Summary
In het manuscript beschrijven we het gebruik van een kwantitatieve analyse van gist gebaseerde fluorescentie, verslaggever te identificeren van cellulaire componenten betrokken bij de handel en het doden van processen van de cytotoxische een subeenheid van de plant toxine ricine (RTA).
Abstract
Bacteriële en plant A / B toxines exploit de natuurlijke mensenhandel trajecten in eukaryotische cellen te bereiken hun intracellulaire doelgroep in het cytosol en uiteindelijk doden. Dergelijke A / B-toxine in het algemeen bestaan uit een enzymatisch actieve Asubunit (b.v., ricine toxine een (RTA)) en een of meer cellen bindende Bsubunit(s), die verantwoordelijk zijn voor de toxine binden aan specifieke cel oppervlakte receptoren. Onze huidige kennis van hoe A / B toxines in staat efficiënt bedwelmende cellen geholpen wetenschappers om te begrijpen fundamentele cellulaire mechanismen, zoals endocytose en intracellulaire eiwitten sorteren in hogere eukaryotische cellen zijn. Vanuit een medisch oogpunt is het ook belangrijk om te identificeren van de aanvoerroutes van grote toxine adequate behandeling om oplossingen te vinden voor patiënten of uiteindelijk therapeutische toxine gebaseerde om toepassingen te ontwikkelen voor kankertherapie.
Sinds het genoom-brede analyse van A / B-toxine handel in zoogdiercellen is complex, tijdrovend en duur, verschillende studies over A / B-toxine vervoer zijn uitgevoerd in de modelorganisme gist Saccharomyces cerevisiae. Ondanks het feit dat minder complex, fundamenteel cellulaire processen in gist en hogere eukaryotische cellen kunnen zijn vergelijkbaar en heel vaak de resultaten die zijn verkregen in gist worden overgedragen aan de zoogdieren situatie.
Hier beschrijven we een snelle en makkelijk te gebruiken verslaggever assay voor het analyseren van de intracellulaire mensenhandel van RTA gist. Een essentieel voordeel van de nieuwe bepaling is de mogelijkheid te onderzoeken van niet alleen RTA retro-translocatie van het endoplasmatisch reticulum (ER) in het cytosol, maar eerder endocytose en retrograde toxine transport uit het plasma-membraan in de ER. De bepaling maakt gebruik van een verslaggever plasmide waarmee indirecte meting van RTA toxiciteit door fluorescentie emissie van de groen fluorescente proteïne (GFP) na in vivo vertaling. Sinds de opening van de proteïne biosynthese RTA efficiënt door 28 rRNA depurination voorkomt, kan deze test de identificatie van de ontvangende cel eiwitten die betrokken zijn bij intracellulair RTA transport via de detectie van veranderingen in fluorescentie emissie.
Introduction
Patiënten met infecties door toxine producerende bacteriën vertegenwoordigen een ernstige medische en financiële lasten voor elke sociale systeem van de gezondheidszorg, in het bijzonder aangezien efficiënte therapeutische behandelingen nog grotendeels ontbreekt zijn. Ontwikkelen van nieuwe therapeutische strategieën, de mechanismen van de complexe intoxicatie van medisch relevante A / B toxines zoals cholera-toxine, Shiga-toxine of ricine moeten volledig worden begrepen op moleculair niveau gebaseerd op de roman krachtige tests die moeten worden uitgevoerd.
In de afgelopen jaren geprobeerd verschillende studies voor het analyseren van A / B-toxine vervoer in gist en zoogdiercellen met behulp van tijdrovende en kostenintensieve methoden zoals radioactieve toxine labeling1,2 , alsmede siRNA gebaseerde screening 3benaderingen. In sommige gevallen toxine mensenhandel gevisualiseerde geweest in vivo door fluorescentie microscopie na chemische en/of genetische koppeling van individuele toxine subeenheden met fluorophores, quantumdots of fluorescerende eiwitten4,5. Helaas leiden dergelijke wijzigingen vaak tot inactieve en/of gewijzigde natuurlijke eigenschappen van de toxines. Een andere elegante manier om niet indirect een breed scala aan wetenschappelijke vragen te beantwoorden is het gebruik van verslaggever systemen op basis van enzymen zoals lacZ, luciferase of fluorescerende eiwitten (bijvoorbeeld GFP of Discosoma sp. rood fluorescerende eiwit () dsRed)).
In dit manuscript, is een eenvoudig protocol beschreven waarin het cellulaire componenten die nodig zijn voor het intracellulair transport van extracellularly toegepaste RTA in S. cerevisiae. Daarmee fungeert een fluorescentie-reporter plasmide met een N-terminal ER-import signaal gevolgd door GFP als een eiwit biosynthese sensor, die niet indirect RTA-gemedieerde eiwit vertaling remming door GFP fluorescentie emissie na in vivo meet vertaling6. In geval dat RTA endocytose en/of intracellulaire handel negatief (of positief) ondergaat in een bepaalde gist schrapping mutant in vergelijking met wild-type, kan dit worden gedetecteerd via een toename (of afname) in GFP fluorescentie emissie6.
Tot nu toe waren alle methoden analyseren van RTA vervoer in gistcellen beperkt tot de ER-te-cytosol retro-translocatie proces van RTA. In zulk een kunstmatige systeem, RTA met een signaal van de import ER zich van een afleidbare promotor, resulterend in een suïcidale fenotype1,7. Hoewel de cel B-subunit van ricine bindend eveneens in de experimentele opstelling wordt beschreven in dit manuscript ontbreekt en, zo niet geheel representatief is de natuurlijke situatie van ricine holotoxin intoxicatie8, vervoer van toxine van het plasma membraan door het Golgi-apparaat naar de ER kan nauw met deze nieuwe test worden geïmiteerd. Interessant is dat blijkt de voorlopige resultaten van de pilot-studie dat de mensenhandel trajecten gebruikt door RTA opvallende gelijkenissen met de route van de dronkenschap van ricine holotoxin onthullen.
Kortom, kan de beschreven methode worden gebruikt om te bepalen van de specifieke rol van geselecteerde cellulaire eiwitten in RTA endocytose en handel in gist. Bovendien, deze experimentele opstelling kan gemakkelijk worden aangepast aan andere ribosoom inactiveren toxines geproduceerd en uitgescheiden door verschillende gist en bacteriesoorten zoals zymocin of Shiga-toxine.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Opmerking: Een overzicht van de algemene experimentele workflow is afgebeeld in Figuur 1.
Let op: RTA is zeer giftig voor de mens. Veiligheid lab toestemming S2 (biosafety level 2 equivalent) is nodig. Gelieve handschoenen te dragen tijdens het hele experiment.
1. heterologe uitdrukking van zijn-gelabeld RTA in Escherichia coli
- Transformeren van E. coli of cellen met waarden de expressie plasmide pET24-RTA(zijn) 6 de lege vector pET24a(+) met behulp van standaard electroporation protocollen9,10. Cellen met de lege plasmide dienen als een negatieve controle.
- Na selectie van positieve klonen op kanamycine-bevattende (100 µg/mL) LB platen, cellen met de RTA expressie plasmide of de lege vector in 5 mL LBkan medium (LB medium met 100 µg/mL kanamycine) beënten en incuberen bij 37 ° C en 220 rpm gedurende 24 uur.
- Aanvulling 1 L LBkan medium met 5 mL pre cultuur en Incubeer de cellen bij 37 ° C en 220 rpm tot cellen hebben bereikt een OD-600 voor 0.8-1.0 (ongeveer 3-4 h). Daarna Verlaag cultuur temperatuur tot 28 ° C en bereiden een 1 M van isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)-stockoplossing in H2O.
- Induceren RTA uitdrukking van de E. coli door toevoeging van IPTG aan een eindconcentratie van 1 mM.
- Na 3,5 uur bij 28 ° C en 220 rpm, oogst cellen door centrifugeren op 10.000 x g- en 4 ° C gedurende 10 min, het wassen van de pellet tweemaal met 5 mL bindende buffer (500 mM NaCl, imidazool 10 mM en 20 mM KH2PO4 pH = 7.4) op 10.000 x g- en 4 ° C gedurende 10 min, en resuspendeer pellet in 5 mL bindende buffer.
Opmerking: Protocol kan in dit stadium worden onderbroken en cellen kunnen worden achtergelaten bij 80 ° C voor meerdere dagen.
2. de zuivering van zijn-gelabeld RTA via de chromatografie van de affiniteit
- Bewerk ultrasone trillingen ten cellen op ijs met behulp van de onderstaande voorschriften: 15 s pulse (20 micron), 30 s pauze. Herhaal deze stap vijf keer.
- Centrifugeer cel lysate op 21.000 x g- en 4 ° C gedurende 15 minuten en filtreer bovendrijvende vloeistof met behulp van een steriele injectiespuit filtersysteem (0,2 µm poriëngrootte).
Opmerking: Cel pellets van monsters met succes sonicated transparante randen weergeven. - Gebruik een geautomatiseerde zuiveringsinstallatie uitgerust met een 5 mL Ni2 +-op basis van affiniteit kolom om te zuiveren van de Fractie zijn-gelabeld RTA uit de steriele gefiltreerd E. coli bezinken. In het algemeen, gebruik een elutie snelheid van 1 mL/min en koel de hele zuiveringsinstallatie om te voorkomen dat niet-efficiënte toxin binding en verlies van toxine activiteit.
Opmerking: Parameters voor efficiënte RTA zuivering worden weergegeven in tabel 1. Zie ook Becker et al.. voor verdere informatie9.- Kort, equilibreer de kolom affiniteit met 20 mL bindende buffer te verwijderen van de opslag-buffer. Steriele-gefilterd op de kolom van de affiniteit met behulp van een injectiespuit supernatant van toepassing.
- Was de kolom met 25-35 mL bindende buffer te verwijderen de niet-afhankelijke eiwitten uit de kolom. De wassen stap uitvoeren tot UV-absorptie bij 280 nm is dicht bij de eerste UV-waarde.
- Elueer afhankelijke RTA breuk in 20-35 mL elutie buffer (500 mM imidazool, 500 mM NaCl, 20 mM KH2PO4, pH = 7.2) en houden van het monster op ijs (figuur 2A en figuur 2B).
Opmerking: De elutie van de RTA breuk wordt gekenmerkt door een toename van de UV-absorptie. Let op: uitsluitend het verzamelen van deze fractie om te voorkomen dat besmetting met niet-specifieke afhankelijke eiwitten. - 20 µL van geëlueerd monsters kunt uitvoeren Coomassie Blue kleuring11 of Western blot analyse12,13 (optioneel). Primaire anti-zijn antilichamen (1:1, 000) en secundaire anti-mouse-IgG-HRP (1:10, 000) gebruiken om te detecteren RTA en controleer of monster zuiverheid (Figuur 3).
- Desalt geëlueerd RTA breuk op een 5 mL demineralisatie kolom en equilibreer monster in 0,8 M sorbitol.
- De column van de affiniteit van de zuiveringsinstallatie van de demineralisatie kolom vervangen en equilibreer eerst de kolom met 20 mL van 0,8 M sorbitol.
- De eluted RTA breuk van toepassing op de kolom via een spuit. Was de kolom met 100 mL van 0,8 M sorbitol en elueer de desalted RTA breuk in een tube van 15 mL zodra de UV-absorptie begint te verhogen (figuur 2C).
- Winkel de eluted RTA breuk bij 4 ° C.
Opmerking: Direct vastloopt RTA breuk bemonstering huidgeleiding verhoogt om zout verontreiniging te voorkomen. Parameters voor de demineralisatie procedure worden weergegeven in tabel 1.
- Concentreer je geëlueerd RTA breuk bij 10.000 x g en 4 ° C gedurende 30-180 minuten met behulp van een 10 kDa cut-off spin kolom een eindvolume van 1-2 mL en opslaan van monster bij 4 ° C voor 3-4 weken.
Let op: Niet het monster invriezen sinds de bevriezing leidt tot een volledig verlies van RTA activiteit. - Bepalen eiwitconcentratie met behulp van een conventionele eiwit bepaling kit. Eiwitconcentratie moet in het bereik van 1 tot 1,5 mg/mL.
Opmerking: RTA neigt te precipiteren als de eiwitconcentratie te hoog is (> 5 mg/mL).
3. gist transformatie en verwijdering van de celwand
- Tover wild-type of geselecteerde gist schrapping mutanten met de GFP verslaggever plasmide pRS315-K28SP- GFP6 met behulp van standaard lithium acetaat transformatie methoden14. Incubeer de cellen op leucine drop-out (d/o) glucose platen (2% glucose, 1,5% agar, 0,5% ammoniumsulfaat, 0,17% gist stikstof Base (YNB) en 0.087% d/o mix zonder leucine) bij 30 ° C gedurende 2-3 dagen voor positieve kloon selectie.
- Kies 3 verschillende gist klonen van elke plaat en enten van de klonen in 100 mL van leucine d/o raffinose medium (2% raffinose, 0,5% ammoniumsulfaat, 0,17% YNB en 0.087% d/o Meng zonder leucine) bij 220 rpm en 30 ° C tot OD600 = 1.0-2.0 (2-4 x 107 cellen/mL).
Nota: De celgroei van de verschillende giststammen verwijdering is verschillend. Monitor OD600 via een spectrofotometer. - OD600 om waarden te berekenen, Verdun monsters OD600 = 0,1-0,3 (1:5 tot 1:10 verdunnen) en OD600 in een spectrofotometer meten. Als referentie, H2O aangevuld met het overeenkomstige bedrag van leucine d/o raffionose medium te gebruiken.
- Na afwerking stap 3.5, meng 4 µL van de spheroplasted 50 mL-cultuur met 496 µL spheroplasting buffer (ongeveer 2 × 106 spheroplasts) en gedurende 10 minuten bij 400 x g centrifugeren.
- Resuspendeer pellet in 10 mL H2O gedestilleerd, vortex monster voor 30 s en plaat uit 10 µL van het monster op leucine d/o glucose platen (2% glucose, 1,5% agar, 0,5% ammoniumsulfaat, 0,17% YNB en 0.087% d/o mix zonder leucine).
- Incubeer de cellen gedurende 3 dagen bij 30 ° C. Tel het totale aantal volwassen cel kolonies op de plaat. Voor de evaluatie van de gegevens, alleen monsters te gebruiken met een rendement hoger dan 98% (total celaantal kolonie < 40 kolonies/plaat).
4. GFP verslaggever Assay meting in 96-wells-platen
- Zaad uit de gist cel spheroplasts verkregen in stap 3.7 in 96-wells-platen (200 µL per putje).
- Toevoegen van 70 µL gestabiliseerde leucine d/o raffinose opslagmedium met negatieve controle (eluaat van een Ni2 +-affiniteit gezuiverde cel lysate uit IPTG-geïnduceerde E. coli cellen uiten de lege vector) of RTA gezuiverd in een RTA eindconcentratie van 5 µM ( overeenkomend met 160 g/L RTA) in elk putje.
- Onmiddellijk vergroten met 30 µL gestabiliseerd galactose oplossing (30% galactose, 0,8 M sorbitol) om te induceren GFP expressie en vervolgens start de meting.
Opmerking: Voer ten minste 3 technische replicatieonderzoeken per experiment en 3 biologische repliceert per giststam. - Na afwerking bereiding van de monsters (stappen 4.1-4.3), leg de 96-wells-plaat in een fluorescentie-lezer en begin van de meting. Gebruik de 475/509 nm filter nodig voor de detectie van GFP fluorescentie instellen. Uitvoeren van metingen bij 30 ° C, 120 omw / m, en met een schudden diameter van 1 mm over een venster van de tijd van 20 h (meting van de intervallen van 10 min).
Opmerking: De GFP filter set is normaal beschikbaar in alle systemen van de lezer. Temperatuur, in het venster tijd, meten van intervallen en RTA concentratie kan worden aangepast voor eigen behoeften. Representatieve resultaten worden weergegeven in Figuur 4. - Optioneel: Gebruik aanvullende interne beheersingsmaatregelen in de meting voor kwaliteitscontrole. Bereid een negatieve controle door het toevoegen van 30 µL gestabiliseerde leucine d/o raffinose medium in plaats van 30% galactose (geen GFP-inductie). Bovendien, 70 µL van 0,8 M sorbitol gestabiliseerd G418 oplossing (300 µg/mL) toe te voegen. De eiwit vertaling remmer G418 fungeert als positieve controle voor de remming van het eiwit zoals het GFP expressie in gist voorkomt.
- Relatieve GFP fluorescentie in procent voor het tijdstip van 20u volgens de volgende vergelijking berekenen (Zie figuur 4A):
waar NC is de negatieve controle
- Anderzijds bepalen de relatieve GFP fluorescentie voor elke meting (in dit geval 10 min, zie ook stap 4.4) met behulp van de bovenstaande vergelijking. Zoals blijkt uit figuur 4B, een grafiek maken door het bevlekken van het GFP fluorescentie intensiteiten (y-as) na verloop van tijd (x-as).
waar NC is de negatieve controle
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De algemene workflow voor het protocol beschreven in dit manuscript wordt geïllustreerd in Figuur 1, ruwweg de samenvatting van de enkele stappen voor succesvol RTA zuivering en de daaropvolgende GFP verslaggever assay experiment. Een meer gedetailleerde beschrijving van elke individuele stap kan worden gevonden in het protocol. Figuur 2 illustreert het verwachte resultaat van een succesvolle RTA zuivering door chromatografie van de affiniteit (figuur 2A) en lege vectorbestrijding (figuur 2B). Figuur 2C toont een representatief resultaat van een demineralisatie experiment illustreren de ideale scheiding van de eiwit-piek (blauw) en de zout-geëlueerd piek (bruin). Een effectieve RTA zuivering wordt gepresenteerd in de vorm van een Coomassie gebeitste SDS-gel in Figuur 3. Figuur 4 bevat ten slotte een overzicht enkele originele resultaten verkregen door deze eenvoudige en robuuste GFP gebaseerde verslaggever assay methode6. Figuur 4A illustreert dat de gevestigde GFP verslaggever bepaling is in staat om betrouwbare resultaten te produceren en schematisch het GFP verslaggever plasmide gebruikt in deze studie toont. In de grafiek, is de relatieve GFP fluorescentie van gist spheroplasts RTA-behandeld en niet-behandelde voorwaarden met elkaar vergeleken. Zoals verwacht, weergeven niet-geïnduceerde evenals G418-behandelde cellen bijna geen GFP fluorescentie. In niet-behandelde en negatieve controle-behandeld (lege vector) cellen, GFP expressie wordt niet beïnvloed en significante verschillen tussen de beide monsters niet zijn nageleefd. RTA behandeling leidt daarentegen tot de verwachte GFP fluorescentie vermindering gemedieerd door haar ribosoom remming van de activiteit. Figuur 4B, wordt een tijd curve van RTA-geïnduceerde GFP fluorescentie remming weergegeven. Dit soort gegevenspresentatie bevat aanvullende informatie over de timing van GFP meningsuiting (90 min na galactose inductie) en het beginpunt van de translationeel remming door RTA (210 min na toepassing in wild-type cellen). De vertraging in de daling van de RTA-gemedieerde fluorescentie waarschijnlijk weerspiegelt de kinetiek van opname en intracellulair transport van RTA aan het cytosol. Figuur 4C illustreert de relatieve GFP fluorescentie geselecteerde gist mutanten verkregen na een 20u RTA-behandeling in vergelijking met RTA-behandeling en in vergelijking met wild-type cellen RTA-behandeld. De ERAD onderdelen Hrd1p en Der1p werden gekozen als geschikt positieve controles omdat eerdere studies reeds aangetoond dat beide eiwitten bij de retrotranslocation ER-te-cytosol van RTA in gist1 betrokken zijn. Daarom tonen beide mutanten de verwachte toename in GFP fluorescentie in vergelijking met wild-type cellen. Relatieve GFP fluorescentie waarden in Δyos9 en Δnup120 cellen zijn daarentegen niet significant verschillend. Het is al beschreven dat een gebrek aan de ER kwaliteitscontrole lectine Yos9p noch een gebrek in de nucleaire porie proteïne Nup20p RTA toxiciteit en vervoer1 beïnvloeden. Een lijst van de parameters voor chromatografie en ontzouten van specifieke affiniteit kan worden gevonden in tabel 1.
Figuur 1: algemene workflow van RTA zuivering en GFP gebaseerde verslaggever assay. De RTA zuivering (links) begint met de transformatie van E. coli met de uitdrukking of lege vector gevolgd door teelt en RTA IPTG-geïnduceerde expressie. Na lysis van de cel en steriele-Filtertechniek, het supernatant wordt gezuiverd via Ni2 + chromatografie van de affiniteit en zuiverheid van de steekproef wordt gecontroleerd via Coomassie kleuring of westelijke vlek. Voordat de eluted RTA breuken klaar zijn voor gebruik in het GFP experiment voor de bepaling van de verslaggever, breuken moeten worden ontzout en geconcentreerd en eiwitconcentratie moet worden bepaald. Het GFP verslaggever assay experiment (rechts) begint met de transformatie van wild-type en/of geselecteerde gist schrapping mutanten met de GFP expressie constructie. Na de teelt, wordt de celwand verwijderd door enzymatische behandeling om RTA in vivo opname. Vervolgens GFP fluorescentie van gist cel spheroplasts toxine behandeld en niet-behandelde voorwaarden wordt gemeten na verloop van tijd in een fluorescentie-lezer (475/509 nm). Ten slotte, relatieve GFP fluorescentie is bepaald met behulp van de vergelijking weergegeven in stap 4.6 en wordt weergegeven als geïllustreerd in Figuur 4. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: Vertegenwoordiger affiniteitchromatografie en ontzouten resultaten van E. coli cellen met huisdier-RTA(zijn) 6 of de lege vectorbestrijding. (A) typisch zuivering grafiek van een E. coli cel lysate monster uitspreken van de RTA(zijn) 6 van vector pET24-RTA(zijn) 6. Blauwe curve vertegenwoordigt de UV-absorptie bij 280 nm veroorzaakt door de aromatische ringen van de aminozuren Trp, Tyr en Cys en dient als indicator voor eiwit. Tijdens het laden van de kolom, worden niet-afhankelijke eiwitten gedetecteerd in de doorstroming (0-10 mL). Na het verwijderen van niet-afhankelijke eiwitten door wassen met bindende buffer, elutie buffer concentratie wordt verhoogd van 0 tot 100% (rode curve) en afhankelijke eiwitten direct uit de kolom worden geëlueerd. Het hoogtepunt van de blauwe curve tussen de 25 en 30 mL staat voor de Fractie van afhankelijk zijn-gelabeld RTA (zwarte doos). (B) typische zuivering grafiek van een E. coli lysate uit cellen leeg vectorbestrijding uitdrukken. Hetzelfde zuivering protocol zoals in (A). Zoals blijkt uit de zwarte doos, worden geen eiwitten geëlueerd uit de kolom in de negatieve controle. (C) Desalting-diagram van een monster E. coli pET24-RTA(zijn) 6 na affiniteit zuivering. Het diagram toont de scheiding van de RTA eiwitoplossing (piek van 280 nm absorptie tussen 20-30 mL) en de zout fractie (toename huidgeleiding piek na 30 mL).Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: vertegenwoordiger Western analyse van verschillende monsters vóór en na de zuivering affiniteit. 20 µL cel lysate (rijstroken 2-4) of gezuiverde monster (rijstroken 5-7) van verschillende varianten van de RTA (alleen ongewijzigde RTA gebruikt in deze studie) geanalyseerd door SDS-pagina en Coomassie blue kleuring. Lane 1, eiwit ladder; Lane 2, ongewijzigde RTA; Lane 3, RTAHDEL; Lane 4, RTAKDEL; steeg 5, ongewijzigde RTA; Lane 6, RTAHDEL; baan 7, RTAKDEL. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: representatieve resultaten verkregen door de verslaggever assay voor het RTA-behandelde wild-type en geselecteerde gist schrapping mutanten. (A) relatieve GFP fluorescentie van wild-type gist spheroplasts met de verslaggever plasmide pRS315-K28SP- GFP (rechts) onder geïnduceerde (3% galactose, GFPind.) en niet-geïnduceerde (2% raffinose, GFPrepr.) voorwaarden na 20u GFP inductie. Relatieve GFP fluorescentie was ook geanalyseerd in aanwezigheid van RTA (5 µM), G418 (300 µg/mL) of de negatieve controle (NC). De eiwit vertaling remmer G418 fungeert als positieve controle en voorkomt GFP expressie in gist. Gemiddelden en standaarddeviatie (SD) worden vermeld. (B) relatieve GFP fluorescentie van (A) weergegeven als tijdsverloop meer dan 20 h. Dit diagram bevat aanvullende informatie over de timing van GFP expressie en vertaling remming door RTA; het gedrag van de kromme weerspiegelt onrechtstreeks de kinetiek van RTA opname- en intracellulair transport naar het cytosol. (C) representatief resultaat van geselecteerde gist mutanten defect in de cellulaire eiwitten die bekend waren bij worden betrokken (Hrd1p en Der1p) of niet betrokken (Yos9p en Nup120p) bij RTA handel in gist1,6. De gestippelde lijn vertegenwoordigt een drempel van betekenis die is gebaseerd op de emissie van de fluorescentie verkregen door de stammen van de positieve controle (zie referentie6voor verdere uitleg). Gemiddelden en standaarddeviatie (SD) worden vermeld. De figuur werd van Becker et al. gewijzigd 6 Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| Affiniteit met chromotography de parameter | ||
| Meten van parameters | UV (280 nm), elutie buffer concentratie, geleidbaarheid | |
| Instellingen | Variabele/eenheid | Waarde |
| Debiet | mL/min | 1 |
| Maximale kolom druk | MPa | 0.35 |
| Golflengte | nm | 280 nm |
| Bindende buffer | Pomp positie | A |
| Elutie buffer | Pomp positie | B |
| Startende concentratie elutie buffer | % | 0 |
| Systeem volume compensatie | mL | 10 |
| Kolom evenwichtsinstelling | mL | 20 |
| Monster injectie over superloop/spuit | mL | cel lysate volume |
| Wassen van stap | mL | 20-35 |
| Elutie stap | mL | 20-35 |
| Concentratie elutie buffer tijdens elutie | % | 100 |
| Herijking van de kolom met 20% EtOH | mL | 50 |
| Demineralisatie parameter | ||
| Meten van parameters | UV (280 nm), huidgeleiding | |
| Instellingen | Variabele/eenheid | Waarde |
| Debiet | mL/min | 4 |
| Maximale kolom druk | MPa | 0.35 |
| Golflengte | nm | 280 nm |
| Bindende buffer | Pomp positie | A |
| Elutie buffer | Pomp positie | B |
| Startende concentratie elutie buffer | % | 0 |
| Systeem volume compensatie | mL | 10 |
| Kolom evenwichtsinstelling | mL | 20 |
| Monster injectie over superloop/spuit | mL | cel lysate volume |
| Demineralisatie buffer injectie (0,8 M sorbitol) | mL | 100 |
| Herijking van de kolom met 20% EtOH | mL | 50 |
Tabel 1: Parameters die worden gebruikt voor kolom gebaseerde affiniteit zuivering en ontzouten. Lijst van alle instellingen van de desbetreffende kolom (bijvoorbeeld, debiet, elutie buffer concentratie, evenwichtsinstelling en wassen stap duur) en gemeten parameters (bijvoorbeeld, geleidingsvermogen of UV-absorptie).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bij het uitvoeren van het bovengenoemde protocol, raden we de volgende suggesties om een geslaagde uitkomst van het experiment.
Voor heterologe eiwit expressie is het belangrijk niet meer bedragen dan de concentratie van de IPTG van 1 mM. IPTG concentraties > 1 mM remmen promotor-geïnduceerde RTA expressie en leiden tot lagere opbrengsten van de toxine. Bovendien moeten cellen niet gekweekt worden bij temperaturen hoger dan 28 ° C om te voorkomen dat integratie lichaam vorming, inefficiënte vouwen en inactivatie van de toxine. RTA uitdrukking bij lagere temperatuur (bv, 20-28 ° C) is mogelijk en leidt ook tot de productie van biologische actieve toxine. Echter de extra temperatuur verlaging niet aanzienlijk verbeterd RTA activiteit/vouwen en resulteert in een lagere opbrengst van de totale toxine in vergelijking tot 28 ° C (gegevens niet worden weergegeven).
Parameters van de zuivering van de chromatografie van de affiniteit (tabel 1) zijn geoptimaliseerd voor het gebruik van een geautomatiseerde zuiveringsinstallatie met 5 mL Ni2 + affiniteit kolom uitgerust en moet worden aangepast aan andere kolom zelfgemaakte of commerciële systemen als RTA zuiverheid en rendement zijn suboptimaal. In het geval van suboptimale RTA zuiverheid (aangegeven door de verschijning van extra proteïnen in SDS-gels Coomassie gebeitste), een toename van de imidazool-concentratie van de buffer bindende normaal vermindert aspecifieke binding van positief geladen eiwitten aan de kolom, waardoor totale RTA zuiverheid. In geval van sub-optimale opbrengsten van RTA, invoering van extra sonification stappen (4-8 pulsen), langere incubatietijd tijden (5 h) of grotere cultuur volumes (> 1 L) kan bijdragen tot verbetering van de totale opbrengst van de toxine. Er is echter ook de mogelijkheid om met succes het zuiveren van RTA via systemen (gegevens niet worden weergegeven) van de kolom op basis van de spin als een geautomatiseerd systeem niet beschikbaar in het lab is.
Tijdens de demineralisatie stap is het belangrijk om de bemonsteringsprocedure overslaan, zodra de huidgeleiding begint te stijgen. Besmetting met zout, vooral imidazool, beïnvloedt de eiwit meting van de concentratie, wat resulteert in onjuiste RTA concentratie bepaling die rechtstreeks van invloed is op de inhoud van de RTA gebruikt in de GFP verslaggever assay.
Het is essentieel voor het opslaan van gezuiverde RTA bij 4 ° C en het voorkomen van bevriezing. Bevroren monsters vertonen een verminderde activiteit van RTA XTT gebaseerde cel vitaliteit testen op HeLa cellen (gegevens niet worden weergegeven). Gezuiverde monsters kunnen worden gehouden voor ongeveer 3-4 weken voordat hun biologische activiteit voortdurend is afgenomen. Daarnaast, zijn hoge RTA concentraties (≥5 mg/mL) na spin kolom concentratie kritische omdat RTA toont een neiging om te precipiteren in 0,8 M sorbitol.
Een nadeel van de methode is het feit dat RTA normaal niet in beslag door intact gistcellen genomen wordt. Betrouwbare om resultaten te bereiken, moet de celwand van de gist door enzymatische behandeling volledig worden verwijderd. Het is daarom essentieel spheroplast formatie om efficiëntie te controleren van elke giststam door de methoden beschreven in stap 3.4-3.5. In het geval van sub-optimale spheroplast de voorbereiding, moet de incubatietijd lytische enzym concentratie worden geoptimaliseerd en gecontroleerd via fase contrast microscopie. Overdigestion (ghost vorming) kan worden voorkomen door vermindering van de concentratie en/of incubatie tijd lytische enzym overwegende dat de tegenovergestelde aanpak nodig is in geval van onvoldoende vertering. Gegevens uit de stammen met onvoldoende celwand verwijdering moeten worden uitgesloten van de evaluatie van de gegevens.
Het moet ook worden vermeld dat de experimentele opzet niet volledig met het proces van de natuurlijke roes van ricine nabootsen. De cel bindende B subeenheid van ricine (RTB) ontbreekt die normaal gesproken verantwoordelijk is voor efficiënte toxin binding aan galactose residuen op het celoppervlak van zoogdiercellen15. Theoretisch, kan deze beperking worden overwonnen door het uitvoeren van het experiment met gezuiverde ricine holotoxin met zijn A en B subeenheid. Niettemin gistcellen niet beschikken over galactose residuen op hun celoppervlak die binding van RTB8 bemiddelen kan; Dit feit verklaart ook waarom intact gistcellen zijn geen gevoelige van ricine. Het is dus onduidelijk of RTB als bindend onderdeel van de cel in het model van de gist fungeren zou. Interessant, voormalige studies al aangetoond dat RTA kunnen bereiken het cytosol van zoogdiercellen zonder haar cel B subeenheid16bindend. Om dit verschijnsel te begrijpen, besloten hebben we met alleen RTA in de experimentele opzet te identificeren van cellulaire componenten in gist die toxine smokkel van het plasma-membraan naar de cytosol vergemakkelijken. Verrassend, weergeven de onderdelen die betrokken zijn bij mensenhandel gist RTA opvallende gelijkenissen met de onderdelen die nodig zijn voor het efficiënt ricine holotoxin vervoer in zoogdiercellen6 Op basis van deze resultaten, kan het worden gespeculeerd dat RTB een kleine rol in de intracellulaire ricine vervoer speelt dan eerder verondersteld en alleen belangrijk voor het eerste contact tot de zoogdieren celoppervlak is.
In tegenstelling, siRNA gebaseerde systemen in zoogdiercellen perfect weerspiegelen de natuurlijke toxine-situatie, maar zijn tijdrovend en duur3. Bovendien, het gebruik van gist schrapping mutanten draagt het belangrijke voordeel dat de mutanten Toon een volledige knock-out van de proteïne van belang, overwegende dat siRNA gebaseerde systemen in het algemeen tot een verlaging van de eiwit-niveau leiden. In sommige gevallen kunnen de residuele eiwitniveaus voldoende voor het vervoer van de toxine waarbij geen gewijzigde fenotype wordt waargenomen, en dus, de betrokkenheid van de specifieke proteïne is niet zichtbaar in siRNA gebaseerde systemen.
Hoewel alleen niet-essentiële giststammen verwijdering werden gebruikt in de oorspronkelijke studie6, temperatuur-gevoelige stammen evenals overvloed daalden de mRNA perturbation (vocht) collectie stammen17 (verminderde expressie niveau van essentiële eiwitten) zijn eveneens geschikt voor dit soort methode in de toekomst. In het algemeen, de rol van essentiële eiwitten kan niet met deze test onderzocht wegens hun gebrek aan levensvatbaarheid, dus een beperking van het test systeem vertegenwoordigen.
De nieuwe reporter assay vormt echter een elegante en alternatieve strategie voor bestaande methoden die proberen te analyseren van RTA vervoer in het modelorganisme S. cerevisiae. De bestaande studies intracellulaire plasmide-gedreven RTA expressiesystemen gebruikt en zijn beperkt tot de analyse van de retro-translocatie van de ER in het cytosol1,7. Succesvolle implementatie van de extracellulaire RTA applicatie nu opent de mogelijkheid om niet alleen studeren ER retrotranslocation maar ook om niet indirect analyseren RTA vervoer vanaf het uur al het Golgi naar de ER.Als de cellulaire functie en de lokalisatie van de meerderheid van de gist is tegenwoordig genen ontdekt en beschikbaar in databases, de geïdentificeerde kandidaat-eiwitten direct kunnen worden toegerekend aan specifieke compartimenten en/of vervoeren van de trajecten.
Over het geheel genomen vertegenwoordigt de geïntroduceerde verslaggever assay methode een eenvoudig en robuust aanpak identificeren kandidaat-eiwitten die betrokken zijn bij intracellulaire handel van toxines of toxine subeenheden (b.v., RTA) die eiwit vertaling in vivo blokkeren. Relatief lage standaarddeviaties (1-10%), alsmede de hoge reproduceerbaarheid in de originele studie bevestigt deze verklaringen. Als gevolg van het formaat van de 96-wells-plaat is een snelle screening van verschillende gist mutanten mogelijk binnen een dag na zuivering van de toxine.
In de toekomst, is er de mogelijkheid tot gebruik van de methode voor high-throughput screening van gist schrapping bibliotheken. In de huidige setup vermag de toegepaste RTA concentratie (5 µM) de relatieve GFP fluorescentie tot 50% verminderen. Onder deze omstandigheden biedt de methode het voordeel om schrapping mutanten met negatieve (verhoogde GFP fluorescentie) en (verminderde GFP fluorescentie) positieve effecten op de RTA vervoer vast te stellen. Voor hoge-doorvoer screenings is er soms een sterker verschil tussen behandeld en niet-behandelde monsters gunstig. Door gebruik van hogere concentraties van RTA en/of verhoging van het Meetinterval (b.v., 48u), moet een nog meer uitgesproken blok van GFP meningsuiting haalbaar zijn.
Het is om te worden benadrukt dat deze methode niet alleen beperkt is tot het analyseren van het proces van de dronkenschap van extracellulaire toegepaste RTA in gist, maar er ook de mogelijkheid om te analyseren de ER invoer van RTA is met het uitspreken van de RTA via een plasmide in deze GFP verslaggever spanning (gegevens niet Zie afbeelding). Bovendien kan de aanpak van de screening eveneens aangepast worden om te bestuderen van intracellulair transport trajecten van andere eiwit biosynthese remmende eiwitten zoals zymocin18 in de toekomst. In tegenstelling tot de modus goed gekarakteriseerd doden van zymocin is relatief weinig bekend over de mensenhandel trajecten verantwoordelijk voor efficiënte toxine vervoer in het cytosol19,20. Zymocin vertegenwoordigt daarmee een optimale kandidaat voor toekomstige studies zoals zymocin uiteraard in beslag door gistcellen genomen wordt. Dus, kan de verwijdering van de celwand worden weggelaten die de algehele prestaties van het GFP verslaggever assay (met betrekking tot tijd en kosten verbetert). Met de hulp van deze krachtige verslaggever assay zou het haalbaar is om het ontleden van het intracellulair transport route van zymocin in gist.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Delen van deze studie waren vriendelijk, gesteund door een subsidie van de Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 1027, A6).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacterial and yeast strains | |||
| E. coli BL21 DE3(Gold) | Aligent Technologies | 230130 | |
| S. cerevisiae BY4742 | Euroscarf | Y10000 | |
| S. cerevisiae BY4742 deletion mutants | Dharmacon | YSC1054 | whole collection |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasmids used in this protocol | |||
| pET24a(+) (Novagen) | Millipore | 69772-3 | |
| pET-RTA(His6) | Becker et al. (2016)3 | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Zymolyase 20T | USBio | Z1000.250 | lytic enzyme for cell wall removal |
| LB broth medium | Thermo Scientific | 10855021 | 15 g agar was added for plate production |
| YNB | Thermo Scientific | DF0335-15-9 | |
| Ammonium sulfate | Sigma-Aldrich | A4418-100G | |
| Yeast drop-out mix supplemts without leucine | Sigma-Aldrich | Y1376-20G | |
| Agar | Sigma-Aldrich | 05040-100G | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G8270-100G | |
| DTT | Sigma-Aldrich | 10197777001 | |
| D-raffinose | Sigma-Aldrich | 83400-25G | |
| D-sorbitol | Sigma-Aldrich | S1876-1KG | |
| D-galactose | Sigma-Aldrich | G0750-10MG | |
| G418 | Thermo Scientific | 11811031 | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I6758-1G | |
| Imidazole | Roth | 3899.1 | |
| PAGE ruler prestained | Fermentas | 26616 | protein ladder used for Western analysis |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material for RTA purification, desalting and reader measurements | |||
| Spectrophotometer Ultrospec 2100 pro | Amersham | ||
| Soniprep 150 | MSE | old model, other models available | |
| Fluoroskan Ascent | Thermo Scientific | 5210470 | old model, not available anymore |
| ÄKTAPurifier | Thermo Scientific | 28406266 | Product is discontinued and replaced |
| HisTRAP HP column | GE Healthcare | 17-5248-02 | |
| HiTRAP desalting column | GE Healthcare | 11-0003-29 | |
| Midisart sterile filter | Sartorius | 16534K | 0.2 µm pore size |
| BCA protein assay kit | Pierce | 23225 | |
| 660 nm assay kit | Thermo Scientific | 22660 | |
| 96 well plates | Thermo Scientific | 260860 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies (optional) | |||
| Anti-Tetra-His | Qiagen | 34670 | primary antibody; 1:1,000 dilution |
| Anti-mouse-HRP | Sigma-Aldrich | A9044-2ML | secondary antibody, 1:10,000 dilution |
References
- Li, S., et al. Folding-competent and folding-defective forms of ricin A chain have different fates after retrotranslocation from the endoplasmic reticulum. Mol Biol Cell. 21 (15), 2543-2554 (2010).
- Li, S., Spooner, R. A., Hampton, R. Y., Lord, J. M., Roberts, L. M. Cytosolic entry of Shiga-like toxin a chain from the yeast endoplasmic reticulum requires catalytically active Hrd1p. PLoS One. 7 (7), e41119 (2012).
- Moreau, D., et al. Genome-wide RNAi screens identify genes required for Ricin and PE intoxications. Dev Cell. 21 (2), 231-244 (2011).
- Giepmans, B. N., Adams, S. R., Ellisman, M. H., Tsien, R. Y. The fluorescent toolbox for assessing protein location and function. Science. 312 (5771), 217-224 (2006).
- Majoul, I. V., Bastiaens, P. I., Soling, H. D. Transport of an external Lys-Asp-Glu-Leu (KDEL) protein from the plasma membrane to the endoplasmic reticulum: studies with cholera toxin in Vero cells. J Cell Biol. 133 (4), 777-789 (1996).
- Becker, B., Schnoder, T., Schmitt, M. J. Yeast Reporter Assay to Identify Cellular Components of Ricin Toxin A Chain Trafficking. Toxins (Basel). 8 (12), (2016).
- Li, X. P., Baricevic, M., Saidasan, H., Tumer, N. E. Ribosome depurination is not sufficient for ricin-mediated cell death in Saccharomyces cerevisiae. Infect Immun. 75 (1), 417-428 (2007).
- Lord, J. M., Roberts, L. M., Robertus, J. D. Ricin: structure, mode of action, and some current applications. Faseb J. 8 (2), 201-208 (1994).
- Becker, B., Schmitt, M. J. Adapting yeast as model to study ricin toxin a uptake and trafficking. Toxins (Basel). 3 (7), 834-847 (2011).
- Seidman, C. E., Struhl, K., Sheen, J., Jessen, T. Introduction of plasmid DNA into cells. Curr Protoc Mol Biol. , (2001).
- Brunelle, J. L., Green, R. Coomassie blue staining. Methods Enzymol. 541, 161-167 (2014).
- Shapiro, A. L., Vinuela, E., Maizel, J. V. Jr Molecular weight estimation of polypeptide chains by electrophoresis in SDS-polyacrylamide gels. Biochem Biophys Res Commun. 28 (5), 815-820 (1967).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. 1979. Biotechnology. 24, 145-149 (1992).
- Ito, H., Fukuda, Y., Murata, K., Kimura, A. Transformation of intact yeast cells treated with alkali cations. J Bacteriol. 153 (1), 163-168 (1983).
- Vitetta, E. S., Yen, N. Expression and functional properties of genetically engineered ricin B chain lacking galactose-binding activity. Biochim Biophys Acta. 1049 (2), 151-157 (1990).
- Wales, R., Roberts, L. M., Lord, J. M. Addition of an endoplasmic reticulum retrieval sequence to ricin A chain significantly increases its cytotoxicity to mammalian cells. J Biol Chem. 268 (32), 23986-23990 (1993).
- Breslow, D. K., et al. A comprehensive strategy enabling high-resolution functional analysis of the yeast genome. Nat Methods. 5 (8), 711-718 (2008).
- Jablonowski, D., Schaffrath, R. Zymocin, a composite chitinase and tRNase killer toxin from yeast. Biochem Soc Trans. 35 (Pt 6), 1533-1537 (2007).
- Jablonowski, D., Schaffrath, R. Saccharomyces cerevisiae RNA polymerase II is affected by Kluyveromyces lactis zymocin. J Biol Chem. 277 (29), 26276-26280 (2002).
- Jablonowski, D., Frohloff, F., Fichtner, L., Stark, M. J., Schaffrath, R. Kluyveromyces lactis zymocin mode of action is linked to RNA polymerase II function via Elongator. Mol Microbiol. 42 (4), 1095-1105 (2001).
