Summary
本文所提出的方法的目的是在模型生物体的正常衰老过程中, 探索蛋白质的聚集性, 即线虫。该协议代表了一个强大的工具, 以研究高度不溶性的大骨料, 形成与年龄和确定如何改变 proteostasis 影响蛋白质聚集。
Abstract
在过去的几十年中, 神经退行性疾病的流行, 如阿尔茨海默氏病 (AD) 和帕金森氏症 (PD), 已经增长。这些年龄相关的疾病的特点是在这些患者的大脑中出现了纤维结构的蛋白质聚集。确切地说, 为什么通常可溶性蛋白质会经历一个聚集过程仍然是不清楚的。发现蛋白质聚集不限于疾病过程, 而是正常衰老过程的一部分, 使研究的分子和细胞机制, 调节蛋白质聚集, 不使用 ectopically 表达人类疾病相关的蛋白质。在这里, 我们描述了通过互补的方法来检查线虫线虫中固有的蛋白质聚集的方法。首先, 我们将研究如何培养大量的年龄同步的线虫来获取衰老的动物, 我们提出了分离高不溶性大团聚体的生物化学程序。结合有针对性的基因击倒, 它可以解剖的作用, 一个基因的兴趣, 以促进或防止年龄依赖性的蛋白质聚集通过使用的综合分析与定量质谱或candidate-based 分析与抗体。然后通过体内分析, 用转基因动物表达荧光标记的聚集易发蛋白来证实这些结果。这些方法应该有助于澄清为什么某些蛋白质容易聚集与年龄和最终如何保持这些蛋白质完全功能。
Introduction
蛋白质折叠和聚集被认为是一些神经退行性疾病的标志, 如 AD, PD, 肌萎缩侧索硬化症 (ALS), 颞痴呆 (FTD), 和许多其他。例如, α-核组装成淀粉样纤维, 在帕金森病患者的黑质中积累为路易体体, 而 ALS 患者 TDP-43 或 FUS 错误在退化的运动神经元中形成细胞质聚集。在这些神经退行性疾病中, 维持蛋白质稳态或 proteostasis 的机制无法阻止错误蛋白的积累, 从而导致疾病。
Proteostasis 是至关重要的, 以确保细胞功能和正常情况下, 这些调控机制严格控制蛋白质的合成, 折叠和降解率。几项研究表明, 随着衰老, 许多细胞和器官保存蛋白质稳态的能力逐渐受到损害, proteostasis 网络的生理退化是一个重要的加重因素神经退行性疾病 (参考1,2,3)。事实上, 蛋白质的质量控制和细胞对展开的蛋白质应激的反应受到年龄的影响, 表明蛋白质折叠和聚集可能是衰老的一般后果。事实上, 我们和其他人已经证明, 蛋白质聚集不限于疾病, 而不是部分的蛋白质组成为高洗涤剂-不溶于老年动物4,5,6,7 ,8,9,10。计算和体内分析显示, 这些生理年龄相关的团聚体在几个方面类似于疾病聚集,5。发现内源性, 年龄依赖性的蛋白质聚集使我们有机会解剖的分子和细胞机制, 调节蛋白质聚集, 不使用 ectopically 表达的人类疾病相关的蛋白质。目前, 关于广泛的蛋白质不的调控, 以及这种失调对机体健康的影响, 只存在有限的信息。
线虫是在衰老研究中最广泛研究的模型生物之一, 因为这些动物的寿命相对较短, 并且在较高的生物体中表现出许多特征老化特征. 通过基于微分溶解度的序贯生化分馏技术, 研究了衰老对蛋白质不的影响, 广泛应用于神经研究领域中的疾病聚集物的提取 11.通过定量质谱法, 在没有疾病5的情况下, 显示了数百个蛋白质在C. 线虫中变得容易聚集。在这里, 我们详细地描述了在液体培养中生长大量蠕虫的协议, 以及用质谱法分离聚合蛋白质并通过印迹分析的顺序提取。由于错误和聚集倾向的蛋白质积累在老年的线虫性腺和其他躯体组织的面具变化5,12,13, 我们使用无性腺突变体来集中分析蛋白质不在非组织中。所提出的方法可以分析不溶于 0.5% SDS 的高不溶大团聚体, 并通过相对较低的离心速度进行颗粒化。另外, 在其他地方也发布了一个不太严格的提取协议来收集更小、更可溶解的聚合体,10。此外, 我们还描述了用于评估C. 线虫中的聚合在体内的方法。
总的来说, 这些方法与 rna 干扰结合, 可以评估一个基因在调节年龄依赖性蛋白质聚集中的作用。为此, 我们描述的分析, 从年轻和年老的蠕虫的提取物, 并没有被击倒的特定蛋白质的兴趣使用 rna 干扰。这些方法应该是一个强大的工具, 以确定哪些组成部分的 proteostasis 网络调节蛋白质不。一些干预措施, 如减少胰岛素/胰岛素样生长因子 (igf-i) 1 信号 (IIS) 已被证明显着延迟C. 线虫老化14。长寿途径往往诱导蛋白质质量控制机制, 因此这些途径可以积极影响蛋白质聚集率。例如, 我们在抑制 IIS 路径7时演示了在长寿命的动物中减少固有的蛋白质聚集。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
注意: 为了更好地理解该过程, 附加了工作流的示意图 (图 1)。
1. 大量年轻和年老的线虫的生长, 以 rna 为目标的基因为对象
注意: 使用C. 线虫温度诱导不育的2 (q388)突变体 (CF2253) 来获得大的老年同步种群。在所有的步骤, 这是重要的工作在不条件下开放的火焰和检查, 没有污染 (例如, 真菌或细菌) 存在。如果温度不被描述, 在室温下执行步骤 (也 centrifugations)。
- 制备线虫 gon-2 (-)突变体以获得无性腺动物
注意: 要获得缺乏性腺的无菌动物, 必须在母动物体内诱导功能突变, 将这些基因在最后幼体阶段 (L4) 转移到25° c, 以避免产妇的贡献。- 首次扩展gon-2 (-)动物以收集用于温度漂移的父代
- 条纹大肠杆菌OP50 株在性肉汤 (LB) 板上, 在37° c 的夜间孵育。
- 第二天接种200毫升 LB 培养基与一 OP50 克隆和孵育它隔夜在37° c。
- 第二天种子15高生长 (HG) 中等板材 (直径 9 cm) 与0.5 毫升 OP50 并且分布 OP50 用刮刀。把盘子放在室温下两天。
- 区块gon-2 (-)动物 (不饿死的最后两代) 到15汞培养基板播种与 OP50 和维持他们在20° c, 直到板块与成人汇合, 一些 OP50 仍然可用。
- 同时, 在台阶1.1.1.3 中描述了 OP50 60 汞培养基板, 并在室温下保持板材。小心: 当琼脂在室温下开裂时, 不应将种子板保存超过一周。
- 一旦大多数成年人开始产卵, 就像先前描述的15一样, 漂白汇合的盘子。收集鸡蛋在两个15毫升管和地方在一个 nutating 搅拌机过夜在20° c。
- 第二天洗涤孵化 L1s 与 M9 缓冲 (85 毫米氯化钠, 42 mm Na2HPO4· 7H2O, 22 mm 的2PO4): 离心机在 3000 x g 为三十年代, 丢弃上清, 并填补高达15毫升标记与 M9。离心机, 丢弃上清, 重复步骤1.1.1.6。填充的管与产生的蠕虫丸高达15毫升标记与 M9。
- 用解剖显微镜计算 L1s 的总数, L1s 2 µL 滴放在 non-seeded 琼脂板上。平均从至少九下落获得的数字。
- 添加 6500 L1s 每种子汞板, 让蠕虫生长在20° c, 直到 L4 阶段。
- 第二次扩展gon-2 (-)动物以获得无性腺动物的实验
- 在 L4 阶段, 转移蠕虫从步骤1.1.1.9 到25° c, 直到他们开始产卵和 L1s 孵化。
- 沉淀法收集卵和 L1s
注意: 在温度转移到25° c 后, 最好使用沉淀法作为一种温和的技术, 将脆弱的卵和 L1s 从成虫中分离出来。- 用5毫升 M9 每五盘子 M9 洗盘子。把虫子转移到50毫升的管子里
- 用 M9 把所有的管子装满45毫升的标记, 让成虫沉淀大约10分钟, 在50毫升的试管中收集每一个上清液, 然后用小球重复这一步骤。将含有卵和 L1s 的上清液离心到 3000 x g 1 分钟, 让 L1s 沉淀约10分钟, 并除去上清, 直到15毫升离开。
注意: 这是一个关键的步骤。不要过早清除上清, 尽可能多地收集 L1s。 - 将含有鸡蛋和 L1s 的管子放在25° c 的 nutating 搅拌机上过夜。
- 首次扩展gon-2 (-)动物以收集用于温度漂移的父代
- 非性腺动物的液体培养, 以收集有兴趣的基因为对象的幼小和年老动物
注意: 一些基因对 rna 干扰的反应可以是温度依赖性, 如先前所描述的16。作为 rna 干扰的替代方法, 突变基因可以被合并到gon-2 (-)背景中。- 液体培养细菌的制备
- 准备 OP50 和 rna 干扰细菌 (细菌生产期望的 dsRNA 和细菌与空的载体作为控制) 通过接种 4 L LB 媒介与12毫升各自细菌文化 (增加最后的集中50µg/毫升羧和1毫米 IPTG 到干扰细菌培养) 和孵化他们在37° c 隔夜在 180 rpm。
- 第二天收获文化在 6700 x g 为10分钟在4° c。在60毫升 ice-cold 的基底介质 (100 毫米氯化钠, 50 毫米磷酸钾 pH 6, 保持在冰上) 去除清和重的每个小球。保持三悬浮颗粒 (OP50, 控制 rna 干扰细菌, 和 rna 干扰细菌为感兴趣的基因) 在4° c 直到步1.2.2 或1.2.3。
注意: 蠕虫可以生长在 L1 阶段的 rna 干扰 (见步骤 1.2.3) 或避免发育缺陷的最后幼体阶段 L4 (见步骤 1.2.2)。
- 液体培养在最后幼体期开始 L4 的 rna 干扰治疗
- 在 Fernbach 培养瓶中添加200毫升的基底介质 (容量2800毫升)。为最后的文化容量300毫升 (参见 1.2.2.4), 添加10毫米柠檬酸钾, pH 6, 3 毫升微量金属溶液 (5 毫米乙酸酸 (EDTA), 2.5 毫米 FeSO4, 1 mm MnCl2, 1 mm ZnSO4, 0.1 mm 丘索4), 3 mm MgSO4, 3 毫米 CaCl2, 100 ng/毫升多菌灵, 5 µg/毫升胆固醇)。用膜螺钉盖把烧瓶关上。有关缓冲区的食谱, 请参阅表 1 。
- 将 L1s 从25° c (步骤 1.1 2.2. 3) 中取出, 并将其转至15毫升管。离心机在 1900 x g 为3分钟, 去除上清, 计数 L1s 每2µL 如在步骤1.1.1.8。在前一步准备的 Fernbach 培养烧瓶中加入 50万 L1s。
- 将 OP50 (从步骤 1.2.1) 按比例添加到蠕虫的数量。例如, 对于50万蠕虫, 添加 60 mL OP50。
- 完整的蠕虫培养与 S 基础, 使总体积为300毫升。孵育蠕虫文化直到 L4 阶段在25° c 在一个震动孵化器以150转每分钟。
- 第二天, 蠕虫应该是野生型 L4s 的大小。从 OP50 到 rna 干扰的细菌, 收集六50毫升的动物管, 让它们沉淀和清除上清。用 M9 清洗 L4s 去除残余 OP50 细菌: 离心机在 1900 x g 为3分钟, 去除上清并且转移所有 L4s 入一个50毫升管子。计算 L4s 每5µL (至少九次)。需要两倍的 L4s 5万的幼虫收集和两次 10万 L4s 是需要的老年蠕虫收集。
- 如1.2.2.1 所述, 准备四 Fernbach 培养烧瓶。也加入最后的浓度50µg/毫升羧和1毫米 IPTG 每瓶。
- 增加控制 rna 干扰的细菌和 rna 干扰细菌为兴趣基因 (从步 1.2.1) 按比例成蠕虫的数量: 增加7毫升各自细菌每瓶为幼小蠕虫和14毫升每瓶为老蠕虫。
- 添加5万蠕虫每瓶幼虫收集和10万蠕虫每瓶老蠕虫收集, 并完成的文化与 S 基础, 以填补高达300毫升。孵育蠕虫培养 (四在总) 在25° c 和150转每分钟。
- L1 期开始的 rna 干扰处理液体培养
- 准备四 Fernbach 培养烧瓶, 如1.2.2.1 所述, 并添加50µg/毫升羧和 1 mM IPTG 的最终浓度。
- 继续进行 L1s 的制备, 如1.2.2.2 所述。总共需要30万只蠕虫将它们分成四烧瓶。
- 添加控制 rna 干扰的细菌和 rna 干扰细菌为感兴趣的基因 (从步 1.2.1) 与蠕虫的数量成正比, 如步骤1.2.2.7 中所描述的, 也考虑 L1 和 L4 阶段之间的生长阶段: 每瓶13毫升, 为年轻 w 添加各自的细菌orm 和26毫升每瓶老年蠕虫。
- 按照步骤1.2.2.8 中的描述继续。
- 维护C. 线虫液体培养
- 周期性地从每个液体培养基中收集一个分, 并将其放置在玻片上 (或者在琼脂板上), 以验证没有污染物。使用解剖显微镜, 特别是在生长阶段检查细菌的食物水平在文化。预先准备 2 L 培养的控制 rna 干扰细菌和 rna 干扰细菌的基因利益的描述在步骤1.2.1。如果需要, 将这些添加到C. 线虫液体培养基中, 其余的保持在4° c。
- 定期检查动物是否是无菌的。大多数动物不会有性腺。根据gon-2突变的显, 有些可能已中止了性腺结构, 但不应观察到具有卵子的动物。
- 液体培养细菌的制备
- 液体培养中的幼虫和老年蠕虫的采集
注: 所有以下步骤为一个液体培养烧瓶, 但两个相同年龄的文化与控制和 rna 干扰细菌为感兴趣的基因应该一起处理。- 在2天或3天收集幼虫来测量蛋白质不的基本水平。当一半的人口死亡时, 应该收集年老的蠕虫 (最迟)。为了确定这一点, 死的和活的蠕虫计数在几滴液体培养放置在琼脂板。比率平均超过九滴。
- 准备以下试剂: 1 l M9, 1 升 M9 与 0.01% Octoxynol-9 (M9 + Octoxynol-9), 和40毫升60% 蔗糖在 ddH2o. 将试剂放在冰上。
- 将蠕虫从一个烧瓶倒入分离漏斗, 让蠕虫在室温下沉积10分钟。打开塞, 将蠕虫滴入一个50毫升的管子中。
- 将该蠕虫颗粒分成两个15毫升管, 并在室温下 1900 x g 离心5分钟。要清洗的蠕虫, 清除上清和填补高达15毫升与 M9。重复离心最后转移到两个50毫升的蠕虫管和填充高达20毫升总体积与 ice-cold M9。
- 为了去除细菌和死的蠕虫, 添加两个20毫升稀释的蠕虫丸到两个50毫升管填充20毫升 ice-cold 60% 蔗糖。在室温下快速离心 2700 x g, 5 分钟, 加速度9和减速7。小心地去除顶部的蠕虫层与一个大吸管 (25 毫升)。采取高达15毫升 (但如果有明显的死蠕虫很多)。把它直接放入37毫升的 M9 + Octoxynol-9 (每蔗糖管3管) 准备在冰上。离心机在 2700 x g 为3分钟在室温, 加速度9和减速7。
注意: 两者都需要 ice-cold;否则分离将不起作用。不要混!因为蔗糖对蠕虫来说是有毒的, 所以要快速执行以下步骤是很重要的。 - 将小球分成四15毫升管, 用 ice-cold M9+ Octoxynol-9 清洗两次: 离心机在 1900 x g 处, 室温下1分钟。取出上清液, 用 ice-cold M9+Octoxynol-9 加15毫升标记, 重复手术。
- 用 ice-cold M9 冲洗一次, 将四根管子与两个管子相结合。在室温下 M9 15 毫升管中的总容积为4毫升, 并在25° c 的 nutating 搅拌器上旋转40分钟。
注意: 这有助于蠕虫消化肠道中的任何残留细菌。检查显微镜下的蠕虫, 看看有没有死的。 - 清洗蠕虫两次与 ice-cold M9+Octoxynol-9 如描述的1.3.5。用 M9 冲洗两次, 将蠕虫转移到一根管子。
- 洗涤蠕虫一次在重新组装 (盐) 无抑制剂的萃取缓冲液 (0.1 米 4-morpholineethanesulfonic 酸 (MES), 1 毫米 ethyleneglycoltetraacetic 酸 (EGTA), 0.1 毫米 EDTA, 0.5 毫米 MgSO4, 0.75 米氯化钠, 0.02 米氟化钠 (氟))收集之前。除去上清液, 直到蠕虫颗粒上没有液体。
注意: 此步骤和下一步应迅速完成, 以避免在缓冲区中高盐浓度引起的蠕虫中产生伪影。 - 估计蠕虫颗粒的体积和添加一个相同的卷与抑制剂 (2x 蛋白酶抑制剂鸡尾酒)。使用巴斯德吸管, 绘制蠕虫, 慢慢滴入50毫升管一半充满液氮放置在干冰。让液氮蒸发, 将冷冻蠕虫储存在-80 ° c, 直到进一步处理。
注意: 液氮处于极低的温度;穿戴适当的保护。
2. 以有兴趣的基因为对象的幼小和年老动物的不溶性蛋白提取
-
1.3 步收集的动物的破坏
注意: 重要的是要避免任何解冻的蠕虫样品。用液氮冷却砂浆, 在干冰上进行完整的操作。
注意: 液氮处于极低的温度;穿戴适当的保护。- 将冷冻蠕虫转移到预砂浆中, 研磨2.5 分钟。
注意: 在研磨过程中要小心: 开始时, 冰冻的蠕虫是小子弹, 很容易失去它们。 - 加入液氮 (约100毫升) 的粉末, 再次冷却下来, 再研磨2.5 分钟. 用显微镜检查蠕虫的身体是否坏了。将粉末转化为2毫升的管子, 并将其储存在-80 ° c。
- 将冷冻蠕虫转移到预砂浆中, 研磨2.5 分钟。
-
快速不溶蛋白提取物用于免疫印迹分析
注意: 使用此方法对不同日的总蛋白含量和不溶蛋白水平进行比较, 并对感兴趣的基因进行 rna 干扰。执行所有步骤, 直到步骤2.2.3 冰!- 溶解50毫克的地面蠕虫从步骤2.1 与150µL Radioimmunoprecipitation 化验 (帕) 缓冲 (50 毫米三 pH 8, 150 毫米氯化钠, 5 毫米 EDTA, 0.5% 钠十二烷基硫酸钠 (SDS), 0.5% 钠胆酸 (SDO), 1% nonylphenylpolyethylenglycol (NP40), 1 毫米磺氟化物 (PMSF), 1x 蛋白酶抑制剂鸡尾酒)。质使用1毫升注射器与灰色针 (27 G x ½ ", 0.4 毫米 x 13 毫米) 的悬浮;草拟暂停10次。
- 离心机在 18400 x g 为20分钟在4° c。收集上清。
- 重在100µL 帕缓冲和离心机在 18400 x g 20 分钟在4° c。丢弃上清, 旋转不久, 并小心去除残留上清。
- 为了溶解高度不溶性的蛋白质, 重75µL 尿素/sds 缓冲液 (8 米尿素, 2% sds, 50 毫米糖 (德勤), 50 毫米三, pH 8), 在室温下孵育10分钟。
- 为了分析总蛋白含量, 将第一帕上清液与2.2.2 和尿素/SDS 颗粒悬浮结合。为了解释提取所用的体积, 总馏分应含有三分之二的帕上清和三分之一的尿素/SDS 颗粒分数。在一个小4-12% 梯度凝胶, 检查不溶性蛋白的水平, 加载9µL 的尿素/SDS 分数和4µL 总联合蛋白。执行总蛋白印迹染色, 以监测蛋白质水平。通过使用特定抗体的西方印迹, 验证不中的个体蛋白质的变化 (见第3节)。
-
不溶蛋白提取分离 SDS 不溶蛋白的质谱
注意: 在冰上执行所有步骤。- 在干冰中, 每一个时间点和每一个 rna 干扰细菌 (年轻和年老的蠕虫, 控制 rna 干扰细菌, 以及感兴趣的基因的 rna 干扰细菌) 将两次350毫克的地面蠕虫分为2毫升的管。
- 为了去除盐可溶性蛋白质, 增加二容量每重量 (700 µL) 与抑制剂, 1 毫米 PMSF, 200 U/毫升 dnasei I 和100µg/毫升核糖核酸 A 对每根管子和溶解粉末在冰。将悬浮液绘制成1毫升注射器 (灰色针, 27 克 x ½, 0.4 毫米 x 13 mm) 15 次, 并在冰上孵育10分钟离心机在 18400 x G, 20 分钟在4° c。通过脂肪层, 收集含有盐可溶性蛋白的上清液为每一个2毫升的条件 (四管总)。除去脂肪并丢弃它。分盐可溶性蛋白在-80 ° c 时凝固。
- 为了除去脂质, 溶解700µL 与含有1米蔗糖的抑制剂 (没有 dnasei I 和核糖核酸 A) 的颗粒。将悬浮液抽出10次, 然后在冰上孵育5分钟, 离心机在 18400 x g 处, 在4° c 处为20分钟。要小心去除所有上清和血脂, 并丢弃它们。
- 为了去除 SDS 可溶性蛋白, 溶解700µL 帕缓冲颗粒。将悬浮液抽出10次, 在冰上孵育10分钟。离心机在 18400 x g 为20分钟在4° c。收集含有 SDS 可溶性蛋白的上清液和分-80 ° c 的冷冻剂。
- 将每个条件的两个样本一起磷, 然后用500µL 的帕缓冲器。把悬浮液抽到注射器里10次离心机在 18400 x g 为20分钟在4° c。要小心去除所有上清和丢弃它。
注: 提取的目的是分离可溶性蛋白质与不溶性蛋白质。因此, 在下一步加入甲酸之前, 必须去除所有残留的帕上清液。 - 溶解最后的球团含有400µL 70% 甲酸的高不溶性蛋白, 并将悬浮液抽出20次。在冰上孵育20分钟。离心机在 5万 x g 为20分钟在4° c, 加速度3和减速 5, 去除蠕虫角质层残骸。收集含有高度不溶性蛋白质的上清液, 在-80 ° c 时将其冷冻。
- 质谱中不溶性蛋白组分的透析
注: 透析在4° c。- 准备8升透析缓冲液 (50 毫米, 1 毫米, 0.1 毫米 PMSF, pH 7.5), 并将其划分为八 1 l 烧杯。在每个 1 L 烧杯的缓冲表面上放置三膜 (膜过滤器 = 0.025 µM)。
- 每膜, 小心地装载65µL 的不溶性蛋白溶解在蚁酸中获得的步骤2.3.6。每个条件被划分到六膜。
- 检查一个样品的 ph 值, 去除5µL, 并添加到 ph 带。如果酸碱度在7和8之间 (近似地在 2 h 以后), 收集样品由移向上和向下柔和地。最后, 用10µL 透析缓冲液冲洗每膜的沉淀。冷冻样品在-80 ° c。
3. 以兴趣基因为目标的 rna 干扰对蛋白质不的变化进行综合鉴定和量化
-
质谱分析的制备
- 评估透析样品中不溶性蛋白质的数量, 通过将分到4-12% 梯度凝胶上, 连同已知浓度的参考样品一起加载。用一个图像分析软件进行总蛋白凝胶染色和量化蛋白质量。这一步是必要的, 以估计的数量, 消化所需的胰蛋白酶 (步骤 3.1.4)。
- 用离心式蒸发器将样品浓缩, 溶解8米尿素最终浓度的不溶性蛋白。
- 烷基化和还原
- 添加三 (2-乙) 膦盐酸盐 (TCEP) 到最后浓度4毫米的样品。孵育为1小时在57° c 以300转每分钟。把样品放到室温下。
- 添加碘到最后浓度为8.4 毫米。在室温下, 在黑暗中孵育45分钟 (可以孵育2小时)。
- 将150毫米碳酸氢铵中的样品稀释以获得最终的2米尿素浓度。
- 在37° c 和 400 rpm 的夜间, 5% w/w 修饰胰蛋白酶的消化蛋白。
- 载入 12% SDS 凝胶中的消化蛋白样品, 并进行总蛋白凝胶染色, 以分析消化是否起作用。如果仍然存在一些带, 重复步骤3.1.4 和3.1.5。
- 从年轻和老年控制和 rna 干扰处理的多肽线虫按照制造商的指示, 用等压标记标记为相对和绝对定量。
注: 另外, 其他标记肽或蛋白质的方法可用于量化, 如串联质量标签。
注: 质谱分析: 为了降低样品的复杂度, 应将强阳离子交换色谱分离成不同的组分进行质谱分析5。一些质谱仪能够分析等压标签的相对和绝对定量的其他地方描述17。所获得的数据应使用适当的软件进行处理。总的来说, 这种分析允许识别高度不溶性蛋白质及其在年龄和 proteostasis 调制时的变化。
4.在体内一种兴趣基因对衰老过程中聚集模式影响的评价
- 从3节的质谱分析中, 选择一个年龄依赖性的聚集易感蛋白, 在受 rna 干扰的动物中积累到不同的程度。生成转基因的线虫线, 表达这种蛋白标记为荧光蛋白, 并在其各自的启动子或组织特异性促进剂的控制下 (见讨论为适当的促进者的选择)。用 OP50 的线虫生长 (NG) 板上的标准技术维持15° c 的应变。例如, 我们选择的蠕虫应变表达 polyadenylate 结合蛋白 (PAB-1) 融合在 N 总站到 tagRFP 控制下的咽肌启动pmyo-2.
-
在体内对与年龄的聚合的变化的评估对兴趣基因的抑制
- 提前一至两天, 准备羧 (Carb)/IPTG 板与控制 (空的 rna 干扰载体 L4440) 细菌和 rna 处理细菌抑制基因的兴趣。(有关线虫中的 rna 干扰的详细协议, 请参阅朱庇特科学教育数据库。生物学精要 1: 酵母,果蝇和C. 线虫在线虫中的 rna 干扰。朱庇特, 剑桥, MA: 10.3791/5105 (2017))。
- 对于从 L1 的 rna 干扰处理, 将产卵的蠕虫放在几个单独的小 NG/碳水化合物/IPTG (6 厘米直径) 的板上, 并在20° c 的情况下, 用控制 rna 或抗干扰细菌为基因进行播种。2小时后取出成虫, 将子代保持在20° c。为避免发育缺陷, 可在 L4 幼虫期后启动 rna 干扰治疗。
- 一旦后代到达 L4 幼虫阶段, 转移这些 L4s 到新的 NG/碳水化合物/IPTG 板种子与控制 rna 或 rna 干扰细菌的基因感兴趣。设置九板与15转基因每个条件和保持他们在20° c。老化的蠕虫需要从他们的后代转移到新的盘子, 直到他们的生育期结束, 以便能够区分他们的后代。
- 每隔一天, 在成人的荧光立体显微镜下, 在24x 倍放大倍数的情况下, 对带有荧光标签的聚合易感蛋白的分布变化进行评估。
注意: 在明亮的点中, 聚集易感蛋白的年龄依赖性积累被用作聚集的出。这些点应该是高度不动的结构被描绘作为聚集体。这应该是由荧光恢复后漂白 (FRAP) 使用共聚焦显微镜。对于聚合蛋白, 在至少4分钟518之后, 漂白区域中不应观察到恢复。为了量化的变化与年龄, 我们在年龄同步蠕虫表达 PAB-1 的分布模式在2天, 5 天, 和7天的成年如下: 低聚集水平 (0-10 tagRFP::P AB-1 点后咽球),中度聚集水平 (咽后部10点以上), 聚集水平高 (咽前球囊内有10点以上)。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
我们使用这里提出的方法来评估如何长寿命的动物与减少的 IIS 调节年龄依赖性蛋白质聚集。由西部污点 (参见步骤 2.2, 快速不溶蛋白提取为西部污点分析), 我们分析了总和不溶蛋白内容的年轻人 (3 天成人) 和年龄 (18 天成人) 蠕虫在控制 rna 干扰和以 rna 干扰为目标胰岛素IGF-1-like 受体daf-2。我们观察到, 在总蛋白水平上, 年龄或控制与daf-2 rna 干扰条件 (图 2A) 之间没有大的变化。正如预期的那样, 我们检测到控制动物中高度不溶性蛋白水平的强年龄相关增加 (图 2B)。在比较长寿的动物在daf-2 rna 干扰, 聚集倾向大大减少。不溶性提取物的全蛋白染色显示, 与年龄匹配的控件相比, 在daf-2 rna 干扰中, 18 天老蠕虫提取物中的蛋白质带模式较不复杂。定量质谱分析表明, 长寿命的动物与减少的 IIS 有全面较少年龄相关的蛋白质聚集和重要的是, daf-2抑制完全废除了年龄依赖性的不蛋白质的特定子集7。为了对这些发现进行后续研究, 我们将重点放在这些易于聚集的蛋白质之一 PAB-1。PAB-1 是一种 RNA 结合蛋白, 具有预测的 "朊病毒样" 域。抗体染色证实长寿动物维持 PAB-1 可溶于年龄 (图 2C)。
对于体内PAB-1 聚集的分析, 我们生产了表达 tagRFP 的转基因动物: 咽肌:P AB-1。在幼小动物, tagRFP::P AB-1 主要广泛位于整个咽 (图 3A, "低" 聚合水平), 但随着年龄的增长, 我们观察到在明亮的点开始在后咽球的渐进积累 (图 3一个"中间" 聚合级别)。在衰老过程中, 我们还观察到在越来越多的动物中, 咽前球的聚集 (图 3A, "高" 聚合水平)。通过将动物分成不同的类别, 我们在人口中 PAB-1 聚集的比率。在成年的2天, 大多数的蠕虫 (88%) 没有或极少数的点, 没有检测到高聚集水平的动物。已经在5天, 19% 的人口显示中间和16% 高聚集水平, 而在天7超过70% 的蠕虫呈现中间和高聚合水平。为了分析长寿对 tagRFP:PAB-1 年龄依赖性聚集的影响, 我们生成了转基因 tagRFP: 用daf-2突变:P AB-1 蠕虫。这些动物显着减少 tagRFP:PAB-1 点形成与老化, 少于15% 的人口表现中间和高聚集水平甚至在7天 (图 3B)。
通过使用这里描述的不同的方法, 我们发现, 减少的 IIS 防止年龄依赖性的蛋白质聚集到不同的程度和长寿的动物是特别有效的恢复动态的 PAB-17。
图 1: 工作流示意图, 用于研究与年龄有关的固有蛋白质聚集的变化C. 线虫 主要步骤是粗体。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2: 蛋白质不随着控制动物年龄的增长而增加, 但在动物中却没有减少daf-2信号.(A) 总分数的总蛋白染色从天3和天 18 gon-2 (-)突变体受控制和daf-2 rna 干扰 (生长在25° c)。(B) 从3天到 18 gon-2 (-)突变体对控制和daf-2 rna 干扰 (在25° c 下生长) 的 SDS 不溶性分数的总蛋白染色。面板从引用7重新发布。(C) 免疫检测 SDS-不溶性分数中的 PAB-1, 由红色箭头指示的相关蛋白带。面板从引用7重新发布。请单击此处查看此图的较大版本.
图 3:减少daf-2信号阻止 tagRFP 的累积::P AB-1 点.(A) 有代表性的蠕虫的图片与 tagRFP::P AB-1 过度表达在咽肌 (高倍放大显微镜, tagRFP 检测设置: 激发 558 nm, 发射 583 nm)。动物低 (0-10 tagRFP::P AB-1 点在咽后球), 中间 (超过10点在咽后球), 或高聚集水平 (超过10点在前咽球) 显示。缩放条 = 20 µm. (B) 不同 tagRFP 的量化: 在野生和daf-2突变背景下的:P AB-1 聚合水平显示强烈延迟 tagRFP::P AB-1 聚集与年龄在长寿的动物。2天、5天和7天daf-2 (-)与野生背景相比, 低于中级和高聚合级别: 费舍尔的精确测试, **p < 0.0001。面板从引用7重新发布。请单击此处查看此图的较大版本.
| 库存解决方案 | 量 | 最终浓度 | 评论/说明 |
| 液体培养, 总容量300毫升 | |||
| S 基部 (500 毫升: 5.9 克氯化钠, 50 毫升1米磷酸钾 pH 6) | 200毫升 | 1 M 磷酸钾 pH 值 6: 1 升: 129 g2PO4二, 52 g K2HPO4二元无水 | |
| 1 M 枸橼酸钾 6 (400 毫升: 13.1 克柠檬酸一水合物, 134.4 g 三钾柠檬酸一水合物) | 3毫升 | 10毫米 | |
| 微量金属溶液 (1 升: 1.86 克乙酸乙酸 (EDTA), 0.69 g FeSO4 · 7 h2O, 0.2 g MnCl2 · 4 H2o, 0.29 g ZnSO4 · 7 H2o, 0.025 g 丘索4· 5 h2o) | 3毫升 | 库存解决方案在黑暗中在4° c | |
| 1 M MgSO4 (500 毫升: 123.3 g) | 900µL | 3毫米 | |
| 1 M CaCl2 (500 毫升: 73.5 g) | 900µL | 3毫米 | |
| 200µg/毫升多菌灵 (用于50毫升:10 毫克甲醇) | 150µL | 100 ng/毫升 | |
| 5毫克/毫升胆固醇 (100 毫升: 0.5 克在乙醇中) | 300µL | 5µg/毫升 | |
| 重组 (盐) 萃取缓冲器, 30 毫升 | |||
| 1米 4-Morpholineethanesulfonic 酸 (MES) | 3毫升 | 100毫米 | 库存缓冲组件 |
| 0.5 米 Ethyleneglycoltetraacetic 酸 (EGTA) | 60µL | 1毫米 | 库存缓冲组件 |
| 0.5 米乙酸乙酸 (EDTA) | 6µL | 0.1 毫米 | 库存缓冲组件 |
| 1 M MgSO4 | 15µL | 0.5 毫米 | 库存缓冲组件 |
| 5 M 氯化钠 | 4.5 毫升 | 750毫米 | 库存缓冲组件 |
| 1米氟化钠 (氟) | 600µL | 20毫米 | 库存缓冲组件 |
| 完成到30毫升共计与 ddH2O | |||
| 50x 蛋白酶抑制剂鸡尾酒 | * | 2x | * 添加试剂后, 采取的数量, 是需要的布的缓冲 (为提取的质谱6毫升)。 |
| 100毫米磺氟化物 (PMSF) 在异丙醇,-20 ° c | * | 1毫米 | |
| 10 U/µL DNaseI | * | 200 U/毫升 | |
| 4毫克/毫升 RNaseA | * | 100µg/毫升 | |
| 1米蔗糖, 30 毫升 | |||
| 2米蔗糖 (50 毫升: 34.2 克) | 15毫升 | 1 M | 添加除 DNaseI 和 RNaseA 外的缓冲试剂 |
| Radioimmunoprecipitation 测定 (帕) 缓冲液, 30 毫升 | |||
| 1 M 三羟甲基氨基 (三) pH 值8 | 1.5 毫升 | 50毫米 | 帕库存缓冲组件 |
| 5 M 氯化钠 | 0.9 毫升 | 150毫米 | 帕库存缓冲组件 |
| 0.5 M EDTA | 0.3 毫升 | 5毫米 | 帕库存缓冲组件 |
| 10% 十二烷基硫酸钠 (SDS) | 1.5 毫升 | 0.50% | 帕库存缓冲组件 |
| 10% 胆酸钠 (SDO) | 1.5 毫升 | 0.50% | 帕库存缓冲组件 |
| Nonylphenylpolyethylenglycol (NP40) | 0.3 毫升 | 1% | 帕库存缓冲组件 |
| 完成到30毫升共计与 ddH2O | |||
| 100毫米 PMSF | * | 1毫米 | * 在服用所需的帕存量缓冲剂后添加试剂 (用于质谱10毫升的萃取)。 |
| 50x 蛋白酶抑制剂鸡尾酒 | * | 1x | |
| 尿素/SDS 缓冲液, 10 毫升 | |||
| 尿素 | 4.8 克 | 8 M | |
| 10% SDS | 2毫升 | 2% | |
| 糖 (德勤) | 77毫克 | 50毫米 | |
| 1 M 三 pH 8 | 0.5 毫升 | 50毫米 | |
| 完成到10毫升共计与 ddH2O | |||
| 透析缓冲, 1 L | |||
| 三 | 6克 | 50毫米 | |
| dtt | 154毫克 | 1毫米 | |
| 100毫米 PMSF | 1毫升 | 0.1 毫米 | |
| 调整到 pH 值7.5 和完成到 1 L 共计与 ddH2O | |||
表 1: 液体培养、不溶蛋白提取和透析的缓冲。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
在这里, 我们报告了一种方法, 以隔离高不溶性蛋白聚合体的老化线虫受 rna 干扰分析的质谱法和西方印迹。我们表明通过减少 IIS 来改善 proteostasis 可以大大防止年龄依赖性的蛋白质聚集。通过在线虫中选择特定的聚集易过度蛋白, 可以进一步解剖调节固有蛋白质聚集的机制。
固有年龄依赖性蛋白质聚集与疾病相关蛋白聚集
目前的工作是根据先前的发现, 蛋白质聚集不限于特定的蛋白质聚合在疾病的背景。通过聚焦于内源性聚集易感蛋白而非 ectopically 表达的疾病相关蛋白, 期望能为聚集过程的生理调节提供新的洞察力。由于在不同的细胞位置5中发现了与年龄相关的蛋白质聚合体, 因此它们的研究也应该提供对隔室特定质量控制机制的洞察。总的来说, 控制固有蛋白质聚集的机制也可能与预防疾病蛋白聚集有关。值得注意的是, 虽然年龄依赖性蛋白质聚集类似于几个方面的疾病蛋白聚集, 但仍然不清楚这些聚合体是否含有淀粉样纤维, 这是许多疾病聚集的特征。
选择c. 线虫模型: 优点和限制
与哺乳动物模型相比, 使用C. 线虫来研究衰老相关特性的最大优点之一是它的寿命很短。在衰老过程中, 几百个蛋白质一直是高度聚集性的, 不的大量增加很容易被检测到, 即使是经过简化的生物化学萃取。然而, 使用C. 线虫研究年龄依赖性蛋白质聚集的一个主要限制是必须隔离大量的老龄动物。由于C. 线虫在其生殖阶段19中雌雄同体并产生大约220或更多的子代, 因此必须防止繁殖或消除后代以使种群老化。有几种方法可诱导不孕: 一种选择是使用化学 fluorodeoxyuridine (FUdR), 一种 DNA 合成抑制剂。然而, FUdR 导致许多副作用, 包括 proteostasis 和减少蛋白质聚合的变化20,21,22。重要的是, FUdR 诱导基因型特定的反应23。另一个选择是使用温度敏感的无菌突变体。例如, spe-9 (hc88), 15 (b26),有限元-1 (hc17), glp-1 (e2141),和尼泊尔-2 (q388)已被用于质谱分析的年龄依赖性聚合蛋白质组5, 8。
然而, 有几个限制与使用这些变种人有关。首先, 由于不育是温度依赖性, 有必要在25° c 下生长动物, 这是一个温和的压力, 加速衰老以及蛋白质聚集。相反, 我们观察到, gon-2、 glp-1和fem-1变种在25° c (未显示数据) 时与野生类型相比是 longer-lived 的。其次, 每种类型的生殖缺陷都有特定的局限性。使用精子缺陷突变体的一个缺点是未受精的卵母细胞的生产 (也产生于老年野生型雌雄同体)。这些卵母细胞的质量随着年龄的增长而下降, 在性腺24,25中积累。定量质谱分析表明, 精子缺陷突变体有几倍高的不溶性蛋白质积累与年龄相比, 无性腺或系缺陷突变。这表明蛋白质折叠和聚集位于性腺5, 与先前研究的协议12,13和在体内实验揭示了聚集蛋白位于异常卵母细胞群集5。因此, 性腺中过量的蛋白质聚集会掩盖体细胞组织中蛋白质聚集的细微变化。在比较不同程度的干预对生殖和躯体组织 proteostasis 的作用时也应考虑这一点。因此, 为了评估体细胞蛋白的聚集, 我们倾向于使用无性腺的gon-2突变体。另一种方法是使用系缺陷的glp-1变种。然而, 我们注意到, 这些动物的固有的蛋白质聚集与年龄相比, gon-2突变体5。这可能是由于信号从系缺陷性腺26,27,28的 proteostasis 在躯体组织中的改善。另一种选择是使用野生型动物, 并通过沉淀去除后代。然而, 这是一个问题, 由于难以完全消除所有的后代。
使用C. 线虫的另一个一般限制是它的小尺寸, 这使得特定的组织提取具有挑战性。由于这种全动物提取物不提供有关不同的条件如何调节特定组织中蛋白质聚集的相关信息。值得注意的是, 此问题可能会被利用最近开发的基于荧光活化的细胞排序的方法来分离, 以隔离C. 线虫29中的特定单元格。然而, 这一方法是否适合于获得不溶蛋白提取的足够材料, 是否适用于老龄动物还有待确定。另外, 组织特异性蛋白聚集及其调控可以通过另外的体内实验来研究。由于转基因动物表达了荧光标记的选择性聚集倾向蛋白, 可以快速生成, 由于动物是透明的, 因此检测蛋白质聚集原位相对容易。
总的来说, 在野生型背景下, 用活体实验来跟踪蛋白质组学结果是非常必要的。生物化学和 microscopy-based 特性的结合使对蛋白质聚集的综合研究和对感兴趣基因的作用的评估。在C. 线虫中, 通过通过喂养和整个基因组 rna 干扰库的可用性进行 rna 干扰来促进后者。此外, 大量具有特征性的突变体存在, 以证实通过 rna 干扰或使用而非 rna 干扰所获得的结果。
液体培养与生化萃取: 优势与局限
由于高度聚合的蛋白质只占总蛋白的一小部分, 因此有必要在大量的动物中开始提取。由于大量的不溶性蛋白, 因此, 进行广泛的多肽分馏, 以减少样品的复杂性, 质谱, 从而提高对低丰度蛋白质的鉴定是可行的。如果只需要少量的不溶性蛋白质, 另一种方法是在盘子上生长蠕虫, 用陶瓷珠子质它们。液体文化的缺点之一是, 在污染的情况下, 整个文化受到影响, 必须放弃。通常, C. 线虫的老化受到温度的强烈影响, 必须在液体培养中严格控制此参数, 以避免年龄依赖性蛋白质聚集的变化。在使用gon-2 (-)突变体时, 温度控制对于获得无性腺动物的同种种群也是必不可少的。
根据研究的目的, 重要的是要考虑不同的提取方法。这里提出的生物化学提取最初是根据协议来隔离疾病相关的聚合体11,30,31。我们选择了相对高浓度的洗涤剂, 如 0.5% SDS, 以隔离更不溶性的聚合体。此外, 通过将 0.5% SDS 不溶性集料以低离心速度制粒, 本议定书只将较大的骨料隔离。或者, 最近发布了一个不太严格的协议10。在这项研究中, 还提取了更多的可溶性和较小的骨料, 通过省略 SDS 和使用非常高的离心速度在 50万 x g。对不同协议的比较表明, 使用不太严格的协议7, 聚合蛋白质组中蛋白质的数量普遍增加。我们注意到, 长寿命的动物与减少的daf-2信号有效地阻止了 sds 可溶性和 sds 不溶性聚集物在性腺较少的动物中的积累7。
在体内年龄依赖性蛋白质聚集性分析
在构建适合于年龄依赖性蛋白质聚集的转基因模型时, 考虑在哪个组织中过度的聚集易感蛋白和表达水平是相关的。我们倾向于在头区的组织表达, 以避免干扰的自发荧光, 这是在老化肠道突出。为了使荧光标记的聚集体与 low-magnification, 聚集易发蛋白应表达在一个较高的水平。另一方面, 太高的表达会导致聚集易产生的蛋白质形成聚合体已经在幼小动物。
总之, 这些方法将帮助我们理解为什么部分蛋白质组聚集在一起的年龄, 并最终导致发展的战略, 促进健康的老龄化。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了 DZNE 和居里夫人国际重返社会补助金 (322120 至 D.C.D.) 的资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fernbach culture flask | Corning | 4425-2XL | Pyrex, Capacity 2,800 ml, with 3 baffle indents |
| Membrane Screw Cap | Schott | 1088655 | GL45 |
| Nutating Mixer | VWR | 444-0148 | |
| Separatory funnel | Nalgene | 4300-1000 | Capacity 1,000 ml |
| 1 ml syringe | BD Plastipak | 300013 | |
| Gray needle, 27 G x ½ ", 0.4 mm x 13 mm | BD Microlance 3 | 300635 | |
| Membrane filters 0.025 µM | Millipore | VSWP04700 | |
| pH strip | Machery-Nagel | 92110 | pH-Fix 0-14 |
| Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 4693132001 | Complete Mini EDTA-free tablets |
| Octoxynol-9 | Applichem | A1388 | Triton X-100 |
| 4-Morpholineethanesulfonic acid (MES) | Sigma-Aldrich | M1317 | |
| Nonylphenylpolyethylenglycol | Applichem | A1694 | Nonidet P40 (NP40) |
| DNaseI | Roche | 04716728001 | recombinant, RNase free |
| RNaseA | Promega | A7973 | solution |
| Total protein blot staining | Thermofisher | S11791 | Sypro Ruby protein blot stain |
| Total protein gel staining | Thermofisher | S12001 | Sypro Ruby protein gel stain |
| TCEP (tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride) | Serva | 36970 | |
| Iodoacetamide | Serva | 26710 | |
| Ammoniumbicarbonate | Sigma-Aldrich | 09830 | |
| Sequencing Grade Modified Trypsin | Promega | V5111 | |
| Isobaric tags for relative and absolute quantitation | Sciex | 4352135 | iTRAQ Reagents Multiplex Kit |
| Centrifuge Avanti J-26XP | Beckmann Coulter | 393126 | |
| Ultracentrifuge Optima Max-XP | Beckmann Coulter | 393315 | |
| Centrifuge 5424R | Eppendorf | 5404000413 | |
| Centrifuge 5702 | Eppendorf | 5702000329 | |
| Centrifuge Megafuge 40R | Thermo Scientific | 75004518 | |
| Concentrator Plus | Eppendorf | 5305000304 | Centrifugal evaporator |
| Fluorescent stereo-microscope M165 FC | Leica | With Planapo 2.0x objective | |
| Dissection microscope | Leica | Leica S6E | |
| High magnification microscope Zeiss Axio Observer Z1 | Zeiss | With PlanAPOCHROMAT 20x objective and Zeiss Axio Cam MRm | |
| Software | |||
| Image analysis software | ImageJ | ||
| Analysis of mass spectrometry data | Protein Prospector | http://prospector.ucsf.edu/prospector/mshome.htm | |
| E.coli strain | |||
| OP50 | CGC | ||
| RNAi bacteria | |||
| L4440 | Julie Ahringer RNAi library | ||
| C. elegans mutants | |||
| CF2253 | CGC, strain name: EJ1158 | Genotype: gon-2(q388) | |
| C. elegans transgenics | |||
| DCD214 | Della David's lab at DZNE Tübingen | Genotype: N2; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::pab-1] | |
| DCD215 | Della David's lab at DZNE Tübingen | Genotype: daf-2(e1370) III; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::pab-1] |
References
- Balch, W. E., Morimoto, R. I., Dillin, A., Kelly, J. W. Adapting proteostasis for disease intervention. Science. 319, 916-919 (2008).
- David, D. C. Aging and the aggregating proteome. Frontiers in genetics. 3, 247 (2012).
- Hartl, F. U., Bracher, A., Hayer-Hartl, M. Molecular chaperones in protein folding and proteostasis. Nature. 475, 324-332 (2011).
- Ayyadevara, S., et al. Age- and Hypertension-Associated Protein Aggregates in Mouse Heart Have Similar Proteomic Profiles. Hypertension. 67, 1006-1013 (2016).
- David, D. C., et al. Widespread protein aggregation as an inherent part of aging in C. elegans. PLoS biology. 8, 1000450 (2010).
- Demontis, F., Perrimon, N. FOXO/4E-BP signaling in Drosophila muscles regulates organism-wide proteostasis during aging. Cell. 143, 813-825 (2010).
- Lechler, M. C., et al. Reduced Insulin/IGF-1 Signaling Restores the Dynamic Properties of Key Stress Granule Proteins during Aging. Cell reports. 18, 454-467 (2017).
- Reis-Rodrigues, P., et al. Proteomic analysis of age-dependent changes in protein solubility identifies genes that modulate lifespan. Aging cell. 11, 120-127 (2012).
- Tanase, M., et al. Role of Carbonyl Modifications on Aging-Associated Protein Aggregation. Scientific reports. 6, 19311 (2016).
- Walther, D. M., et al. Widespread Proteome Remodeling and Aggregation in Aging C. elegans. Cell. 161, 919-932 (2015).
- Lee, V. M., Wang, J., Trojanowski, J. Q. Purification of paired helical filament tau and normal tau from human brain tissue. Methods in enzymology. 309, 81-89 (1999).
- Goudeau, J., Aguilaniu, H. Carbonylated proteins are eliminated during reproduction in C. elegans. Aging cell. 9, 991-1003 (2010).
- Zimmerman, S. M., Hinkson, I. V., Elias, J. E., Kim, S. K. Reproductive Aging Drives Protein Accumulation in the Uterus and Limits Lifespan in C. elegans. PLoS genetics. 11, 1005725 (2015).
- Uno, M., Nishida, E.
- Sulston, J. H. The Nematode Caenorhabditis elegans. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 587-606 (1988).
- Maine, E. M. RNAi As a tool for understanding germline development in Caenorhabditis elegans: uses and cautions. Developmental biology. 239, 177-189 (2001).
- Rauniyar, N., Yates, J. R. Isobaric labeling-based relative quantification in shotgun proteomics. Journal of proteome research. 13, 5293-5309 (2014).
- Brignull, H. R., Morley, J. F., Garcia, S. M., Morimoto, R. I. Modeling polyglutamine pathogenesis in C. elegans. Methods in enzymology. 412, 256-282 (2006).
- Fay, D. S.
- Brunquell, J., Bowers, P., Westerheide, S. D. Fluorodeoxyuridine enhances the heat shock response and decreases polyglutamine aggregation in an HSF-1-dependent manner in Caenorhabditis elegans. Mech Ageing Dev. 141, 1-4 (2014).
- Angeli, S., et al. A DNA synthesis inhibitor is protective against proteotoxic stressors via modulation of fertility pathways in Caenorhabditis elegans. Aging (Albany NY). 5, 759-769 (2013).
- Feldman, N., Kosolapov, L., Ben-Zvi, A. Fluorodeoxyuridine improves Caenorhabditis elegans proteostasis independent of reproduction onset. PLoS One. 9, 85964 (2014).
- Davies, S. K., Leroi, A. M., Bundy, J. G. Fluorodeoxyuridine affects the identification of metabolic responses to daf-2 status in Caenorhabditis elegans. Mech Ageing Dev. 133, 46-49 (2012).
- Luo, S., Kleemann, G. A., Ashraf, J. M., Shaw, W. M., Murphy, C. T. TGF-beta and insulin signaling regulate reproductive aging via oocyte and germline quality maintenance. Cell. 143, 299-312 (2010).
- Andux, S., Ellis, R. E. Apoptosis maintains oocyte quality in aging Caenorhabditis elegans females. PLoS genetics. 4, 1000295 (2008).
- Vilchez, D., et al. RPN-6 determines C. elegans longevity under proteotoxic stress conditions. Nature. 489, 263-268 (2012).
- Ghazi, A., Henis-Korenblit, S., Kenyon, C. A transcription elongation factor that links signals from the reproductive system to lifespan extension in Caenorhabditis elegans. PLoS genetics. 5, 1000639 (2009).
- Shemesh, N., Shai, N., Meshnik, L., Katalan, R., Ben-Zvi, A. Uncoupling the Trade-Off between Somatic Proteostasis and Reproduction in Caenorhabditis elegans Models of Polyglutamine Diseases. Front Mol Neurosci. 10, 101 (2017).
- Kaletsky, R., et al. The C. elegans adult neuronal IIS/FOXO transcriptome reveals adult phenotype regulators. Nature. 529, 92-96 (2016).
- Kawarabayashi, T., et al. Age-dependent changes in brain, CSF, and plasma amyloid (beta) protein in the Tg2576 transgenic mouse model of Alzheimer's disease. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 21, 372-381 (2001).
- Kraemer, B. C., et al. Neurodegeneration and defective neurotransmission in a Caenorhabditis elegans model of tauopathy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 9980-9985 (2003).
