रूप में स्थानीयकृत समूहों में कोशिकाओं को जब एक छवि ढेर के माध्यम से स्क्रॉल द्वारा मनाया जाता है ।
हिप्पोकैम्पस स्लाइस के न्यूरॉन्स में exogenous जीन की शुरूआत के लिए विभिन्न वायरल वैक्टर की उपयोगिता का आकलन करने के लिए, हम ए वी, AAV, और संयोजक lentiviral वैक्टर का उपयोग कर स्लाइस infectivity की तुलना में, प्रत्येक अलग फ्लोरोसेंट टैग या का उपयोग कर व्यक्त अभिव्यक्ति को चलाने के लिए विभिंन प्रवर्तकों । ए वी (2 एक्स 107 संक्रामक U/एक मजबूत, गैर सेल विशिष्ट सीएमवी प्रवर्तक के पीछे cofilin mRFP व्यक्त एक चूहा हिप्पोकैम्पस टुकड़ा है कि coverslips पर 9 हफ्तों के कल्चरित किया गया था संक्रमित किया गया । cofilin-mRFP की अभिव्यक्ति 5 दिनों के बाद संक्रमण पर टुकड़ा भर में पाया गया था, एक 4x उद्देश्य के साथ मनाया के रूप में टुकड़ा परिधि के चारों ओर सबसे तीव्र अभिव्यक्ति के साथ (चित्रा 9ए) । स्लाइस के भीतर cofilin-mRFP व्यक्त भी एक 20X उद्देश्य (चित्रा 9बी) के साथ कुछ उज्ज्वल कबरा धुंधला और भी दोनों ंयूरॉंस और गैर में अभिव्यक्ति फैलाना के साथ देखा गया-ंयूरॉन कोशिकाओं । संस्कृति में 17 सप्ताह के बाद (8 सप्ताह के बाद संक्रमण), सहज cofilin-छड़ कुछ कोशिकाओं में गठन किया था, संभवतः जंगली प्रकार के cofilin-mRFP (चित्रा 9सी)26,27के व्यक्त द्वारा संचालित ।
हमने यह भी दर्शाया है कि AAV (1010 कण) को स्लाइस में अभिव्यक्ति के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।AAV के साथ संस्कृति में 9 सप्ताह में संक्रमित स्लाइस की छवियां, जिसमें एक ंयूरॉन विशिष्ट synapsin प्रवर्तक GCaMP5 की अभिव्यक्ति चलाई-cofilin-mRFP के साथ एक स्व-सट P2A पेप्टाइड अनुक्रम के लिंक में अनुवादित polyprotein21, 8 पर कब्जा कर लिया गया सप्ताह के बाद संक्रमण (17 संस्कृति में सप्ताह) । न्यूरॉन्स में व्यक्त GCaMP5 और cofilin-mRFP, कुछ cofilin छड़/समुच्चय का गठन (चित्रा 9डी एफ). छड़ के प्रतिदीप्ति तीव्रता/समुच्चय इतना मजबूत है कि एक फैलाना cofilin के बहुत कम प्रतिदीप्ति-mRFP पूरा संतृप्ति और छड़ के cofilin प्रतिदीप्ति छवि के खिल के बिना मनाया जा सकता था । सहज cofilin छड़ न्यूरॉन्स में दिखाई देते हैं जिसमें जंगली-प्रकार cofilin-फ्लोरोसेंट प्रोटीन chimeras पर किया गया है26,27, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से तनाव में ंयूरॉंस10। एडीनोवायरस के titers के आधार पर, जो infectivity14 के आधार पर निर्धारित किया जाता है और कण गणना AAV titer के निर्धारण के लिए प्रयुक्त होते हैं, के बारे में १०० से ५०० गुना उच्च कण संख्या AAV प्राप्त करने के लिए आवश्यक है लगभग एक ही infectivity/ AV की तुलना में स्लाइस में व्यंजक.
संयोजक lentivirus-स्लाइस में फ्लोरोसेंट प्रोटीन की मध्यस्थता अभिव्यक्ति का पालन करने के लिए, स्लाइसें 6 DIV पर 1, 3, 10, और 30 µ एल aliquots के साथ एक संयोजक lentivirus के ंयूरॉन विशिष्ट अभिव्यक्ति (synapsin प्रमोटर) के लिए संक्रमित थे cofilin-R21Q-mRFP, cofilin-actin रॉड गठन के लिए एक जीवित सेल इमेजिंग जांच के रूप में विकसित16। स्लाइसें 11 div में ंयूरॉन महत्वपूर्ण डाई के साथ लेबल और डाई और cofilin-R21Q-12 और 14 DIV पर mRFP अभिव्यक्ति के लिए विशिष्ट क्षेत्रों में छवि थे । 30 µ एल aliquot वायरस के साथ संक्रमित स्लाइस इमेजिंग के लिए जीवित नहीं था, लेकिन तपसिल स्लाइस वायरस के अन्य संस्करणों के साथ इलाज किया mRFP की एक खुराक पर निर्भर अभिव्यक्ति दिखाया. चित्रा 10 6 और 8 दिनों के बाद संक्रमण पर lentivirus के 1 µ एल और 10 µ एल के साथ संक्रमित स्लाइस की छवियों से पता चलता है. दो अलग स्लाइस के कई क्षेत्रों में महत्वपूर्ण डाई और mRFP अभिव्यक्ति के साथ सह-ंयूरॉंस के दाग के लिए मात्रा थे । lentivirus के 1 µ l से संक्रमित स्लाइस के लिए, के बारे में 28% न्यूरॉन्स 6 दिनों के बाद संक्रमण पर mRFP व्यक्त की, 8 दिनों के बाद संक्रमण से ८५% की वृद्धि. lentivirus के 10 µ l से संक्रमित स्लाइस के लिए, के बारे में ५८% न्यूरॉन्स 6 दिनों के बाद संक्रमण पर mRFP व्यक्त की, 8 दिनों के बाद संक्रमण से ८६% की वृद्धि. इस प्रकार, lentivirus के 1 µ एल 8 दिनों के बाद संक्रमण द्वारा व्यापक स्लाइस infectivity और ंयूरॉंस अभिव्यक्ति प्रदान करने के लिए पर्याप्त था ।
प्रदर्शित करने के लिए कि इस संस्कृति प्रणाली cofilin विकृति के विकास के बाद में उपयोगी है, cofilin व्यक्त करने के लिए lentivirus से संक्रमित स्लाइस-R21Q-mRFP में न्यूरॉन्स अनुपचारित छोड़ दिया गया या विभिन्न सांद्रता (1 µ m, ३३३ एनएम, और १०० एनएम) के साथ इलाज सिंथेटिक मानव Aβ प्रोटीन है कि oligomers के लिए फार्म का28मशीन आया था । पिछले अध्ययनों से परिणाम है कि सिंथेटिक Aβओ प्रेरित cofilin-actin छड़ असंबद्ध हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स के 25% करने के लिए29,30,31में पैदा करते हैं । सभी तीन Aβ के 1 µ एम एकाग्रता के साथ इलाज स्लाइस पहले 24 घंटे में coverslip से ढीला आया, जबकि सभी वाहन स्लाइस (नियंत्रण) और उन ३३३ एनएम और Aβ के १०० एनएम सांद्रता के साथ इलाज किया उन दो हफ्तों के लिए बच गया है कि वे पीछा कर रहे थे । एक ही सेलुलर क्षेत्रों (CA1, CA3, और डीजी) १०० एनएम Aβओ के साथ इलाज एक टुकड़ा में कई दिनों से अधिक छवि (60x उद्देश्य) थे । नियंत्रण स्लाइसें कि 6 div पर lentivirus के साथ synapsin संचालित cofilinR21Q-mRFP के साथ संक्रमित थे 15 div (चित्र 11ए) द्वारा सेलुलर mRFP अभिव्यक्ति फैलाना था । स्लाइसें उजागर १०० एनएम Aβओ पर 14 div और 15 div पर imaged दिखाया है कि cofilin-R21Q-mRFP के वितरण कबरा बन गया, दोनों रॉड आकार संरचनाओं और समुच्चय में प्रदर्शित होने (चित्रा 11बी) । इन संरचनाओं और भी अधिक प्रमुख बन गया 6 Aβ-उपचार के बाद दिन (चित्रा 11सी, जो चित्रा 11बीके रूप में कोशिकाओं का एक ही क्षेत्र है) । कई स्थानों में neurites में अमीर जहां न्यूरॉन सेल सोमा अनुपस्थित रहे हैं (चित्र 11डी), कबरा और रॉड की तरह-cofilinR21Q की arrays-mRFP विकसित (चित्र में तीर 11ग), cofilin के वितरण के समान-actin छड़ पहले संस्कृति29,30,31में Aβ-इलाज न्यूरॉन्स के neurites के भीतर की सूचना दी । इस प्रकार, संवर्धन और मेटाबॉलिज्म हिप्पोकैम्पस स्लाइस के लिए यह नई विधि उपयोगकर्ताओं को उन कक्षों की दीर्घकालिक व्यवहार्यता निर्धारित करने की अनुमति देगी, जिनमें cofilin एग्रीगेट और छड़ रूप और विकास के विभिन्न चरणों में विकृति के reversibility, और आसानी से खुराक-प्रतिक्रिया माप है कि ब्लॉक या एक और अधिक vivo मेंसेलुलर संगठन में cofilin विकृति के गठन रिवर्स सकता है पर प्रदर्शन करते हैं ।
चित्र 1: रोलर ट्यूब रैक की तैयारी । (A) बाहर 15 सेमी ऊतक संस्कृति पकवान नीचे ड्रिलिंग के लिए छेद पदों अंकन के लिए टेंपलेट । यदि आंकड़ा पैमाने पर दिखाया पट्टी के आकार में छपा है, यह बाहर काटा जा सकता है और दिखाया छेद ड्रिलिंग के लिए एक 15 सेमी संस्कृति पकवान पर पदों अंकन के लिए इस्तेमाल किया । (ख) दो ट्यूबों के साथ पूरा रोलर ट्यूब रैक डाला । प्रत्येक रैक एक स्टीकर पर गिने आसानी से रैक के शीर्ष पर दिखाई है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 2 : रोलर संस्कृति ट्यूबों की तैयारी । (एक) ट्यूब में 6 मिमी छेद बाहर ड्रिलिंग के लिए एक ड्रिल प्रेस पर एक जिग में डाला रोलर ट्यूब के सामने देखें । धराशायी लाइन जिग में फ्लैट पक्षीय रोलर ट्यूब की स्थिति से पता चलता है । ट्यूब डाला और छेद पर गठबंधन किया ड्रिल बिट के साथ जिग के अंत दृश्य (ख) । (C) एक 6 mm ड्रिल बिट के साथ रोलर ट्यूबों बाहर ड्रिलिंग के लिए जिग में छेद के शीर्ष दृश्य ।सफेद तीर की स्थिति से पता चलता है कट-बंद कील ट्यूबों के लिए एक बंद के रूप में डाला, और काले डबल लाइनों बिट संरेखण के लिए कर रहे हैं । (घ) स्प्रिंग क्लिप्स (काला तीर) जिग तल पर स्थापित करने के लिए सुरक्षित रूप से यह स्थिति में पकड़ जब ड्रिलिंग ट्यूबों । (ई) छेद बाहर ड्रिलिंग के बाद, किनारों एक गड़गड़ाहट उपकरण के साथ चिकनी और खांचे छेद के भीतर की ओर (इनसेट एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के माध्यम से देखा छेद से पता चलता है) ट्यूब रोटेशन के दौरान छेद से draining मध्यम बढ़ाने के लिए कर रहे हैं । (च) सिलिकॉन रबर चिपकने वाला में एक छेद करने के लिए गठबंधन छेद के साथ संस्कृति ट्यूब, जो करने के लिए coverslip संलग्न किया जाएगा । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 3: हिप्पोकैम्पस मस्तिष्क स्लाइस की तैयारी । दिखा एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के साथ लिया तस्वीरें: (एक) बरकरार माउस मस्तिष्क । forebrain और सेरिबैलम को हटाने के लिए कटौती की स्थिति नीली डैश्ड रेखाओं के रूप में दिखाई जाती हैं । (ख) forebrain और सेरिबैलम को हटाने के बाद । (ग) मस्तिष्क का टुकड़ा बी से पीछे क्षेत्र (सेरिबैलम की ओर) का सामना करना पड़ के साथ ९० ° से फ़्लिप है । डिश के बगल में टुकड़ा पोजिशनिंग midbrain (नीले डैश्ड सर्कल) जो शेष हिप्पोकैंपस, thalamus, और hypothalamus से दूर छेड़ा जा सकता है को हटाने के साथ मदद करता है । संदंश के साथ दो कटौती (नीली डैश्ड लाइनें) शेष हिप्पोकैंपस वाले दोनों गोलार्द्धों से युक्त टुकड़ा फ्लैट को फैलाने की अनुमति देते हैं । (घ) हिप्पोकैम्पस विदर (नीला तीर) के साथ चल रहे रक्त वाहिनियों को दिखाते हुए चपटा मस्तिष्क टुकड़ा । इस ऊतक प्लास्टिक की फिल्म पर रखा गया है और धराशायी लाइन की दिशा में टुकड़ा करने की क्रिया के लिए ऊतक हेलिकॉप्टर को हस्तांतरित । (E) कटा हुआ ऊतक GBSS/ग्लूकोज के लिए वापस जा रहा है के बाद थोड़ा आधे से अधिक हिप्पोकैंपस दिखा । (च) हिप्पोकैंपस के अंतिम विच्छेदन और स्लाइस की सफाई के लिए गैर हिप्पोकैम्पस सामग्री को दूर । (G) अंतिम क्लीन-अप के बाद कई फ़्लोटिंग स्लाइस । (H) coverslip को हस्तांतरण के लिए एक एकल स्लाइस के बढ़े हुए फोटो । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 4 : चढ़ाना और स्लाइसें मशीनिंग । (क) एक माउस हिप्पोकैम्पस स्लाइस से एक रंग की नोक पर संस्कृति डिश से निकाल दिया जाता है संदंश के टिप का उपयोग करने में मदद यह समाधान से मुक्त लिफ्ट । (ख) टुकड़ा एक photoetched के केंद्र में फ्लैट रखा गया है और इलाज 12 मिमी चिकन प्लाज्मा के 2 µ एल पर coverslip और एक 1:1 प्लाज्मा के एक और २.५ µ एल/thrombin मिश्रण एक थक्का उत्पन्न करने के लिए जोड़ा जाता है. (ग) थक्का सेट (लगभग 1-2 मिनट) के बाद, कवर एक रोलर ट्यूब पर सिलिकॉन रबर चिपकने वाला सर्कल से हटा दिया जाता है और coverslip छेद में केंद्रित थक्का के साथ तैनात है; फिर coverslip एक अंगूठे के साथ जगह में दबाया और के बारे में 1 मिनट के लिए स्थिति में आयोजित किया जाता है । (D) ०.८ mL को पूर्ण संस्कृति माध्यम से जोड़ें । (ङ) रोलर ट्यूब धारकों के अंदर एक बड़े रोलर मशीन के सामने के साथ 5 ° झुकाव के लिए ट्यूबों के तल पर मध्यम रखने के लिए उठाया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 5: रोलर ट्यूब धारक और स्टेज प्लेट मशीन । (क) ट्यूब धारक है कि ट्यूब ऐसी है कि coverslip इमेजिंग के लिए स्थिति में बनाए रखा है पदों । (ख) ट्यूब धारक एक खुर्दबीन स्टेज अनुकूलक प्लेट में घुड़सवार । ओर स्लाइडर्स इमेजिंग के लिए सुरक्षित रूप से ट्यूब पकड़ो । ट्यूब धारक और साइड पैनलों के साथ (ग) स्टेज अनुकूलक एक तापविद्युत तापमान नियंत्रक से जुड़े हीटिंग स्ट्रिप्स युक्त जोड़ा । एक बार ट्यूब घुड़सवार और तैनात कर रहे हैं, बॉक्स के लिए एक ठोस शीर्ष इमेजिंग के दौरान तापमान बनाए रखने में मदद करने के लिए जोड़ा जा सकता है । ऑरेंज वायर thermocouple लीड है । डिजाइन और मंच अनुकूलक और हीटर के निर्माण के लिए योजना पर उपलब्ध हैं: https://vpr.colostate.edu/min/custom-machining/roller-tube-holder/। कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 6 : समान कक्षों की दोहराए जाने वाली इमेजिंग के लिए फिड्यूशियल चिह्नों का उपयोग करना. (ए) subiculum (पूंछ) के साथ photoetched coverslip (1 मिमी चौकों) पर हिप्पोकैम्पस टुकड़ा 4x उद्देश्य और उज्ज्वल क्षेत्र रोशनी के साथ देखा । प्लास्टिक रोलर ट्यूब की वक्रता ग्रिड के दृश्य को बढ़ाता है कि एक परोक्ष रोशनी बनाने में मदद करता है । बॉक्स एक 60X फ़ील्ड की स्थिति और आकार दिखाता है । (ख) वर्ग ३४ से 4 के नीचे की नोक के रूप में फिड्यूशियल निशान ढूंढने के लिए एक 20x उद्देश्य के साथ एक ही स्लाइस का एक दृश्य । y और x ऑफ़सेट reproducibly उच्च आवर्धन फोकल इमेजिंग के लिए इच्छित बॉक्स के केंद्र का पता लगाने के लिए दिखाए जाते हैं । (ग-च) एक टुकड़ा ंयूरॉन महत्वपूर्ण डाई 13 DIV के साथ लेबल एक 60x उद्देश्य का उपयोग कर रहा था और लगातार 4 दिनों (14-17 DIV) पर एक 30 µm प्रक्षेपण छवि बना । समान न्यूरॉन्स प्रत्येक दिन की छवि थे. प्रत्येक तीन न्यूरॉन्स में नाभिक की स्थिति एक अलग प्रतीक के साथ चिह्नित किया गया है । वे और अधिक आसानी से अपने 3 डी स्थिति परिवर्तन थोड़ा के रूप में छवि स्टैक के माध्यम से स्क्रॉल द्वारा की पहचान कर रहे हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 7 : इमेजिंग ंयूरॉंस में एक ंयूरॉन महत्वपूर्ण डाई के साथ स्लाइसें । (एक) ंयूरॉन महत्वपूर्ण डाई सना हुआ टुकड़ा प्लाज्मा थक्का में 4x उद्देश्य के साथ चढ़ाना के बाद 24 ज लिया । डाई (१०० एनएम) जोड़ा गया था जब टुकड़ा पहले रोलर ट्यूब धारक में रखा गया था और बाहर धोया 2 h बाद में ।Subiculum थक्का में हिप्पोकैंपस के चारों ओर कर्ल है । (ख-ङ) plasmin द्वारा थक्का विघटन के बाद 6 DIV में जोड़ा, स्लाइस साप्ताहिक अंतराल पर इमेजिंग के अग्रिम में महत्वपूर्ण डाई 24 एच के साथ 5 बार पुनः लोड किया गया । दिखाए गए चित्र 8, 21, 28 और ३५ DIV (B-E, क्रमशः) पर एकत्र किए गए थे । (च) हिप्पोकैम्पस टुकड़ा 3 सप्ताह के लिए संस्कृति और 4x उद्देश्य के साथ इमेजिंग के अग्रिम में ंयूरॉन महत्वपूर्ण डाई 24 एच के साथ सना हुआ । (G) 1 µm अंतराल पर लिए गए ६१ विमानों का 3d दृश्य दिखाते हुए F के रूप में उसी स्लाइस पर छवियों का फोकल स्टैक । ंयूरॉन महत्वपूर्ण डाई स्पष्ट रूप से दोनों neurites और कोशिका शरीर लेबल लेकिन यह नाभिक से बाहर रखा गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 8 : 4 सप्ताह से अधिक स्लाइस का एक ही स्थान में ंयूरॉंस की दोहराव इमेजिंग । कोशिकाओं के एक ही क्षेत्र के 30 µm फोकल छवि के ढेर के अधिकतम प्रक्षेपण छवियों (स्थिति से) महत्वपूर्ण डाई-लेबल 12, 20, 30, और ४० DIV पर लिया स्लाइस से (ए-डी, क्रमशः) । यह प्रक्षेपण छवियों में लंबे समय तक फ्रेम पर व्यक्तिगत कोशिकाओं को दोहराए पहचान करने के लिए मुश्किल है । हालांकि, यहां तक कि इन लंबे समय से अधिक, एक ही कोशिकाओं की पहचान अक्सर संभव है छवि के ढेर के माध्यम से स्क्रॉल या 3 डी छवियों है कि घुमाया जा सकता है के निर्माण, जैसे चित्रा 7Gमें दिखाया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 9 : वायरल-मध्यस्थता अभिव्यक्ति और फ्लोरोसेंट प्रोटीन की इमेजिंग। (क) हिप्पोकैम्पस स्लाइस 9 हफ्तों के लिए संस्कृति और cofilin व्यक्त करने के लिए एडीनोवायरस से संक्रमित एक सीएमवी प्रमोटर के पीछे mRFP । अभिव्यक्ति 5 दिनों के बाद संक्रमण पर टुकड़ा भर में पाया गया था, लेकिन प्रतिदीप्ति टुकड़ा परिधि के पास प्रतिभाशाली था । (B) समान स्लाइस ने 20X उद्देश्य के साथ देखे जाने पर स्लाइस के भीतर गहरी कोशिकाओं में व्यंजक दिखाया । छवि 2 µm अलग स्थान पर 20 छवियों के ढेर से एक प्रक्षेपण है । (ग) संस्कृति में 17 सप्ताह के बाद एक ही स्लाइस की जांच की थी (8 सप्ताह के बाद संक्रमण) और cofilin mRFP छड़ी के आकार का समुच्चय में देखा के रूप में एक ७० µm के ढेर से इस प्रक्षेपण छवि में देखी गई 23 छवियां, 3 µm अलग, एक 40X उद्देश्य के साथ लिया । (डी-एफ) माउस हिप्पोकैम्पस टुकड़ा संस्कृति में 9 सप्ताह से कम एक AAV व्यक्त एक GCaMP5-(P2A)-cofilin-mRFP एक synapsin प्रमोटर के पीछे के साथ संक्रमित । प्रतिदीप्ति 10 दिनों के बाद रेड और ग्रीन दोनों ही चैनल में दिख रहा था । (D) GCaMP5, एक कैल्शियम संवेदी रिपोर्टर की अभिव्यक्ति दिखा स्लाइस की एक एकल विमान छवि, (ई) कई cofilin-युक्त छड़, और (F) एक ओवरले छवि । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 10 : cofilin की अभिव्यक्ति-R21Q-संयोजक lentiviral वैक्टर से संक्रमित न्यूरॉन्स में एक synapsin प्रमोटर द्वारा संचालित mRFP. एक कमजोर प्रतिदीप्ति संकेत का पता लगाने के पहले के बारे में 3-4 दिनों के बाद संक्रमण वायरस के 10 µ एल का उपयोग करके मनाया जाता है और 5-6 दिनों के द्वारा प्रयोग करने योग्य हो जाता है, (ई) के रूप में इन एक 60x उद्देश्य के साथ अधिग्रहीत छवियों में देखा । हालांकि यह 1 वायरस के µ एल के साथ अभिव्यक्ति के एक ही स्तर को प्राप्त करने के लिए अब लेता है, 8 दिनों के बाद संक्रमण न्यूरॉन्स (महत्वपूर्ण डाई लेबल) के एक समान उच्च प्रतिशत से cofilin-R21Q-mRFP व्यक्त कर रहे थे. केवल 27% न्यूरॉन्स के 6 दिनों के बाद mRFP प्रतिदीप्ति के लिए सकारात्मक थे 1 µ एल के साथ संक्रमण (ए, बी) लेकिन यह 8 दिनों से ८५% (सी, डी) की वृद्धि हुई. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 11 : माउस हिप्पोकैम्पस स्लाइस में Aβ oligomer-प्रेरित cofilin विकृति. एक 60x उद्देश्य के साथ 30 µm छवि ढेर के रूप में लिया सभी छवियों और अधिकतम प्रक्षेपण छवियों के रूप में दिखाया जाता है । स्लाइस 6 div पर cofilin-R21Q-mRFP से संक्रमित थे । (A) 15 div स्लाइस पर इलाज किया 14 वाहन के साथ div (DMSO/HAMS F12 माध्यम Aβओउत्पंन करने के लिए प्रयुक्त) । (ख) स्लाइस 15 DIV १०० एनएम Aβओके साथ इलाज किया । (ग) के रूप में बी 20 DIV में लिया और (डी) में दिखाया गया है के रूप में एक ही क्षेत्र में ंयूरॉन महत्वपूर्ण डाई लेबल के साथ एक ओवरले के रूप में । तीर neurites लेकिन कुछ सेल निकायों युक्त टुकड़ा के क्षेत्र में cofilin समुच्चय और छड़ के रैखिक arrays दिखाओ । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
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Discussion
रोलर ट्यूब विधि यहाँ वर्णित लंबी अवधि के संवर्धन और कटा हुआ मस्तिष्क ऊतक के उच्च संकल्प लाइव इमेजिंग के लिए अनुमति देता है । स्लाइस तकनीक के रूप में यहां लागू के साथ एक प्रमुख मुद्दा स्लाइस के बढ़ते और रखरखाव में है । Coverslip कोटिंग्स कि टुकड़ा आसंजन का समर्थन, neurites और कोशिकाओं के प्रवास के बाहर टुकड़ा की वृद्धि को बढ़ाने के द्वारा thinning टुकड़ा को बढ़ावा देने; इस प्रकार, हम इन सब्सट्रेट के उपयोग से परहेज । 3 के साथ उपचार द्वारा कांच पर अमीनो समूहों के सम्मिलन-aminopropyltriethoxysilane स्लाइस के पालन में सुधार हुआ है, लेकिन बहुत कम या बहुत ज्यादा coverslip पर चिकन प्लाज्मा भी पालन नुकसान के लिए अग्रणी समस्याओं का कारण बन सकता है । उचित आसंजन के लिए आवश्यक प्लाज्मा की मात्रा संस्कृतिपूर्ण मस्तिष्क टुकड़ा के आकार पर निर्भर है, और इस प्रकार चूहे हिप्पोकैम्पस स्लाइस, जो माउस मस्तिष्क स्लाइस से क्षेत्र में लगभग 4 गुना बड़ा है के लिए अधिक है । यदि स्लाइस के तहत बहुत ज्यादा प्लाज्मा थक्के, coverslip के लिए सेल आसंजन बिगड़ा हुआ है और plasmin के साथ उपचार टुकड़ा इतना ढीला होगा कि यह या तो परिवर्तन की स्थिति या पूरी तरह से अलग करती है । हालांकि, थक्का में बहुत कम प्लाज्मा मशीन में रोटेशन के पहले कुछ दिनों के दौरान नुकसान टुकड़ा करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । हाल ही में एक प्रयोग में ३९ स्लाइसें शामिल है, तीन लेकिन खो उन में से कुछ टुकड़ा टुकड़े टुकड़े की प्रक्रिया के दौरान होने वाली क्षति से हो सकता है । फिर भी, हम आम तौर पर प्रयोग के लिए आवश्यक अनुमानित संख्या से ५०% अधिक स्लाइस के बारे में तैयार करते हैं । संस्कृति की समस्याओं का दूसरा प्रमुख कारण coverslip सील के आसपास मध्यम का रिसाव है । यह समस्या तब बिगड़ती है जब coverslips की स्थिति में मजबूती से कम 1 मिनट के लिए उन्हें सील पर चिपका के बाद आयोजित नहीं कर रहे हैं । दबाव सबसे अधिक संभावना लागू करने के लिए इस्तेमाल अंगूठे से हीट आसंजन पूरा मदद करता है । रिसाव कि घटित करता है अक्सर coverslip के तहत छोटे हवाई चैनलों के माध्यम से किया जाता है कि एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के साथ मनाया जा सकता है । ये आमतौर पर लंबे समय तक अंगूठे के दबाव का उपयोग करने पर गायब हो जाते हैं । धीमी गति से रिसाव के कारण संस्कृतियों के बारे में 2% की हानि की उंमीद की जा सकती है और इस तरह यह वायरल संक्रमण प्रदर्शन से पहले संस्कृतियों की स्थापना के बाद 10 दिनों तक इंतजार करने की सिफारिश की है । अत्यधिक अंगूठे का दबाव, विशेष रूप से यदि coverslip भर असमान उत्पादन किया, भी coverslip दरार पैदा कर सकता है । यदि टूटना एक मुद्दा है, एक रबर माउस एक मशीन में गर्म पैड पर फ्लैट नीचे ट्यूबों दबाने coverslip भर में और भी दबाव प्रदान करने में मदद हो सकती है ।
पहले हवा में झिल्ली पर मस्तिष्क टुकड़ा संस्कृति के लिए तरीकों का वर्णन तरल अंतरफलक (खुली प्रणाली) या एक ग्लास coverslip पर एक सील प्लास्टिक ट्यूब के अंदर (बंद प्रणाली) दीर्घकालिक टुकड़ा अस्तित्व के लिए बहुत प्रभावी रहे हैं, लेकिन प्रत्येक विधि अपनी ताकत है और कमजोरियों. हवा तरल अंतरफलक पर झिल्ली पर स्लाइस संस्कृतियों उच्च संकल्प इमेजिंग7के लिए विसर्जन उद्देश्यों के साथ संयुक्त electrophysiological अध्ययन के लिए लाभप्रद हैं, लेकिन के लिए कोशिकाओं की सटीक क्षेत्र खोजने के संबंध में कमियां है समय और संभावित उपयोगकर्ता जोखिम और उद्देश्य संदूषण जब वायरल मध्यस्थता जीन अभिव्यक्ति का उपयोग कर के साथ पुनः इमेजिंग । transgenes की अभिव्यक्ति के लिए वायरस का उपयोग सुरक्षित और एक बंद प्रणाली में प्रदर्शन करने के लिए आसान है, जहां माइक्रोस्कोप उद्देश्यों के संदूषण एक मुद्दा नहीं है । हमारे संशोधित रोलर ट्यूब विधि उच्च संकल्प इमेजिंग के लिए टुकड़ा की पहुंच देता है, हालांकि यह electrophysiological अध्ययन के लिए उत्तरदाई नहीं है ।
स्लाइस संस्कृति की स्थिति मूषक मस्तिष्क के कई क्षेत्रों के लिए स्थापित किया गया है2, लेकिन यहां हम केवल हिप्पोकैंपस का उपयोग क्योंकि यह सबसे व्यापक रूप से अध्ययन मस्तिष्क क्षेत्रों और परिवर्तन है कि हिप्पोकैंपस में होने के अध्ययन में बहुत रुचि के है में से एक है संज्ञानात्मक हानि । सीए और डीजी क्षेत्रों के पिरामिड सेल परतों संस्कृति में कई हफ्तों से अपने संगठन को बनाए रखने और आसानी से मनाया जा सकता है आकृति । हम एक नव विकसित फ्लोरोसेंट ंयूरॉन व्यवहार्यता मार्कर25का उपयोग किया है, जो प्रतिदीप्ति गुण है कि यह हिप्पोकैम्पस स्लाइस के भीतर ंयूरॉंस व्यवहार्यता और संगठन पर नजर रखने के लिए इस्तेमाल किया जा करने के लिए महीनों की अवधि के दिनों पर भी है कई अंय फ्लोरोसेंट प्रोटीन और पत्रकारों के उपयोग के साथ संगत । हालांकि NeuO प्रतिदीप्ति25के लिए इष्टतम नहीं है, हम पर NeuO में उत्तेजित कर सकते है ४८८ एनएम और मापने के उत्सर्जन में & #62; ६१७ एनएम । photoetched coverslips पर फिड्यूशियल मार्क्स संस्कृति के कई दिनों के दोहराव से एक ही कोशिकाओं का पता लगाने में मदद मिली और हमें कई हफ्तों से अधिक स्लाइस की छवि समान क्षेत्रों के लिए अनुमति दी । वस्तुतः स्लाइस के thinning कोई महत्वपूर्ण संस्कृति में 5 हफ्तों के दौरान संशोधित गिलास coverslips पर हुई, सबसे लंबा समय बिंदु जिसके लिए हम टुकड़ा मोटाई माप प्राप्त की ।
ए वी, AAV, और संयोजक lentivirus वैक्टर स्लाइस में exogenous जीन व्यक्त करने के लिए अच्छी तरह से काम करते हैं । Lentivirus एक ंयूरॉंस विशिष्ट प्रमोटर के साथ विशेष रूप से एक बहुत ही उच्च प्रतिशत में अभिव्यक्ति प्राप्त करने के लिए उपयोगी है (& #62; न्यूरॉन्स की ८५%) 8 दिनों के बाद संक्रमण । इसके अलावा, हम बताते है कि cofilin-actin रॉड मानव विज्ञापन10,11 और Aβ माउस विज्ञापन मॉडल में संज्ञानात्मक घाटे के विकास के साथ जुड़े विकृति३२ स्लाइस के साथ इलाज संस्कृतियों में निगरानी की जा सकती है अपेक्षाकृत कम सांद्रता (१०० एनएम) सिंथेटिक मानव Aβहे। हम कल्पना है कि इस विधि के भविष्य अनुप्रयोगों निस्र्पक नई चिकित्सकीय cofilin-actin रॉड विकृति और/या सही वृक्ष रीढ़ विषमता है कि कई स्नायविक विकारों में होने के लिए रिवर्स करने के लिए शामिल होंगे३३।
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bottoms from 15 cm culture dishes | VWR Scientific | 25384-326 | |
| Phillips Head Machine Screws (#10-32) | Ace Hardware | 2.5" long and 3/16" in diameter | |
| Flat Washers #10 | ACE Hardware | ||
| Machine Screw Nuts (#10-32) | ACE Hardware | ||
| Rubber Grommets | ACE Hardware | 5/16", thick; 5/8", hole diameter; 1.125", OD | |
| Polyethylene tubing (5/16"; OD, 3/16"; ID) | ACE Hardware | Cut to 1.8" length | |
| Lock Washer #10 | ACE Hardware | ||
| Drill Press, 5 speed | Ace Hardware | ProTech Model 1201 | |
| Nunclon Delta Flat-Sided Tubes | VWR | 62407-076 | |
| Drill bits, 3 mm, 6 mm and 15 mm | Ace Hardware | Diablo freud brand | Drill bits for cutting plastic. |
| Drill bits for wood, 1.5 cm and 1 mm | Ace Hardware | ||
| Wood file, 1/4" round | Ace Harware | ||
| Spring clips, 16 mm snap holder | Ace Hardware | ||
| Swivel Head Deburring Tool, 5" | Ace Hardware | 26307 | |
| Adhesive Silicone Sheet (Secure Seal) | Grace Bio-Labs | 666581 | 0.5 mm Thickness |
| 6 mm hole punch | Office Max | ||
| 12 mm hole punch | thepunchbunch.com | ||
| 70% Ethanol | |||
| Phototeched Coverslips, 12 mm diameter | Bellco Glass, Inc. | 1916-91012 | |
| Bunsen Burner | |||
| Absolute Ethanol | |||
| Nanopure Water | |||
| 3-aminopropyltriethoxylane | Sigma-Aldrich | A3648 | |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 179124 | |
| #5 Dumont Forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | |
| McIlwain Tissue Chopper | Ted Pella, Inc. | 10180 | |
| Double Edge Razor Blades | Ted Pella, Inc. | 121-6 | |
| Whatman Filter Paper | VWR | 28450-182 | Cut into 5.8 cm diameter circles |
| Poly-chloro-trifluoro-ethylene (Aclar) | Ted Pella, Inc. | 10501-10 | Cut into 5.8 cm diameter circles |
| #21 Surgical Blade | VWR Scientific | 25860-144 | |
| #5 Dumont Forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | |
| Spatula, stainless with tapered end | VWR | 82027-518 | |
| Gey's Balanced Salt Solution | Sigma-Aldrich | G9779 | |
| Glucose | ThermoFisher Scientific | 15023-021 | 25% (w/v) Solution, 0.2 mm filter sterilized |
| Chicken Plasma | Cocalico Biologicals | 30-0300-5L | Rehydrate in sterile water, centrifuge at 2500 x g 30 min at 4 °C, quick freeze aliquots in liquid nitrogen and store at -80 °C. |
| Thrombin, Topical (Bovine) | Pfizer | Thrombin-JMI | Quick freeze aliquots in liquid nitrogen at 1,000 international units/mL in diluent provided and store at -80°C. Use at 250 units/mL. |
| Cell Roller System | Bellco Biotech | SciERA | |
| Roller Incubator | Forma | Model 3956 | |
| N21-MAX | ThermoFisher Scientific | AR008 | |
| Pen/Strep (100X) | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| 200 mM Glutamine | ThermoFisher Scientific | 25030081 | |
| Glucose | ThermoFisher Scientific | 15023-021 | 25% (w/v) Solution, 0.2 mm filter sterilized |
| Neurobasal A | ThermoFisher Scientific | 10888-022 | Complete Medium: 48 mL Neurobasal A, 1 mL N21-MAX, 0.625 mL 200 mM Glutamine, 0.180 mL 25% Glucose, 0.250 mL 100x pen/strep. |
| Third generation lentivirus packaging | Life Technologies | K4975-00 | |
| 159 K cutoff centrifugal filters (Centricon) | EMD Millipore | ||
| Lentiviral cloning system (InFusion) | Clonetech | ||
| Plasmids 30323, 50856, 51279 | Addgene | ||
| Neuronal cell viability dye (NeuO) | Stemcell technologies | 1801 | Thaw once and quick freeze in 4 µL aliquots. Store at -20 °C |
| Inverted microscope | Olympus | IX83 | |
| Microscope objectives | Olympus | air: 4X, 20; oil: 40X, 60X, | |
| Spinning disc confocal system | Yokagawa | CSU22 | |
| Microscope EMCCD camera | Photometrics | Cascade II | |
| Linear encoded (x,y), piezo z flat top stage | ASI | ||
| Microscope lasers and integration | Intelligent Imaging Innovations | ||
| HEK293T cells | American Type Culture Collection | CRL-3216 | |
| Human Plasmin | Sigma Aldrich | P1867 | 0.002 U/mL in 0.1% bovine serum albumin (0.2 mm filter sterilized), quick freeze in liquid nitrogen and store at -80 °C. |
References
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