Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

פרוטוקול עבור Decellularizing Cochleae העכבר עבור הנדסת רקמות האוזן הפנימית

Published: January 1, 2018 doi: 10.3791/56523
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 3
1Department of Otolaryngology, University of Kansas Medical Center, 2Stephenson School of Biomedical Engineering, University of Oklahoma, 3Department of Plastic Surgery, University of Kansas Medical Center

Summary

המטרה של פרוטוקול זה היא להפגין שיטה יעילה decellularize, decalcify cochleae העכבר עבור ניצול כמו פיגומים עבור יישומי הנדסת רקמות.

Abstract

אצל יונקים, תאים שיער mechanosensory המאפשרים שמיעה חוסר היכולת להתחדש, אשר מוגבל טיפולים עבור אובדן שמיעה. אסטרטגיות רפואה רגנרטיבית הנוכחי התמקדו משתילים בתאי גזע או מניפולציה גנטית של סביב תמיכה התאים באוזן הפנימית כדי לעודד החלפה של תאים פגומים גזע כדי לתקן אובדן שמיעה. ובכל זאת, מטריצות (ECM) עשוי לשחק תפקיד חיוני גרימת ושמירה על תפקוד של תאים שיער, לא נבדקה היטב. באמצעות את שבלולי ECM בדומה לפיגום לגדל תאי גזע בוגרים עשויים לספק תובנות ייחודיות איך הרכב ואת הארכיטקטורה של הסביבה חוץ-תאית מסייע תאים הסדירה פונקציה השמיעה. כאן אנו מציגים שיטה אנליטית, decellularizing cochleae של עכברים להשתמש פיגומים מקבל תאי גזע בוגרים perfused. בפרוטוקול הנוכחי, cochleae הם בודדו אותנו מהמתרחש עכברים לאללה, decellularized, decalcified. לאחר מכן, תאים ג'לי האנושי וורטון (hWJCs) הם בודדו אותנו מהמתרחש הטבור היו perfused בזהירות לתוך כל שבלול. Cochleae שימשו ריאקטורים, התאים היו תרבותי עבור 30 ימים לפני שעברו עיבוד לניתוח. Decellularized cochleae נשמרות לזיהוי מבנים חוץ-תאית, אך אינו חושף את הנוכחות של תאים או מורגש שברי DNA. התאים perfused לתוך שבלול פלשו רוב הפנים והחוץ של שבלול, גדלה ללא תקלות משך זמן של 30 ימים. לכן, השיטה הנוכחית ניתן ללמוד איך שבלולי ECM משפיע על התא התפתחות והתנהגות.

Introduction

שבלול הוא מבנה לולייני המורכב נמצאו הרקה. הוא מורכב של המבוך הגרמי החיצוני ואת המבוך membranous קונצנטריים, פנימית1. המבוך membranous מורכב 3 משבצות נוזלים: סקאלה vestibuli, סקאלה מדיה, ו טימפני סקאלה1. התקשורת סקאלה בתים האפיתל חושית, המורכב משילוב של מספר רב של סוגי תאים, אך התאים שיער חושית (HC), אשר מגלי אנרגיה מכנית של גלי קול דחפים עצביים2, הם מעניינים במיוחד. חשיפה טראומה אקוסטית3,4,5, תרופות6,7,המחלה8והזדקנות9 כל יכול לגרום תפקוד לקוי השמיעה דרך המוות HC. איבוד תאים שיער אצל יונקים הוא קבע, בניגוד HCs העופות, אשר יכול להתחדש לאחר פציעה10.

מגוון רחב של מאמצי מחקר עכשווי ביקשו לשחזר HCs אבוד, אף הגישות ניסיוני ספציפיים משתנים. מניפולציה של ביטוי גנים בתוך האפיתל חושית, השתלה של תאי גזע הבדיל מחוץ לגוף הם גישות דומיננטי בתחום, למרות שיטות אינדוקציה שואפים להבדיל תאי גזע לתוך שבלולי organoids היה ניסיון11,12,13. כל הגישות הללו הוא גם מסתמך ישירות על תאי גזע, או התפתחותית הותאם בשימוש בתאי גזע; עם זאת, רגע משותף, שעשוי להיות קריטי, אלמנט זה ה-ECM של שבלול עצמו14,15.

ECM לא רק מספק תמיכה פיזית תאים ורקמות, אשר כולל משטח אדהזיה תא, התפשטות, הישרדות של ההעברה, אך גם ממלא תפקידים חיוניים להתפתחות HCs ומן ספירלה גנגליון15,16 ,17. באופן טבעי ECM המתרחשים מספק אותות אינדוקטיבית להנחות תא בנחישות פנוטיפ ו/או תא אדהזיה התפשטות, הישרדות18. כתוצאה מכך, השימוש של שבלול decellularized בשילוב עם hWJCs בתרבית מציעים הזדמנות ייחודית לגלות את התפקיד של התחדשות ECM ו- HC. HWJCs הם סוג זמינים, נתינת תא מבודד מן האדם חוטי חבל הטבור המתנהגים כמו גזע mesenchymal19. HWJCs הראו את היכולת להבחין תא neurosensory שושלות20,21. לפיכך, בפרוטוקול הנוכחי מפרט את הבידוד, decellularization ו זלוף של cochleae מ- C57BL הגוויות עכבר עם hWJCs עבור הנדסת רקמות האוזן הפנימית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל ההליכים, לרבות בעלי חיים המתת חסד, נערכו לפי שאושרו אכפת לי חיה מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC) הפרוטוקול (תגיד #2014-2234) במרכז הרפואי של אוניברסיטת קנזס (KUMC).

הערה: HWJCs הם בודדו אותנו מהמתרחש חוטי חבל הטבור אנושי זה נתרמו על ידי מטופלים סיפק מדעת, דגימות שימשו לפי הפרוטוקולים שאושרו על-ידי אוניברסיטת קנזס הוועדה בנושאים אנושיים (KU-IRB #15402).

1. עצם הרקה הקציר ובידוד שבלול

  1. לערוף כראוי לאללה, בת שבוע 15 עכבר על ידי חיתוך בין הגולגולת לבין חוליות הראשון עם זוג מספריים כירורגיים חדים, ואז לרסס את הראש עם 70% אתנול לחטא (איור 1 א').
  2. קטיעות הגולגולת במטוס מאמצע-הווריד באמצעות אותו זוג מספריים כירורגיים (איור 1B-C, קווים מקווקווים) חדה.
  3. הסר את רקמת המוח לגולגולת באמצעות זוג מלקחיים (איור 1D, ראש חץ).
  4. לזהות העצם הטמפורלית דרך נוכחות של השמיעה העצב vestibular שורשים (איור 1E-F, ראשי חץ) על החלק הפנימי של הגולגולת, תעלת האוזן מבחוץ (איור 1F, חץ). לחתוך בזהירות דרך הגולגולת כדי לבודד את עצם הרקה מהשארית של הגולגולת (איור 1 ג'י).
    הערה: במקרים מסוימים, ייתכן שתהיה אפשרות לחטט בעדינות את עצמות הגולגולת מן העצם הטמפורלית שמסביב ללא צורך חיתוך.
  5. הכנס המלקחיים בסדר פתיחת תעלת האוזן כ 5 מ מ (איור 1 H), אז הטיפים לא לסכן את ניקב שבלול. בעדינות שבירת העצם של בולה (איור 1 H, האזור המוצלל אדום) אז זה שברים (קואיור 1I, אדום מנוקד).
    הערה: אם יש צורך, מיקרוסקופ לנתיחה עשויים לסייע בתהליך זה כדי להבטיח מיקום מדויק ומניפולציה של כלי נגינה.
  6. בעזרת מלקחיים בסדר, לחטט משם את שארית בולה מן העצם הטמפורלית, חשיפת המבוך הגרמי של שבלול (איור 1J, מרובעים אדום).
  7. מניחים צלחת פטרי גדולה מספיק כדי להכיל הרקה (לדוגמה, 30 מ מ ומעלה) מתחת לנתח היקף שדה ראייה, למלא אותו עם מספיק פוספט Buffered מלוחים (PBS) כדי לכסות את העצם הטמפורלית (למשל, 0.5-1 מ ל).
  8. להטביע הרקה עם בולה להסיר את PBS עם החלונות עגולה, סגלגל של שבלול פונה כלפי מעלה.
    הערה: הסרת שיווי המשקל של שבלול הוא לא הכרחי, כפי שיווי המשקל משמש גם נקודת אחיזה עבור מניפולציה המכוונת תכונות של שבלול (איור 1I ו איור 2B).
  9. באמצעות זוג מלקחיים ultra-בסדר, להסיר את העורק stapedial, אשר עובר דרך באוזן.
  10. הוסף עצה אחת של המלקחיים ultra-בסדר דרך הקשת של באוזן שבו העורק עברו, והרם בעדינות באוזן כלפי מעלה. באוזן disarticulated צריך להרים את החלון הסגלגל.
  11. משתמש קצה אחד של המלקחיים ultra-בסדר, לנקב את האליפסה, בחלונות העגולים.
  12. שימוש של PBS 1 x מלא 28.5-מד מזרק עם אבובים (הקוטר הפנימי 0.28 מ מ, הקוטר החיצוני 0.61 מ"מ) מצורפים, מקם את הצנרור מעל החלון הסגלגל (איור 2A -B).
    הערה: הפתיחה של הצינור ניתן לטפל באמצעות מלקחיים ultra-בסדר לסייע להבטיח מיקום מדויק.
    1. השתמש מזרק טריים ואת צינורות עבור כל שבלול.
  13. Perfuse 2 מיליליטר 10% אנטיביוטיקה-antimycotic (אנטי-נגד) ו- 10% פניצילין-סטרפטומיצין (עט-דלקת) ב- PBS דרך שבלול מעל 5 דקות כדי להסיר את perilymph. מה קורה מהר מדי עם לחץ רב מדי יגרום נזק המבנים הקנס בתוך שבלול.
    הערה: נהיגה באופן ידני את המזרק ביד כדי perfuse את הנוזל דרך שבלול הוא יעיל, למרות משאבה זלוף יכול לשמש אלטרנטיבה.
    1. אם פרפוזיה באופן ידני, השתמש זוג הקנס, עצמי סגירת מלקחיים לייצב שבלול (איור 2 א) במהלך זלוף על ידי האוחז בחלק שיווי המשקל של העצם הטמפורלית.
      הערה: למרות שאינך נדרש, זה משאיר שתי ידיים חופשיות להתמודד עם מכשירים; יד אחת יכול להסיע את המזרק (איור 2 א) ואילו השני ניתן למקם את הצנרור כראוי (איור 2B).
    2. שלב זה קדימה, לטפל כדי למנוע חשיפת שבלול שלא לצורך לשידור. היכרות עם בועות אוויר לתוך שטחים נוזלים יחסום זרימת נוזל ולאחר ייבוש נוסף יגרום נזק המבנים הקנס בתוך שבלול.
  14. להסיר ולמחוק כל שריר רקמות ועצמות והשריד באמצעות מלקחיים משובחים.
  15. במידת הצורך, אחסן cochleae מבודדים ב 4 ° C אנטי-אנטי 10%, 10% הפתרון עט-דלקת ב- PBS עד שבעה ימים בשינויים קבועים של פתרון אנטיביוטי כל 48 שעות.

2. עיבוד שבלול

  1. Decellularization
    1. עבור כל שבלול, מילוי בקבוקון נצנוץ 20-מ ל זכוכית עם dodecyl נתרן 1% חומצה גופרתית (מרחביות) פתרון במים מיוננים (DI) אשר משמש כדי decellularize שבלול.
    2. חותכים את העצה ממני פיפטה פלסטיק 7-mL העברה באמצעות סכין גילוח כך הפתח מספיק גדול עבור שבלול לעבור.
    3. באמצעות פיפטה של העברה, בעדינות צייר שבלול לתוך פיפטה כך עובר לקצה ניתוק על ידי כמה מילימטרים.
    4. לגרש שבלול לתוך המבחנה 1% פתרון מלא נצנוץ מרחביות.
    5. הפיצו 2 מ של 1% מרחביות במים מיוננים (DI) דרך שבלול בבקבוקון נצנוץ באמצעות פיפטה של העברה.
    6. למקם את המבחנה נצנוץ מסובב, ולאפשר את המבחנה נצנוץ לסובב במהירות של סל ד 10 במשך 72 שעות בטמפרטורת החדר.
      1. שנה 1% פתרון מרחביות כל 24 שעות ביממה במשך 72 h. . שמור על עצמך בעת שינוי מרחביות לחשוף לעולם לא שבלול לאוויר.
    7. רחץ שבלול שלוש פעמים במשך 30 דקות כל במים DI.
לבצע את מנקי בבקבוקון נצנוץ באותו המשמש את ההאשמות מרחביות; בשלב זה, שבלול הוא decellularized.
  • Decalcification
    1. הסר את יתרת כמות המים DI המבחנה נצנוץ, משאיר מספיק כדי להשאיר שבלול מתחת למים.
    2. כדי להתחיל decalcification, הוסף 5 מ של 10% חומצה ethylenediaminetetraacetic (EDTA) (0.02 נקודות ז) במים DI נצנוץ למבחנה המכילה שבלול.
    3. הפיצו 2 מיליליטר 10% EDTA במים DI דרך שבלול בבקבוקון נצנוץ באמצעות פיפטה של העברה.
    4. הכנס את המבחנה נצנוץ בחזרה מסובב, ולאפשר את המבחנה נצנוץ לסובב במהירות של סל ד 10 במשך 72 שעות בטמפרטורת החדר. לשנות את הפתרון EDTA 10% בכל 24 שעות ביממה במשך 72 h. יש להיזהר בעת שינוי פתרונות כך שבלול ואינו חשוף לאוויר.
    5. לשטוף שבלול 3 פעמים עבור 2 h כל עם PBS 1 x; בשלב זה, שבלול הוא decalcified.
  • אחסון
    1. לאחסן את cochleae עבור עד 72 שעות ב- 10% אנטי-נגד, 10% עט-דלקת פתרון ב- PBS ב 4 º C.
      הערה: פרקי זמן ממושכים אחסון ייתכן שניתן בשינויים קבועים של פתרון לאנטיביוטיקה; עם זאת, אחסון מורחב של cochleae מעובד לא אומתה ב פרוטוקול זה.

    • 3. רכש והרחבה של hWJCs

    1. לבודד hWJCs על פי פרוטוקולים שפורסמו בעבר22. בקצרה, קטע חבל הטבור מיתרי למקטעים של 3 ס מ.
    2. בזהירות עושים חתך רדוד עם איזמל לאורכו על כל קטע הטבור לפרוש ולחשוף וורטון הטבור. להשתמש מלקחיים כדי להסיר את כלי הדם.
    3. רחץ הטבור מקטעי פעמיים עם מספיק PBS (למשל, מ 40 ל 60 מ מ פטרי) ומטביעים את הרקמה. דק מינצ מקטעי רקמת עם אזמל. מעכלים רקמת ב- 100 מ מ צלחת פטרי עם 50 מ של עיכול בינוני (0.2% מסוג 2 collagenase, 1% פניצילין-סטרפטומיצין, בגלוקוז נמוך בינוני (DMEM ששינה הנשר של Dulbecco)).
    4. מקום רקמות לעכל בינוני על תפקודי לב / נשימה ב-50 סל ד לילה ב- 5% CO2, חממה 37 º C. למחרת, לדלל עיכול בינוני ביחס של 1:16 % 2 אנטיביוטיקה-antimycotic ב- PBS, גלולה תאים על ידי צנטריפוגה ב 500 x g בטמפרטורת החדר (~ 27 ° C) במשך 10 דקות להשליך תגובת שיקוע.
    5. Resuspend כדורי ב Mesenchymal תא גזע הצמיחה בינונית (MSCGM) ולשלב מחדש תאים. צלחת תאים על צפיפות של 7 x 103 תאים/cm2 בתרבות רקמה מטופלים T-75 המבחנות. תרבות HWJCs ב MSCGM, להרחיב את המעבר 5 לניסויים.
      הערה: HWJCs עשוי להיות תת תרבותי לתוך T-מבחנות גדולות יותר (למשל, T-150, T-300) כאשר passaging להגדיל תשואה של hWJCs לניסויים.

    4. אינפוזיה של hWJCs אל Decellularized Cochleae

    1. להכין decellularized cochleae
      1. באמצעות הטכניקה aseptic, לשטוף cochleae מאוחסנת ב- PBS 1 x שלוש פעמים במשך 30 דקות כל אחד.
      2. להעביר את cochleae לתוך בארות נפרדים של צלחת 24-ובכן, ולהוסיף 1 מ"ל של 37 ° C מראש חימם MSCGM.
      3. דגירה cochleae ב 5% CO2, 37 ° C תא תרבות חממה לקבוצות של h 1 לפני אינפוזיה של תאים.
    2. מביצועם hWJCs, resuspend
      1. שטיפת hWJCs עם 37 ° C מראש חימם 1 x PBS פעמיים.
      2. הוסף מספיק 37 ° C מראש חימם טריפסין עם EDTA 0.5% כדי לכסות את המשטח הקיבול של התא.
      3. דגירה hWJCs של עד 5 דקות 5% CO2, 37 ° C תא תרבות חממה.
        1. ודא כי 90% של תאים יש מנותקת השטח התרבות התא על-ידי הצגת תאים תחת מיקרוסקופ הפוכה.
          הערה: תאים ינוע הכלי תרבות הוא טפח בעדינות, יש להתנתק. תאים דייל, יש אינו מנותק.
        2. טפח בעדינות את צידי הבקבוק עוד יותר מכך התאים המצורפת.
      4. באמצעות הטכניקה aseptic, hWJCs העברה מכלי הקיבול תרבות אל צינור חרוטי 50-mL המכילים אמצעי אחסון המקבילה של MSCGM לנפח של טריפסין נהגו מביצועם התאים.
      5. גלולה של hWJCs על ידי צריך שתוציאו ב 500 g x בטמפרטורת החדר (~ 27 ° C) במשך 5 דקות.
      6. האחות תגובת שיקוע, resuspend hWJCs של MSCGM-ריכוז של תאים למ"ל 500,000.
    3. Perfuse cochleae
      1. העברת cochleae צלחת 24-ובכן חדשה באמצעות פיפטה של העברה.
      2. להוסיף טיפה של MSCGM כל שבלול כדי למנוע כל שבלול ממנו להתייבש.
      3. בעדינות אוריינט שבלול באמצעות מלקחיים ultra-בסדר, כך החלונות סגלגל ועגול פונות מעלה.
        הערה: שמור על עצמך קיצוני בעת טיפול ישירות כל שבלול כמו שבלול בקלות יתערער.
      4. באמצעות מזרק אינסולין 28.5-מד סטרילי עם צינורות מחוברים, צייר עד 0.2 מ"ל resuspended hWJCs (100,000 תאים).
      5. בעזרת מלקחיים בסדר מעוקר, הצב אבובים החלון הסגלגל.
      6. בעדינות, לאט לאט perfuse שבלול 0.2 מ של hWJCs resuspended באמצעות מזרק אינסולין 28.5-מד מחובר לצנרת פוליאתילן (הקוטר החיצוני: 0.61 מ מ, קוטר פנימי: 0.28 מ מ) במשך כ 5 דקות.
      7. לאחר זלוף, להוסיף 0.8 מ של 37 ° C מראש חימם MSCGM את טוב המכיל שבלול להביא את הנפח הכולל בבאר 1 מ"ל.
      8. חזור על צעדים 4.3.3-4.3.7 עבור כל שבלול, באמצעות מזרק טריים, אבובים בכל פעם.
      9. הכנס perfused cochleae 5% CO2, 37 ° C תא תרבות חממה, ושנה מדיה שלוש פעמים בשבוע.

    5. שבלול הקציר ושימור

    הערה: Cochleae עשוי להיות בתרבית וקצרו בכל נקודת זמן עד 30 ימים שלאחר זלוף.

    1. כדי לשמר את cochleae, לתקן את paraformaldehyde 4% ב- PBS 1 x לילה ב 4 ° C על פלטפורמה נדנדה.
    2. לאחר קיבוע, לשטוף cochleae עם 1 x PBS שלוש פעמים במשך 5 דקות.
    3. בהדרגה מייבשים שבלול עם אתנול, לנקות עם הממס פחמימן אליפטיות לפני הטבעה של פרפין.
    4. סעיף דגימות עובי של 10 מיקרומטר באמצעות מיקרוטום הר על זכוכית שקופיות מיקרוסקופ.
      הערה: הדוגמאות הם עכשיו מוכן היסטולוגית או immunohistochemical עיבוד באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    באמצעות השיטות המובאות כאן, decellularization מוצלחת של cochleae הוערך על-ידי בדיקת נוכחות או היעדרות של ה-DNA באמצעות 4 אינץ ', 6-diamidino-2-phenylindole (דאפי) מכתים. Cochleae נחשבו decellularized באופן מלא אם הדנ א לא זוהה בתוך שבלול decellularized. שבלול יליד מהניסוי הקודם זה לא עברה decellularization או decalcification שימש פקד חיובי כדי להמחיש את המבנים ותאים שנמצאו באופן מסורתי שבלול העכבר C57BL. שבלול decellularized-decalcified, אשר לא היה שום hWJCs חלוט, שימש פקד שלילי. אין גרעין התא דאפי צבעונית לכימות נצפו בכל אזור של סעיף הרקמה (איור 3). שני cochleae היו decellularized, decalcified, ואז רווי hWJCs עבור הפרוייקט הנוכחי. Cochleae decellularized-decalcified זה היו perfused עם hWJCs נצפו יש רבים דאפי צבעונית גרעינים בתוך שבלול, גדל על המעטפת גרמית מחוץ שבלול (טבלה 1). המשוערת הכוללת תא צפיפויות של התא חדורים שבלול הראשון היו תאים 113,759/שבלול לאחר 30 ימים של תרבות (איור 4 , איור 5) ועבור שבלול השני היו תאים 118,732/שבלול לאחר 30 ימים של תרבות (איור 6 ו איור 7). הערכות אלה צפיפות תא כוללים את סקאלה טימפני, סקאלה מדיה, וסקאלה פרוזדור ואמצעי אחסון של המבנים בתוך המרחבים נוזלים שלושה, אבל הערכות אלה נכללים כל המבוך הגרמי הנותרים. בנוסף, דגימות כל שבלול היו מוכתמים Hematoxylin ואאוזין (H & E) כדי להציג את הנוכחות של תאים, תכונות אנטומיות בתוך כל שבלול (איור 8). האנטומיה של מזערים שבלול נותר ללא שינוי בעיקר לאורך כל סעיפים מוכתמים; עם זאת, אין תאים היו לזיהוי בסעיף decellularized-decalcified (איור 8 ב'). הזיהוי של גרעין התא היה שונה באופן דרמטי בין שבלול מקורי (איור 8A) cochleae decellularized-decalcified עם תאים (איור 8C–D).

    Figure 1
    איור 1: העכבר בידוד עצם הרקה. ברגע העכבר מורדמים כראוי, לערוף את החיה על ידי חיתוך בין צוואר הרחם החוליה הראשונה בבסיס הגולגולת, לרסס את הראש עם אתנול לחטא (A). קטיעות הגולגולת במטוס sagittal סעיף (B–C) בעזרת זוג מספריים כירורגיים, דרך רקמת המוח והן עצם חד. הראש העכבר זיבצנטן (D, מנדיבל התחתון הוסר עבור עבודה ניסויית לא קשורים) אז כנראה על רקמת המוח הוסר כדי לחשוף את העצם הטמפורלית. שני foramina שדרכו שימושיים מעבר השמיעה ועצבים vestibular (E, אדום ראשי חץ) סימנים לזיהוי בהצלחה הרקה. הסר את הבשר של הגולגולת (F). תעלת האוזן החיצונית (F, חץ, החלונית העליונה) מספק רמז חיצוני שימושי גם כן. בזהירות לחתוך משם העצם עודף, עוזב רק המבודד העצם הטמפורלית (G). בולה (H, החלונית העליונה, האזור המסומן אדום) ואז בעדינות להסירו באמצעות מלקחיים בסדר (H, החלונית התחתונה). בולה עצם דק, יכול להיות בקלות סדוקים משם (אני) עד המבוך הגרמי של שבלול חשף (J, אדום מרובעים). גודל ברים על כל התמונות הם 1 מ מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

    Figure 2
    איור 2: שבלולי זלוף. ברגע העצם הטמפורלית היה מבודד בולה הוסר, שבלול ואז ניתן להגדיר עבור זלוף-מיקרוסקופ. כאשר פרפוזיה באמצעות מזרק מונע באופן ידני עם אבובים מצורף (, קו מנוקד) עשוי להיות שימושי לייצב שבלול באמצעות זוג מלקחיים עצמית הסגירה. בעדינות לצרף המלקחיים לחלק שיווי המשקל של העצם הטמפורלית (B) ולנוח המלקחיים נגד שפתו של הפטרי (A). זה מותיר שתי ידיים חופשיות לתפעל מכשירים במהלך זלוף. ביד אחת ואז יכולים לתמרן את המזרק, שליטה קצב זרימת הנוזל, בעוד היד השנייה ניתן למקם את הצנרור מעל החלון הסגלגל באמצעות זוג מלקחיים (B) השני. חיתוך ללא סוף הצנרור בזווית מאפשר מיקום קל, ומאפשר את הצנרור להציב כראוי בלי לחסום את שדה הראיה. סולם בר הוא 1 מ מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

    Figure 3
    איור 3: סעיף הרקמה של שבלול העכבר decellularized. מיקרוסקופ epi-פלורסנט זקוף שימש לשיקוף דוגמאות בהגדלה גדולה של 200 X (עינית X 10 ו- 20 X המטרה). תמונות היו תפרו יחד כדי ליצור במצרף 4 x 5. דאפי גרעיני מכתים מראה חוסר תאים מוצג בלוח א' באמצעות דאפי מסנן סט משותף (350 nm עירור, 470 פליטה nm), ואת overexposed של תמונה בגווני אפור של autofluorescence באמצעות מסנן משותף של isothiocyanate (FITC) fluorescein סט (490 nm עירור, 525 פליטה nm), המספק ציוני אנטומיים, מוצג בחלונית B. תא אוטומטיות ספירת בוצעו שלושה אזורים מעניינים, אשר מפורטים על שני לוחות A ו- B. סה כ תא ספירת חושבו עבור סעיף הרקמה כולה (1, קו לבן מלא) ושבלול (2, קו מקווקו). שני מספרים אלה שימשו כדי לחשב את מספר התאים במבנים גרמית מחוץ שבלול, אך בתוך הקצוות החיצוניים, הגרמי של סעיף הרקמה (3, שטח בין קו מנוקד קו מקווקו). סולם סורגים על כל התמונות הם 500 מיקרומטר.אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

    Figure 4
    איור 4: קטע בקרבת מקום ל- modiolar של העכבר decellularized שבלול 1 רווי hWJCs. דאפי מכתים גרעיני מוצג בחלונית ש-a מעולף על autofluorescence בגווני אפור overexposed, מערוץ ירוק, אשר מספק ציוני אנטומי. אוטומטי תא סעיפים בוצעו שלושה אזורים מעניינים, אשר מפורטים בלוח א'. סה כ תא ספירת חושבו עבור סעיף הרקמה כולה (1, קו לבן מלא) ושבלול (2, קו מקווקו). שני מספרים אלה שימשו כדי לחשב את מספר התאים במבנים גרמית מחוץ שבלול, אך בתוך הקצוות החיצוניים, הגרמי של סעיף הרקמה (3, שטח בין קו מנוקד קו מקווקו). צביעת דאפי מבודד מוצג בחלונית B, סף ההכתמה דאפי בשימוש במהלך כימות האוטומטי מוצג בחלונית C. סולם סורגים על כל התמונות הם 500 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

    Figure 5
    איור 5: תצוגה בהגדלה של מקטע בקרבת מקום ל- modiolar של העכבר decellularized שבלול 1 רווי hWJCs. דאפי מכתים גרעיני מוצג בחלונית ש-a מעולף על תמונה בגווני אפור overexposed, autofluorescence מן התעלה ירוק, אשר מספק ציוני אנטומי. צביעת דאפי מבודד מוצג בחלונית B, התמונה הסף המשמשת במהלך ספירת תאים אוטומטיות מוצג בחלונית C. מקומות נוזלים ואת מזערים פיינר שוכן בתוך שבלול יפה נשמרים במהלך decellularization וסלולרי תרבות שלבי הניסוי. סקאלה Vestibuli (SV), טימפני סקאלה (SM), Basilar ממברנה (מוניטור), Tectorial Membrane (TM), ספירלה לימבוס (L), של רוזנטל התעלה (RC), Modiolus (ז), ספירלה רצועה (SL) ו Vascularis לחריץ (*). הממברנה של Reissner לא הוגדרה בבהירות בסעיפים רקמות, כתוצאה מכך התקשורת סקאלה הוגדר מפורשות. סולם סורגים על כל התמונות הם 250 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

    Figure 6
    איור 6: קטע בקרבת מקום ל- modiolar של העכבר decellularized שבלול 2 זה היה רווי hWJCs. צביעת גרעיני דאפי מוצג לוח A, מעולף על autofluorescence בגווני אפור מערוץ ירוק, אשר מספק ציוני אנטומי. אוטומטי תא סעיפים בוצעו שלושה אזורים מעניינים, אשר מפורטים בלוח א'. סה כ תא ספירת חושבו עבור סעיף הרקמה כולה (1, קו לבן מלא) ושבלול (2, קו מקווקו). שני מספרים אלה שימשו כדי לחשב את מספר התאים במבנים גרמית מחוץ שבלול, אך בתוך קצות החיצוני, גרמית בסעיף רקמות (3, שטח בין קווים מקווקווים קו מנוקד). צביעת דאפי מבודד מוצג בחלונית B, סף ההכתמה דאפי בשימוש במהלך כימות האוטומטי מוצג בחלונית C. סולם סורגים על כל התמונות הם 500 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

    Figure 7
    איור 7: תצוגה בהגדלה של מקטע בקרבת מקום ל- modiolar של העכבר decellularized שבלול 2 זה היה רווי hWJCs. צביעת גרעיני דאפי מוצג לוח A, מעולף על autofluorescence בגווני אפור מערוץ ירוק, אשר מספק ציוני אנטומי. צביעת דאפי מבודד מוצג בחלונית B, התמונה הסף המשמשת במהלך ספירת תאים אוטומטיות מוצג בחלונית C. מקומות נוזלים ואת מזערים פיינר שוכן בתוך שבלולי נשמרים במהלך שלבי תרבות decellularization ותא של הניסוי. סקאלה Vestibuli (SV), טימפני סקאלה (SM), Basilar ממברנה (מוניטור), Tectorial Membrane (TM), ספירלה לימבוס (L), של רוזנטל התעלה (RC), Modiolus (ז), ספירלה רצועה (SL) ו Vascularis לחריץ (*). הממברנה של Reissner לא הוגדרה בבהירות בסעיפים רקמות, כתוצאה מכך התקשורת סקאלה הוגדר מפורשות. סולם סורגים על כל התמונות הם 250 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

    Figure 8
    איור 8: Hematoxylin ואאוזין מכתים של שליטה, שטופלו cochleae. Hematoxylin ואאוזין צבעונית מקטעים הצגה של שבלול טיפוסי עם מתנה מקורית תאים מוצג בחלונית A. פאנל B מכילה מבנים אותה כמו פאנל A, אך נמצא במרחק של שבלול decellularized לחלוטין, אשר משאירה את מטריצה חוץ-תאית. Cochleae שמוצג בעבר שני רווי hWJCs נראים לוחות C ו- D. האנטומיה שבלולי ברוטו נשאר ללא שינוי בעיקר באמצעות decellularization ותהליכי התרבות תאים, למרות אוכלוסיות תאים מסוים והמיקומים השתנו באופן דרמטי. סקאלה Vestibuli (SV), טימפני סקאלה (SM), Basilar ממברנה (מוניטור), Tectorial Membrane (TM), ספירלה לימבוס (L), של התעלה (RC), Modiolus (ז), ספירלה רצועה (SL) rosenthal לחריץ Vascularis (*). סולם סורגים על כל התמונות הם 250 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

    A1 שבלול + תאים A2 שבלול + התאים B2 שלילית
    שליטה שבלול המבוך הגרמי בחוץ 3,758 549 0 עצם מחוץ רווחים שבלול 248 586 0 בתוך שבלול 518 701 0 סה כ תאי 4,524 1,836 0 סעיף נפח (μl) 0.0077 0.0100 0.0147 אחוז נפח שבלול 0.46% 0.59% 0.87% אומדן תא צפיפות בתוך שבלול 113,759 118,732 0

    טבלה 1: תא ספירות. דאפי צבעונית מקטעים שבלולי היו thresholded, כימות באמצעות כלים אוטומטיים ספירה ב ImageJ 3 אזורים שאינם חופפים עניין (מחוץ המבוך הגרמי, עצם הרקה מחוץ הרווחים הנוזל בשבלול האוזן, ובתוך שבלול). חתך אזור שבלולי נמדדה גם ב- ImageJ, ערך זה שימש לחישוב נפח סעיף בשילוב עם סעיף עובי (10 מיקרומטר). באמצעות הערכה של הנפח שבלולי הכולל בהוצאת סנטי. et al. 23, נפח שבלולי היחסי של קטע נתון מחושב. צפיפות תא שבלול כולו הוערך שימוש באמצעי האחסון שבלולי היחסי של המקטע הנתון בשילוב עם ספירת לזווג.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    בהצלחה הראו כי ניתן להסיר תאים שבלולי יליד שבלול באמצעות תהליך decellularization, מה שמאפשר עבור השימוש של שבלול לגרדום רקמות מורכבות, תלת מימדי. סנטי ואח. 15 פיתח את שיטת הראשוני עבור decellularizing cochleae, במדויק העריכו את אמצעי האחסון של מבנים רבים-שבלולי דרך בעזרת מיקרוסקופ אור גיליון23. עבודה מוקדמת כל כך שימש בסיס חזק הנדסת רקמות וטכניקות התרבות התא המוצג כאן. שבלול decellularized בהצלחה יכול להיות מוחדר עם תאים ולאחר מכן תרבותי לתקופה ממושכת של זמן. תיאורטית יכול להיות מנוצל cochleae ממגוון רחב של החיות בשילוב עם מגוון רחב באופן דומה של סוגי תאים. אלה שילובים לאפשר את הטכניקות המובאים כאן כדי להיות מנוצל עיצובים מוטוריים אפשריים רבים, כגון רקמות יישומי לבחון פיתוח חושי אפיתל14, סמים בדיקות של סוכנים חדשים התרופות הנדסה 24, פיתוח של תיקון שבלולי הדגמים25. עם זאת, למרות תחולתה רחבה של טכניקות אלה הן אינן ללא מגבלות.

    אחת המגבלות של הטכניקה הנוכחית הוא זלוף הוא משתנה בהתבסס על הפרט. בעל, שבלול, ופיתוח באמצעות מזרק משאבה לנהל perfusions עשוי להגביר את הדיוק ואת ההצלחה של התהליך. בנוסף, בהחלט מוכיח decellularization מוצלח יכול פוטנציאל להתבצע באמצעות מספר שיטות. אנחנו מועסקים דאפי מכתים שבה השתמשת כדי לכמת את גרעין התא הנותרים, הבחנו אין גרעינים שיורית פוסט-decellularization. בנוסף, תקן ה-DNA כימות מבחני לנצל את מגיב, צבע ירוק גילוי picogram כמויות של ה-DNA, לזהות שרידים חומצת גרעין, אשר באופן חזותי עשוי להיות רגיש יותר דאפי לזיהוי הנוכחות של רסיסי nucleic חומצות רקמות decellularized26. בין טכניקות אשר משמשים לאימות decellularization מוצלח, זה לא ייתכן שניתן להראות decellularization מלאה של שבלול בודדים לפני ניצול זה בדומה לפיגום. עם זאת, מצאנו את תהליך decellularization להיות מוצלח וחזק.

    שני השלבים הקריטיים ביותר בפרוטוקול הנוכחי הם בידוד הטיפול cochleae, זלוף של cochleae. זהירות רבה יש לנקוט כאשר שבלול מופרד בתחילה, כמו שבלול הוא עדין ושביר. אם יותר מדי כוח זה מוחל בעת טיפול שבלול עם מלקחיים, שבלול יכול קטע. לכן, זה הכרחי כדי להתמודד עם כל שבלול בעדינות לפני decellularization ו- decalcification. מערכת שיווי המשקל, אם נותר ללא פגע, משמש נקודת אחיזה מעולה תופס את האוזן הפנימית מורכבת עם מלקחיים, המכוונת שבלול. באופן דומה, כאשר פרפוזיה שבלול עם תאים, הלחץ מאחורי זלוף אינו יכול להיות גדול מדי, אחרת תאים עלול לא לשרוד את זלוף. כאמור בפרוטוקול הנוכחי, הצמדת אבובים עד הסוף של מזרק אינסולין 1-mL מאפשר טיפול קל יותר של שבלול עם יד אחת, דיוק רב יותר פרפוזיה תאים דרך שבלול עם היד השנייה.

    כצעד הבא, זה יהיה טבעי כדי להעריך את סמני התפתחותית ופונקציונליים כדי לקבוע אם ה-ECM שבלול הוא גרימת התמיינות של תאי גזע, ואם, אילו רכיבים ספציפיים ECM ב שבלול הם גרימת שינויים בתאים. פרפוזיה סוגים שונים של תאים (למשל, תאי גזע, neuroprogenitors, fibroblasts, וכו ') דרך שבלול צג תאית התמיינות ובאופן הפעולה תהיה חקירה מעקב מרתק. בנוסף, תאים ששונו גנטית או נחשפים פרוטוקול בידול פקטורי גדילה עלול מספקים תובנות חדשות איך ה-ECM שבלולי תומך פיתוח neurosensory, ואולי אף פונקציה בדיון. כך, הפרוטוקול הנוכחי הוא צעד ראשון משמעותי באמצעות ECM שבלול ללמוד באוזן הפנימית neurosensory פיתוח ותחזוקה, אשר אולי יום אחד להוביל לפיתוח טיפולים חדשים כדי לשחזר את אובדן שמיעה.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    המחברים אין לחשוף.

    Acknowledgments

    הפרויקט הנוכחי מומן על ידי אוניברסיטת קנזס הוכחת הרעיון קרן. ברצוננו להודות. האחיות-KUMC (קנזס סיטי, קאי אס) עבור מסייע לנו בהשגת האנושי חבל הטבור חוטי יורגנסן דוד על סיוע עם תרבויות cochleae.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Allegra X-14R Centrifuge Beckman-Coulter B08861
    Intramedic Semi-Rigid Tubing Becton Dickinson 427401
    New Brunswick Innova 2000 Orbital Shaler Eppendorf M1190-0002
    Surgical Scissors Fine Science Tools 14060-10
    Fine Forceps Fine Science Tools 11370-40
    Ultra-Fine Forceps Fine Science Tools 18155-13
    50-mL Conical Tubes Fisher Scientific 12565271
    Petri Dish Fisher Scientific FB087579B
    U-100 Insulin Syringe Fisher Scientific 14-829-1B
    Scintillation Vial Fisher Scientific 03-341-73
    Rotator Fisher Scientific 88-861-049
    Transfer Pipette Fisher Scientific 22-170-404
    Razor Blade Fisher Scientific 12-640
    Antibiotic-Antimycotic Fisher Scientific 15-240-062
    Penicillin-Streptomycin Fisher Scientific 15-140-122
    24-Well Plate Fisher Scientific 07-200-84
    SuperFrost PLUS Glass Microscope Slides Fisher Scientific 12-550-15
    Transfer Pipette Fisher Scientific 22-170-404
    ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI Fisher Scientific P36935
    Clear-Rite 3 Fisher Scientific 22-046341
    Thermo Scientific Forma Series II 3110 Water-Jacekted CO2 Incubator Fisher Scientific 13-998-078
    Mesenchymal Stem Cell Growth Medium Lonza PT-3001
    Trypsin-EDTA Lonza CC-3232
    TPP T-75 Culture Flask MidSci TP90076
    TPP T-150 Culture Flask MidSci TP90151
    TPP T-300 Culture Flask MidSci TP90301
    Dissection Microscope Nikon Instruments SMZ800
    Nikon Eclipse Ts2R-FL Inverted Microscope Nikon Instruments MFA51010
    NuAire Class II, Type A2 Biosafety Cabinet NuAire NU-425-600
    1X PBS Sigma-Aldrich P5368-10PAK
    1% SDS Solution Sigma-Aldrich 436143-100G
    10% EDTA Sigma-Aldrich E9884-100G

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Raphael, Y., Altschuler, R. A. Structure and innervation of the cochlea. Brain Res Bull. 60 (5-6), 397-422 (2003).
    2. LeMasurier, M., Gillespie, P. G. Hair-Cell Mechanotransduction and Cochlear Amplification. Neuron. 48 (3), 403-415 (2005).
    3. Neal, C., et al. Hair cell counts in a rat model of sound damage: Effects of tissue preparation & identification of regions of hair cell loss. Hear Res. 328, 120-132 (2015).
    4. Ivory, R., Kane, R., Diaz, R. C. Noise-induced hearing loss: a recreational noise perspective. Curr Opin Otolaryngol Head Neck Surg. 22 (5), 394-398 (2014).
    5. Stucken, E. Z., Hong, R. S. Noise-induced hearing loss: an occupational medicine perspective. Curr Opin Otolaryngol Head Neck Surg. 22 (5), 388-393 (2014).
    6. Dille, M. F., et al. Tinnitus onset rates from chemotherapeutic agents and ototoxic antibiotics: results of a large prospective study. J Am Acad Audiol. 21 (6), 409-417 (2010).
    7. Sajjadi, H., Paparella, M. M. Meniere's disease. Lancet. 372 (9636), 406-414 (2008).
    8. House, J. W., Brackmann, D. E. Tinnitus: surgical treatment. Ciba Found Symp. 85, 204-216 (1981).
    9. Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Acceleration of age-related hearing loss by early noise exposure: evidence of a misspent youth. J Neurosci. 26 (7), 2115-2123 (2006).
    10. Ryals, B. M., et al. Avian species differences in susceptibility to noise exposure. Hear Res. 131 (1-2), 71-88 (1999).
    11. Koehler, K. R., Mikosz, A. M., Molosh, A. I., Patel, D., Hashino, E. Generation of inner ear sensory epithelia from pluripotent stem cells in 3D culture. Nature. 500 (7461), 217-221 (2013).
    12. Sekiya, T., et al. Cell transplantation to the auditory nerve and cochlear duct. Exp Neurol. 198 (1), 12-24 (2006).
    13. Shi, F., Edge, A. S. Prospects for replacement of auditory neurons by stem cells. Hear Res. 297, 106-112 (2013).
    14. Mellott, A. J., Shinogle, H. E., Nelson-Brantley, J. G., Detamore, M. S., Staecker, H. Exploiting decellularized cochleae as scaffolds for inner ear tissue engineering. Stem Cell Res Ther. 8, (2017).
    15. Santi, P. A., Johnson, S. B. Decellularized ear tissues as scaffolds for stem cell differentiation. J Assoc Res Otolaryngol. 14 (1), 3-15 (2013).
    16. Davies, D., Holley, M. C. Differential expression of alpha 3 and alpha 6 integrins in the developing mouse inner ear. J Comp Neurol. 445 (2), 122-132 (2002).
    17. Gerchman, E., Hilfer, S. R., Brown, J. W. Involvement of extracellular matrix in the formation of the inner ear. Dev Dyn. 202 (4), 421-432 (1995).
    18. Goodyear, R. J., Richardson, G. P. Extracellular matrices associated with the apical surfaces of sensory epithelia in the inner ear: molecular and structural diversity. J Neurobiol. 53 (2), 212-227 (2002).
    19. Mellott, A. J., et al. Improving Viability and Transfection Efficiency with Human Umbilical Cord Wharton's Jelly Cells Through Use of a ROCK Inhibitor. Cell Reprogram. , (2014).
    20. Mellott, A. J., Shinogle, H. E., Moore, D. S., Detamore, M. S. Fluorescent Photo-conversion: A second chance to label unique cells. Cell Mol Bioeng. 8 (1), 187-196 (2015).
    21. Mitchell, K. E., et al. Matrix cells from Wharton's jelly form neurons and glia. Stem Cells. 21 (1), 50-60 (2003).
    22. Mellott, A. J., et al. Nonviral Reprogramming of Human Wharton's Jelly Cells Reveals Differences Between ATOH1 Homologues. Tissue Eng Part A. 21 (11-12), 1795-1809 (2015).
    23. Buytaert, J. A., Johnson, S. B., Dierick, M., Salih, W. H., Santi, P. A. MicroCT versus sTSLIM 3D imaging of the mouse cochlea. J Histochem Cytochem. 61 (5), 382-395 (2013).
    24. Nonoyama, H., et al. Investigation of the ototoxicity of gadoteridol (ProHance) and gadodiamide (Omniscan) in mice. Acta Otolaryngol. 136 (11), 1091-1096 (2016).
    25. Dai, C., et al. Rhesus Cochlear and Vestibular Functions Are Preserved After Inner Ear Injection of Saline Volume Sufficient for Gene Therapy Delivery. J Assoc Res Otolaryngol. , (2017).
    26. Sutherland, A. J., Converse, G. L., Hopkins, R. A., Detamore, M. S. The bioactivity of cartilage extracellular matrix in articular cartilage regeneration. Adv Healthc Mater. 4 (1), 29-39 (2015).

    Tags

    בביו-הנדסה גיליון 131: שבלול תא שיער לגרדום decellularize תאים ג'לי וורטון הנדסת רקמות תרבית תאים
    פרוטוקול עבור Decellularizing Cochleae העכבר עבור הנדסת רקמות האוזן הפנימית
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Neal, C. A., Nelson-Brantley, J. G., … More

    Neal, C. A., Nelson-Brantley, J. G., Detamore, M. S., Staecker, H., Mellott, A. J. A Protocol for Decellularizing Mouse Cochleae for Inner Ear Tissue Engineering. J. Vis. Exp. (131), e56523, doi:10.3791/56523 (2018).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter