Summary
Этот протокол описывает метод для одновременной обработки изображений thalamocortical аксона ветвления и СИНАПС формирования в organotypic cocultures таламуса и коры головного мозга. Аксоны отдельных thalamocortical и их Пресинаптический терминалы визуализируются путем электропорации техника одной ячейки с DsRed и synaptophysin GFP-тегами.
Abstract
Аксон ветвления и СИНАПС формирования являются важнейших процессов для установления точных нейронных цепей. Во время разработки сенсорные thalamocortical (TC) аксоны составляют филиалов и синапсы в определенных слоях коры головного мозга. Несмотря на очевидные пространственной корреляции между аксона ветвления и СИНАПС формирования плохо понимается причинно-следственной связи между ними. Для решения этой проблемы, мы недавно разработали метод для одновременной обработки изображений ветвления и СИНАПС формирования отдельных TC аксоны в organotypic cocultures.
Этот протокол описывает метод, который состоит из комбинации organotypic coculture и электропорации. Organotypic cocultures таламуса и коре облегчить генные манипуляции и наблюдения аксональное процессов, сохраняя характерные структуры, такие как ламинарная конфигурации. Два отдельных плазмид, кодировки DsRed и EGFP-меткой synaptophysin (SYP-EGFP) были совместно transfected в небольшое количество таламуса нейронов, метод электропорации. Этот метод позволил нам визуализировать отдельных аксональное морфологии TC нейронов и их Пресинаптический сайтов одновременно. Метод позволяет также долгосрочное наблюдение, который выявил причинную связь между аксона ветвления и СИНАПС формирования.
Introduction
Thalamocortical (TC) проекция в мозге млекопитающих является подходящей системы расследовать аксона руководства и ориентации механизмов. Во время разработки сенсорные TC аксоны растут в корковых плита и форма ветвей и синапсы преференциально в слой IV первичных сенсорных областей в коре1,2. Даже после установления основных соединений аксональное беседки и синаптическую терминалы перестроенный в зависимости от изменений окружающей среды3,4. Однако плохо понимается как TC аксона морфология динамически изменяется. Одна из главных причин является отсутствие надлежащей техники соблюдать структурных изменений на уровне отдельной ячейки. Хотя недавние события в микроскопии, например два Фотон микроскопии, позволили прямого наблюдения о жизни корковых нейронов в естественных условиях, есть еще технические ограничения для захвата общей ТК траектории5, 6. Таким образом, в пробирке методы для живых изображений TC аксонов обеспечит мощные инструменты для структурного анализа аксона ветвления и СИНАПС формирования.
Наша группа впервые создан метод культуры статический фрагмент с проницаемой мембраны7. С помощью этого метода, кусочек коры головного мозга крыс было cocultured с блоком сенсорные таламуса и пластинки конкретных TC соединения были сведены воедино в этой organotypic cocultures7,,8. Разреженные маркировки с флуоресцентный белок далее позволил нам наблюдать за ростом аксона TC и филиал формирование9,10,11. Недавно мы разработали новый метод для одновременного отображения ветвления и формирования синапсов отдельных TC аксоны в organotypic cocultures12. Чтобы визуализировать TC аксонов и Пресинаптический сайтов одновременно, совместно transfected в небольшое количество таламуса нейронов путем электропорации organotypic coculture DsRed и EGFP-меткой synaptophysin (SYP-EGFP). Текущий метод облегчает морфологический анализ TC аксонов и позволяет для долгосрочного наблюдения, который может использоваться для отображения причинная связь между аксона ветвления и СИНАПС формирования.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эксперименты проводились в соответствии с руководящими принципами, установленными комитетами животных Осакский университет и общество неврологии Японии.
1. Organotypic cocultures таламуса и коры головного мозга
Примечание: Подробные процедуры, обратитесь к оригинальной публикации7,8,13. Все процедуры должны выполняться в стерильных условиях. Крысах Sprague-Dawley (SD) используются для нейронов культур.
-
Подготовка реагентов
Примечание: Объемы следующих реагентов, для одного крыса мозга.- Подготовка 10 x изменение N2 дополнение 13: инсулин (50 мкг/мл), прогестерон (200 Нм), гидрокортизон (200 Нм), селенит натрия (300 Нм), трансферрин (1 мг/мл), путресцин (1 мм), глюкозы (60 мг/мл)
- Подготовка сыворотки содержащих питательной среды (10 мл): 85% DMEM/F12, дополнение N2 10 x изменения 10%, 5% плода бычьим сывороточным (ФБС)
- Подготовка сыворотки свободной культуры среднего (20 мл): 90% DMEM/F12, 10% 10 x изменения N2 дополнение
- Готовить крыс хвост коллагена раствор (0,5 мл). Короче говоря Возьмите нежный волокна от крыс хвост в стерильных условиях и инкубировать в растворе уксусной кислоты на ночь. После центрифугирования собирать супернатант (несколько мг/мл) и хранить в холодильник13.
-
Приготовление блюд культуры
- Место вставки мембраны в 35 мм Петри.
- Добавить 40-50 мкл раствора коллагена хвост крысы мембраны и распространение коллагена раствор вокруг центра.
- Воздух сухой мембрана полностью в чистой скамейке.
- Положите 1,5-2 мл сыворотки содержащих питательной среды в блюдо, так что мембрана пропитанной со средой.
- Место культуры блюдо в инкубатор (37 ° C, увлажненный воздух 95% и 5% CO2) перед обшивкой.
-
Подготовка корковых фрагментов
- Стерилизуйте всех хирургических инструментов с 70% этанол 10 минут или дольше.
- Вскрыть весь мозг быстро от послеродового день (P) 2 крысу под ледяной анестезии (погружен в кусочки льда на несколько минут).
- Место мозга в 100 мм Петри, содержащие 100 мл холодного Хэнкс сбалансированного солевого раствора.
- Удаление Пиа вопрос от мозга с тонкой щипцами и сократить корковых срезы (толщиной 300-400 мкм) от визуальных и соматосенсорной коры микрохирургическое ножницами (для подробной информации, смотрите Рисунок 1).
Примечание: Толщины коркового ломтиками примерно оценивается по шкале сетки под Микроскоп бинокулярный.
Примечание: В качестве альтернативы корковых ломтиками могут быть сделаны с vibratome в стерильных условиях. - Перенесите несколько кусочков коры на вставки мембраны с одноразовые пластиковые пипетки.
- Скорректировать позиции срезов рядом с центром культуры вставки с пожар полированные пипетка Пастера (подробности см.8,13) и удалите избыток среднего из вставки.
Примечание: Отрегулируйте уровень среднего чуть ниже поверхности срезов, таким образом, чтобы срезы можно получить достаточное количество как газа, так и среднего. Это имеет решающее значение для жизнеспособности клеток. - Поддерживать фрагменты в сыворотке содержащих питательной среды при 37 ° C в среде увлажненные 95% воздуха и 5% CO2, культуры и только на один день, прежде чем блок таламуса приняты и помещены рядом с ним.
-
Подготовка таламуса блоков
- Стерилизуйте всех хирургических инструментов с 70% этанол 10 минут или дольше.
- Анестезировать беременная крыса (эмбриональных день 15) внутрибрюшинной инъекцией Пентобарбитал (50 мг/кг), содержащий цистит.
- Вскрыть каждого эмбриона из рогов матки и эмбрионы в 100 мм Петри, содержащие 100 мл холодного Хэнкс сбалансированного солевого раствора.
- Под бинокулярный микроскоп удалите мозг от каждого эмбриона и режут таламуса блоки, содержащие главным образом в ventrobasal комплекс и боковых коленчатое (примерно 0,5 мм x 3)7 с использованием микрохирургической ножницы (см. Рисунок 1).
-
Культура и поддерживать organotypic cocultures
- Использование пипетки Пастера, место таламуса блок рядом с желудочковой поверхности корковых срез, который был сделан на мембраны фильтра.
- Сохранить cocultures в сыворотке содержащих питательной среды при 37 ° C в среде увлажненные воздуха 95% и 5% CO2.
- Обмен половина среды с сыворотка свободной культуры среднего после двух дней в культуре. После этого обмен носитель каждые 2-3 дня.
Примечание: Уровень среднего должны быть проверены после среднего обмена, как это важно для выживания клетки.
2. Электропорация
Все процедуры должны выполняться в стерильных условиях.
Примечание: Выполните электропорации один день после подготовки таламуса блоков для предотвращения отряд блоков.
-
Плазмиды
- Сделать смесь плазмид следующим: pCAGGS-DsRed 2 мкг/мкл; pCAG-SYP-EGFP 3,5 мкг/мкл.
Примечание: Очистить обе плазмид, используя набор бесплатно эндотоксинов Maxiprep и растворить в Hanks сбалансированного солевого раствора.
- Сделать смесь плазмид следующим: pCAGGS-DsRed 2 мкг/мкл; pCAG-SYP-EGFP 3,5 мкг/мкл.
-
Настройка оборудования Электропорация
Электрические инструменты, такие как стимулятор и изолятор должен быть подключен как показано на рисунке 2.- Соединить стимулятор двухфазный изолятор.
- Подсоедините к отрицательным изолятора электрода (серебряной проволоки диаметром 0,2 мм).
- Подключиться электродом (серебряной проволоки диаметром 1 мм) в серии 100 Ω резистор и положительные терминал изолятора.
- Подключите усилитель к осциллографу следить ли электрические токи передаются через резистор, измеряя напряжение с усилителем.
-
Подготовка стеклянной пипетки
Примечание: Для отстрела плазмида решения и применения электрических импульсов используются два типа стеклянной пипетки.- Сделайте пипетки из стеклянных капилляров с электродом съемник.
- Разбейте подсказка для отстрела пипетки (диаметр кончика должно быть 20-50 мкм).
- Измельчить и польский кончиком пипетки электрод с наждачной бумагой, после чего огонь шлифовальные (внутренний диаметр должен составлять 50-200 мкм).
Примечание: Электрода должна быть ровной и гладкой, поскольку он непосредственно затрагивает ткани.
-
Процедура Электропорация
- Подключите пипетки отстрела и электрода к манипуляторов.
- Вставьте серебряной проволоки (диаметром 0,2 мм) в пипетку электрода.
- Прикрепите отстрела пипетки к 1 мл шприц с надетой трубкой.
- Занять до > 5 мкл раствора плазмида в выброса пипетку в шприц всасывания.
- Поставьте coculture на сцене электропорация и вставьте электродами диаметром 1 мм в питательной среды.
- Место отстрела пипетки на эксплант таламуса.
- Вставьте шприц вручную после того, как кончик касается поверхности таламуса блока.
Примечание: О 0.5 мкл плазмида решение обычно используется в один блок таламуса. - Место электрода пипетки на блоке таламуса сразу же после втягивания отстрела пипеткой.
- Доставить электрические импульсы (μA 50-400, 3-5 поездов 200 прямоугольных импульсов продолжительностью 1 мс при 200 Гц). Отслеживание амплитуды и количество поездов на осциллограф.
Примечание: Амплитуды электрических токов зависит от внутреннего диаметра электрода пипеткой13. - Убрать пипеткой электрода и вернуть инкубатора блюдо.
-
Микроскопические наблюдения
- Положите культуры блюдо на микроскопические сцене вертикально Конфокальный микроскоп оснащен двумя наборами фильтров для EGFP (возбуждение, 488 нм; выбросов, 515 нм) и DsRed (возбуждения, 514 Нм; выбросов, 565 Нм).
- Возьмите изображения оптических разделов 10-25 на 1-7 мкм шаг размеров с 20 X Лонг рабочие расстояния объектива. Выберите индивидуально различимых помечены аксонов, которые выражают DsRed и SYP-EGFP.
Примечание: Наблюдаемые площадь составляет около 0,7 х 0,7 мм (соответствует 1024 x 1024 пикселей, то есть, 0,68 мкм/пиксель). - Захват изображения каждые 24 ч для ежедневных изображений. В течение 10 мин при комнатной температуре и возвращение культур в инкубаторе. За короткий промежуток времени Замедленная съемка изображений, сохранить культуру в камере культуры, которая утверждает, что окружающей среде увлажняется 95% воздуха и 5% CO2 при 37 ° C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Эксперимент, описанные здесь стремится выявить взаимосвязь между ТК аксона ветвления и СИНАПС формирования. Чтобы одновременно визуализировать аксональное траекторий и местах Пресинаптический сайтов, один или несколько таламуса клетки в organotypic cocultures были transfected с двумя плазмид кодирования SYP-EGFP и DsRed с помощью электропорации. В течение второй недели в культуре индивидуально различимых TC аксоны были четко обозначены DsRed (рис. 3). Только аксонов, которые выставлены DsRed и SYP-EGFP были отобраны для наблюдения. Приклеенные этикетку TC аксоны вторглись корковых срез и сформировали ветви главным образом в верхних слоях, указав, что таламуса аксоны в organotypic cocultures формы ветвей с ламинарным специфика походить, найденные в естественных условиях7, 8,10,14,,1516,17. В то же время можно наблюдать пунктата агрегаты SYP-EGFP (SYP-EGFP puncta) вдоль DsRed меченых TC аксоны (Рисунок 3D-3F). Поскольку эти SYP-EGFP puncta были в основном colocalized с immunopositive для VGLUT2, который является маркером Пресинаптический таламуса клеток, сигналы и сигналы для PSD95, который является общим постсинаптических маркером, вполне вероятно, что SYP-EGFP puncta основном представляют Пресинаптический сайты на TC аксоны12.
Промежуток времени изображений TC аксонов, далее показал, что аксон ветвления и формирования синапсов таламуса нейронов были непрерывный и динамичный, с добавлением и ликвидации (рис. 4)12. Кроме того большинство отделений были найдены выйти из puncta SYP-EGFP, указав, что Пресинаптический сайты спровоцировать отделение формирования (подробности см.12).
Рисунок 1 . Процедура подготовки organotypic cocultures таламуса и коре. (A) вид сверху из мозга новорожденных крыс. Первый разрез делается параллельно средней линии (1). Затем 300 - 500-мкм толщиной корональных секции, вырезанные из первичной визуальные и соматосенсорной коры (2). Наконец сделайте парасагиттальных вырезать для получения корковых ломтиками (3). (B) A схематическое представление organotypic coculture таламуса и коры головного мозга. Корковых фрагменты от послеродового день 2 крысы и таламуса блоков из эмбриональных день 15 cocultured на мембраны фильтра. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 . Схема электрических инструментов для электропорации. Стимулятор, изолятор и электрода пипеткой подключены в серии. Доставить отрицательно заряженной ДНК, Пипетка электрода подключен к негативные терминал изолятора. Электрических токов для электропорации может контролироваться с помощью осциллографа. TH: таламуса. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 . Аксоны Thalamocortical в coculture после 2 недель культуры. (FA–) ИССЛЕДОВАНИџ SYP-EGFP с DsRed в thalamocortical (TC) аксон. DsRed плюс SYP-EGFP плазмид были введены в культивированный таламуса клетки на 1 день в пробирке (DIV) с помощью электропорации. (A) organotypic coculture таламуса и корковые фрагментов после 12 DIV. (B) DsRed-меченых таламуса ячейки расширяет аксон в кортикальной срез и образует филиалов в верхних слоях. (C) увеличенное изображение в штучной упаковке региона в (A). (D-F) показывают DsRed меченых TC аксона (D) и SYP-EGFP puncta (E) в регионе в штучной упаковке (C). Дискретные накопление SYP-EGFP было отмечено вдоль аксона одного TC. TH: таламуса. Масштаб бары: (B) (C) , 1 мм 100 мкм и (F) 20 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4 . Промежуток времени изображений thalamocortical аксона, выражая SYP-EGFP и DsRed в organotypic coculture. DsRed плюс SYP-EGFP плазмид были введены в культивированный таламуса клетки на 1 DIV с помощью электропорации. Этот аксона было imaged ежедневно за 4 дня (11 DIV 14 DIV). Линейки: 50 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Текущий протокол является также мощным инструментом для изучения аспектов развития роста аксонов не проекции TC11. Например сочетание корковых ломтик культуры и метод электропорации позволяет визуализации отдельных аксональное морфология корковых нейронов и долгосрочные наблюдения9,18.
С помощью текущего протокола, роли интересных генов в аксона ветвления и СИНАПС формирования также могут быть проанализированы совместно выражением флуоресцентных белков и генов интерес. Как правило более 90% клеток выражая флуоресцентный белок совместно transfected с второй плазмида когда молярное соотношение решений плазмида корректируется до 1:218,19. Однако оптимальное соотношение может отличаться как сопредседатель трансфекции эффективность и уровень выражения разнообразны среди векторов.
Хотя текущий протокол является эффективным для покадровой экспериментов, есть некоторые технические проблемы. Для ежедневных изображений, coculture был сделан на микроскопические сцене каждый день. Хотя аксональное развития, по-видимому, не будут серьезно затронуты ежедневно изображений10, каждое наблюдение должно быть завершено в течение 10 мин, чтобы свести к минимуму испарения раствора культуры и изменения pH питательной среды. Кроме того было бы лучше для поддержания температуры, влажности и рН культур на микроскопические этап12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Мы также благодарим Габриэль руку для критических чтении.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F12 | GIBCO | 11320-033 | |
| Hanks’ balanced salt solution (HBSS) | Nissui | 5905 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Scientific | SH30396-03 | Hyclone |
| Insulin | Sigma | I6634 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Hydrocortisone | Sigma | H0888 | |
| Sodium selenite | Wako Pure Chemical Industries |
192-10843 | |
| Transferrin | Sigma | T1147 | |
| Putrescine | Sigma | P5780 | |
| Glucose | Wako Pure Chemical Industries |
16806-25 | |
| 35 mm petri dishes | Falcon | 351008 | |
| Millicell-CM insert | Millipore | PICMORG50 | |
| 100 mm petri dishes | BIO-BIK | I-90-20 | petri dish sterrile |
| HiPure Plasmid Maxiprep Kit | Invitrogen | K210006 | |
| Disposable sterile plastic pipettes | 202-IS | transfer pipets sterile | |
| Glass capillary: OD 1.2 mm | Narishige | G-1.2 | inner diameter, 1.2 mm |
| Silver wire: 0.2 and 1 mm | Nilaco | AG-401265 (diameter, 0.2 mm), AG-401485 (diameter, 1.0 mm) | |
| 1 mL syringe | Terumo | SS-01T | |
| Stimulator | A.M.P.I | Master 8 | |
| Biphasic isolator | BAK ELECTRONICS | BSI-2 | |
| Amplifier | A-M Systems | Model 1800 | |
| Oscilloscope | Hitachi | VC-6723 | |
| Manipulator | Narishige | SM-15 | |
| Micromanipulator | Narishige | MO-10 | |
| Stereomicroscope | Olympus | SZ40 | |
| Universal stand | Olympus | SZ-STU2 | |
| Light illumination system | Olympus | LG-PS2, LG-DI, HLL301 | |
| Electrode puller | Narishige | PC-10 | |
| Confocal microscope | Nikon | Digital eclipse C1 laser | |
| x20 objective | Nikon | ELWD 20x/0.45 | |
| Culture chamber | Tokai Hit | UK A16-U | |
| Sprague-Dawley (SD) rat | Japan SLC and Nihon-Dobutsu | ||
| Microsurgery scissors | Natsume | MB-54-1 |
References
- Kageyama, G. H., Robertson, R. T. Development of geniculocortical projections to visual cortex in rat: evidence early ingrowth and synaptogenesis. J. Comp. Neurol. 335 (1), 123-148 (1993).
- Lopez-Bendito, G., Molnar, Z. Thalamocortical development: how are we going to get there. Nat. Rev. Neurosci. 4 (4), 276-289 (2003).
- Espinosa, J. S., Stryker, M. P. Development and plasticity of the primary visual cortex. Neuron. 75 (2), 230-249 (2012).
- Portera-Cailliau, C., Weimer, R. M., De Paola, V., Caroni, P., Svoboda, K. Diverse modes of axon elaboration in the developing neocortex. PLoS Biol. 3 (8), 272 (2005).
- Holtmaat, A., Svoboda, K. Experience-dependent structural synaptic plasticity in the mammalian brain. Nat. Rev. Neurosci. 10 (9), 647-658 (2009).
- Bhatt, D. H., Zhang, S., Gan, W. B.
- Yamamoto, N., Kurotani, T., Toyama, K. Neural connections between the lateral geniculate nucleus and visual cortex in vitro. Science. 245 (4914), 192-194 (1989).
- Yamamoto, N., Yamada, K., Kurotani, T., Toyama, K. Laminar specificity of extrinsic cortical connections studied in coculture preparations. Neuron. 9 (2), 217-228 (1992).
- Uesaka, N., Hirai, S., Maruyama, T., Ruthazer, E. S., Yamamoto, N. Activity dependence of cortical axon branch formation: a morphological and electrophysiological study using organotypic slice cultures. J. Neurosci. 25 (1), 1-9 (2005).
- Uesaka, N., Hayano, Y., Yamada, A., Yamamoto, N. Interplay between laminar specificity and activity-dependent mechanisms of thalamocortical axon branching. J. Neurosci. 27 (19), 5215-5223 (2007).
- Uesaka, N., Nishiwaki, M., Yamamoto, N. Single cell electroporation method for axon tracing in cultured slices. Dev. Growth Differ. 50 (6), 475-477 (2008).
- Matsumoto, N., Hoshiko, M., Sugo, N., Fukazawa, Y., Yamamoto, N. Synapse-dependent and independent mechanisms of thalamocortical axon branching are regulated by neuronal activity. Dev Neurobiol. 76 (3), 323-336 (2016).
- Matsumoto, N., Sasaki, K., Yamamoto, N. Electroporation Method for Mammalian CNS Neurons in Organotypic Slice Cultures. Electroporation Methods in Neuroscience. , 159-168 (2015).
- Molnar, Z., Blakemore, C. Lack of regional specificity for connections formed between thalamus and cortex in coculture. Nature. 351 (6326), 475-477 (1991).
- Bolz, J., Novak, N., Staiger, V. Formation of specific afferent connections in organotypic slice cultures from rat visual cortex cocultured with lateral geniculate nucleus. J. Neurosci. 12 (8), 3054-3070 (1992).
- Yamamoto, N., et al. Inhibitory mechanism by polysialic acid for lamina-specific branch formation of thalamocortical axons. J. Neurosci. 20 (24), 9145-9151 (2000).
- Yamamoto, N., et al. Characterization of factors regulating lamina-specific growth of thalamocortical axons. J Neurobiol. 42 (1), 56-68 (2000).
- Ohnami, S., et al. Role of RhoA in activity-dependent cortical axon branching. J. Neurosci. 28 (37), 9117-9121 (2008).
- Yamada, A., et al. Role of pre- and postsynaptic activity in thalamocortical axon branching. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (16), 7562-7567 (2010).
