Summary
In passato, piccolo animale irradiazione solitamente è stato effettuato senza la possibilità di indirizzare un volume del tumore ben delineati. L'obiettivo era quello di imitare il trattamento del glioblastoma umano in ratti. Utilizza una piattaforma piccola irradiazione degli animali, abbiamo effettuato MRI-guida 3D conformal irradiazione con PET-base sub-volume d'amplificazione in un ambiente preclinico.
Abstract
Per decenni, ricerca di piccolo animale radiazione principalmente è stato effettuato usando abbastanza grezzi messe a punto sperimentali applicando semplici tecniche di una trave senza la possibilità di indirizzare un volume del tumore specifico o ben delineati. La consegna di radiazione è stata realizzata utilizzando sorgenti di radiazioni fisso o acceleratori lineari, producendo raggi x megavoltage (MV). Questi dispositivi sono in grado di raggiungere sub-millimetrica precisione richiesta per piccoli animali. Inoltre, le dosi elevate consegnato alla valutazione della risposta sana circostante tessuto ceste. Per aumentare la traduzione tra piccoli studi sugli animali e gli esseri umani, il nostro obiettivo era quello di imitare il trattamento del glioblastoma umano in un modello del ratto. Per attivare un'irradiazione più accurata in un ambiente preclinico, recentemente, piattaforme di ricerca guidata da immagini piccolo animale radiazione di precisione sono stati sviluppati. Simile a umani sistemi di pianificazione, pianificazione su queste micro-irradiatori del trattamento si basa su tomografia computata (CT). Tuttavia, basso contrasto dei tessuti molli sul CT rende molto difficile da localizzare bersagli in alcuni tessuti, come il cervello. Di conseguenza, incorporando la risonanza magnetica (MRI), che ha un eccellente contrasto di molli rispetto al CT, consentirebbe una delineazione più precisa dell'obiettivo per irradiazione. Nelle ultime tecniche decennio di imaging anche biologici, come la tomografia a emissione di positroni (PET) ha riscosso interesse orientativa trattamento terapia di radiazioni. PET consente la visualizzazione di ad es., consumo del glucosio, trasporto dell'amminoacido o ipossia, presente nel tumore. Targeting quelle parti altamente proliferative o radio-resistente del tumore con una dose più elevata potrebbe dare un vantaggio di sopravvivenza. Questa ipotesi ha condotto all'introduzione del volume del tumore biologico (BTV), oltre il volume di destinazione lordo convenzionale (GTV), volume bersaglio clinico (CTV) e volume bersaglio pianificato (PTV).
Presso il laboratorio di imaging preclinico dell'Università di Gand, un micro-irradiatore, un piccolo animale PET e un animale di piccola T 7 MRI sono disponibili. L'obiettivo era di incorporare irradiazione MRI-guidato e animale-guida sub-volume d'amplificazione in un modello del ratto di glioblastoma.
Introduction
Glioma di alto grado è il tumore cerebrale maligno più comune e più aggressivo in adulti con una sopravvivenza mediana di 1 anno nonostante le modalità correnti di trattamento. Lo standard di cura comprende maximal resezione chirurgica seguita da radioterapia esterna del fascio combinato (RT) e temozolomide (TMZ), seguita da manutenzione TMZ1,2,3. Sin dall'introduzione di TMZ ora più di 15 anni fa, non sono stati apportati miglioramenti significativi nel trattamento di questi tumori. Di conseguenza, l'implementazione di nuove strategie terapeutiche è urgente ma dovrebbe essere esaminato in primo luogo nei modelli di terapia del cancro di animali piccoli (per lo più topi e ratti). Modelli del roditore del tumore-cuscinetto possono essere utilizzati per studiare l'efficacia dei protocolli di radiazione nuovi e complessi, possibilmente combinato con altri agenti di trattamento (nuovo), per valutare la risposta di radiazione o per ricercare agenti radio-protettivi. Dei principali vantaggi della ricerca preclinica di radiazione è la capacità di lavorare in condizioni sperimentali controllate utilizzando larghe coorti conseguente resa dati accelerata a causa le durate della vita più breve dei roditori. I risultati preclinici quindi dovrebbero essere tradotta in una sperimentazione clinica in un modo molto più veloce e più efficiente rispetto all'attuale prassi4.
Esperimenti di piccolo animale radiazioni negli ultimi decenni sono stati raggiunti in genere utilizzando radiazione fisso fonti5,6,7, ad esempio, 137Cs e 60Co, isotopi, o lineare acceleratori destinato ad uso clinico umano, l'applicazione di un campo di radiazione singolo con raggi x MV6,8,9,10,11. Tuttavia, questi dispositivi non raggiungono sub-millimetrica precisione, che è richiesto per animali di piccola taglia12. Inoltre, i raggi x MV hanno caratteristiche inadatte per irradiare piccoli bersagli, come un accumulo di dose all'interfaccia aria-tessuto della regione di ingresso del fascio con un limite nell'ordine l'animale stesso misura4,6 ,8,9,10,11. Quest'ultima rende molto impegnativo per trasportare una dose uniforme ad un tumore risparmiando che circonda il cervello normale tessuto4,8,9,10,11. Quindi, non è chiaro in quali gli studi sugli animali corrente di misura sono ancora rilevanti per moderno RT pratica12. A questo proposito, recentemente sviluppati tridimensionale (3D) conformal piccolo animale micro-irradiatori sono promettenti per colmare il divario tecnologico tra 3D immagine-guida RT tecniche avanzate, quali la radioterapia ad intensità modulata (IMRT) o conformi archi utilizzati in esseri umani ed attuale piccolo animale irradiazione4,13. Queste piattaforme fanno uso di una sorgente di raggi x di kilovoltage (kV) per ottenere penumbras tagliente e per evitare l'accumulo di dose. Queste piattaforme includono una fase comandata da calcolatore per animale posizionamento, un kV sorgente di raggi x per immagini e radioterapia, un assembly di rotazione gantry per consentire la consegna di radiazione da varie angolazioni e un sistema di collimazione per modellare il fascio di radiazioni 4. nel 2011, un micro-irradiatore è stato installato presso il laboratorio di imaging preclinico dell'Università di Gand (Figura 1). Questo sistema è simile alla pratica moderna radioterapia umano e consente una grande varietà di esperimenti preclinici, come la sinergia di radiazione con altre terapie, combinazioni di radiazione complessi e studi di spinta di immagine-guida sub-target.
Pianificazione su queste micro-irradiatori del trattamento si basa sul CT, che equivale a umano pianificazione sistemi14,15. Per formazione immagine di CT, un rivelatore di raggi x a bordo è usato in combinazione con il tubo radiogeno kV stesso che viene utilizzato durante il trattamento. Formazione immagine di CT viene utilizzata in quanto consente per un posizionamento accurato degli animali e fornisce le informazioni necessarie per il calcolo della dose individuale radiazione tramite segmentazione. Tuttavia, a causa del basso contrasto del morbido-tessuto in CT imaging, tumori nel cervello di animali di piccole taglia, come il glioma di prima scelta, non possono essere facilmente delineati. L'incorporazione di imaging multi-modalità è pertanto necessario per una delineazione del volume target preciso. Rispetto al CT, MRI fornisce il contrasto morbido-tessuto notevolmente superiore. Questo lo rende molto più facile visualizzare i confini della lesione che si tradurrà in una molto migliore delineazione del volume bersaglio, contribuendo a meglio irradiare la lesione ed evitare che circonda il tessuto, come illustrato Figura 24, 16. Un ulteriore vantaggio è che la risonanza magnetica utilizza radiazioni non-ionizzanti, a differenza di CT che utilizza radiazioni ionizzanti. Gli svantaggi principali di MRI sono i tempi di acquisizione relativamente lunghi e costi operativi elevati. È importante notare che le esplorazioni di MRI non possono essere utilizzate per il calcolo della dose, come non forniscono le informazioni di densità dell'elettrone richiesto, anche se si registrano progressi in questo campo, anche con il recente sviluppo di MR-Linac. Come tale, un set di dati combinati di CT/MRI è il metodo di scelta per la pianificazione l'irradiazione del glioma maligno, contenente sia le informazioni necessarie per il targeting (volumi basati su MRI) e per il calcolo della dose (densità dell'elettrone basati su CT).
Per diminuire il divario tra irradiazione di animali piccolo e routine clinica, MRI chiaramente deve essere integrata nel flusso di lavoro di micro-irradiatore, che richiedono una registrazione corretta tra MRI e CT, che è tutt'altro che banale. In questa carta, il nostro protocollo per MRI-guida 3D conformal irradiazione di F98 glioblastoma in ratti è discussa, che è stato recentemente pubblicato17.
Anche se incorporando CT e MRI del flusso di lavoro di micro-irradiatore è un chiaro passo avanti nella ricerca di piccoli animali irradiazione, queste tecniche di imaging anatomiche non sempre consentono una definizione completa del volume di destinazione. Le mutazioni patologiche nel cervello il CT e MRI sono caratterizzate da maggiore contenuto d'acqua (edema) e perdita della barriera emato - encefalica o aumento di contrasto. Tuttavia, sia aumento di contrasto e iper-intense aree su T2-weighted MRI non sono sempre una misura accurata dell'estensione del tumore.Le cellule del tumore sono state rilevate ben oltre i margini di aumento di contrasto12. Inoltre, nessuna di queste tecniche può identificare le parti più aggressive all'interno del tumore, che può essere responsabile di resistenza terapeutica e ricorrenza del tumore. Di conseguenza, ulteriori informazioni da tecniche di imaging molecolare come animale domestico può avere un valore aggiunto per RT volume individuazione del target perché queste tecniche permettono di visualizzare percorsi biologici in vivo12,18, 19.
Nel 2000, Ling et al ha introdotto il concetto di volume bersaglio biologico (BTV) integrando imaging anatomico e funzionale nel flusso di lavoro di radioterapia, portando a quello che loro chiamano la radioterapia conformal multidimensionali20. Questo crea la possibilità di migliorare la dose di targeting formulando una dose non uniforme per un'area di destinazione utilizzando ad esempio immagini PET. Il più usato traccianti PET per la stadiazione del tumore e per monitorare il trattamento risposta è fluor-18 (18F) con l'etichetta del fluorodeoxyglucose (FDG), che Visualizza il metabolismo di glucosio21. Nel cancro della testa e del collo, studi precedenti hanno dimostrato che l'uso di 18F-FDG PET hanno portato a una migliore stima del volume del tumore effettivo, come definito dagli esemplari patologici, confrontati con il CT e MRI22. In cerebrali primari tumori, dove FDG non è utile a causa del segnale di fondo molto forte dal cervello normale, gli aminoacidi, come 11C-metionina e, più recentemente, 18F-fluoroetthyltyrosine (FET), sono stati studiati per GTV delineazione con spesso marcate differenze tra amminoacido PET e basati su MRI GTVs23. Tuttavia, nessuna prova futura indagare il significato di questa scoperta è stata effettuata ancora. In questo studio, abbiamo selezionato l' amminoacido tracciante 18F-FET e l'ipossia tracciante 18F-fluoroazomycin-arabinoside (18F-FAZA). 18 F-FET e 18F-FAZA sono stati selezionati perché un maggiore assorbimento di aminoacidi è fortemente correlato con il tasso di proliferazione in tumori GB, mentre l'assorbimento di un'ipossia PET-tracciante è correlato con la resistenza a (chemio) radioterapia18 , 23. sub-volume d'amplificazione usando la micro-irradiatore è stato ottimizzato dando una dose di radiazione supplementare ad una parte del tumore in ratti F98 GB PET-definito.
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Protocol
Lo studio è stato approvato dal comitato etico per gli esperimenti sugli animali (ECD 09/23 ed ECD 12/28). Tutti i dettagli commerciali possono essere trovati nella Tabella materiali.
1. F98 GB ratto modello cellulare
- Le cellule di F98 GB, ottenute da ATCC, negli strati monomolecolari utilizzando di Dulbecco modificato Eagle Medium, siero del vitello di 10%, 1%, penicillina, streptomicina 1%, 1% L-Glutammina e 0,1% amfotericina b, della cultura e posto in un'incubatrice di CO2 (5% CO2 e 37 ° C).
- Inoculare le cellule di glioma nel cervello di ratti femminili di F344 Fischer (170 g di peso corporeo).
- Utilizzare strumenti sterili e indossare guanti sterili in ogni momento.
- Anestetizzare i ratti iniettando una miscela di 74 mg/kg ketamina e 11 mg/kg xylazina intrapertioneally (IP) con una siringa da insulina (1 mL, 29 G). Confermare l'amputate dall'assenza di risposta per il riflesso di ritiro dell'arto. Immobilizzare i ratti in un dispositivo stereotassica con punti di fissaggio per naso e orecchie. Posto un occhio di carbomer gel per prevenire la secchezza degli occhi mentre sotto anestesia.
- Radere il ratto dall'altezza degli occhi alla parte posteriore del cranio e disinfettare la pelle con povidone-iodio.
- Esporre il cranio attraverso un'incisione del cuoio capelluto del midline di 2 cm e fare un 1 mm foro (carotatrice) 2 mm posteriore e 2,5 mm laterale per il bregma nell'emisfero frontale di destra.
- Inserire un ago da insulina stereotactically guidate (29 G) e iniettare sospensione di 5 µ l cellulare (20.000 celle F98 GB) 3 mm di profondità utilizzando un controller pompa microsiringa (impostazioni: iniettare (I50), tasso (001 SDN) 1 nL/s).
- Estrarre la siringa lentamente e chiudere l'incisione con la cera dell'osso. Suturare la pelle e disinfettare con povidone-iodio.
- Stabilizzare la temperatura corporea dell'animale post-ambulatorio utilizzando una lampada rossa. Monitorare il risveglio del ratto fino a quando ha riacquistato coscienza sufficiente per mantenere decubito sternale. Non restituire l'animale per la compagnia di altri animali fino a quando completamente recuperato. Tenere tutti gli animali in condizioni ambiente controllate (cicli di luce/buio normali 12 h, 20-24 ° C e umidità relativa 40-70%) con cibo e acqua ad libitum. Assicurarsi di seguire da vicino gli animali monitorando il loro peso corporeo, cibo, assunzione di acqua e loro attività e il comportamento normale. Utilizzare una dose letale di sodio pentobarbital per eutanasia degli animali (160 mg/kg), se si osserva un calo di peso corporeo di 20% o quando il comportamento normale si deteriora gravemente (ad es., mancanza di governare).
2. conferma della crescita del tumore
Nota: Valutare usando MRI di T2-weighted MRI contrapporre-aumentato dinamico (DCE-MRI) e contrapporre-aumentata di T1-weighted MRI post-inoculazione del tumore crescita 8 giorni. Quando il tumore raggiunge una dimensione di 2.5 x 2.5 x 2.5 mm3, selezionare il ratto per la terapia.
- In primo luogo, collegare un ago 30 G per un tubo lungo 60 cm, che viene inserito per via endovenosa nella vena caudale laterale. Anestetizzare i ratti attraverso un cono di naso con 2% isoflurane mescolata con ossigeno (0,3 L/min). Confermare amputate quando i ratti non rispondono per il riflesso di ritiro dell'arto. Coprire i ratti con una coperta riscaldata e metterli nel letto del MRI. Utilizzare un gel di carbomer occhio per prevenire la secchezza.
- Posizionare il letto nel supporto con una bobina di superficie del cervello di ratto fisso e posizionare il letto in una bobina trasmittente di 72mm ratto tutto il corpo.
- Eseguire una scansione di localizzatore seguita da una scansione di filare-eco di T2-weighted per valutare la crescita del tumore. Dettagli di sequenza di T2-MRI: TR/TE 3661/37,1 ms, 109 µm isotropo in piano ad alta risoluzione, fetta spessore 600 µm, 4 medie, TA 9 min 45 s.
- Se il tumore è confermato dall'acquisizione di T2-weighted, iniettare un agente di contrasto contenenti gadolinio i tubi posizionati per via endovenosa (agente di contrasto MRI; 0,4 mL/kg) 30 s dopo l'inizio dell'acquisizione DCE-MRI. Acquisire DCE-MRI durante 12 min utilizzando un fast-basso angolo girato sequenza (FLASH) in una sola fetta (fetta di 1 mm di spessore). Utilizzare una risoluzione spaziale nel piano di (312 µm2) e una risoluzione temporale di 1,34 s.
- Utilizzando lo strumento di analisi di sequenza di immagine, selezionare una regione di interesse (ROI) all'interno della regione di tumore ritenuto sospetto per tracciare l'intensità del segnale nel tempo. Successivamente, analizzare la forma della curva di DCE risultante per confermare la presenza di glioblastoma (Figura 3).
- Infine, acquisire una sequenza di contrapporre-aumentata spin-echo T1-weighted. Dettagli di sequenza T1-MRI: TR/TE 1539/9,7 ms, 117 µm isotropo in piano ad alta risoluzione, fetta spessore 600 µm, 3 medie, TA 4 min 15 s. tipico contrasto T1-weighted MR immagini ottimizzate sono mostrate nella Figura 2.
- Dopo aver finalizzato la sequenza di T1-weighted, l'animale può svegliarsi sotto continuo controllo, finché non si riacquista la piena coscienza.
3. multimodality Imaging per la selezione del Volume di destinazione
Nota: Per poter eseguire MRI-guida 3D conformal irradiazione del ratto F98 GB modello con l'animale-guida sub-volume potenziamento, 3 imaging modalità necessità di essere eseguita. Prima di iniettare il radiotraccitore, poi eseguire risonanza magnetica durante l'assorbimento dell'elemento tracciante, successivamente eseguire un'acquisizione PET statica e un trattamento pianificazione CT.
- Anestetizzare gli animali utilizzando un cono di naso con 2% isoflurane mescolata con ossigeno (0,3 L/min). Confermare amputate quando i ratti non rispondono per il riflesso di ritiro dell'arto. Utilizzare un carbomer eye gel per prevenire la secchezza mentre sotto anestesia.
- Inserire un catetere (26 G) nella vena della coda, che consente l'iniezione di tracciante radioattivo di 37 MBq di PET sciolto in soluzione salina µ l 200. Iniettare 18F-FET o 18F-FAZA, 30 min o 2 h prima dell'acquisizione di PET, rispettivamente.
- Iniettare mezzo di contrasto MRI (0,4 mL/kg) per via endovenosa nella vena caudale utilizzando il catetere 15min prima acquisizione PET.
- Mettere i ratti su un in-House ha reso il letto di multimodalità e fissare mediante gancio-e-strappo, mantenendo una posizione fissa durante la formazione immagine e micro-irradiazione (Figura 1).
- Difficoltà tre marcatori multimodalità (capillari riempiti con acqua) sotto, sopra e sul lato destro del cranio. Posizionare il ratto, ancora fissato sul letto multimodalità, nel supporto animale dello scanner MRI, fissare la bobina di superficie del cervello del ratto e posizionare questo set-up in una bobina di corpo intero trasmettitore ratto di 72 mm. Eseguire una scansione di localizzatore seguita da una sequenza di contrapporre-aumentata spin-echo T1-weighted.
- Trasportare l'animale per eseguire un 18F-FET o 18acquisizione PET F-FAZA. Acquisire una scansione PET statica 30 min in modalità elenco. Scansione dovrebbe essere acquisito o 30 min dopo l'iniezione di 18F-FET o a 2 h dopo l'iniezione di 18F-FAZA.
4. pianificazione del trattamento RT
- Utilizzare il trattamento pre-clinico di pianificazione di sistema (PCTPS) per la pianificazione del trattamento. Importare il CT pianificazione del PCTPS e del segmento manualmente questa immagine di CT in tre codici categoria differenti del tessuto: osso, tessuti molli e aria. Questa segmentazione manuale si basa sulla definizione di tre diverse soglie di valore di grigio sulla pianificazione TAC. Queste soglie grigio-valore manualmente selezionate dovrebbero essere scelto tale che l'aria nel cervello è assente e quello spessore dell'osso del cranio è diverso da zero. Una volta definite queste soglie, densità del materiale vengono assegnati da PCTPS per osso, tessuti molli e aria (Figura 4).
- Se solo è necessaria una guida di MRI, caricare l'esplorazione di MRI e co-registrare con il CT pianificazione utilizzando il PCTPS.
- Utilizzare le trasformazioni di corpo rigido (tre traslazioni e tre rotazioni), i marcatori di multimodalità e il cranio. Sovrapponendo l'intensità aumentata del segnale del cranio sul CT con nero segnale su MRI, una fusione precisa può essere realizzato (Figura 5).
- Selezionare la destinazione per irradiazione al centro del tumore d'aumento su T1-weighted MRI, Vedi Figura 6 e Figura 7.
- Quando ulteriori informazioni PET devono essere inclusi, includere una co-registrazione CT/MRI/PET utilizzando il software di quantificazione di immagini biomediche (BIQS).
- Utilizzare l'utensile contouring nella BIQS per ottenere la fusione di immagini PET/MRI (Figura 8). Dopo co-registrazione, selezionare la destinazione nel centro del maggiore assorbimento dell'elemento tracciante PET in BIQS (Figura 9) e inserire manualmente le coordinate PCTPS utilizzando le seguenti trasformazioni: X → -X, Y → Z e Z → -Y.
- Selezionare la dose prescritta, il numero di archi, posizione di arco, gamma di rotazione di archi e la dimensione del collimatore (Figura 10).
- Per MRI-guida RT, utilizzare le seguenti impostazioni: una dose prescritta di 20 Gy, 3 archi posizionati a divano angoli di-45 °, 0 ° e 45 ° con rotazioni di arco di 120 ° e una dimensione di collimatore di 5 x 5 mm.
- Per animale-MRI-guida RT, utilizzare le seguenti impostazioni: una dose prescritta di 20 Gy usando 3 archi e un collimatore di 5 x 5 mm ed extra di 5 Gy per sub-volume d'amplificazione utilizzando 3 archi non complanari e un collimatore di 1 x 1 mm. Selezionare una rotazione di 120 ° per tutti gli archi mentre si cambia la posizione del divano (-45 °, 0 ° e 45 °).
- Calcolare la distribuzione di dose all'interno dell'animale e i parametri di consegna del fascio di consegnare la dose prescritta di destinazione tramite il PCTPS. Prima di irradiazione effettiva, testare le rotazioni di arco a divano diverse posizioni per evitare qualsiasi collisione durante l'irradiazione.
- Per l'irradiazione effettiva, selezionare un filtro di rame di 0,15 mm, impostare la tensione dei raggi x a 220 kV, impostare i raggi x corrente 13 mA, e la posizione del collimatore giusto sul cavalletto. Eseguire il RT trasferendo i parametri di consegna del fascio appropriato dal PCTPS per la micro-irradiatore.
- Durante queste procedure, il ratto è tenuto sotto anestesia continuo isoflurano (2% isoflurane, mescolata con ossigeno 0,3 L/min). Dopo l'esecuzione dell'ultimo arco, l'animale può svegliarsi sotto continuo controllo, finché non si riacquista la piena consapevolezza.
5. dose Volume istogrammi (DVHs)
Nota: Per confrontare la dose effettiva consegnata per i volumi di destinazione del tumore e del tessuto di cervello normale circostante, calcolare DVHs.
- Disegnare un volume di interesse (VOI) intorno al tumore e il cervello normale su T1-weighted contrapporre-aumentata immagini della onorevole per calcolare la media, massima e minima dose (Figura 11).
- Come un surrogato per la massima, la media e la dose minima per il volume del tumore e il volume di tessuto cerebrale normale, calcolare la D2, D50e D90. D sta per la dose ricevuta da x % del volume, indicati con l'indice e può essere derivata dal DVH risultante.
6. TMZ e Sham chemioterapia
- Per simulare il trattamento del glioblastoma in pazienti, somministrare la chemioterapia concomitante usando le iniezioni di IP di 29 mg/kg che TMZ disciolti in una soluzione salina con 25% dimetilsulfossido (DMSO) una volta al giorno per 5 giorni a partire dal giorno della irradiazione24, 25. uso 1 mL, siringa da insulina 29 G per iniezione.
- Per il gruppo di controllo, è necessario somministrare per iniezione da passo 6.1 senza TMZ.
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Representative Results
Per simulare la metodologia di trattamento umano per l'irradiazione del glioblastoma in un modello preclinico, l'inclusione della radioterapia MRI-guida era necessario. Utilizzando il PCTPS e l'interfaccia di micro-irradiatore siamo stati in grado di irradiare F98 glioblastoma in ratti con molteplici archi non complanari conformi targeting per regione contrapporre-aumentata su T1-weighted MRI17. Trasformazioni del rigido-corpo in combinazione con un letto di multimodalità sono state utilizzate per la registrazione di immagine tra MRI e pianificazione CT. Il isocenter per irradiazione è stata selezionata al centro della regione contrapporre-aumentata del tumore su T1-weighted MRI (Figura 7).
Distribuzioni di dose e DVHs cumulativo della dose media, massima e minima del volume di destinazione e il volume di tessuto normale del cervello sono stati calcolati per cinque diversi animali (Figura 12). Basandosi sulla somiglianza con il protocollo clinico irradiazione e una distribuzione di dose ottimale, è stato selezionato un piano di dose mediante tre archi non complanari. L'applicazione di quest'ultimo, 90% del volume di destinazione ha ricevuto la dose desiderata, riducendo al minimo la dose al cervello normale tessuto17.
Dopo aver confermato la fattibilità di irradiazione MRI-guida del modello di glioblastoma del ratto F98, abbiamo cercato di incorporare basati su PET sub-volume d'amplificazione del flusso di lavoro preclinici per la pianificazione di RT. Siamo stati in grado di combinare 3 modalità di imaging, eseguendo prima MRI, quindi PET, e infine CT mentre il topo è fissato su un letto di multimodalità made in-House (Figura 1). Per co-registrazione di queste modalità, abbiamo usato il BIQS, abilitazione molto di più strumenti per fisso corrispondente (Figura 8). Applicare una semplice trasformazione, sia il signor basato e PET basato isocenter (Figura 9) potrebbe essere trasferito per il PCTPS. In Figura 13, basati su PET isocenter per irradiazione dopo il calcolo della dose nella PCTPS e MRI sono mostrati. Per irradiare l'intero volume dimiglioramento abbiamo selezionato un collimatore di 5 x 5 e tre archi rotazione 120 °. Per stimolare la parte più metabolicamente attivo tumore identificato su 18F-FET PET o la parte di tumore più hypoxic identificata su 18F-FAZA PET, una dose di 5 Gy è stata selezionata e recapitata utilizzando un collimatore di 1 mm di diametro. Ancora una volta, vengono applicati 3 archi rotazione 120 °.
Figura 1: l'integrazione di un tubo di raggi x di kV, un cavalletto rotante, una fase di robot controllati dal computer, un sistema di collimazione per forma il fascio e un rilevatore di CT piatto Micro-irradiatore. L'animale è collocato su un letto di multimodalità 4 mm spesso PVC per impedire movimenti tra acquisizioni di immagini multiple, come un'esplorazione di MRI, seguita da una pianificazione CT, che facilita la fusione di immagini. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: conferma di Glioblastoma. T1-weighted MRI T2-weighted MRI e DCE-MRI di un ratto F98 GB. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: curva di DCE. Utilizzando lo strumento di analisi di sequenza di immagine, può essere selezionato un ROI sull'esplorazione di DCE-MRI per tracciare l'intensità del segnale nel tempo. Successivamente, l'analisi della forma della curva di DCE risultante è in grado di confermare la presenza di glioblastoma. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: segmentazione CT. Segmentazione basata sul CT avviene definendo manualmente un numero di valori di soglia per distinguere con precisione aria dal tessuto polmonare, tessuto grasso, ossa e altri tessuti all'interno dell'immagine. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: fusione MRI-CT. Sovrapponendo l'intensità aumentata del segnale del cranio sul CT con nero segnale su MRI, una fusione precisa può essere realizzata. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Cone beam CT. Nessun tumore è visibile sul CT, rendendo impossibile selezionare il isocenter nel centro del tumore. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7: contrapporre-aumentata di T1-weighted MRI. Contrapporre-aumentata di T1-weighted MRI Visualizza chiaramente un tumore di cervello di ratto F98. Il centro del miglioramento del contrasto è selezionato come il isocenter per la pianificazione di RT. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 8: fusione di MRI-PET. Utilizzando l'utensile contouring nella BIQS, fusione di immagini PET/MRI è raggiunto.Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 9: selezione della destinazione di MRI-PET. L'obiettivo per irradiazione è selezionato nel centro di aumento di contrasto su T1-weighted MRI (a sinistra). L'obiettivo per l'amplificazione di sub-volume è selezionato al centro del segnale aumentato su 18F-FET PET (a destra). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 10: pianificazione della radioterapia. Per calcolare la pianificazione della radioterapia, selezionare isocenter, prescritto dose, numero di archi, posizione di arco, gamma di rotazione di archi e la dimensione del collimatore. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 11: calcolo DVH. Disegnare le immagini T1-weighted contrapporre-aumentata signor per calcolare il DVH all'interno di questo volume un volume di interesse (VOI) intorno al tumore. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 12: piano di Dose utilizzando contrapporre-aumentata di T1-weighted MRI e tre arcsto non complanari consegnare 20 Gy al volume bersaglio. Sulla destra, è dato il cumulativo Dose Volume istogramma (DVH) del volume del tumore e il tessuto cerebrale normale delineato su contrapporre-aumentata di T1-weighted MRI. Questa figura è stata modificata da Bolcaen et al. 20 Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 13: selezionati MRI e animale-guida isocenter per irradiazione. Con il piano di dose consegna 20 Gy alla regione di destinazione (regione giallo) viene visualizzata l'immagine di CT in vista assiale, corona e sagittale. Isocenter che è stato identificato su MRI dimiglioramento è visibile (verde) e il isocenter localizzato sulla parte del tumore metabolicamente attivi identificata su 18F-FET PET è anche visibile (rosso). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Per raggiungere irradiazione accurata del bersaglio del tumore glioblastoma nel cervello del ratto, Consiglio di CT di micro-irradiatore a bordo non era sufficiente. I tumori cerebrali sono difficilmente visibili a causa di contrasto insufficiente dei tessuti molli, anche se l'aumento di contrasto sarebbe stato utilizzato. Come tale, MRI deve essere incluso per consentire l'irradiazione più precisa. Utilizzando un'acquisizione di MR sequenziale su un sistema di T 7 e un'acquisizione di CT su micro-irradiatore di che siamo stati in grado indirizzare la dose al tessuto del tumore d'aumento nel cervello e calcolare un piano di dose mediante il pianificazione CT. Questo è stato fattibile dopo calcoli di fusione e la dose di immagini utilizzando il PCTPS17. Tuttavia, dovrebbe essere tenuto a mente che MRI è soggetta a distorsioni geometriche che non sono corretti in questo protocollo. Inoltre, prima di tradurre questo protocollo di irradiazione in altre parti del corpo, ulteriore ricerca è necessaria. L'importanza di una segmentazione accurata del tessuto a causa dell'uso di fotoni di energia inferiore kV dovrebbe essere considerato. Mentre la suddivisione in tre classi di tessuto potrebbe essere sufficiente nel cervello del ratto, è necessario essere indicato nella regione toracica o addominale dei ratti per fornire calcoli accurati dose più tessuto classi. Per evitare movimenti durante il trasporto tra i diversi sistemi di imaging, abbiamo fatto uso di un letto di multimodality che riduce al minimo il movimento della testa (Figura 1). Tuttavia, un ulteriore sforzo è necessario quando l'applicazione del presente protocollo ad altre parti del corpo, regioni o toraciche o addominale. Animale soprattutto piccola irradiazione degli organi influenzato dal movimento respiratorio o transito intestinale è comunque impegnativo.
L'incorporazione di animale-guida sub-volume d'amplificazione inoltre è stato indicato per essere fattibile, nonostante un protocollo di lavoro ad alta intensità. Un vantaggio di tecniche di imaging nucleare, come la PET, è l'abilità all'immagine l'eterogeneità all'interno dei tumori, che permette di targeting parti altamente metabolicamente attivi o resistente alle radiazioni del tumore. Siamo stati in grado di aumentare la dose, specificamente mirata sulla regione più biologicamente attiva o più hypoxic del tumore usando 18F-FET PET o 18F-FAZA PET, rispettivamente. Il passaggio fondamentale nel protocollo è co-registrazione immagine. Attualmente, nessun software è in grado di co-registrare automaticamente pre-clinici MRI o CT con immagini PET con sufficiente precisione e riproducibilità. In genere, traccianti PET in neuro-oncologia mostrano un assorbimento basso nel cervello normale che complica il processo di registrazione. Per fusione tra le tre modalità di formazione immagine (CT, MRI, PET), abbiamo preferito il BIQS piuttosto che PCTPS, che non è attualmente sviluppato facilmente combinare molteplici modalità di imaging. Inoltre, il BIQS ha più strumenti intelligenti per corrispondenza rigida. Un aiuto importante è anche l'uso di un letto di multimodalità, impedendo il movimento dell'animale tra le acquisizioni di immagini diverse. Tuttavia, co-registrazione manuale è che richiede tempo e aumenta il tempo di anestesia degli animali. Una volta ottenuta la registrazione di immagine, esportazione delle coordinate dalla BIQS nella PCTPS era fattibile applicando una trasformazione semplice sulle coordinate di destinazione.
Non è solo importante indirizzare con precisione il volume del tumore (biologico): con parsimonia del tessuto di cervello normale circostante deve essere preso in considerazione pure. Quest'ultimo è spesso trascurato negli esperimenti animali radioterapia attuale ma molto importante per rendere il modello anche clinicamente rilevanti. Questo è stato ottenuto mediante l'applicazione di molteplici archi non complanari. A nostra conoscenza, più irradiazione cranica arco nei piccoli animali è stata mai applicata prima. Per quanto riguarda l'utilizzo del fascio, questa metodologia è a chiudere la somiglianza con la clinica RT conformal immagine-guida e grazie all'utilizzo di trattamento di arco la destinazione riceve infine la dose prescritta, mentre i tessuti normali ricevono solo una frazione di esso. Come tale, un primo passo è fatto per ridurre al minimo il divario tra preclinica e clinica RT tecnologia17. Una limitazione di questo micro-irradiatore è che la rotazione del cavalletto è limitata a 120 °. Combinazione di rotazioni di arco con un cambiamento nella posizione del lettino è ulteriormente aumentato il risparmio del tessuto cerebrale normale che circonda il bersaglio del tumore.
Questa metodologia è un passo importante verso l'inclusione di modalità di imaging biologica per l'orientamento di radioterapia. Tuttavia, i nuovi sviluppi sono necessari per semplificare la fusione di immagini pre-clinica e incorporare dose pittura dai numeri (DPBN) in applicazioni precliniche. Utilizzando la corrente micro-irradiatore, siamo ora in grado di applicare sub-volume d'amplificazione; Tuttavia, DPBN non è ancora possibile a causa delle limitazioni nel calcolo della dose, rotazioni del cavalletto e progettazione del collimatore. Infine, lo sviluppo di compatto scanner PET preclinici che offre risoluzione spaziale sub-millimetrica è promettente26 e questi dispositivi potrebbero fornire una soluzione molto elegante per integrare una piattaforma piccola radiazione animali PET.
Abbiamo dimostrato l'applicabilità di questo modello per combinato MRI e PET-guida irradiazione e la chemioterapia del glioblastoma in ratti e per future ricerche sulle nuove terapie per glioblastoma. Inoltre, l'applicazione di animale-guida sub-volume d'amplificazione è un primo passo verso la costituzione di un BTV nella programmazione del trattamento di radiazione, di modelli piccoli animali del cancro.
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse di divulgare
Acknowledgments
Gli autori vorrei ringraziare Stichting Luka Hemelaere e Soroptimist International per sostenere questo lavoro.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GB RAT model | |||
| F98 Glioblastoma cell line | ATCC | CRL-2397 | |
| Fischer F344/Ico crl Rats | Charles River | N/A | http://www.criver.com/products-services/basic-research/find-a-model/fischer-344-rat |
| Micropump system | World Precision Instruments | UMP3 | Micro 4: https://www.wpiinc.com/products/top-products/make-selection-ump3-ultramicropump/#tabs-1 |
| Stereotactic frame | Kopf | 902 | Model 902 Dual Small Animal Stereotaxic frame |
| diamant drill | Velleman | VTHD02 | https://www.velleman.eu/products/view/?id=370450 |
| Bone wax | Aesculap | 1029754 | https://www.aesculapusa.com/products/wound-closure/hemostatic-bone-wax |
| Insulin syringe Microfine | Beckton-Dickinson | 320924 | 1 mL, 29G |
| InfraPhil IR lamp | Philips | HP3616/01 | |
| Ethilon | Ethicon | 662G/662H | FS-2, 4-0, 3/8, 19 mm |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture | |||
| DMEM | Invitrogen | 14040-091 | |
| Penicilline-streptomycine | Invitrogen | 15140-148 | |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030-032 | |
| Fungizone | Invitrogen | 15290-018 | |
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25300-062 | |
| PBS | Invitrogen | 14040-224 | |
| Falcons | Thermo Scientific | 178883 | 175 cm2 nunclon surface, disposables for cell culture with filter caps |
| Cell freezing medium | Sigma-aldrich | C6164 | Cell Freezing Medium-DMSO, sterile-filtered, suitable for cell culture, endotoxin tested |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animal irradiation | |||
| Micro-irradiator | X-strahl | SARRP | |
| software for irradiation | X-strahl | MuriPlan | pre-clinical treatment planning system (PCTPS), version 2.0.5. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Small animal PET | |||
| microPET system possibility 1 | Molecubes | B-Cube | http://www.molecubes.com/b-cube/ |
| microPET system possibility 2 | TriFoil Imaging, Northridge CA | FLEX Triumph II | http://www.trifoilimaging.com |
| PET tracers | In-house made | 18F-FDG, 18F-FET, 18F-FAZA, 18F-Choline | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Small animal MRI | |||
| microMRI system | Bruker Biospin | Pharmascan 70/16 | https://www.bruker.com/products/mr/preclinical-mri/pharmascan/overview.html |
| Dotarem contrast agent | Guerbet | MRI contrast agent, Dotarem 0,5 mmol/ml | |
| rat whole body transmitter coil | Rapid Biomedical | V-HLS-070 | |
| rat brain surface coil | Rapid Biomedical | P-H02LE-070 | |
| Water-based heating unit | Bruker Biospin | MT0125 | |
| 30 G Needle for IV injection | Beckton-Dickinson | 305128 | 30 G |
| PE 10 tubing (60 cm/injection) | Instech laboratories, Inc | BTPE-10 | BTPE-10, polyethylene tubing 0.011 x .024 in (0.28 x 60 mm), non sterile, 30 m (98 ft) spool, Instech laboratories, Inc Plymouth meeting PA USA- (800) 443-4227- http://www.instechlabs.com |
| non-heparinised micro haematocrit capillaries | GMBH | 7493 21 | these capillaries are filled with water to create markers visible on MRI and CT |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Consumables | |||
| isoflurane: Isoflo | Zoetis | B506 | Anaesthesia |
| ketamine: Ketamidor | Ecuphar | Anaesthesia | |
| xylazine: Sedaxyl | Codifar NV | Anaesthesia | |
| catheter | Terumo | Versatus-W | 26G |
| Temozolomide | Sigma-aldrich | T2577-100MG | chemotherapy |
| DMSO | Sigma-aldrich | 276855-100ML | |
| Insulin syringe Microfine | Beckton-Dickinson | 320924 | 1 mL, 29G |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Image analysis | |||
| PMOD software | PMOD technologies LLC | PFUS (fusion tool) | biomedical image quantification software (BIQS), version 3.405, https://www.pmod.com/web/?portfolio=22-image-processing-pfus |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthesia-equipment | |||
| Anesthetic movabe unit | ASA LTD | ASA 0039 | ASA LTD, 5 valley road, Keighley, BD21 4LZ |
| Oxygen generator | Veterinary technics Int. | 7F-3 | BDO-Medipass, Ijmuiden |
References
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