Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Bruker CRISPR/Cas9 Gene redigering for å undersøke kreftfremkallende aktiviteten av muterte Calreticulin i cytokin avhengige blodkreft cellene

Published: January 5, 2018 doi: 10.3791/56726
Automatic Translation
1, 1,2,3
1Division of Hematology, Department of Medicine, Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School, 2Broad Institute, 3Dana-Farber Cancer Institute, Harvard Medical School

Summary

Målrettet genet redigering med CRISPR/Cas9 har mye lettere forståelsen av biologiske funksjoner gener. Her bruker vi CRISPR/Cas9 metodikken å modell calreticulin mutasjoner i cytokin-avhengige blodkreft cellene for å studere aktiviteten deres kreftfremkallende.

Abstract

Gruppert regelmessig interspaced kort palindromic gjentar (CRISPR) er en adaptiv immunitet system i prokaryoter som har blitt repurposed av forskere å generere RNA-guidede nucleases, som CRISPR-assosiert (Cas) 9 for områdespesifikke eukaryote genom redigering. Genomet engineering av Cas9 brukes effektivt, enkelt og robust endre endogene gener i mange biomedically relevante pattedyr linjer og organismer. Her viser vi et eksempel på hvordan å utnytte CRISPR/Cas9-metodikk for å forstå de biologiske funksjonen av bestemte genetiske mutasjoner. Vi modellen calreticulin (CALR) mutasjoner i murine interleukin-3 (mIL-3) underordnede pro-B (Ba/F3) celler ved levering av enkelt guide RNAs (sgRNAs) målretting endogene Calr locus i den spesifikke regionen der innsetting og/eller sletting (indel ) CALR mutasjoner oppstår i pasienter med myeloproliferative neoplasms (MPN), en type blodkreft. SgRNAs opprette dobbel-strand bryter (DSBs) i det målrettede området er reparert av ikke-homologe slutten med (NHEJ) for å gi indeler i ulike størrelser. Vi bruker deretter standard Ba/F3 mobilnettet transformasjon analysen å forstå effekten av fysiologiske nivå uttrykk for Calr mutasjoner på blodkreft mobilnettet transformasjon. Denne tilnærmingen kan brukes på andre gener å studere deres biologisk funksjon i ulike pattedyr linjer.

Introduction

CRISPR/Cas9-teknologien har nylig revolusjonert målrettet genomet redigering i levende celler og organismer. Det har blitt en svært kraftig verktøy for biomedisinsk forskning og er for tiden brukes som en potensiell avenue for behandling av genetiske sykdommer1. Grunnlaget for alle genomet redigeringsverktøy er avhengig av etableringen av en nuclease-indusert DNA dobbel strandet pause (DSB) på genomisk locus endres. DSBs kan repareres av ikke-homologe slutten begynte (NHEJ) eller homologi-rettet reparasjon (HDR)2,3. Fordelen med den Cas9 nuclease over andre genomet engineering nucleases, som sink finger nucleases (ZFNs) og transkripsjon aktivator som effektor nucleases (TALENs) er sin avhengighet av RNA for målretting nuclease til en ønsket DNA sekvens, sammenlignet til protein-DNA samhandlingene i ZFNs og TALENs2,3.

Etter oppdagelsen av CRISPR/Cas9 nuclease veien som en adaptive immunsystemet i prokaryote celler4,5gått mye arbeid inn tilpasse veien for bruk i pattedyr linjer og modell organismer2, 3. som et verktøy for redigering av genet, CRISPR/Cas9 veien benytter to hovedkomponenter: Streptococcus pyogenes (Sp) avledet Cas9 nuclease og sgRNAs rettet mot genet av interesse2,3. SgRNA består av 20 nukleotider som direkte Cas9 for et bestemt område på genomet til RNA-DNA base par komplementaritet2,3. Målområdet for sgRNA må være tilstøtende til et protospacer tilstøtende motiv (PAM) i form av 5' NGG, som er anerkjent av SpCas9 nuclease. Med disse verktøyene kan Cas9 rettes til noen DNA sekvensen ved å designe sgRNAs som mål regionen rundt. I tillegg til Sp avledet Cas9, er det flere varianter av Cas9 med forskjellige funksjoner avhengig av det bestemte programmet. For eksempel finnes det Cas9 varianter med høyere spesifisitet for på målet redigering eller single-strand cleavage kapasitet for DNA skår6,7. Videre er katalytisk inaktive Cas9 nylig utviklet for transcriptional regulering8. Forskere har brukt CRISPR/Cas9 systemet til en rekke programmer, for eksempel genet knockin og knockout å studere biologiske funksjonene gener9, tap av funksjon og gevinst-av-funksjon bibliotek skjermer10 og genetisk utvikling av modell organismer11.

I denne protokollen kombineres CRISPR/Cas9 metodikken med Ba/F3 mobilnettet transformasjon analysen å forstå biologisk funksjon CALR mutasjoner. Ba/F3 cellene er en murine IL-3 underordnede blodkreft cellen linje som kan gjengis IL-3 uavhengig på uttrykk for visse oncogenes som BCR-ABL12. For å forstå om mutant calreticulin kan forvandle Ba/F3 celler cytokin uavhengig vekst, vi målrettet ekson 9 av endogene Calr locus bruker CRISPR/Cas9 for å innføre indel mutasjoner og deretter trakk IL-3 fra cellene gjelder et positiv utvalg press, med mål om recapitulating gevinst-av-funksjon CALR mutasjoner i MPN pasienter. Protokollen inneholder design, kloning og levering av sgRNAs, utviklingen av stabile Cas9 uttrykke celler og screening for CRISPR på målet genet redigering. Dette kan brukes på ulike gener og ulike cytokin-avhengig cellelinjer rundt og er spesielt nyttig i modellering og studere biologiske funksjonen i gener involvert i kreft.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. sgRNA Design bruke nettverktøy13

  1. Utforme sgRNAs målretting genet av interesse ved hjelp av fritt tilgjengelig online verktøy.
    1. Kopier og lim NCBI referanse sekvensen av genet av interesse i brede Institute sgRNA designer web verktøyet: (http://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design).
      Merk: Dette verktøyet identifiserer sgRNA sekvenser med cleavage områder i exons og de som dekker intron/ekson grensen men likevel holde seg innenfor exon.
    2. Last ned og åpne output tekstfilen i excel.
    3. Fokus på kolonnene fylles ut med sgRNA sekvenser og sgRNA sammenheng sekvenser. Merk at sgRNA sekvenser inneholder protospacer tilstøtende motivet (PAM) men sammenheng sekvenser gjør.
    4. Merk at på målet effekt score viser anslått cleavage effektivitet score på en skala fra 0 til 1 der en score på 1 angir en høyere cleavage effektivitet.
    5. Bruk funksjonen 'form' i excel enten bestille målene ved effekt score eller ved beliggenhet i genet av målet gjennom kolonnen 'Mål kutt %'.
      Merk: Sortert etter plassering i genet er nyttig for å identifisere sgRNAs som er rettet mot bestemte domener eller ekson rundt.
    6. Velg 3-6 sgRNAs at målet området av interesse med høy (> 0,6) effekt score på målet. Det kan være nyttig å vite hva slags mutasjoner kan være ansvarlig for fenotypen som ønsket (se figur 1 forklarer det målretting strategien anvendt for calreticulin).
      Merk: sgRNAs under foreslåtte 0,6 effekt score terskelen bør vurderes når det er mangel av andre gode kandidater.
    7. Bruk verktøyet MIT gRNA analyse web til skjermen for potensielle off-målet effekter (http://crispr.mit.edu/). For hver sgRNA valgt, kjøre mål sekvensen (inkludert PAM).
      Merk: Bred Institute sgRNA designer web-verktøyet kan også brukes til skjermen for off-målet effekter (http://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design).
      1. Merk at MIT sgRNA analyseverktøyet score hver sgRNA på en skala fra 1-100 der en score på 100 angir høyere spesifisitet. En poengsum som er større enn 70 er ideelle og en sgRNA med minimum off-målet effekter. Dette nettstedet også genererer en liste av off-målet treff med deres plassering i genomet og hvor mange samsvarer de har med kandidaten guide.
        Merk: Off-målet treff med fire uoverensstemmelser eller større anses trygt14. Off-målet treff med mindre enn fire uoverensstemmelser kan være problematisk hvis de faller innenfor exons14.
    8. Velg 2-3 sgRNAs som målet forskjellige steder i regionen av interesse for målet genet, og som har høyest sammenkoblede cleavage effektivitet og off-målet score (se tabell 1 for sgRNA sekvenser målretting ekson 9 av Calr).
      Merk: Avhengig av eksperimentelle mål, større vekt kan være plassert på de ulike verdiene fra verktøyene.

2. kloning sgRNA Oligos13

  1. Generere frem oligo
    1. Opprett en liste over sgRNA sekvenser uten PAM området.
    2. Legge til en G 5' slutten av sekvensen hvis 5' utgangen av det sgRNA ikke er en G.
      Merk: Denne G er nødvendig for å maksimere U6-drevet sgRNA transkripsjon nivå. Tillegg av en G er nødvendig for m1 sgRNA (tabell 1).
    3. Legge til sekvensen "CACC" på 5' slutten av G-optimalisert guide sekvensen (ingen PAM) (tabell 2) for å generere overheng kreves for ligation av glødet oligos i BsmBI fordøyd lentiGuide vektor (se trinn 3).
  2. Generere den omvendte oligo
    1. Omvendt supplement G-optimalisert guide sekvensen (ingen PAM).
    2. Legge sekvensen "AAAC" til 5' slutten av omvendt supplert G-optimalisert guide sekvensen (tabell 2).
    3. Bestill designet oligos fra en primer syntese company.
  3. Anneal og phosphorylate oligos
    1. Legg 1 µL av fremover oligo (100 µM), 1 µL av omvendt oligo (100 µM), 1 µL av 10 x T4 ligation buffer, 0,5 µL av T4 polynucleotide kinase (PNK) og 6.5 µL av H2O slik PCR (totalt = 10 µL).
    2. Kjøre følgende program i thermocycler: 37 grader for 30 min, 95 grader i 5 min, rampe fra 95 til 25 på 0,1 ° C/s.
    3. Fortynne reaksjon produktet på 1:250 i H2O.

3. fordøyelsen av lentiGuide-Puro vektor13

  1. Ufullstendig lentiGuide-Puro vektor
    1. Montere en 50 µL fordøyelsen reaksjon med følgende komponenter: 5 µg sirkulær plasmider, 2 µL (30 enheter) av BsmBI begrensning enzym, 5 µL begrensning enzym buffer og 50 µL av H2O.
    2. Kjøre reaksjonen 2 h 55 ° C. Etter den første timen, Legg 1 µL mer av BsmBI begrensning enzym.
  2. Dephosphorylate klippe ryggraden
    1. Legge til 7 µL fosfatase reaksjon bufferen og 2 µL av fosfatase enzym fordøyd vektoren.
    2. Inkuber i 30 min på 37 ° C.
  3. PCR renser kutt og dephosphorylated ryggraden med en kommersiell kit.
    Merk: Erstatning gitt rosa farget kolonnene med miniprep kit blå farget kolonner siden disse rommer bedre stor plasmider størrelser. Avkastningen kan økes ved oppvarming elueringsbufferen i en 90 grader varme blokk før elueringsrør og eluting DNA fra kolonnen to ganger på slutten (kjøre eluted DNA fra første tilsettes tilbake gjennom en gang).

4. ligation ofAnnealed Oligos i fordøyd ryggraden13

  1. Legge 50 ng av fordøyd ryggrad, 1 µL av herdet oligo fortynning, 1 µL av 10 x T4 ligation buffer, 1 µL T4 ligase og 10 µL av H2O slik PCR. Inkuber 1t ved romtemperatur
  2. Transformere Stbl3 celler med 2 µL av hemorroider reaksjonen. Plate på en lysogeny kjøttkraft (LB) agar tallerken med 100 µg/mL ampicillin og ruge over natten på 37 ° C.
  3. Velg 3 kolonier og vaksinere til en mini prep kultur.
  4. Validere riktig oligo innsetting
    1. Utføre en miniprep for hver kultur og rekkefølgen oligo innsetting området fra en primer i U6 selskapet bruker en kommersiell kit.
    2. Utføre en midi-prep eller en maxi-prep sekvens-verifiserte kultur.

5. generasjon cellen lLines stabilt uttrykke SpCas9

Merk: Denne protokollen innebærer levering av pLX_TRC311-Cas9 plasmider av lentiviral infeksjon. Denne protokollen er beskrevet i detalj for murine interleukin-3 (mIL-3) avhengige pro-B (Ba/F3) celler, en suspensjon cellen linje og kan tilpasses andre celletyper foretrukne kultur betingelser for hver celle. Kultur medium for Ba/F3 celler består av RPMI med 10% fosterets bovin serum, 1% penicillin/streptomycin/L-glutamin og 10 ng/mL murine interleukin 3.

  1. Transfect HEK-293T celler
    1. Frø 3 x 106 HEK-293T celler per 10 cm vev kultur parabol. Holde seeded celler over natten før transfection.
      Merk: HEK-293T celler er en tilhenger cellen og rutinemessig brukes for virus produksjon. Cellene blir vedlikeholdt i DMEM med 10% fosterets bovin serum, 1% penicillin/streptomycin/L-glutamin. Celler bør være 80% confluent ved transfection.
    2. Pre varme redusert serum media (Opti-MEM) og vekst medium.
    3. Legge til 500 µL av redusert serum media, 7 µg pLX_TRC311-Cas9 konstruksjon, 4 µg av pCMV-VSV-G lentiviral emballasje plasmider og 4 µg av psPAX2 lentiviral emballasje plasmider inn i et rør
      Merk: Total DNA per 10 cm rett av 293T celler er 15 µg.
    4. DNA blandingen og legge 45 µL av transfection reagensen. Bland forsiktig og la den stå for 20 min.
      Merk: Det er viktig å bruke redusert serum medier fordi serum vil hemme komplekse dannelsen mellom transfection reagens og plasmider DNA.
    5. Sug opp den gamle mediet i 293T plate og legge 5 mL av nye vekst medium.
    6. Legge til DNA og transfection reagens blandingen i en dråpe klok måte 293T platen. Swirl forsiktig og ruge på 37 ° C og 5% CO2 24 h.
    7. Høste viral supernatants på 24 og 48 h innlegget transfection. Passerer gjennom et 0.22 µm filter og aliquot inn i et cryovial rør (1.6 mL/t og 1,5 mL skal brukes for infeksjon).
    8. Lagre viral nedbryting på-80 ° C.
      Merk: lentiviral nedbryting kan brukes i 6 måneder. Hvis mulig, skal spinfection transductions utføres med fersk virus).
  2. Lentiviral infeksjon Ba/F3 celler
    1. Tine viral nedbryting på is, hvis frosset.
    2. Sentrifuge cellene på 300 x g for 4 min.
    3. Sug opp nedbryting og resuspend cellene i en konsentrasjon av 3 x 106 celler/mL.
    4. Legge til 500 µL av resuspended celler, 1,5 mL av viral nedbryting, 4 µL av polybrene (lager: 2 mg/mL) og 10 ng/mL m-IL3 i en 6-og vev kultur plate. Sørg for å inkludere en infisert med 1,5 mL av medier i stedet for viral nedbryting som en kontroll.
      Merk: Mengden av viral nedbryting lagt skal tilsvare et mangfold av infeksjon (MOI) < 1.
    5. Sentrifuge platen 440 x g for 120 min på 37 ° C.
    6. Ta plate ut av centrifuge og plasser i 37 ° C og 5% CO2 inkubator og tillater for å vokse over natten.
    7. Nedspinning cellene etter 24 timer, og resuspend med 5 mL fersk varm medium i en 6-vel plate.
  3. Cas9 infisert celleutvalg
    1. Nedspinning cellene og resuspend med fersk varm media med 5 µg/mL av blasticidin, 48t innlegg spinfection.
    2. Merk cellene for 9 dager med blasticidin eller til uninfected (negativ) kontroll celler er død.
    3. Når merkingen er fullført, kan du overføre motstandsdyktig cellene til medium med lavere konsentrasjon av blasticidin.

6. reporter analysen for Cas9 aktivitet15

  1. Transduce foreldre cellene og stabilt uttrykke Cas9 med pXPR-011 av lentiviral infeksjon (se trinn 5.1-5.2).
    Merk: Denne vektoren inneholder både GFP og en guide rettet mot GFP. Celler som inneholder aktive Cas9 vil resultere i en reduksjon av GFP (figur 2).
  2. Merk cellene i 3 dager med 2 µg/mL puromycin, 48t innlegg spinfection.
  3. Analysere prøvene for GFP uttrykket av flowcytometri.
    Merk: En GFP reduksjon av 50% eller mer representerer optimale Cas9 aktivitet. En høyere konsentrasjon av blasticidin utvalg kan brukes til å øke Cas9 aktivitet hvis mindre enn 50% reduksjon er observert. Ikke alle cellelinjer tåler blasticidin utvalg. I dette tilfellet kan bruk av Cas9 vektorer med andre utvalg kassetter være nødvendig. I tillegg tåler ikke alle cellelinjer stabil uttrykk for Cas9. I dette tilfellet kan forbigående transfection av Cas9 brukes.

7. Spinfection av sgRNAs i Cas9 uttrykker celler

  1. Følg trinnene 5.1-5.2 for lentiviral infeksjon av sgRNAs i cellene av interesse.
    Merk: I trinnet 5.1.3 Erstatt pLX_TRC311-Cas9 konstruksjon med lentiGuide-Puro Konstruer validert fra punkt 4.
  2. 48t post spinfection, merker du cellene i 3 dager med 2 µg/mL puromycin.
  3. Overføre motstandsdyktig cellene til medium med lavere konsentrasjon av antibiotika og fortsette valg for en annen 4 dager for at tilstrekkelig redigering.

8. Ba/F3 mobilnettet transformasjon og positiv utvalg med m-IL3 uttak

Merk: Denne analysen er beskrevet for mIL-3 underordnede Ba/F3 celler, men kan brukes til alle cytokin underordnet celle linje.

  1. Nedspinning eksponensielt voksende Ba/F3 celler uttrykke ectopically Cas9 og sgRNA av interesse.
  2. Sug opp nedbryting og vask cellene med 5 mL av fosfat bufret saltvann (PBS).
  3. Nedspinning cellene og gjenta vask trinnet i 8.2 fire ganger (dette trinnet sikrer at media er gratis IL-3).
  4. Sug opp PBS og resuspend cellene i 5 mL av fersk media uten IL-3.
  5. Telle celler ved hjelp av en hemocytometer eller en celle levedyktighet analysator.
  6. Ætt cellene i tre eksemplarer i en 6-og vev kultur plate i en konsentrasjon av 1 x 105 celler/mL i et totalt volum på 2 mL frisk media uten IL-3.
  7. Overvåke og telle celler hver 2 dager for totalt 8 dager.
    Merk: Ba/F3 celler mangler IL-3 vanligvis dø 2 dager innlegget IL-3 sult. Det er viktig å inkludere en negativ kontroll i analysen (vanligvis en ikke målretting guide brukes som en kontroll).

9. screening for redigering av CRISPR på mål

  1. Utforme CRISPR screening primere oppstrøms og nedstrøms sgRNA cleavage området
    Merk: Bruk primere minst 100 bp fra webområdet spådd cleavage for å sikre oppdagelsen ikke ville bli påvirket av en stor innsetting og/eller sletting (indel) på webområdet sgRNA.
  2. Isolere genomisk DNA (gDNA) fra transformert celler (på slutten av vekstkurve) og cellene pre-cytokin tilbaketrekning.
    Merk: Alltid inkludere celler overexpressing ikke målretting guiden som en kontroll for genet redigering. Isolere gDNA fra celler før og etter transformasjon vil identifisere kloner som var positivt valgt for og har proliferativ fordel.
  3. Montere en 50 µL PCR med følgende komponenter: 25 µL av 2 x PCR mix, 1 µL frem primer (10 µM), 1 µL av omvendt primer (10 µM), 50-100 ng gDNA og H2O opptil 50 µL.
    Merk: Mange Hi-Fi-polymerases kan brukes i trinn 9.3.
  4. Kjøre prøver i en thermocycler med følgende parametere: 95° C i 1 minutt, 30 sykluser (94 ° C i 1 minutt, 52 ° C for 30 s, 72 ° C for 30 s), og 72 ° C i 10 min. Denne PCR er optimalisert for Calr primerne oppført i tabell 3. Optimalisere PCR betingelser for primer paret i trinn 9.1 basert på tester den på gDNA.
  5. Kjør 5 µL av prøvene på en 2% agarose gel på 10 V/cm med 1 x Tris-acetate-EDTA (TAE) buffer. Undersøke prøver etter / fravær av et forsterket band tilsvarer genet av interesse.
  6. Bruk resten av PCR reaksjonen (45 µL) for å utføre et PCR-rensing.
  7. Klone av amplicons med en PCR kloning kit i en plasmider vektor. PGEM T-lett vektorer brukes for eksempel vanligvis.
  8. Forvandle plasmider Stbl3 celler eller andre kompatible celler og plate på LB agar plater med det aktuelle antibiotikaet. Velg 10-20 kolonier, mini prep hver enkelt, og underlagt hver klone Sanger sekvensering å karakterisere indeler opprettet fra CRISPR/Cas9 redigering.
    Merk: Hvis ønskelig, enkelt celle fluorescens aktivert celle sortering (FACS) kan utføres på hoveddelen endret befolkningen til å isolere en klone med en bestemt indel. Dessuten kan neste generasjons sekvensering (NGS) metoder brukes mer robust kvantifisere på målet redigering med dyp sekvensering av PCR amplicons omfatter sgRNA målregion. Sporing av indeler av nedbryting eller TIDEVANNET kan for eksempel brukes i stedet for subcloning for å nøyaktig bestemme spektrum og hyppigheten av målrettet mutasjoner genereres i en pool av celler (https://tide.nki.nl/#about)16.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Med metoden skissert her er målet med dette eksperimentet å studere funksjonelle virkningene av å innføre indel mutasjoner til endogene Calr locus på blodkreft celle transformasjon. CRISPR/Cas9 systemet brukes som et verktøy til å opprette endogene Calr mutasjoner i Ba/F3 celle. To sgRNAs ble valgt målrette ekson 9 av Calr (figur 1), i regionen hvor innsettinger og/eller sletting (indel) mutasjoner oppstår vanligvis i CALR-mutant MPN pasienter17,18. Den første sgRNA (m1) ble valgt basert på dens høy cleavage effektivitet og gunstige off-målet score (tabell 1). Den andre sgRNA (m2) var valgt primært for ligger i ekson 9 og mangel på ytterligere sgRNAs i regionen for å redigere med høy cleavage effektivitet og gunstige off-målet score (tabell 1). To forskjellige sgRNAs (m1 eller m2) ble brukt i separate infeksjoner for å sikre at de observerte effektene skyldtes på målet genet redigering. Off-målet effekter er usannsynlig å deles av flere uavhengige sgRNAs. Kontrollen ikke målretting (pakke) ble også brukt som en negativ kontroll. Rekruttering av Cas9 endonuclease å Calr ekson 9 er spådd til å opprette DSBs på denne locus. DSBs vil deretter bli reparert av NHEJ, som kan generere indeler av variabel størrelse (figur 1).

For å utvikle den i vitro CRISPR/Cas9 systemet i Ba/F3 celler, ble celler som uttrykker stabilt Cas9 protein gjort av lentiviral-mediert signaltransduksjon som protokollen beskrevet ovenfor. Stabil Cas9 uttrykk gir robust Cas9 aktivitet. Cas9 aktivitet i Ba/F3-Cas9 celler ble målt ved pXPR-011, en reporter konstruksjon som inneholder både GFP og en guide rettet mot GFP15. Celler som inneholder aktive Cas9 vil resultere i en reduksjon på GFP15. GFP ble målt i celler ved hjelp av flowcytometri. Ba/F3-Cas9 celler vises en reduksjon på ca 76% i GFP, tilsvarer robust Cas9 aktivitet (figur 2).

Type 1 cytokin reseptorer, som thrombopoietin reseptoren (MPL), erytropoietin reseptoren (EPOR) og granulocytt koloni-stimulerende faktor reseptor (G-CSFR) var hver individuelt, stabilt uttrykt i Ba/F3-Cas9 celler å avgjøre deres cooperativity med mutant calreticulin i indusere transformasjon av Ba/F3 celler. Signaltransduksjon av sgRNA sammensetningene (m1, m2 eller en scramble (ikke målretting guide)) ble deretter gjennomført i hver av de Ba/F3 celle linjene stabilt uttrykke Cas9 og reseptoren av interesse. Cellene ble deretter valgt i 7 dager med puromycin å ha tilstrekkelig tid for CRISPR/Cas9 gene redigering. En positiv utvalg Press ble så brukt av sultende cellene av cytokin (mIL-3). Målet med dette sult presset er å identifisere hvis indeler i Calr ekson 9, ligner i MPN pasienter, er valgt, uavhengig av cytokin vekst og endring av Ba/F3 celler. Vekstkurve ble utført for totalt 8 dager og cellene var regnet hver 2 dager for å måle deres transformasjon (Figur 3)19. Cellen pellets for genomisk DNA utvinning ble samlet før begynnelsen av vekstkurve, og på slutten av vekstkurven etter på målet redigering og for å overvåke indeler som utvidet innlegget cytokin sult (Figur 3)19.

Cytokin uavhengig vekst ble observert i Calr-målrettet Ba/F3-MPL-Cas9 celler (figur 4B), men ikke Calr-målrettet foreldrenes Ba/F3-Cas9 celler (figur 4A) eller Ba/F3-Cas9 celler uttrykke ectopically EPOR (figur 4C ) eller G-CSFR (Figur 4 d)19. For å bekrefte at mIL-3 uavhengig vekst i Calr målrettede Ba/F3-MPL-Cas9 celler var et resultat av på målet genet redigering, celler ble høstet 8 dager innlegget mIL-3 uttak og genomisk DNA var utdraget19. En 422 bp regionen spenner over målområdet ble forsterket bruker primerne oppført i tabell 3. Sub kloning av PCR amplicons ble utført og 30 personlige kloner ble sendt for Sanger sekvensering. M1 eller m2 Calr-målrettet Ba/F3-MPL-Cas9 celler, alle sub kloner inneholdt indeler av varierende størrelse på aktuelle kuttet området (figur 5)19. 11 av 13 m1 sub kloner ble funnet å inneholde indeler som førte til 1 bp frameshift mutasjoner (figur 5), ligner funnet hos pasienter. For m2 Calr-målrettet celler, 10 av 17 sub kloner ble funnet for å inneholde indeler som førte til 1 bp frameshifts (figur 5)19. Disse dataene bekrefte at CRISPR/Cas9-mediert innføring av + 1bp frameshift mutasjoner av endogene Calr ekson 9 locus er nok til å tildele kreftfremkallende aktivitet til Calr19. Sekvensering dataene i figur 5 også antyder at innføringen av heterozygote + 1bp frameshift mutasjoner til endogene Calr locus er tilstrekkelig til å transformere Ba/F3-MPL celler, samsvar med observasjon at CALR mutasjoner er vanligvis heterozygote i MPN pasienter17,18. Siden NHEJ reparere resulterer i høy heterogenitet mellom indeler, kan enkelt celle sortering for å isolere en klone av interesse utføres. Dette vil tillate forskeren å studere virkningene av spesifikke mutasjoner skapt av CRISPR/Cas9.

Figure 1
Figur 1: Skjemaet for CRISPR/Cas9 gen-redigering målretting av ekson 9 av Calr. To sgRNAs var designet for å målrette et område i musen Calr ekson 9 regionen tilsvarer det mål av den + 1bp frameshift mutasjoner i menneskelig MPN (rød linje). Målet sekvenser med PAMs (mørk blå) vises, og forventede områder cleavage av Cas9 er merket med røde trekanter. DSBs genereres av CRISPR/Cas9 er deretter reparert av NHEJ, som er ventet å generere indeler variabel lengde19. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: Cas9 aktivitet analysen. Foreldrekontroll Ba/F3 cellene og Ba/F3 overexpressing Cas9 var transduced med pXPR-011 måle Cas9 aktivitet. En reduksjon i GFP korrelerer med økt Cas9 aktivitet. Foreldrekontroll Ba/F3 celler er ~ 100% FITC + sammenlignet Ba/F3-Cas9 celler der FITC reduseres ~ 76%. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: tidslinje for smitte og utvalget av sgRNAs i Ba/F3 celle. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: Innføring av 1 bp frameshift mutasjoner i endogene Calr locus er nok til å tildele kreftfremkallende aktivitet til Calr. (A-D) vekst kurver i foreldrenes Ba/F3-Cas9 celler (A) Ba/F3-MPL-Cas9 celler (B), Ba/F3-EPOR-Cas9 celler (C), og Ba/F3-G-CSFR-Cas9 celler (D) viser IL-3 uavhengig vekst i Calr målrettede Ba / F3-MPL-Cas9 celler bare19. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: Sanger sekvensering bekreftelse. Bekreftelse på målet redigering av endogene Calr (ekson 9) i Ba/F3-MPL celler. 1 bp frameshift mutasjoner angis i svart19. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Målet genet sgRNA-ID Målet sekvens (5' til 3) Strand Kløv effektivitet Off-målet score
Calr M1 AGAGGACAAGAAGCGTAAAGAGG + 0,7 70
Calr M2 GAGGCTTAAGGAAGAAGAAGAGG + 0,3 28

Tabell 1:20-mer protospacer sekvenser inkludert PAM nettsted (i fet skrift) for to sgRNAs målretting ekson 9 i Calr 19.

Primer-ID Sekvens (5' til 3)
M1-F CACCGAGAGGACAAGAAGCGTAAAG
M1-R AAACCTTTACGCTTCTTGTCCTCTC
m2-F CACCGAGGCTTAAGGAAGAAGAAG
m2-R AAACCTTCTTCTTCCTTAACCTC

Tabell 2: Protospacer sekvenser og deres omvendt utfyller med "CACC" og "AAAC" lagt til for kloning i pLenti-Guide vektor bruker BsmBI begrensning enzymet 19.

Primer-ID Sekvens (5' til 3)
Calr_Fwd ACCACCTGTCTTTCCGTTCT
Calr_Rev GGCCTCTACAGCTCATCCTT

Tabell 3: CRISPR screening PCR primere oppstrøms og nedstrøms sgRNA cleavage området.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Her viser vi bruk av CRISPR/Cas9 gene redigering for å studere biologiske funksjon CALR mutasjoner i blodkreft cellene. Suksessen til denne protokollen er svært avhengig av flere faktorer. Først er det viktig å vite hvilke typer mutasjoner kan være ansvarlig for fenotypen som er ønsket. I denne protokollen, readout er transformasjonen av Ba/F3 celler til mIL-3 uavhengighet og de mutasjoner er indeler i ekson 9 i CALR. Men hvis ønsket mutasjon er en enkelt base par substitusjon, er HDR-mediert reparasjon den foretrukne metoden fordi det kan innføre nøyaktig punkt mutasjoner eller innsettinger fra en enkelt-strand eller double-strandet DNA donor mal2, 3. Hvis det er ønskelig å knockout genet, så etableringen av storskala genomisk slettinger målretting tidlig koding exons er foretrukket20.

Andre må cellen linjen være cytokin avhengig av for å tillate positiv utvalg press innlegget cytokin tilbaketrekning. Det er viktig å merke seg at ikke alle linjer kan tolerere stabil uttrykk for Cas9 (se trinn 6.3). Dette kan skyldes blasticidin utvalget, som ikke er tolerert av alle linjer. I dette tilfellet, kan valget av andre Cas9 konstruksjoner med annet kassetter være nødvendig. En påminnelse ved å bruke cytokin-avhengig cellelinjer, som Ba/F3 celler er at de er utsatt for spontane cytokin uavhengig vekst, noen ganger som følge av oppkjøpet av mutasjoner i genet ectopically uttrykt interesse etter cytokin uttak21. Derfor er bruk av egnede kontroller nødvendig for å være sikker på at den observerte mobilnettet transformasjonen skyldes på målet CRISPR gene redigering. I denne protokollen, vi ikke observerer mobilnettet transformasjon i Ba/F3-MPL cellene transduced med en ikke-målgruppe sgRNA kontroll eller Ba/F3-EPOR og Ba/F3-GCSFR transduced med Calr-målrettet sgRNAs. Dette gir ytterligere tillit til at mobilnettet transformasjon i Ba/F3-MPL celler er et resultat av på målet redigering av endogene Calr locus.

I denne protokollen introduserer DNA-reparasjon av NHEJ indeler av variabel størrelse som vist i figur 5. Analyse av Sanger sekvensering ble utført på et sub utvalg av befolkningen bulk redigert celler for å se etter utvidelse av indeler som fører til 1 bp frameshift mutasjoner innlegget cytokin tilbaketrekning. Neste generasjons sekvensering nevnt i trinn 9,9 er en mer robust måte å kvantifisere mål redigering for bulk celle populasjoner. Hvis analyse på en bestemt klone, er enkeltcelle sortering av bulk befolkningen nødvendig. Enkelt celle sortering er en fordel i å forstå den biologiske effekten som følge av en bestemt type mutasjon og er nyttig når målet er å forstå forskjellene mellom to ulike typer mutasjoner.

En bekymring med CRISPR/Cas9 systemet er off-målet effekter, som spalting hendelser utenfor regionen målrettet. Vurdere spesifisitet av CRISPR/Cas9 og kontroller at transformert befolkningen ikke inneholder noen off-målet effekter fører til observert transformasjon, måtte vi undersøke om genomet redigering oppstod utenfor regionen interesse. Dette kan gjøres etter bevis på Cas9/NHEJ-drevet genomet redigering på potensielle off-målet genomisk loci med betydelig sekvens likhet å det tiltenkte målet. For dette, neste generasjons sekvensering kan også brukes til å vurdere kvantitativt frekvensen av off-målet effekter på angitte steder langs genomet. For å redusere faren for off-målet effekter, kan ulike faktorer innlemmes i protokollen. Som nevnt i resultatene, sikrer studere flere sgRNAs målretting regionen rundt at fenotypen er et resultat av en hendelse på målet. Videre har studier antydet at avkortet sgRNAs med 17 nukleotider kan redusere frekvensen av off-målet cleavage hendelser22. I tillegg kan langvarig eksponering for Cas9 fra stabil uttrykk resultere i en høyere frekvens av off-målet effekter. Det er viktig å merke seg at et dobbelt vektor system som inneholder både Cas9 og sgRNA kan brukes i protokollen i stedet for stabil uttrykk for Cas9; men pleier disse vektorer å være svært store og resultere i en lav lentiviral titer og lavere infeksjon effektivitet. Som et resultat, kan forbigående transfection av den Cas9 konstruksjonen i cellene av nucleofection brukes. Nylige rapporter har også utviklet Cas9 konstruksjoner med høyere spesifisitet for på målet redigering, som eSpCas9 konstruere6.

I sammendraget representerer CRISPR/Cas9 en effektiv, rimelig og pålitelig genomet engineering verktøyet, muliggjør studiet av genetiske mutasjoner på fysiologiske uttrykk nivåer. Her brukes CRISPR/Cas9 gene redigering som en robust og effektiv metode for å fremme forståelsen av funksjonelle effekten av CALR mutasjoner i blodkreft cellene.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Vi har ingen konflikter av interesse knyttet til denne rapporten.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av NIH (R01HL131835), en Damon Runyon kliniske etterforsker award og Starr kreft konsortiet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BsmBI New England Biolabs R0580L
Blasticidin Sigma Aldrich 15025
Puromycin Life Technologies A1113803
Stbl3 cells Life Technologies C737303
TransIT-LT1 Thermo Fisher Scientific MIR2300
Opti-MEM Life Technologies 51985034
RPMI Thermo Fisher Scientific MT10040CV
DMEM Thermo Fisher Scientific 10-017-CV
Fetal bovine serum (FBS) Omega Scientific FB-11
Penicillin/streptomycin/L-glutamine Life Technologies 10378016
mIL-3 Peprotech 213-13
psPAX2 Addgene N/A
pCMV-VSV-G Addgene N/A
pLX_TRC311-Cas9 Addgene N/A
polybrene Sigma Aldrich H9268
pXPR-011 Addgene N/A
Phosphate Buffered Saline (PBS) Genessee Scientific 25-507
TAE buffer Thermo Fisher Scientific FERB49
LentiGuide-Puro Addgene Plasmid #52963
PNK New England Biolabs M0201S
T4 ligase New England Biolabs M0202S
PCR purification kit Qiagen 28104
Miniprep kit Qiagen 27104

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. DeWitt, M. A., et al. Selection-free genome editing of the sickle mutation in human adult hematopoietic stem/progenitor cells. Sci Trans Med. 8, 360 (2016).
  2. Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nat Biotechnol. 4, 347-355 (2014).
  3. Gaj, T., Gerbach, C. A., Barbas, C. F. ZFN, TALEN, CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends Biotechnol. 31 (7), 397-405 (2013).
  4. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  5. Wiedenheft, B., Samuel, S. H., Doudna, J. A. RNA-guided genetic silencing systems in bacteria and archea. Nature. 482 (7385), 331-338 (2012).
  6. Slaymaker, I. M., Gao, L., Zetsche, B., Scott, D. A., Yan, W. X., Zhang, F. Rationally engineered Cas9 nucleases with improved specificity. Science. 351 (6268), 84-88 (2016).
  7. Ran, F. A., et al. Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity. Cell. 154 (6), 1380-1389 (2013).
  8. Larson, M. H., et al. CRISPR interference (CRISPRi) for sequence-specific control of gene expression. Nat Protoc. 8 (11), 2180-2196 (2013).
  9. Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153 (4), 910-918 (2013).
  10. Kim, H. S., et al. CRISPR/Cas9-mediated Gene-knockout screens and target identification via Whole genome sequencing uncover host genes required for picornavirus infection. J Biol Chem. 10, 1074 (2017).
  11. Heckl, D., et al. Generation of mouse models of myeloid malignancies with combinatorial genetic lesions using CRISPR-Cas9 genome editing. Nat Biotechnol. 32 (9), 941-946 (2014).
  12. Daley, G. Q., Baltimore, D. Transformation of an interleukin 3-dependent hematopoietic cell line by the chronic myelogenous leukemia-specific bcr/abl protein. Proc Natl Acad Sci USA. 85, 9312-9316 (1988).
  13. Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).
  14. Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biol. 17, 148 (2016).
  15. Doench, J. G., et al. Rational design of highly active sgRNAs for CRISPR-Cas9-mediated gene inactivation. Nat Biotechnol. 32, 1262-1267 (2014).
  16. Brinkman, E. K., et al. Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition. Nucl Acid Res. 42, e168 (2014).
  17. Klampfl, T., et al. Somatic mutations of calreticulin in myeloproliferative neoplasms. N Engl J Med. 369, 2379-2390 (2013).
  18. Nangalia, J., et al. Somatic CALR mutations in myeloproliferative neoplasms with nonmutated JAK2. N Engl J Med. 369, 2391-2405 (2013).
  19. Elf, S., et al. Mutant Calreticulin requires both its mutant C-terminus and the thrombopoietin receptor for oncogenic transformation. Cancer Discovery. 6 (4), 368-381 (2016).
  20. Bauer, D. E., Canver, M. C., Orkin, S. H. Generation of Genomic Deletions in Mammalian Cell lines via CRISPR/Cas9. J. Vis. Exp. (95), e52118 (2015).
  21. Watanabe-Smith, K., et al. Analysis of acquired mutations in transgenes arising in Ba/F3 transformation assays: findings and recommendations. Oncotarget. 8, 12596-12606 (2017).
  22. Fu, Y., et al. Improving CRISPR-Cas nuclease specificity using truncated guide RNAs. NatBiotechnol. 32, 279-284 (2014).

Tags

Kreftforskning problemet 131 CRISPR Cas9 gen redigering sgRNA calreticulin sekvensering reporter
Bruker CRISPR/Cas9 Gene redigering for å undersøke kreftfremkallende aktiviteten av muterte Calreticulin i cytokin avhengige blodkreft cellene
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Abdelfattah, N. S., Mullally, A.… More

Abdelfattah, N. S., Mullally, A. Using CRISPR/Cas9 Gene Editing to Investigate the Oncogenic Activity of Mutant Calreticulin in Cytokine Dependent Hematopoietic Cells. J. Vis. Exp. (131), e56726, doi:10.3791/56726 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter