Summary
Vi presentiamo un protocollo per la sincronizzazione della timidina doppia delle cellule HeLa seguita da analisi mediante microscopia confocale ad alta risoluzione. Questo metodo è la chiave per ottenere il numero elevato di celle che procedono in modo sincrono dalla fase S alla mitosi, permettendo studi sui ruoli mitotici delle proteine multifunzionali che possiedono anche funzioni di interfase.
Abstract
Studio dei vari eventi regolatori del ciclo cellulare in un modo dipendente dalla fase fornisce una chiara comprensione sulla crescita delle cellule e la divisione. La sincronizzazione delle popolazioni delle cellule in specifiche fasi del ciclo cellulare è stata trovata per essere molto utile in tali sforzi sperimentali. Sincronizzazione delle cellule dal trattamento con sostanze chimiche che sono relativamente meno tossico può essere vantaggioso rispetto all'uso di farmaci inibitori farmacologici per lo studio del ciclo cellulare conseguente eventi e ottenere arricchimento specifico delle fasi mitotiche selezionati. Qui, descriviamo il protocollo che sincronizzazione cellule umane nelle diverse fasi della cella ciclo, compresi sia in fase S e M con un blocco di doppia timidina e rilasciare procedura per studiare la funzionalità delle proteine mitotic in allineamento del cromosoma e la segregazione. Questo protocollo è stato estremamente utile per studiare i ruoli mitotici delle proteine multifunzionali che possiedono funzioni di interfase stabilito. Nel nostro caso, il ruolo mitotic di Cdt1, una proteina fondamentale per la replica di origine licenza nella fase G1, possa essere studiato in modo efficace solo quando Cdt1 G2/M-specifici possono essere esaurite. Descriviamo il protocollo dettagliato per lo svuotamento di G2/M specifiche Cdt1 utilizza la sincronizzazione della timidina doppia. Abbiamo anche spiegare il protocollo di fissazione delle cellule e live imaging cellulare mediante microscopia confocale ad alta risoluzione dopo il rilascio della timidina. Il metodo è anche utile per analizzare la funzione delle proteine mitotic in condizioni sia fisiologiche che sconcerta come per Hec1, un componente della Ndc80 complesso, poiché consente di ottenere campioni di grandi dimensioni di cellule mitotiche per cella fissa e dal vivo analisi come indichiamo qui.
Introduction
Nel ciclo cellulare, le cellule subiscono una serie di eventi altamente regolamentati e controllati temporaneamente per la duplicazione esatta del loro genoma e la proliferazione. Nei mammiferi, il ciclo cellulare è costituito da interfase e fase M. In interfase, che consiste di tre fasi - G1, S, e G2, la cellula Duplica il suo genoma e subisce una crescita che è necessaria per ciclo cellulare normale progressione1,2. Nella fase M, che consiste di mitosi (profase, prometafase, metafase, anafase e telofase) e citochinesi, un cellulare parentale produce due cellule figlie geneticamente identiche. Nella mitosi, sorella cromatidi del genoma duplicato sono condensati (Profase) e vengono catturati a loro cinetocori dai microtubuli del fuso mitotico assemblato (prometafase), che spinge il loro allineamento alla piastra di metafase (metafase) seguita da loro uguale segregazione quando sorella cromatidi sono diviso verso e trasportati al mandrino opposto poli (anafase). Le due cellule della figlia sono fisicamente separate dall'attività di un anello contrattile di actina-basato (telofase e citochinesi). Il cinetocore è una struttura specializzata proteinaceo che assembla alla regione centromerica di cromatidi e fungono da siti di attacco per i microtubuli dell'alberino. La sua funzione principale è di guidare la cattura del cromosoma, allineamento e aiuto nella correzione allegato microtubule mandrino improprio, mentre mediando il checkpoint di montaggio del mandrino per mantenere la fedeltà del cromosoma segregazione3,4.
La tecnica di sincronizzazione del cellulare serve come uno strumento ideale per comprendere gli eventi molecolari e strutturali coinvolti nella progressione del ciclo cellulare. Questo approccio è stato utilizzato per arricchire le popolazioni delle cellule alle fasi specifiche di vari tipi di analisi, tra cui analisi di espressione genica, analisi di processi biochimici cellulari e la rilevazione della localizzazione subcellulare delle proteine. Cellule di mammifero sincronizzate possono essere utilizzate non solo per lo studio dei prodotti genici individuali, ma anche per gli approcci di analisi di genomi interi tra cui analisi di microarray di gene espressione5, miRNA espressione modelli6, regolazione traduzionale7e l'analisi proteomica di proteina modifiche8. Sincronizzazione può anche essere utilizzato per studiare gli effetti di espressione genica o proteina knock-down o knock-out, o di sostanze chimiche sulla progressione del ciclo cellulare.
Le cellule possono essere sincronizzate nelle diverse fasi del ciclo cellulare. Metodi fisici e chimici sono ampiamente utilizzati per la sincronizzazione delle cellule. I criteri più importanti per la sincronizzazione delle cellule sono che la sincronizzazione dovrebbe essere noncytotoxic e reversibile. A causa delle potenziali conseguenze negative cellulare di sincronizzazione di cellule da agenti farmacologici, metodi chimico-dipendente possono essere vantaggiosi per studiare gli eventi chiave del ciclo cellulare. Ad esempio, hydroxyurea, amphidicolin, mimosina e lovastatina, può essere utilizzati per la sincronizzazione delle cellule in fase G1/S ma, a causa del loro effetto sulle vie biochimiche che inibiscono, attivare meccanismi di checkpoint del ciclo cellulare e uccidere un importante frazione delle cellule9,10. D'altra parte, feedback inibizione della replicazione del DNA con l'aggiunta di timidina ai media crescita, noti come "blocco" di timidina, può arrestare il ciclo cellulare a determinati punti11,12,13. È inoltre possibile sincronizzare le cellule in fase G2/M trattando con nocodazole e RO-33069,14. Nocodazole, che impedisce di microtubuli, ha una relativamente alta citotossicità. Inoltre, le cellule nocodazole-arrestato possono tornare in interfase precocemente di slittamento mitotico. Doppia timidina blocco arresto cellule alla fase G1/S e dopo il rilascio dal blocco, le cellule si trovano a procedere in modo sincrono attraverso G2 e nella mitosi. La normale progressione del ciclo cellulare per cellule rilasciato dal blocco di timidina può essere osservata in microscopia confocale ad alta risoluzione da fissazione delle cellule o formazione immagine dal vivo. L'effetto di perturbazione delle proteine mitotic possa essere studiato specificamente quando le cellule entrare e procedere attraverso mitosi dopo il rilascio dal blocco doppio della timidina. Cdt1, una proteina multifunzionale, è coinvolto nel DNA replica origine licensing in fase G1 e inoltre è richiesto per gli allegati cinetocore dei microtubuli durante la mitosi15. Per studiare la funzione di Cdt1 durante la mitosi, uno ha bisogno di adottare un metodo che evita l'effetto del suo svuotamento su replica delle licenze durante la fase G1, mentre allo stesso tempo effettuando il suo svuotamento in particolare durante la fase G2/M solo. Qui, presentiamo dettagliati protocolli basati sul blocco di timidina doppia per studiare il ruolo mitotico delle proteine eseguire diverse funzioni nelle varie fasi del ciclo cellulare da formazione immagine fissa e cellule vive.
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Protocol
1. doppio blocco di timidina e rilascio: preparazioni di reagente
- Fare 500 mL che Dulbecco per volta medium medium (DMEM) Eagle supplementato con 10% FBS, penicillina e streptomicina.
- Fare magazzino di 100mm di timidina in acqua sterile e conservare in aliquote a-80 ° C.
2. il protocollo per l'Imaging cellulare fisso di progressione mitotica (Figura 1A)
- Il giorno 1, seme ~ 2 x 105 le cellule HeLa nei pozzetti di una piastra a 6 pozzetti con un vetrino coprioggetto (sterilizzato con etanolo al 70% e l'irradiazione UV) e 2 mL di terreno DMEM. Crescere le cellule in un incubatore per 24 h a 37 ° C e 5% CO2.
- 1 blocco di timidinast : il giorno 2, miscelare accuratamente il volume richiesto di timidina nei media DMEM fresco (100 mM stock, 2mm concentrazione finale).
- Aggiungere 2 mL di timidina contenente media per le cellule in ogni pozzetto del pozzo 6-piastra ed incubare per 18 h.
- Il giorno 3, il mezzo di aspirare e lavare le cellule due volte con 2 mL di PBS 1x 1 e una volta con DMEM preriscaldati fresco; crescere le cellule in medium DMEM preriscaldati fresco per 9 h per rilasciare cellule dal blocco.
- 2nd timidina blocco: nuovamente aggiungere 2 mL di timidina contenente media (concentrazione finale di 2 mM) per le cellule in ciascun pozzetto della piastra 6 pozzetti.
- Incubare per un altro 18 h.
- Il giorno 4, aspirare il mezzo e lavare le cellule due volte con 2 mL di PBS 1x 1 e una volta con DMEM preriscaldati fresco.
- SiRNAs diluito (controllo e Cdt1) e reagente di transfezione in mezzo libera crescita siero separatamente per 10 min. mescolare insieme e incubare per 20 minuti a TA. La concentrazione finale di siRNA utilizzato in ogni transfezione era di 100 nM. Aggiungere la miscela di reazione per le cellule che sono state lavate fuori della timidina.
- Incubare le cellule a 37 ° C per 9-10 h rilasciare da bloccare e fissare le cellule su vetrini coprioggetto con 4% PFA per 20 minuti a TA.
Attenzione: PFA è tossico, indossare una protezione appropriata. -
Immunostain cellule, dopo permeabilizing con detergente 0.5% (v/v) per 10 min a RT e lavare le cellule due volte con PBS 1X per 5 minuti ciascuno.
- Bloccare le cellule con BSA 1% (p/v) in 1X PBS per 1h a RT seguita da trattando le cellule con 50 µ l di anticorpi primari (anticorpo anti-α-tubulina, diluito 1:1, 000, anticorpo di coniglio anti-Zwint1 diluito a 1: 400 e mouse anti-fosfo-ɣ H2AX diluito a 1: 300) in 1% (p/v) BSA in PBS 1X per 1 h a 37 oC.
- Dopo aver lavato le cellule con 1x PBS tre volte, trattare le cellule con 50 µ l di anticorpi secondari per ogni vetro di copertura (Alexa 488 e rodamina rosso alle diluizioni 1: 250 a 1% (p/v) BSA in 1X PBS) per 1 h a TA.
- Dopo aver lavato le cellule con PBS 1X due volte per 5 minuti ciascuno, trattare le cellule con DAPI (0.1 µ g / mL in PBS 1X) per 5 minuti a TA.
- Dopo aver lavato le cellule con PBS 1X due volte per 5 minuti ciascuno, posizionare il vetrino coprioggetto rivolto verso le cellule per il supporto di montaggio appropriato su un vetrino trasparente al microscopio.
- Immagine delle celle per le proteine immunostained con 60 X o 100 obiettivo a immersione in olio X 1.4 NA piano-apocromatico DIC montate su un microscopio confocale invertito ad alta risoluzione dotato di una fotocamera appropriato come necessario per la qualità delle immagini necessarie.
- Acquisire immagini a temperatura ambiente come z-pile di spessore di 0,2 µm utilizzando il software appropriato per il microscopio.
3. protocollo per Live Cell Imaging della progressione mitotica (Figura 3A)
- Il giorno 1, circa 0,5-1 x 105 cellule HeLa che esprimono stabilmente mCherry-H2B e GFP-α-tubulina (leggermente variabile in base al tipo di cellula e le proteine che essi esprimono) in piatti di fondo di vetro 35mm con 1,5 mL di terreno DMEM di semi e farli crescere in un umidificata incubatrice per 24 h a 37 oC e 5% CO2.
- 1 blocco di timidinast : il giorno 2, aggiungere 1,5 mL di timidina contenente media per le cellule nel piatto (timidina 100mm, concentrazione finale di 2 mM,).
- Incubare per 18 h.
- Il giorno 3, aspirare il supporto contenente timidina e lavare le cellule tre volte, due volte con 2 mL di PBS 1X e una volta con DMEM preriscaldati fresco.
- SiRNAs diluito (controllo e Hec1) e reagente di transfezione con il mezzo di crescita gratis siero separatamente per 10 minuti mescolare insieme e incubare per 20 minuti a TA. La concentrazione finale di siRNA utilizzato in ogni transfezione era di 100 nM. Aggiungere la miscela di reazione per le cellule che sono state lavate fuori della timidina.
- Crescere le cellule in 1,5 mL di terreno DMEM preriscaldato nuovo per 8 h rilasciare cellule dal blocco.
- 2nd timidina blocco: aggiungere 1,5 mL di timidina contenente media (concentrazione finale di 2 mM) per le cellule nel piatto.
- Incubare per un altro 18 h.
- Il giorno 4, aspirare il mezzo e lavare le cellule tre volte, due volte con 2 mL di PBS 1X e una volta con DMEM preriscaldati fresco. Poi crescere le cellule in Leibovitz preriscaldati fresco di media (L-15) completati con 10% FBS e 20 mM HEPES a pH 7.0 per 8 h rilasciare cellule dal blocco.
- Mettere il piatto nella camera di controllo di temperatura impostata nel microscopio confocale ad alta risoluzione che ha già acceso per almeno 30 minuti prima di iniziare l'imaging per stabilizzare le temperature sul palco e sperimentale.
- Fuoco nel campo luminoso con obiettivo 60x fino a quando le cellule sono visibili, quindi manualmente setacciare sul palco nella regione di scelta.
- Impostare la luce e laser potenza/esposizione, parametri di acquisizione immagine e la durata dell'esperimento utilizzando il software di acquisizione di immagine microscopio di scelta. Utilizzare filtri per GFP (eccitazione 488; 385 nm emissione) e mCherry (561 nm eccitazione e 385 nm emissione) per acquisire immagini.
- Eseguire l'esperimento di time-lapse acquistando separatamente pulsata luce trasmessa e fluorescenza immagini ogni 10 min per un periodo fino a 16 ore.
- Acquisire immagini come dodici 1.0 µm-separati z-aerei a 9 h dopo il rilascio dal blocco della timidina doppia utilizzando il software appropriato al microscopio.
- Analizzare le immagini monitoraggio delle singole celle per progressione mitotica e infine montare il film corrispondente con il software di fonte Fiji/ImageJ.
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Representative Results
Studio della progressione mitotica e la stabilità dei microtubuli in cellule risolti dopo rilascio da doppio blocco di timidina
Cdt1 è coinvolto nella concessione di licenze di origini di replicazione del DNA nella fase G1. È degradata durante la fase S, ma ri-si accumula in fase G2/M. Per studiare il suo ruolo nella mitosi, il Cdt1 endogeno ha bisogno di essere impoverito specificamente alla fase G/M usando la tecnica di sincronizzazione cellulare più adatta, la timidina doppio blocco15. Le cellule transfected con siRNA immediatamente dopo il rilascio dal blocco 2nd timidina, quando le cellule sono nella S di fase e dal momento che le licenze delle origini di replicazione in G1, che richiede anche la funzione di Cdt1, è lungo stata completata. Lo svuotamento di Cdt1 dopo 9 h di transfezione di siCdt1 e doppio rilascio di blocco della timidina è stato validato mediante Western blotting (Figura 1B). Fissazione delle cellule 9 h dopo il rilascio dal blocco della timidina doppia mostra che la maggior parte delle cellule sono in fase di metafase in sia controllo che Cdt1 siRNA transfected le cellule. Ma la fissazione di cellule 10 h dopo il rilascio dal blocco della timidina doppia mostra che la maggior parte delle cellule trattate con siRNA di Cdt1 ancora sono arrestate in fase tardiva prometafase mentre le cellule di controllo immettere anafase e normalmente segregano loro cromosomi come previsto (Figura 1 ). Per comprendere l'effetto di svuotamento Cdt1 sulla stabilità del cinetocore-microtubulo (kMT), le cellule sono state fissate a 9 h dopo il rilascio dal doppio blocco di timidina seguita da trattamento a freddo, che solo mantiene stabili cinetocore-microtubuli (kMTs). La kMTs delle cellule Cdt1-vuotati sono relativamente meno robusto dopo trattamento a freddo rispetto a quello delle cellule di controllo (Figura 1). Così, utilizzando questo approccio, la progressione delle cellule mitotiche normali dopo la perturbazione della funzione delle proteine mitotiche di interesse può essere studiata in modo efficace, anche senza l'uso di formazione immagine di cellule vive.
La figura 2 Mostra che la concessione di licenze di origine di replicazione del DNA non è perturbato quando le cellule sono vuotate di Cdt1 in fase G2/M utilizzando il nostro protocollo, che inoltre è stata osservata in cellule di controllo. Cellule impoverite di Cdt1 durante la fase G2/M non hanno indotto l'accumulazione di ɣH2AX fosforilato, un indicatore di danno del DNA, durante la successiva fase G2; considerando che la transfezione di siRNA delle culture asincrone per vuotare Cdt1 indotta accumulo dei fuochi di fosfo-ɣH2AX-positivo, probabilmente a causa di danni al DNA indotti da improprio DNA replica delle licenze.
Studio della progressione mitotica nelle cellule dopo il rilascio dal blocco di timidina doppia da formazione immagine di cellule vive
Dopo la rottura dell'involucro nucleare (NEB), le cellule normali (in assenza di perturbazione di una proteina funzionale mitotica) immettere mitosi e sottoporsi ad insorgenza anafase per uscire dalla mitosi entro circa 30-60 min (Figura 3B). Ma atterramento di RNAi-mediata di Hec1, una proteina chiave cinetocore che è richiesta per la formazione di kMT robusto allegato, è stato trovato per ritardare la progressione mitotica normale. In questo scenario, maggior parte delle cellule immettere mitosi dopo il NEB, ma non subiscono inizio anafase o uscita dalla mitosi anche dopo diverse ore di ritardo in mitosi (Figura 3). Allo stesso modo, l'effetto di RNAi-mediata atterramento di qualsiasi altra proteina che localizza ai cinetocori o aventi una funzione durante la mitosi può così essere osservato efficacemente mediante imaging di tensione delle cellule dopo la liberazione dai blocchi di timidina doppia. Oltre a studiare la natura della progressione mitotica, ritardo e arresto, sono alcuni dei altri fenomeni mitotici chiavi che possono essere analizzati utilizzando questo metodo cromosoma allineamento, formazione del fuso mitotico e l'attivazione di posizionamento e silenziamento della checkpoint di montaggio del mandrino.
Figura 1: analisi della progressione mitotica e la stabilità dei microtubuli cinetocore in celle fisse dopo la doppia sincronizzazione di timidina. (A), A rappresentazione schematica della cella sincronizzazione, fissazione e immunofluorescenza. (B) Western blot per atterramento di Cdt1 dopo 9 ore di rilascio dal 2 ° blocco di timidina. (C) micrografie di immunofluorescenza per mostrare le cellule mitotiche fisso 9 e 10 h dopo il rilascio dalla timidina doppio blocco e trattamento con controllo (in alto) o Cdt1 siRNA (in basso). Macchiatura di α-tubulina è in rosso, il DNA è in verde, come le cellule esprimono GFP-istone H2B. Barra della scala = 10 µm. cellule prometafase e metafase sono indicate utilizzando giallo e bianco rispettivamente le punte delle frecce. Cellule HeLa (D) dopo il trattamento con siRNA di controllo (pannello superiore) e dopo svuotamento Cdt1 (pannello inferiore) per 9 h dopo il rilascio dal doppio blocco di timidina seguita dal trattamento con gelida Leibovitz (L-15) medio e la fissazione. Le cellule erano immunitario-macchiato per mandrino MT (verde) e un indicatore del cinetocore, Zwint1 (rosso) e DAPI per DNA in bianco e nero. Barra della scala = 5 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Cdt1-svuotamento durante la fase G2/M non perturbare la replica delle licenze. Cellule HeLa asincrone trattati con luciferasi di controllo (pannello superiore) o cdt1 siRNA (pannello centrale) o doppia timidina sincronizzato cellule HeLa trattate con siRNA cdt1 durante la 2nd timidina sbiaditura seguita da fissazione a 10 h dopo il rilascio (pannello inferiore) erano macchiati con DAPI (pseudo-colore verde) e l'anticorpo anti-fosfo-ɣH2AX (rosso). Barra della scala = 10 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: analisi della progressione mitotica da live cell imaging in sincronizzato cellule. (A), A rappresentazione schematica di sincronizzazione cellulare e live cell imaging. Cellule HeLa che esprimono stabilmente mCherry-istone H2B e GFP-α-tubulina sono stati liberati dal blocco di timidina doppia per 8 h per far loro da arresto di fase S procedere alla fase G2/M. Formazione immagine diretta è stata effettuata utilizzando un microscopio confocale ad alta risoluzione a partire 8 h dopo il rilascio le cellule dal blocco di timidina e continuando per fino a 16 h da quel punto. Le immagini fisse dal video catturato ogni 10 min per controllo celle senza perturbazione di alcuna proteina mitotica (B) o di cellule impoverite della subunità Hec1 della Ndc80 complesse (C), sono indicate qui. Barre della scala = 10 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Il vantaggio più critico di sincronizzazione della timidina doppia è che fornisce una dimensione di campione maggiore di cellule mitotiche in una finestra di tempo breve con molte di queste cellule in mitosi sta entrando all'unisono, permettendo così anche analisi di allineamento del cromosoma, bipolare formazione e segregazione del cromosoma del mandrino con efficienza molto più alta.
Molti complessi proteina regolatrice e vie di segnalazione sono dedicate a garantire la normale progressione attraverso mitosi e deregolamentazione di questo processo potrebbe portato alla tumorigenesi. Live imaging cellulare delle cellule HeLa stabilmente esprimendo mCherry-H2B e GFP-tubulina e rilasciato dal doppio timidina blocco mostra che la maggior parte delle cellule di controllo segregano i loro cromosomi in anafase entro circa 60 min dopo NEB (Figura 3B). D'altra parte, live imaging cellulare delle cellule HeLa perturbate con Hec1 funzione Mostra che la maggior parte delle cellule rimanere nella fase mitotica per un lungo periodo con cromosomi disallineati seguiti da anafase insorgenza o apoptosi (Figura 3).
Timidina eccedente inibisce la sintesi del DNA durante la fase di S, bloccando così le cellule in fase di G1/S11. Anche se timidina doppio blocco sincronizzazione è il più comunemente usato metodo nello studio del ciclo cellulare e progressione mitotica, uno deve essere critico di alcune delle limitazioni di questo metodo. Importante, deve essere garantito che il prodotto chimico è stato lavato accuratamente (per 7-8 h) modo che l'effetto è completamente reversibile e cellule possono procedere normalmente con il resto del ciclo cellulare. Cellule in caso contrario non possono entrare il secondo ciclo, causando la progressione improprio però mitosi. La proporzione di cellule sincronizzate potrebbe non essere sufficientemente alta con un blocco singolo timidina e un blocco di timidina doppia può essere necessario aumentare il numero di cellule sincronizzate, soprattutto se si è interessati a studiare una specifica fase della mitosi. La durata del trattamento della timidina dovrà essere ottimizzata a causa della diversa sensibilità tra i tipi di cellule a seconda del tempo di generazione. Ad esempio, cellule di criceto hanno 16h del tempo di generazione e sono trattate con timidina per 11 h per sincronizzazione ottimale17. In questo studio, abbiamo trattato le cellule HeLa per 16-18 h con timidina. Inoltre, la timidina in eccesso non solo impedisce la sintesi del DNA, ma anche può uccidere importanti frazioni delle cellule11,12,18 e chiudere attenzione deve essere pagato per monitorare questa perdita. La soluzione di riserva della timidina utilizzata in questo studio dovrebbe essere preparata in acqua distillata sterile e deve essere miscelata accuratamente nel terreno di coltura cellulare per evitare la relativa precipitazione dopo aggiungendolo ai media di siRNA transfected le cellule e anche per garantire la sua omogenea distribuzione nei dintorni di cellule coltivate.
Per studiare la funzione di una proteina mitotic di destinazione durante la progressione mitotica, si sarebbe idealmente le cellule trattate con siRNA per atterramento i livelli della proteina di interesse durante il blocco di timidina 1st o durante il rilascio dal 1 ° blocco di timidina, dipendendo il tempo necessario per ottenere proteine efficiente atterramento19,20,21. D'altra parte, per studiare il ruolo delle proteine multifunzionali come Cdt1 durante la mitosi, è necessario trattare le cellule con siCdt1 durante il rilascio del blocco di timidina 2nd per ottenere specifico svuotamento G2/M. Cdt1 è un giocatore fondamentale nel licensing di DNA replica origini15. Per capire il suo ruolo specializzato durante la mitosi senza interferire con il suo ruolo nel licensing, Cdt1 deve essere vuotato specificamente a fase G2/M, che può essere realizzata in modo efficiente dalla doppia sincronizzazione di timidina, evitando così la necessità di ricorrere ad altri approcci di perturbazione di mitosi-specifici che sono difficili da eseguire. Lo svuotamento di Cdt1 nelle culture asincrone indurre risposta al danno al DNA dovuta all'interruzione delle licenze delle origini di replicazione del DNA, che a sua volta avrebbero confuso l'analisi di una funzione possibile per questa proteina durante la mitosi. Così, la tecnica di sincronizzazione della timidina doppia offre un approccio sperimentale unico per generare cellule che hanno subito una normale fase G1 e S ma mancavano Cdt1 funzione durante la fase G2 e M. Il significato speciale del nostro protocollo di sincronizzazione risiede nella sua inibizione delle proteine multifunzionali nella fase specifica (G2/M) per studiare le loro funzioni romanzo durante la mitosi. Pertanto, questo metodo sarà utile non solo per studiare il ruolo delle proteine che hanno molteplici funzioni durante le fasi di ciclo cellulare differenti ma anche di quella di tutta la proteina nel processo di allineamento del cromosoma, kMT allegati e segregazione del cromosoma mitotica.
Per l'imaging di cellule vive, dopo il rilascio dal blocco doppio timidina, le cellule vanno incubate in pre-riscaldato Leibovitz (L-15) supplementato con 10-20% FBS fino all'inizio dell'imaging. Le celle immettere mitosi a intervalli di tempo variabile dopo il rilascio dal blocco della timidina a seconda del tipo di cella. L'ora di inizio di cattura delle immagini o la fissazione deve essere ottimizzato a seconda del tipo di cella. Per l'imaging di cellule vive, l'utilizzo della microscopia confocale convenzionale può causare photobleaching durante la formazione immagine a lungo termine. D'altra parte, il microcopy confocale ad alta risoluzione offre un'immagine chiara e ad alta risoluzione con il limite minimo di effetti photobleaching.
I passaggi critici in questo protocollo sono la durata del trattamento della timidina, adeguato washout della timidina, la tempistica di trasfezione con siRNA e i tempi di avvio dell'imaging.
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Disclosures
Gli autori dichiarano che non hanno alcun interesse finanziario concorrenti.
Acknowledgments
Siamo grati alla dottoressa Kozo Tanaka dell'Università di Tohoku, Giappone per la condivisione di cellule HeLa che esprimono stabilmente mCherry-istone H2B e GFP-α-tubulina. Questo lavoro è stato supportato da una sovvenzione NCI in DV (R00CA178188) e dai fondi di Start-up presso la Northwestern University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM (1x) | Life Technologies | 11965-092 | Store at 4 °C |
| DPBS (1x) | Life Technologies | 14190-144 | Store at 4 °C |
| Leibovitz’s (1x) L-15 medium | Life Technologies | 21083-027 | Store at 4 °C |
| Serum reduced medium (Opti-MEM) | Life Technologies | 319-85-070 | Store at 4 °C |
| Penicillin and streptomycin | Life Technologies | 15070-063 (Pen Strep) | 1:1,000 dilution |
| Dharmafect2 | GE Dharmacon | T-2002-02 | Store at 4 °C |
| Thymidine | MP Biomedicals LLC | 103056 | Dissolved in sterile distiled water |
| Cdt1 siRNA | Life Technologies | Ref 10 | |
| Hec1 siRNA | Life Technologies | Ref 13 | |
| HeLa cells expressing GFP-H2B | |||
| HeLa cells expressing GFP-α-tubulin and mCherry H2B | Generous gift from Dr. Kozo Tanaka of Tohoku university, Japan | ||
| Formaldehyde solution | Sigma-Aldrich Corporation | F8775 | Toxic, needs caution |
| DAPI | Sigma-Aldrich Corporation | D9542 | Toxic, needs caution |
| Mouse anti-α-tubulin | Santa Cruz Biotechnology | Sc32293 | 1:1,000 dilution |
| Rabbit ant-Zwint1 | Bethyl | A300-781A | 1:400 dilution |
| Mouse anti-phospho-γH2AX (Ser139) | Upstate Biotechnology | 05-626, clone JBW301 | 1:300 dilution |
| Alexa 488 | Jackson ImmunoResearch | 1:250 dilution | |
| Rodamine Red-X | Jackson ImmunoResearch | 1:250 dilution | |
| BioLite 6 well multidish | Thermo Fisher Scientific | 130184 | |
| 35 mm Glass bottom dish | MatTek Corporation | P35GCOL-1.5-14-C | |
| Nikon Eclipse TiE inverted microscope | Nikon Instruments | ||
| Spinning disc for confocal | Yokagawa | CSU-X1 | |
| Ultra 888 EM-CCD Camera | Andor | iXon Ultra EMCCD | |
| 4 wave length laser | Agilent Technologies | ||
| Incubation System for Microscopes | Tokai Hit | TIZB | |
| NIS-elements software | Nikon Instruments |
References
- Lajtha, L. G., Oliver, R., Berry, R., Noyes, W. D. Mechanism of radiation effect on the process of synthesis of deoxyribonucleic acid. Nature. 182 (4652), 1788-1790 (1958).
- Puck, T. T., Steffen, J. Life Cycle Analysis of Mammalian Cells. I. A Method for Localizing Metabolic Events within the Life Cycle, and Its Application to the Action of Colcemide and Sublethal Doses of X-Irradiation. Biophys. J. 3, 379-392 (1963).
- Santaguida, S., Musacchio, A. The life and miracles of kinetochores. EMBO J. 28 (17), 2511-2531 (2009).
- Musacchio, A., Desai, A. A Molecular View of Kinetochore Assembly and Function. Biology (Basel). 6 (1), E5 (2017).
- Chaudhry, M. A., Chodosh, L. A., McKenna, W. G., Muschel, R. J. Gene expression profiling of HeLa cells in G1 or G2 phases. Oncogene. 21 (12), 1934-1942 (2002).
- Zhou, J. Y., Ma, W. L., Liang, S., Zeng, Y., Shi, R., Yu, H. L., Xiao, W. W., Zheng, W. L. Analysis of microRNA expression profiles during the cell cycle in synchronized HeLa cells. BMB Rep. 42 (9), 593-598 (2009).
- Stumpf, C. R., Moreno, M. V., Olshen, A. B., Taylor, B. S., Ruggero, D. The translational landscape of the mammalian cell cycle. Mol. Cell. 52 (4), 574-582 (2013).
- Chen, X., Simon, E. S., Xiang, Y., Kachman, M., Andrews, P. C., Wang, Y. Quantitative proteomics analysis of cell cycle-regulated Golgi disassembly and reassembly. J. Biol. Chem. 285 (10), 7197-7207 (2010).
- Rosner, M., Schipany, K., Hengstschläger, M. Merging high-quality biochemical fractionation with a refined flow cytometry approach to monitor nucleocytoplasmic protein expression throughout the unperturbed mammalian cell cycle. Nature Protocols. 8 (3), 602-626 (2013).
- Coquelle, A., et al. Enrichment of non-synchronized cells in the G1, S and G2 phases of the cell cycle for the study of apoptosis. Biochem. Pharmacol. 72 (11), 1396-1404 (2006).
- Amon, A.
- Cooper, S. Rethinking synchronization of mammalian cells for cell cycle analysis. Cell Mol. Life Sci. 60 (6), 1099-1106 (2003).
- Whitfield, M. L., Sherlock, G., Saldanha, A. J., Murray, J. I., Ball, C. A., Alexander, K. E., Matese, J. C., Perou, C. M., Hurt, M. M., Brown, P. O., Botstein, D. Identification of genes periodically expressed in the human cell cycle and their expression in tumors. Mol. Biol. Cell. 13 (6), 1977-2000 (2002).
- Vassilev, L. T., et al. Selective small-molecule inhibitor reveals critical mitotic functions of human CDK1. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (28), 10660-10665 (2006).
- Varma, D., Chandrasekaran, S., Sundin, L. J., Reidy, K. T., Wan, X., Chasse, D. A., Nevis, K. R., DeLuca, J. G., Salmon, E. D., Cook, J. G. Recruitment of the human Cdt1 replication licensing protein by the loop domain of Hec1 is required for stable kinetochore-microtubule attachment. Nat. Cell Biol. 14 (6), 593-603 (2012).
- Garcia, M., Westley, B., Rochefort, H. 5-Bromodeoxyuridine specifically inhibits the synthesis of estrogen-induced proteins in MCF7 cells. Eur. J. Biochem. 116 (2), 297-301 (1981).
- Bostock, C. J., Prescott, D. M., Kirkpatrick, J. B. An evaluation of the double thymidine block for synchronizing mammalian cells at the G1-S border. Exp. Cell Res. 68 (1), 163-168 (1971).
- Martin-Lluesma, S., Stucke, V. M., Nigg, E. A. Role of Hec1 in spindle checkpoint signaling and kinetochore recruitment of Mad1/Mad2. Science. 297, 2267-2270 (2002).
- Brouwers, N., Mallol Martinez, N., Vernos, I. Role of Kif15 and its novel mitotic partner KBP in K-fiber dynamics and chromosome alignment. PLoS One. 12 (4), e0174819 (2017).
- Dou, Z., et al. Dynamic localization of Mps1 kinase to kinetochores is essential for accurate spindle microtubule attachment. Proc Natl Acad Sci USA. 112 (33), E4546-E4555 (2015).
- Chan, Y. W., Jeyaprakash, A. A., Nigg, E. A., Santamaria, A. Aurora B controls kinetochore-microtubule attachments by inhibiting Ska complex-KMN network interaction. J Cell Biol. 196 (5), 563-571 (2012).
