Summary
Métodos de detección de rutina utilizando amplificación del genoma viral están limitados por su incapacidad para discriminar infecciosas de partículas no infecciosas. El propósito de este artículo es proporcionar protocolos detallados para métodos alternativos facilitar la discriminación de las partículas infecciosas norovirus con aptámeros vinculante, dispersión dinámica de luz y microscopía electrónica de transmisión.
Abstract
Norovirus humano exige salud pública considerable y las pérdidas económicas en todo el mundo. En vitro avances de cultivo no son todavía aplicables para la detección rutinaria del virus. Detección de corriente de las técnicas de cuantificación, que dependen sobre todo de amplificación de ácidos nucleicos, no discriminan infecciosas de partículas virales no infecciosas. El propósito de este artículo es presentar detalles específicos sobre avances recientes en técnicas que se usan juntos con el fin de adquirir más información sobre el estado de la infectividad de las partículas virales. Una técnica consiste en evaluar atascamiento de un aptámero de ssDNA de norovirus a la cápsida. Los aptámeros tienen la ventaja de ser fácilmente sintetizada y modificada y son baratas y estables. Otra técnica, dinámica, dispersión de luz (DLS), tiene la ventaja de observar el comportamiento de la cápside en la solución. La microscopia electrónica permite la visualización de la integridad estructural de la cápsida viral. Aunque prometedor, existen algunos inconvenientes de cada técnica, como aptámeros inespecífica Unión a moléculas de carga positiva en matrices de muestra, requisito de cápside purificada para DLS y la sensibilidad pobre para microscopía electrónica. Sin embargo, cuando se utilizan estas técnicas en combinación, el cuerpo de datos proporciona una información más completa en la integridad de la cápside de norovirus que puede usarse para inferir la infectividad, información que es esencial para la evaluación precisa de métodos de inactivación o la interpretación de la detección de virus. Este artículo proporciona protocolos para que el uso de estos métodos para diferenciar las partículas infecciosas de norovirus humanos.
Introduction
Norovirus humano es responsable de una carga considerable de salud pública a nivel mundial, causando unos 685 millones de enfermedades y 212.000 muertes anualmente1, a un costo en miles de millones de dólares2,3. Hoy, la cuantificación y detección de norovirus implica amplificación del genoma y las plataformas de ligando. El anterior se prefiere generalmente, ya que es más sensible, proporciona información cuantitativa y tiene generalmente un menor riesgo de falsos positivos4. La técnica más común norovirus detección y cuantificación genoma amplificación es reacción en cadena cuantitativa de polimerasa de la transcriptasa reversa (RT-qPCR). Porque apunta y amplifica un segmento pequeño del genoma humano norovirus, RT-qPCR solo no es capaz de discriminar entre infecciosos y partículas no infecciosas, como RNA genómico gratis, dañaron cápsida que contiene genomas y cápsida con fatalmente genomas mutados/trunca todavía pueden ser amplificados por RT-qPCR. Mientras que recientemente se han reportado dos nuevos en vitro técnicas de cultivo para norovirus humano5,6 , todavía confían en RT-qPCR para la cuantificación del virus y todavía no son métodos viables para la rutina clínica y ambiental pruebas para los norovirus humanos. Así, RT-qPCR sigue siendo el estándar de oro para la prueba clínica y ambiental.
Otros métodos en vitro se han desarrollado en un esfuerzo para estimar mejor el estado de infectividad de las partículas de norovirus. Estos métodos se pueden categorizar generalmente como los que abordan la integridad de la cápside de norovirus y los evaluar la integridad del genoma. El enfoque anterior es más popular. Un método comúnmente usado es el pretratamiento de Rnasa antes de la extracción de ARN genómico viral, sin embargo esto no se da cuenta de las partículas virales que permanecen intactas, pero carecen de la capacidad de enlazar host receptores/co-factores, así como partículas virales que fatalmente han mutado o han truncado o ligeramente dañados genomas7. Integridad de la cápside puede ser evaluado basado en la capacidad del virus para enlazar a norovirus humano co-receptor/co-factores, que es hidratos de carbono conocidos como antígenos del grupo histo-sanguíneo (HBGAs). HBGAs están presentes en las células epiteliales intestinales del huésped como parte de glicoproteínas o glicolípidos (entre varios otros tejidos) y pueden ser secretadas en los líquidos corporales como saliva. Bacterias entéricas que contengan sustancias de HBGA-como en sus superficies ha demostrado para atar norovirus humano8,9,10, y estas interacciones pueden promover infección de norovirus5. El concepto básico de utilizar el enlace de HBGA es que sólo las partículas virales capaces de atar el supuesto receptor/co-factor sería capaces de infectar las células. Múltiples estudios sugieren que el enlace de HBGA basado en el grano antes de amplificación de ácidos nucleicos es un método prometedor para infectividad discriminación11,12,13,14, 15,16. Un reto importante en cuanto a HBGAs es que no solo tipo HBGA puede enlazar todos los genotipos de norovirus humanos. Para abordar esto, mucina gástrica porcina, que contiene HBGAs, se ha utilizado en lugar de carbohidratos HBGA purificadas en aras de la facilidad de síntesis, coherencia y un coste reducido.
Una publicación reciente por Moore et al. 17 introdujo una serie de nuevas técnicas para estimar la integridad de la cápside de norovirus humanos. En lugar de HBGAs, Moore et al. 17 investiga la Unión de un ácido nucleico ampliamente reactivo aptámeros (M6-2)18 y ampliamente reactivo anticuerpo monoclonal (NS14)19 para tratamiento térmico cápsida de norovirus GII.4 Sydney (virus-como partículas o VLPs) y esto en comparación con el atascamiento a HBGAs sintético. Ácido nucleico aptámeros son cortas (~ 20-80 nt) solo trenzado ácidos nucleicos (ssDNA o ARN) que doblan en estructuras tridimensionales únicas como consecuencia de su secuencia y unen un objetivo. Porque son ácidos nucleicos, son menos costosos; fácilmente químicamente sintetizado, purificado y modificado; y estable al calor. Existen varios informes de aptámeros generados contra los norovirus, con algunos de ellos mostrando amplia reactividad a una variedad de cepas18,20,21,22. Por ejemplo, Moore et al. 17 demostró aptámeros M6-2 limitado a norovirus humano purificado, montado cápsida (VLPs) y se comportó de manera similar a HBGA en la dependencia de la cápside viral para mantener la estructura de la proteína de más alto orden (por ejemplo, secundario y terciario) para Enlace a ocurrir. Por otro lado, una proporción significativa de atascamiento de VLP de norovirus a anticuerpo NS14 permanecía después de cápsida fueron totalmente desnaturalizado. Evaluación de enlace de norovirus en el estudio realizado por Moore et al. 17 se hizo mediante un método simple, basado en la placa similar al ELISA, con la excepción que los aptámeros se utilizan en lugar de anticuerpos (por lo tanto, el método fue llamado ELASA). Este método experimental de alto rendimiento se utilizó para evaluar los efectos de diferentes tratamientos en la cápside de norovirus, trabajo que es valioso para comprender el mecanismo de inactivación viral sobre la exposición a factores estresantes físicos o químicos. Sin embargo, una desventaja a este método es la baja sensibilidad y falta de tolerancia para contaminantes matriz asociada a niveles más altos causantes de fijación no específica de aptámeros.
Moore et al. 17 utilizar otro método, dispersión de luz dinámica (DLS), para controlar la agregación de partículas virales en la respuesta al tratamiento térmico. DLS es comúnmente usado para evaluar el tamaño de las suspensiones de nanopartículas y se ha extendido a las proteínas23,virus y24 25,26,27. La intensidad de luz dispersada por las partículas en la solución varía en función del tamaño de partícula, lo que permite el cálculo del coeficiente de difusión y diámetro de partícula usando fórmulas establecidas. La técnica DLS puede distinguir entre el diámetro hidrodinámico de las partículas dispersas hasta la nanoescala, que permite la detección de virus dispersos, proteínas de la cápsida individuales o dímeros y agregados de virus basados en tamaño27. Agregación de virus, representada por un aumento de tamaño de partícula, es indicativa de pérdida de la integridad de la cápside. La cápside es desnaturalizada y perturbado de su estructura, residuos hidrofóbicos verse expuestas y hacen que las partículas a pegarse y formar agregados. DLS puede utilizarse para medir el tamaño de las partículas después de un tratamiento determinado o la cinética de la agregación en tiempo real17,28. Este método tiene la ventaja de permitir la observación del comportamiento de la cápside en solución pero requiere altas concentraciones de purificada cápside, que puede no ser totalmente representativos de los virus en su estado natural.
El último método utilizado por Moore et al. 17 fue la microscopía electrónica de transmisión (TEM). Aunque este método carece de sensibilidad y no produce datos cuantitativos, permite la visualización de los efectos de diferentes tratamientos sobre la estructura de la cápside viral. Aunque no es todavía ideal para ajustes clínicos y ambientales, el uso de estos métodos en combinación es valioso en la comprensión de inactivación de norovirus humanos. El propósito de este artículo es proporcionar protocolos detallados para el análisis de enlace basado en la placa (ELASA), DLS, y utilizar métodos de preparación de TEM para investigar los efectos de tratamientos térmicos en la cápside de norovirus en el contexto de los efectos de los tratamientos en la cápsida integridad que se presenta en Moore et al. 17.
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Protocol
1. placa base vinculante ensayo para evaluación de pérdida de más alto orden Norovirus cápsida estructura
Nota: un protocolo ELASA muy similar al presentado aquí ha sido publicado 29, y ensayos ELASA similares se han divulgado previamente como parte de la investigación en otros lugares artículos 17 , 18 , 22.
- Tratamiento térmico de cápsida de humano norovirus GII.4 Sydney
- obtener norovirus humano purificado proteína importante del capsid (VP1) de GII.4 Sydney (adhesión: JX459908) en icosahédrica.
Nota: Cápsida en el estudio fueron obtenido por cortesía de R. Atmar (Baylor College of Medicine, Houston, TX).
Cápsida de - diluido a 50 μg/mL en 1 x solución salina con tampón fosfato (PBS, pH 7,2) a un volumen máximo de 15 μl en tubos PCR con individuales. Asegúrese de que el tubo contiene por lo menos 600 ng de cápside. Asegúrese de que hay 600 ng de cápsida por combinación ligando tratamiento.
- Precalentar el termociclador a tratamiento térmico deseado.
Nota: para los efectos del presente Protocolo, tratamiento a 68 ° C por diferentes tiempos (0 - 25 min) fue elegido. - Precalentamiento un adicional termociclador a 4 ° C para refrigeración inmediata. Añadir los tubos con solución de cápside en el termociclador para el tiempo deseado. Inmediatamente transferir a cycler previamente refrigerado 4 ° C por 5 min después de la calefacción.
- Incluye 95 ° C por 5 min tratamiento como control de cápside desnaturalizada. Incluyen solución de cápside sin tratar (23 ° C) como control positivo. Incluyen PBS con ninguna cápside como control negativo adicional.
- Desactivación brevemente en una centrífuga para obtener todas las gotas en la parte inferior del tubo y diluir las soluciones de la cápside vírica tratada en PBS a 3 μg/mL. Asegurar que haya al menos 200 μL de cápside diluido, tratada (100 μL/pocillo).
- obtener norovirus humano purificado proteína importante del capsid (VP1) de GII.4 Sydney (adhesión: JX459908) en icosahédrica.
- Aplicar 100 μl de solución de la cápside a cada pocillo, asegurando que hay al menos dos pozos por tratamiento. Además, incluyen 2 pocillos de control con 100 μl PBS para cada ligando; Esto proporciona la absorbancia de fondo del ensayo. Cubra la placa con tapa, sello los bordes con parafina para reducir la evaporación de la película y dejan toda la noche en un incubador de agitación a 4 ° C o 2 h a temperatura ambiente.
- Preparar la solución amortiguadora de bloqueo haciendo el 5% de sólidos de leche descremada (w/v) en PBS con 0,05% Tween 20 (SAFT).
- Extraer las soluciones tratadas cápsida de la placa. Agregar 200 μL/pocillo de solución amortiguadora de bloqueo. Incubar por 2 h a temperatura ambiente o durante la noche, sellada en 4 ° C.
- Preparar el ligando vinculante soluciones para el aptámero biotinilado 2 M6 18 , 29 y biotinilado sintético HBGA sangre tipo A o tipo biotinilado H.
- Diluir el aptámero biotinilado a 1 μm en agua libre de nucleasa. Asegúrese que hay suficiente solución para 200 μL total para cada tratamiento. Diluir el biotinilado solicitada HBGA a 30 μg/mL de la solución amortiguadora de bloqueo. Asegurar que hay suficiente solución para el volumen total de 200 μL para cada tratamiento.
Nota: Para utilizar menos HBGA, 10 μg/mL de HBGA en 0.25% leche descremada-SAFT pueden ser sustituidos. Las concentraciones para biotinilado 2 M6 y HBGA han optimizado previamente y registrados.
- Diluir el aptámero biotinilado a 1 μm en agua libre de nucleasa. Asegúrese que hay suficiente solución para 200 μL total para cada tratamiento. Diluir el biotinilado solicitada HBGA a 30 μg/mL de la solución amortiguadora de bloqueo. Asegurar que hay suficiente solución para el volumen total de 200 μL para cada tratamiento.
- Solución amortiguadora de bloqueo de quitar y lavar los platos 3 veces con 200 μL/pocillo de SAFT. La placa boca abajo sobre toallas de papel estéril para secar la humedad residual de la palmadita. Soluciones de enlace
- añadir 100 μL/pocillo del ligand, asegurando que hay 2 pozos por combinación de tratamiento térmico-ligando. Incube la placa cubierta con una tapa en un agitador orbital a alrededor de 60 rpm durante 1 h a temperatura ambiente.
Nota: Asegúrese de incluir 2 pozos de la cápsida no tratada y cápsida totalmente desnaturalizado para cada ligando como controles positivos y negativos, respectivamente. Además, incluyen 2 " sin cápside " pozos para cada ligando que la placa de control del fondo. - Eliminar las soluciones de ligando y lavar los pocillos 3 veces con 200 μL/pocillo de SAFT. Pat la placa boca abajo sobre toallas de papel estéril para secar la humedad residual.
- Añadir 100 μL/pocillo de solución de 0.2 μg/mL estreptavidina-peroxidasa en PBS. Incubar por 15 min a temperatura ambiente con agitación suave en un agitador orbital.
Nota: Conjugados de peroxidasa de rábano de estreptavidina diferentes puede tener diferentes concentraciones. Consultar el usuario ' manual para el rango ideal de concentraciones para las aplicaciones de enzima ELISA y estar seguro que es óptimo. - Quitar la solución de conjugado. Lavar 3 veces con 200 μL/pocillo de SAFT. Pat la placa boca abajo sobre toallas de papel estéril para secar la humedad residual.
- Añadir 100 μL/pocillo 3,3 ', 5,5 '-sustrato de tetrametilbenzidina (TMB) y permitir que el color se desarrolle para 5-15 minutos observar pozos de control negativo para cualquier coloran y asegúrese de desarrollar constantemente por el mismo tiempo entre platos repetidos. Tener en cuenta el rango de absorbancia del lector de placa utilizado, así.
Nota: Los tiempos de desarrollo pueden diferir basándose en la calidad de los ligandos/reactivos usados. - Detener el desarrollo de la reacción con ácido fosfórico de 1 M a 100 μL/pocillo. Leer inmediatamente la placa a 450 nm. Guardar los datos.
Nota: Introducción del ácido generalmente disminuye drásticamente la reacción pero no totalmente detenerlo. No dejar la placa parada por un largo período de tiempo antes de leer la absorbancia.
2. Análisis de resultados del ensayo de placa de base
- guardar los datos de absorbancia crudo en un programa de hoja de cálculo. Producir la absorbancia promedio para cada par bien con el tratamiento específico y ligando. Utilice estos promedios para todos los análisis posteriores.
Nota: Comparar ambas absorbancias bien para asegurarse de que no pares de pozos tienen valores significativamente diferentes. - Para analizar la integridad absoluta de la cápside (enlace de todos), reste la absorbancia cruda de la " sin cápside " control de cada otro valor de absorbancia de muestra.
Nota: Como alternativa, pérdida de enlace debido a la pérdida de orden superior (secundaria, terciaria, cuaternaria) estructura puede directamente ser analizada. En lugar de restar la absorbancia del control negativo (sin cápside), reste el valor del control completamente desnaturalizada de la cápside. Este elimina todo enlace de señal debido a la vinculante al aparato como vinculante debido a la secuencia de la cápside. HBGA y aptámeros M6-2 pantalla poco vinculante a cápside completamente desnaturalizada, por lo que cualquiera de los métodos produce resultados similares. Falsa señal positiva atribuida a aptámeros vinculante debe ser considerado al elegir que análisis para uso. - Con las absorbancias negativas o desnaturalizadas de control ajusta dividir el tratamiento absorbancia por sus respectivos positivos (sin tratamiento) control de absorbancia y multiplica por 100. Esto proporciona el porcentaje de señal de la cápside tratada con respecto al control sin tratar.
- Para estimar el grado de señal de enlace para cada ligando atribuible a la secuencia de la cápside, restar el " sin cápside " control de la absorbancia inicial negativo y tomar la absorbancia ajustada de la cápside desnaturalizada. Divida esto por la absorbancia ajustada de la señal de control positivo y multiplicar por 100. Esto da el porcentaje aparente de la señal debido al atascamiento del ligand a desnaturalizado cápside/cápside secuencia.
3. DLS para la detección del Virus de la agregación después del tratamiento térmico
Nota: Los pasos siguientes pueden ser específicos para el software y el instrumento utilizado, pero puede adaptado y aplicado a dispositivos similares.
- Crear un nuevo tamaño de SOP en la DLS instrumento software con: Material = proteína, dispersor = PBS, temperatura = 25 ° C, tiempo de equilibrado = 0 seg, tipo de la célula = cubeta desechable (pequeño volumen, ZEN0040), ángulo de medición = 173° retrodispersión, Duración de medición = automático, número de mediciones = 3, demora entre mediciones = 0 seg, procesamiento de datos: modelo de análisis = de propósito General (resolución normal). Utilice la configuración predeterminada para todos los otros parámetros.
- Seleccione la flecha verde de funcionamiento dentro del software y el nombre de la muestra.
- Pasos 1.1.1 a 1.1.4 para el tratamiento térmico de VLPs.
- Diluir el calor había tratado VLPs 1:10 en PBS 1 x a una concentración final de 5 μg/mL. (Opcional) Filtrar la muestra con un tamaño del poro μm 1 a remover las partículas de polvo; DLS es muy sensible al polvo, como partículas grandes dispersión mucho más luz que las pequeñas partículas. Cubeta
- transferir 50 μl de VLPs diluidos en un volumen pequeño desechable. Insertar la cubeta en la cámara de muestra del instrumento de.
- Iniciar el funcionamiento y utilizar el ' Correlogram ', ' Cumulants ajuste ', y ' Consejo profesional ' fichas para evaluar la calidad de los datos.
- Durante el arranque, compruebe que el valor de índice de polidispersidad es menor que 0.3, que representa una medida de calidad. en el ‘ multi-view ’ pestaña, asegúrese de que el coeficiente de correlación es constante y cerca, pero no más de 1, en poco tiempo, y las gotas apagado agudamente a 0 en un momento posterior, característico del tamaño de partícula. Uso el ‘ Consejo profesional ’ ficha de retroalimentación sobre la calidad de los datos durante las mediciones.
- Vez finalizada la medición, compruebe otra vez que el valor de índice de polidispersidad es menor que 0.3. Asegúrese de que los cumulants ajuste sigue línea los datos de puntos cerca de la ‘ Cumulants ajuste ’ ficha
- Tomar la media del diámetro de partícula de Z promedio registrada para cada medición como el tamaño de las partículas de cada muestra. Trazar el diámetro en nm vs temperatura en ° C.
4. DLS para detectar Virus de agregación en tiempo Real
Nota: los pasos siguientes pueden ser específicos para el software y el instrumento utilizado, pero puede adaptado y aplicado a dispositivos similares.
- Crear un nuevo tamaño de SOP en la DLS instrumento software con: Material = proteína, dispersor = PBS, temperatura = como tiempo de conseguir el equilibrio deseado, = sec 0, tipo de la célula = cubeta de cuarzo, ángulo de medición = 173° retrodispersión, duración de la medida = automático, Número de medidas = 50 (puede ser la tasa aumentada o disminuida dependiendo de agregación), demora entre mediciones = 0 seg, procesamiento de datos: modelo de análisis = múltiples modos estrechos (alta resolución). Utilice la configuración predeterminada para todos los otros parámetros.
- Seleccionar la flecha de ejecución dentro del software para abrir y nombrar una nueva muestra y que el instrumento alcanzar el equilibrio de temperatura.
- Suspender las VLPs de 1 X PBS en un tubo de microcentrífuga en una concentración de 5 μg/mL y un volumen entre 200-500 μl. vórtice la suspensión.
- Girar por la suspensión VLP para 5-10 s en una centrifugadora de mesa a gas de. Esto ayuda a prevenir la formación de burbujas durante el tratamiento térmico que interfiere con las mediciones de tamaño.
- Transferencia de la VLP suspensión a un cuarzo pequeño volumen cubeta-evitar burbujas y pipeta lentamente contra la pared de la cubeta. Después de que el instrumento ha alcanzado el equilibrio de la temperatura, inserte la cubeta en la cámara de muestra.
- Esperar 10 s para la temperatura de la muestra se equilibren, luego iniciar la carrera. Iniciar un temporizador en el inicio de la carrera. Detener el temporizador al final de la primera medición. Tomar este tiempo como el primer momento. Obtener puntos de tiempo posteriores desde los tiempos de medida registrados por el software.
- Iniciar el funcionamiento y vigilar la correlogram, ajuste de distribución y asesoramiento de expertos para evaluar la calidad de los datos.
Nota: La PDI no necesariamente será que menor que 0,3 estas mediciones como la muestra se espera que sea polidispersas durante la agregación.- Asegúrese de que el coeficiente de correlación es constante y cerca, pero no más que 1 a corto plazo y cae bruscamente en una o más veces más adelante, característicos del tamaño de partícula.
- Asegúrese de que la distribución ajuste sigue línea puntos cerca de los datos.
- Analizar los datos de talla.
Punto de
- Determine cada vez de la diferencia de tiempo entre cada medida y el momento inicial. Duración de medición no es todos exactamente lo mismo.
- Usando una distribución de intensidad, registrar el tamaño de los picos con las áreas más grandes para cada punto de medición y hora.
- Trazar los diámetros máximo en nm vs tiempo en min.
5. Preparación de muestras de TEM
- obtener soporte de carbono rejillas de película (níquel) diseñadas para TEM.
Nota: Consultar con la instalación de la base en reactivos recomendados y su manejo para el uso con el microscopio de la instalación. Asegúrese de almacenar cuadrículas en una caja que contenga desecante o una cámara de vacío para minimizar la exposición a la humedad. - Romper piezas de aproximadamente 5 cm x 5 cm de papel de filtro. Obtener platos de Petri de vidrio y cierre adecuado invertir pinzas diseñadas para su uso en microscopía.
- Cortar aproximadamente 2,5 cm x 5 cm de la película de parafina. Lugar en el escritorio.
- Tratamiento térmico de cápsida de norovirus GII.4 Sydney
- siga el procedimiento de tratamiento térmico exactamente como se describe en pasos 1.1.1 - 1.1.5 excepto: utilizar 10 mM HEPES (pH 7.4) para el tratamiento en lugar de PBS y no diluir más cápsida después del tratamiento (solución mantener a 50 μg/mL). Pipetear la gota entera ~ 15 μl de solución de cápside tratados en la película de parafina.
- Agarrar el borde de la rejilla con las pinzas, lo que les permite cerrar en el borde para mantener la red y colocar el rejilla carbono hacia abajo encima de la gota de la solución tratada. Dejar incubar durante 10 minutos permitir que la cápside conectar a la red.
- Dependiendo de la pureza de la preparación de la cápside, añadir lavados de la solución HEPES 10 mM si es necesario en forma de gotas de 10-15 μl colocó en línea después de la gota de la cápside vírica tratada.
- Después de 10 minutos, levante la rejilla con la gota. Coloque la parrilla casi perpendiculares a un pedazo de papel de filtro de mecha a la gota. Recoger la gota de 10-15 μl de tampón de HEPES con la cuadrícula, mantenga durante 30 s, luego mecha lejos con otro pedazo de papel de filtro a Washington
- Coloque una gota de 15 μl de solución de acetato de uranilo 2% en la película de parafina en un área vacía.
- Recoger la gota de acetato de uranilo con la rejilla y mantenga durante 45 s. mecha lejos el acetato de uranilo, asegurándose de eliminar la mayor parte de la solución. Coloque la rejilla carbono-lado hacia arriba sobre un trozo de papel de filtro, teniendo cuidado de que la red no " palo " a la humedad en las pinzas. Coloque el papel filtro con la cuadrícula en en un plato de Petri de vidrio abierto.
Nota: No utilice platos de Petri de plástico, ya que las rejillas se sentirán atraídas electrostáticamente a ellos y se atasque al plato.
- Recoger la gota de acetato de uranilo con la rejilla y mantenga durante 45 s. mecha lejos el acetato de uranilo, asegurándose de eliminar la mayor parte de la solución. Coloque la rejilla carbono-lado hacia arriba sobre un trozo de papel de filtro, teniendo cuidado de que la red no " palo " a la humedad en las pinzas. Coloque el papel filtro con la cuadrícula en en un plato de Petri de vidrio abierto.
- Repetir para todos los tratamientos. Coloque las mitades de la caja de Petri con las rejillas en un desecador durante la noche para secar antes de observar con TEM.
- Consultar la instalación de microscopía en la institución respectiva en cuanto a observar las rejillas preparadas. Algunos servicios permiten al usuario en la operación de sus instalaciones ' instrumento s. Detalles específicos sobre la configuración y la observación de un microscopio específico es beyond el alcance de este artículo.
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Representative Results
La integridad estructural de la cápsida de humano norovirus GII.4 Sydney (VLPs) se evaluó mediante varios métodos novela presentada por Moore et al. 17. en primer lugar, se realizó un experimento en que la integridad de la cápsida en función de su capacidad un supuesto receptor/co-factor (HBGA) o aptámeros ssDNA (M6-2) fueron comparados (figura 1). Los resultados mostrados anteriormente se presentan por Moore et al. 17y demostrar que el comportamiento del enlace aptámeros M6-2-cápside era similar a la de virus HBGA vinculantes para la exposición a un tratamiento térmico de 68 ° C para diferentes tiempos de exposición. Mientras que la señal de enlace de HBGA perdió un poco antes de que de los aptámeros 2 M6, M6-2 muestra una tasa similar de pérdida de señal calculada después de VLPs fueron expuestos a 65 ° C y 68 ° C por tiempo varios puntos (tabla 1)17. Esto sugiere que HBGA y aptámeros M6-2 encuadernación fue suprimido de manera similar.
Medidas DLS demostraron que la agregación debido a la desnaturalización de la proteína probable correspondió con pérdida de señal de enlace de ligando (figura 2), como un diámetro hidrodinámico mayor a 100 nm se observó después de alrededor de 18 minutos de tratamiento a 68 ° C. Estas eran las condiciones en que la pérdida completa de HBGA vinculantes y casi toda la pérdida de señal de enlace de aptámeros M6-2 (> 80%) se produjo (figura 1)17. Resultados TEM apoyaron estas observaciones como cambios morfológicos y aglutinación de la cápsida se convirtió cada vez más aparente a medida que la temperatura aumentó progresivamente entre 60 ° C y 80 ° C por 1 minuto (figura 3a). Un fenómeno similar fue observado después de calentar la cápsida a 68 ° C por 25 min, pero la resolución de la temperatura es que menos pronunciada (figura 3b)17.
Figura 1: Unión dependiente de la conformación de dos ligandos diferentes a la cápsida de norovirus GII.4 Sydney sometidos a tratamiento térmico. Cápsida GII.4 Sydney purificada (VLPs) fueron sometido a tratamiento térmico a 68 ° C para diferentes cantidades de tiempo, y el atascamiento sanguíneo un HBGA y aptámeros M6-2 fue evaluado usando un análisis basado en la placa ELASA vinculante. El eje y muestra la señal de absorbancia observada para el tratamiento (tiempo de exposición) como el porcentaje de un control de cápside sin tratar. Esta figura se ha presentado previamente y esta cifra ha sido modificada de Moore et al. 17 barras de error representan ± 1 desviación estándar de señal %. Los datos son de al menos tres placas replicadas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: ejemplo DLS datos para norovirus tratada térmicamente cápsida GII.4 Sydney mostrando resultados ideales y ambiguo y baja calidad. Cápsida (VLPs) fueron sometido a tratamiento térmico a 65 º C y 68 ° C, y su tamaño fue monitoreado en tiempo real. Panel (a) corresponde a una alta calidad, medición del coeficiente de correlación clara; y (b) a una baja calidad, medición de coeficiente de correlación ambigua. Panel (c) muestra los datos de tamaño de partícula, mostrando un perfil claro de agregación para cápsida tratados a 68 ° C; y (d) muestra los datos de tamaño de partícula ambigua de cápsida tratada térmicamente. Algunos de estos datos se presentan, y por lo tanto esta imagen es modificada de Moore et al. 17 haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: TEM de cápsida de norovirus GII.4 Sydney sometidos a diferentes tratamientos térmicos. Cápsida purificada (VLPs) fueron sometido a diferentes tratamientos térmicos y había observado usando microscopia electrónica de transmisión. Panel (una) muestra datos de cápsida calentada a diferentes temperaturas (60, 65, 70, 75 y 80 ° C) por 1 minuto Panel (b) demuestra cápsida sometido a 68 ° C para 0 - 25 minutos escala (bar) en fotos derecha representa 100 nm. Estas imágenes se presentan en Moore et al. 17 haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Tasa de decaimiento exponencial (% señal/min) | |||
| Temperatura | 65 ° C | 68 ° C | |
| Ligand | |||
| HBGA tipo A | 2.50 ± 0.24 | 13.30 ± 1.15 | |
| Aptámeros M6-2 | 2.47 ± 0,66 | 13.18 ± 0.47 | |
Tabla 1: tasas de decaimiento exponencial para la cápsida de norovirus GII.4 Sydney trataron a 65 ° C y 68 ° C. Cápsida se sometieron a tratamientos térmicos para varias horas a 65 ° C y 68 ° C, enfriado a 4 ° C y su capacidad sintética HBGA o aptámeros evaluados. Luego se calculó la tasa de pérdida de señal en el tiempo (tasa de decaimiento) con cada ligando para cada temperatura. Estos datos han sido presentados previamente en Moore et al. 17 los datos se presentan como % señal/min ± 1 desviación estándar de señal %.
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Discussion
El protocolo y las técnicas descritas aquí constituyen un medio de evaluar la cápside de norovirus humanos integridad/funcionalidad. Estos métodos pueden utilizarse para la obtención de la visión mecanicista de los efectos de los tratamientos de inactivación contra el virus y potencialmente pueden complementar los métodos tradicionales de evaluación de inactivación como ensayo de RT-qPCR o placa. Por ejemplo, la evaluación de inactivación química o física por el análisis de la placa solo proporciona una medida del grado de inactivación de virus pero no el mecanismo subyacente de la inactivación. También, agregación de virus puede provocar subestimación de título y por lo tanto sobreestimar la eficacia de tratamiento30. Estos métodos pueden informar aún más dicho estudio proporcionando información sobre los efectos de un tratamiento sobre la integridad de la cápside de norovirus. Recientemente, dos en vitro (cultivos celulares) métodos de cultivo de norovirus humanos han sido reportado5,6; Estos todavía dependían de PCR para la enumeración de virus, aunque teóricamente el modelo enteroide presentado podría utilizarse para TCID50 usando el anticuerpo para la determinación de la reducción relativa. Los métodos presentados aquí podrían tener utilidad para comprender el mecanismo completo de inactivación viral para múltiples tipos de tratamientos más allá de sólo tratamiento de calor. Por ejemplo, ligando la placa base y TEM fueron utilizados como herramientas para complementar RT-qPCR y placa de datos de ensayo para determinar el mecanismo de inactivación de norovirus en superficies de cobre31,32, a la exposición de dihidrógeno de plata citrato de33y tratamiento de alta presión14.
Hay numerosos pasos en estos protocolos en que la atención al detalle metodológico es crucial. Específicamente, para el análisis de la placa, gran atención debe prestarse al búfer utilizado para diluir el ligando para el enlace. Aptámeros M6-2 y aptámeros de ssDNA en general, son sensibles a la sal concentraciones y condiciones de buffer. Utilizando un buffer no óptima con el aptámero puede ablar vinculante. Aunque aptámeros en que M6-2 se ha utilizado con éxito diluyeron heces humanas, demasiada interferencia del taburete y matrix puede interferir con el enlace, que es consistente con las observaciones de otros norovirus humano aptámeros18,22. Un factor importante que causa esto es que los aptámeros pueden exhibir un grado de Unión no específica a moléculas positivamente cargadas. Por lo tanto, esto podría conducir a un cierto grado de falsa señal positiva en el ensayo que se describe aquí. Esto puede explicarse mediante la selección de un control negativo que es una matriz compleja sin virus o una proteína relacionada con. Asimismo, la concentración de HBGA y la cantidad de sólidos de leche descremada en el tampón de Unión pueden afectar significativamente positivos y señales de fondo. Tenga en cuenta que HBGAs diferentes tienen diferentes grados de afinidad a diferentes cepas de norovirus humanos, los buffers de Unión pueden necesitar ser optimizado dependiendo de HBGA tipo14,31,33. Similar debería considerarse en el búfer utilizado para el conjugado de peroxidasa estreptavidina-rábano, como concentraciones de distintos fabricantes pueden diferir; sin embargo, mucho menos variabilidad podría esperarse dada la alta afinidad de la interacción de estreptavidina-biotina34. Debido a la gran capacidad de adaptación de este método basado en la placa, la solución de problemas de resultados subóptimos es relativamente sencilla. Por ejemplo, en el caso de señal de fondo alta, optimización por aumento de que la concentración de la leche descremada y baja concentración de ligando pueden ser investigados y viceversa para las placas con baja señales positivas. Para la TEM, una de las consideraciones más importantes es el uso de materiales no estático (como vidrio) cuando el almacenamiento y manejo las rejillas, como las rejillas son extremadamente difíciles de manejar alrededor de los materiales como placas de Petri desechables. Si se utilizan estos materiales, rejillas tenderá a "saltar" y pegue el material. Además, debe tenerse mucho cuidado para asegurar que no hay ninguna humedad residual en las rejillas. Idealmente, un desecador de vacío debe utilizarse si está disponible.
Al realizar experimentos usando DLS, la pureza de la muestra es una consideración muy importante. Las funciones utilizadas para correlacionar cambios en la intensidad de la dispersión de la luz diámetro dependen de tener monomodal o estrecho distribuciones multimodales de la partícula. Las impurezas hasta la nanoescala, incluyendo proteínas, introducen polidispersidad y alteran cálculos de tamaño. También, la intensidad de luz dispersada es proporcional al diámetro elevado a una potencia de 6, por lo que las partículas grandes como polvo sustancialmente interfieran con las mediciones. Formación de burbujas durante tratamientos térmicos en tiempo real produce resultados absurdos debido a la luz dispersado por las burbujas fluctuantes. Concentración de cápside (VLP) también debe considerarse cuando se usa DLS. Las concentraciones de la muestra deben ser lo suficientemente alto como para producir la señal suficiente y lo suficientemente bajo como para evitar la dispersión múltiple. También es de vital importancia para el correcto material de entrada y propiedades dispersantes, como estos valores son utilizados por el software para los cálculos de tamaño. En particular, dispersante viscosidad es función de la temperatura y se debe ajustar por consiguiente durante los tratamientos de calor (el software utilizado tiene viscosidades dependientes de la temperatura del agua construida).
Aunque los métodos aquí describen ofrecen múltiples oportunidades para mejores formas de evaluar integridad de cápside, no son perfectos. Ya que estos métodos requieren muy altas concentraciones de virus, debe utilizarse con cápsida purificada, montado en lugar de virus infecciosos nativos. Las VLPs usados aquí consisten en la proteína mayor cápside de norovirus humanos (VP1), que agrupa en la cápside de norovirus sin ácido nucleico viral. Aunque estas VLPs actuar antigénicamente similares a la cápsida del virus infeccioso, pueden ser más susceptibles a la inactivación. Además, VLPs son difíciles de producir y purificar y no están disponibles para muchos investigadores. Uso de norovirus humanos purificada (por ejemplo, utilizando ultracentrifugación) es posible pero la disponibilidad de muestras fecales humanas norovirus-positivo es limitado e incluso con purificación, títulos de virus pueden no ser lo suficientemente altos como para dar cabida a los métodos se describe aquí. Trabajo futuro en la optimización de ensayos para el uso de semi purificado virus infeccioso en heces está actualmente en marcha. De hecho, esto ya ha sido demostrada para el ensayo de placa18,22, pero, sin duda, sería más complicado para DLS. También hay que señalar que estos métodos sólo se aplicaron para evaluar la integridad de la cápside después de la aplicación de un examen físico (calor) enfoque de inactivación que se sabe que afectan directamente a la cápside. Resultados pueden ser más ambiguos fueron estas técnicas utilizadas para evaluar la integridad de la cápside mediante otros métodos de inactivación, como agentes químicos o métodos sobre todo dirigidos a la destrucción del genoma viral. Sin embargo, algunos informes han demostrado favorablemente el desempeño de enlace de HBGA para evaluar la inactivación química31,33,35,36,37. En el momento actual, los protocolos registrados aquí se utilizan mejor en concierto con técnicas tradicionales como la RT-qPCR y plensayos de aque con virus de suplente.
Estos protocolos proporcionan que una alternativa sencilla significa que entender los efectos de un método de inactivación de virus físicos (calor) de norovirus humanos. Estos métodos podrían ampliarse es probable que para el uso con otros virus no-envueltos (p. ej., hepatitis A y E virus), como el principio general de detección de pérdida de la estructura de la proteína de mayor orden es el mismo. Además, se debe evaluar el comportamiento y potencial de uso de otros ligandos para indicar pérdida de la integridad de la cápside. Adaptando los protocolos a las matrices de muestras más complejas y mejorar su sensibilidad analítica (límites de detección) es también una dirección lógica de futuro. En general, los métodos descritos aquí proporcionan un medio más accesible para determinar la integridad de la cápside de norovirus humanos y aumentar la comprensión mecanicista de los efectos de los tratamientos de inactivación contra este patógeno importante.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por la agricultura y alimentos investigación iniciativa competitiva beca Nº 2011-68003-30395 desde el Departamento de agricultura de Estados Unidos, el Instituto Nacional de alimentos y la agricultura a través del proyecto NoroCORE. Financiación para la carga del acceso abierto fue proporcionada por el Departamento de agricultura de Estados Unidos. Nos gustaría agradecer a Robert Atmar (Baylor College of Medicine, Houston, TX) por favor que nos la cápsida purificada y Valerie Lapham para su ayuda con las imágenes TEM. También nos gustaría dar las gracias a Frank N. Barry por ayudarnos a empezar los experimentos presentados.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plate-Based Binding Assay for Evaluating Loss of Higher Order Norovirus Capsid Structure | |||
| 96-well, medium-binding polystyrene EIA plate | Fisher (Costar) | 07-200-36 | |
| Lid for 96-well plate | Thermo Fisher | 3098 | |
| Paraffin film (Parafilm) | Thermo Fisher | PM999 | |
| 1x PBS (pH 7.2) | Life Technologies | 20012-050 | |
| Polysorbate 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| 1x PBS (pH 7.2) + 0.05% Polysorbate 20 | N/A | N/A | |
| Purified, assembled human norovirus GII.4 capsids | N/A | N/A | |
| Individual 0.2 ml PCR tubes | Genesee Scientific | 22-154G | |
| 2 thermocyclers | Bio-Rad | 1861096 | |
| Tabletop mini centrifuge | Fisher Scientific | 12-006-901 | |
| Skim milk solids | Thermo Fisher | LP0031B | |
| Synthetic histo-blood group type A disaccharide, biotinylated | Glycotech | 01-017 | |
| Biotinylated aptamer M6-2 (stock concentration 100 µM in nuclease-free water): 5'-/5Biosg/AGTATACGTATTACCTGCAGCTGGGAAGAGGTCCGGTAAATGCAGGGTCAGCCCGGAGAGCGATATCTCGGAGATCTTGC -3’ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
| Streptavidin-horseradish peroxidase conjugate (ELISA grade), We use Life Technologies SNN2004 | Life Technologies | SNN2004 | |
| 3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine (TMB) substrate, room temperature | Thermo Fisher | 50-76-00 | |
| 1 M phosphoric acid | N/A | N/A | |
| Microplate reader capable of reading 450 nm | Tecan | Infinite m200 Pro | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Analysis of Plate-Based Assay Results | |||
| Microsoft Excel or similar program | N/A | N/A | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dynamic Light Scattering Experiments | |||
| Zetasizer ZSP, or similar particle size analysis instrument | Malvern Instruments | N/A | |
| Vortex | Fisher Scientifc | 02-215-365 | |
| Quartz cuvette | Hellma | 104-002-10-40 | |
| Small volume disposable cuvette (to reduce VLP use) | Malvern Instruments | ZEN0040 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Transmission Electron Microscopy Sample Preparation | |||
| Nickel electron microscopy grids with carbon support film | Ladd Research | 10880-100 | |
| Self-closing reverse electron microscopy tweezers | Ted Pella | 5372-NM | |
| Qualitative filter paper | Sigma-Aldrich (Whatman) | WHA1002055 | |
| Glass petri dishes | Sigma-Aldrich | BR455743 | |
| 100 mM stock HEPES solution (pH 7.2) | N/A | N/A | |
| 2% uranyl acetate | N/A | N/A |
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