Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Ved hjælp af CRISPR/Cas9 gen redigering til at undersøge de muterede aktivitet af Mutant Calreticulin i cytokin afhængige hæmatopoietisk celler

Published: January 5, 2018 doi: 10.3791/56726
Automatic Translation
1, 1,2,3
1Division of Hematology, Department of Medicine, Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School, 2Broad Institute, 3Dana-Farber Cancer Institute, Harvard Medical School

Summary

Målrettet gen redigering bruger CRISPR/Cas9 har høj grad lettet forståelsen af de biologiske funktioner af gener. Her, udnytte vi CRISPR/Cas9 metoden til model calreticulin mutationer i cytokin-afhængige hæmatopoietisk celler for at studere deres mutationer aktivitet.

Abstract

Grupperet regelmæssigt interspaced korte palindromiske gentagelser (CRISPR) er en adaptive immunitet system i prokaryoter, der har været repurposed af forskere til at generere RNA-styrede nukleaser, såsom CRISPR-forbundet (Cas) 9 for lokationsspecifikke eukaryote genom redigering. Genom engineering af Cas9 bruges effektivt, nemt og håndfast ændre endogene gener i mange biomedically relevante pattedyr cellelinjer og organismer. Her viser vi et eksempel på, hvordan du udnytter CRISPR/Cas9 metoden til at forstå den biologiske funktion af specifikke genetiske mutationer. Vi model calreticulin (CALR) mutationer i murine interleukin-3 (mIL-3) afhængig af pro-B (Ba/F3) celler ved levering af enkelt guide RNA'er (sgRNAs) rettet mod den endogene Calr locus i den specifikke region hvor indsættelse og/eller sletning (indel ) CALR mutationer opstår hos patienter med myeloproliferative neoplasmer (MPN), en type af blodkræft. SgRNAs oprette dobbeltstrenget pauser (DSBs) i målrettede region, der er repareret af ikke-homologe ende sammenføjning (NHEJ) for at give indels i forskellige størrelser. Vi ansætter derefter standard Ba/F3 cellulær transformation analysen at forstå virkningen af fysiologiske niveau udtryk af Calr mutationer på hæmatopoietisk cellulær transformation. Denne fremgangsmåde kan anvendes til andre gener at studere deres biologiske funktion i forskellige pattedyr cellelinjer.

Introduction

CRISPR/Cas9 teknologi har for nylig revolutionerede målrettede genom-redigering i levende celler og organismer. Det er blevet et meget kraftfuldt værktøj til biomedicinsk forskning og er i øjeblikket ved at blive udnyttet som en potentiel avenue til behandling af genetiske sygdomme1. Grundlaget for alle genom redigeringsværktøjer bygger på oprettelsen af en nukleasen-induceret DNA dobbelt strandede pause (DSB) på den genomisk locus skal ændres. DSBs kan repareres af ikke-homologe ende-sammenføjning (NHEJ) eller homologi-instrueret reparation (HDR)2,3. Fordelen ved Cas9 nukleasen over andre genom engineering nukleaser, såsom zink finger nukleaser (ZFNs) og transkription aktivere-lignende effektor nukleaser (TALENs) er dens afhængighed af RNA for målretning nukleasen til en ønskede DNA sekvens, sammenlignet at de protein-DNA interaktioner findes i ZFNs og TALENs2,3.

Efter opdagelsen af CRISPR/Cas9 nukleasen pathway som en adaptive immunsystem i Prokaryote celler4,5, er meget indsats gået ind i tilpasning pathway til brug i pattedyr cellelinjer og model organismer2, 3. som et værktøj til redigering af genet, CRISPR/Cas9 pathway anvender to hovedkomponenter: Streptococcus pyogenes (Sp) afledte Cas9 nukleasen og sgRNAs rettet mod gen interesse2,3. SgRNA består af 20 nukleotider, direkte Cas9 til et bestemt websted på genom RNA-DNA basepar komplementaritet2,3. Mål-webstedet af sgRNA skal ligge ved siden af en protospacer tilstødende motiv (PAM) site i form af 5' NGG, som er anerkendt af SpCas9 nukleasen. Med disse værktøjer, kan Cas9 rettes til enhver DNA sekvens ved at designe sgRNAs der er rettet mod det pågældende område. Derudover at Sp afledt Cas9, er der yderligere varianter for Cas9 med forskellige funktioner afhængigt af den konkrete anvendelse. For eksempel, er der Cas9 varianter med højere specificitet redigeringsværktøjer mål eller enkelt-strenget kavalergang evne til DNA nicking6,7. Derudover er katalytisk inaktive Cas9 for nylig blevet udviklet for transkriptionel regulering8. Forskere har nu brugt CRISPR/Cas9-systemet for en bred vifte af applikationer, som genet knockin og knockout at studere de biologiske funktioner af gener9, tab af funktion og gevinst af funktion bibliotek skærme10 og genetiske engineering af model organismer11.

I denne protokol kombinerer vi CRISPR/Cas9 metode med Ba/F3 cellulær transformation analysen til at forstå den biologiske funktion af CALR mutationer. BA/F3 celler er en murine IL-3 afhængige hæmatopoietisk cellelinje, der kan gengives IL-3 uafhængige ved udtryk for visse onkogener såsom BCR-ABL12. For at forstå om mutant calreticulin kan omdanne Ba/F3 celler til cytokin uafhængige vækst, vi målrettet exon 9 af den endogene Calr locus ved hjælp af CRISPR/Cas9 for at indføre indel mutationer og derefter trak IL-3 fra cellerne til at anvende en positiv udvælgelse pres, med mål at recapitulating gevinst af funktion CALR mutationer findes i MPN patienter. Protokollen omfatter design, kloning og levering af sgRNAs, udvikling af stabile Cas9 udtrykker celler og screening for CRISPR på-target gen redigering. Denne protokol kan anvendes til forskellige gener og forskellige cytokin-afhængige cellelinjer af interesse og er særligt værdifuldt i modellering og studere den biologiske funktion af gener involveret i kræft.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. sgRNA Design ved hjælp af onlineværktøjer13

  1. Design sgRNAs rettet mod gen af interesse ved hjælp af frit tilgængelige online værktøjer.
    1. Kopiere og indsætte NCBI reference sekvensen af gen af interesse i bred Institut sgRNA designer webværktøj: (http://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design).
      Bemærk: Dette værktøj identificerer sgRNA sekvenser med kavalergang websteder inden for exons og dem, der strækker sig over intron/exon grænsen men stadig spaltes i exon.
    2. Download og Åbn tekstfilen i excel.
    3. Fokus på kolonnerne befolket med sgRNA sekvenserne og sgRNA konteksten sekvenser. Bemærk at sgRNA sekvenser ikke indeholder protospacer tilstødende motiv (PAM) men sammenhæng sekvenser.
    4. Bemærk, at på target effektivitet score lister den forudsagte kavalergang effektivitet score på en skala fra 0 til 1 hvor en score på 1 angiver en højere kavalergang effektivitet.
    5. Brug funktionen 'form' af excel enten bestille målene ved effektivitet score eller ved placering i genet mål gennem kolonnen 'Target Cut %'.
      Bemærk: Sortering af placering inden for genet er nyttig til at identificere sgRNAs, der er målrettet mod et bestemt domæne eller exon af interesse.
    6. Vælg 3-6 sgRNAs, der er målrettet området af interesse med høj (> 0,6) effektivitet score på målet. Det kan være nyttigt at vide, hvad slags mutationer kan være ansvarlig for fænotype, der ønskede (Se figur 1 forklarer målretning strategien bruges til calreticulin).
      Bemærk: sgRNAs under den foreslåede 0,6 effektivitet score tærskel bør overvejes, når der er mangel på andre gode kandidater.
    7. Brug MIT gRNA analyse webværktøj til skærmen for potentielle off target effekter (http://crispr.mit.edu/). For hver sgRNA valgt, køre target sekvens (herunder PAM).
      Bemærk: Bred Institut sgRNA designer webværktøj kan også bruges til at screene for off-target effekter (http://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design).
      1. Bemærk, at MIT sgRNA analyseværktøj scorer hver sgRNA på en skala fra 1-100 hvor en score på 100 angiver højere specificitet. En score større end 70 er ideelle og repræsenterer et sgRNA med minimum off target effekter. Denne hjemmeside også genererer en liste af off-target hits med deres placering i genomet, og hvor mange mismatches de hver især har med kandidat guide.
        Bemærk: Off target hits med fire uoverensstemmelser eller større betragtes som sikker14. Off-target hits med mindre end fire uoverensstemmelser kan være problematisk, hvis de falder ind under exons14.
    8. Vælg 2-3 sgRNAs som målrette forskellige steder i regionen af interesse for mål-genet, og som har de højeste parrede kavalergang effektivitet og off-mål scores (Se tabel 1 for sgRNA sekvenser målretning exon 9 af Calr).
      Bemærk: Afhængigt af de eksperimentelle mål lægges større vægt kan ved de forskellige værdier, der er fremstillet af de nævnte redskaber.

2. kloning sgRNA Oligos13

  1. Generere den fremad oligo
    1. Opret en liste over sgRNA sekvenser uden webstedet PAM.
    2. Tilføje en G 5' slutningen af sekvensen hvis 5'-enden af sgRNA sekvens ikke er en G.
      Bemærk: Denne G er nødvendige for at maksimere U6-drevet sgRNA transskription niveau. Tilføjelse af en G er nødvendige for m1 sgRNA (tabel 1).
    3. Tilføje sekvens "CACC" til 5'-enden af G-optimeret guide sekvens (ingen PAM) (tabel 2) for at generere udhæng kræves for ligatur af udglødet oligos i BsmBI fordøjet lentiGuide vektor (Se trin 3).
  2. Generere den omvendte oligo
    1. Omvendt supplement G-optimeret guide sekvens (ingen PAM).
    2. Tilføje sekvens "AAAC" til 5'-enden af den omvendte suppleret G-optimeret guide sekvens (tabel 2).
    3. Bestil den designede oligos fra en primer syntese selskab.
  3. Bind og phosphorylate oligos
    1. Tilføj 1 µL af fremad oligo (100 µM), 1 µL af reverse oligo (100 µM), 1 µL af 10 x T4 ligatur buffer, 0,5 µL af T4 polynucleotide kinase (PNK) og 6,5 µL af H2O til en PCR rør (Total = 10 µL).
    2. Køre følgende program i thermocycler: 37 ˚C til 30 min, 95 ˚C i 5 min, rampe fra 95 til 25 på 0,1 ° C/s.
    3. Fortynd reaktionsprodukt på 1:250 i H2O.

3. fordøjelse af lentiGuide-Puro vektor13

  1. Fordøje lentiGuide-Puro vektor
    1. Samle en 50 µL fordøjelsen reaktion med følgende komponenter: 5 µg cirkulære plasmid, 2 µL (30 enheder) af BsmBI begrænsning enzym, 5 µL af begrænsning enzym buffer og op til 50 µL af H2O.
    2. Køre reaktion i 2 timer ved 55 ° C. Efter den første time, tilføje 1 µL mere af BsmBI begrænsning enzym.
  2. Dephosphorylate skære rygraden
    1. Tilføje 7 µL af fosfatase reaktion buffer og 2 µL af fosfatase enzym til fordøjet vektoren.
    2. Inkuber i 30 minutter ved 37 ° C.
  3. PCR rense cut og defosforyleret rygraden ved hjælp af en kommerciel kit.
    Bemærk: Stedfortræder de medfølgende pink farvede kolonner med miniprep kit blå farvede kolonner, da disse bedre kan rumme store plasmid størrelser. Udbyttet kan øges ved opvarmning eluering buffer i en 90 ˚C varme blok før eluering og eluerer DNA fra kolonnen to gange i slutningen (køre eluted DNA fra den første eluering tilbage gennem en anden gang).

4. ligatur ofAnnealed Oligos i fordøjet rygraden13

  1. Tilføje 50 ng af fordøjet rygraden, 1 µL af udglødet oligo fortynding, 1 µL af 10 x T4 ligatur buffer, 1 µL af T4 ligase og op til 10 µL af H2O til en PCR rør. Inkuber i 1 time ved stuetemperatur
  2. Omdanne Stbl3 celler med 2 µL af ligatur reaktion. Plade på en lysogeny bouillon (LB) agar plade med 100 µg/mL ampicillin og inkuberes natten over ved 37 ° C.
  3. Pick 3 kolonier og podes i en mini prep kultur.
  4. Validere korrekt oligo indsættelse
    1. Udfør en miniprep for hver kultur og sekvens gennem oligo indsættelsesstedet med udgangspunkt i en primer i U6 arrangøren ved hjælp af en kommerciel kit.
    2. Udføre en midi-prep eller en maxi-prep for den sekvens-verificerede kultur.

5. generation af celle lLines stabilt at udtrykke SpCas9

Bemærk: Denne protokol indebærer levering af pLX_TRC311-Cas9 plasmid af lentiviral infektion. Denne protokol er beskrevet i detaljer for murine interleukin-3 (mIL-3) afhængig af pro-B (Ba/F3) celler, en suspension cellelinie og kunne tilpasses til andre celletyper ved hjælp af foretrukne dyrkningsbetingelserne for hver celle. Næringssubstratet for Ba/F3 celler består af RPMI, suppleret med 10% føtal bovint serum, 1% penicillin/streptomycin/L-glutamin og 10 ng/mL af murine interleukin 3.

  1. Transfect HEK-293T celler
    1. Seed 3 x 106 HEK-293T celler pr. 10 cm vævskultur parabol. Holde seedede celler natten før Transfektion.
      Bemærk: HEK-293T celler er en vedhængende cellelinie og bruges rutinemæssigt til virus produktion. Cellerne er fastholdt i DMEM suppleret med 10% føtal bovint serum, 1% penicillin/streptomycin/L-glutamin. Celler skal være 80% sammenflydende på tidspunktet for Transfektion.
    2. Før varm reduceret serum medier (Opti-MEM) og vækstmedium.
    3. Tilsæt 500 µL af reducerede serum medier, 7 µg for pLX_TRC311-Cas9 konstruktion, 4 µg for pCMV-VSV-G lentiviral emballage plasmid og 4 µg for psPAX2 lentiviral emballage plasmid ind i et rør
      Bemærk: Samlede DNA pr. 10 cm parabol af 293T celler er 15 µg.
    4. Blandes DNA godt og tilføje 45 µL Transfektion reagens. Bland forsigtigt og lad det stå i 20 min.
      Bemærk: Det er vigtigt at bruge nedsat serum media fordi serum vil hæmme den komplekse dannelse mellem Transfektion reagens og plasmid DNA.
    5. Opsug den gamle medium i 293T pladen og tilsættes 5 mL af nye vækstmediet.
    6. Tilføje DNA og Transfektion reagens blandes på en klog måde, drop til 293T plade. Swirl forsigtigt og inkuberes ved 37 ° C og 5% CO2 i 24 timer.
    7. Høste viral analysere på 24 og 48 h post Transfektion. Passere gennem et 0,22 µm filter og alikvot ind i et cryovial rør (1,6 mL/rør og 1,5 mL vil blive brugt til infektion).
    8. Butik viral supernatanten ved-80 ° C.
      Bemærk: lentiviral supernatanten kan bruges inden for 6 måneder. Hvis muligt, skal spinfection transductions udføres med friske virus).
  2. Lentiviral infektion i Ba/F3 celler
    1. Tø viral supernatanten på is, hvis frosset.
    2. Der centrifugeres celler ved 300 x g i 4 min.
    3. Opsug supernatanten og resuspend celler i en koncentration på 3 x 106 celler/mL.
    4. Tilsættes 500 µL af resuspenderede celler, 1,5 mL af viral supernatanten, 4 µL af polybrene (lager: 2 mg/mL) og 10 ng/mL af m-IL3 i en 6-godt vævskultur plade. Sørg for at medtage en uinficeret godt med 1,5 mL af medier i stedet for viral supernatanten som kontrol.
      Bemærk: Mængden af viral supernatanten tilføjet bør svare til en mangfoldighed af infektion (MOI) < 1.
    5. Centrifugeres plade på 440 x g i 120 minutter ved 37 ° C.
    6. Tag pladen ud af centrifugen og placere i 37 ° C og 5% CO2 inkubator og giver mulighed for at vokse natten over.
    7. Spin ned celler efter 24 timer, og pelleten med 5 mL frisk varm medier i en 6-godt plade.
  3. Udvalg af Cas9 inficerede celler
    1. Spin ned celler og resuspend med frisk varm media suppleret med 5 µg/mL af blasticidin, 48 h post spinfection.
    2. Marker cellerne i 9 dage med blasticidin, eller indtil uinficeret (negativ) kontrol celler er døde.
    3. Når udvælgelsen er færdig, skal du overføre de modstandsdygtige celler til medium med lavere koncentration af blasticidin.

6. reporter Assay for Cas9 aktivitet15

  1. Transduce forældre celler og celler, der udtrykker stabilt Cas9 med pXPR-011 af lentiviral infektion (Se trin 5.1-5.2).
    Bemærk: Denne vektor indeholder både normal god landbrugspraksis og en guide målretning normal god landbrugspraksis. Celler, der indeholder aktive Cas9 vil resultere i en reduktion af normal god landbrugspraksis (figur 2).
  2. Marker cellerne i 3 dage med 2 µg/mL af puromycin, 48 h post spinfection.
  3. Analysere prøverne for normal god landbrugspraksis udtryk ved flowcytometri.
    Bemærk: En normal god landbrugspraksis reduktion på 50% eller mere repræsenterer optimal Cas9 aktivitet. En højere koncentration af blasticidin udvalg kunne bruges til at øge Cas9 aktivitet, hvis mindre end en 50% reduktion er observeret. Ikke alle cellelinjer kan tåle blasticidin udvalg. I dette tilfælde kan brug af Cas9 vektorer med andre udvalg kassetter være nødvendigt. Derudover tåler ikke alle cellelinjer stabil udtryk for Cas9. I dette tilfælde kan forbigående Transfektion af Cas9 bruges.

7. Spinfection af sgRNAs i Cas9 at udtrykke celler

  1. Følg trin 5.1-5.2 for lentiviral infektion af sgRNAs i cellerne af interesse.
    Bemærk: I trin 5.1.3, erstatte pLX_TRC311-Cas9 konstruktion med lentiGuide-Puro konstruere valideret fra afsnit 4.
  2. 48 h post spinfection, markere cellerne i 3 dage med 2 µg/mL af puromycin.
  3. Overføre de modstandsdygtige celler til medium med lavere koncentration af antibiotika og fortsat udvalg i en anden 4 dage for at give mulighed for tilstrækkelig redigering.

8. Ba/F3 cellulær Transformation og positiv markering med m-IL3 tilbagetrækning

Bemærk: Denne analyse er beskrevet for mIL-3 afhængige Ba/F3 celler, men kunne anvendes på enhver cytokin afhængige cellelinie.

  1. Spin ned eksponentielt voksende Ba/F3 celler ectopically udtryk for Cas9 og sgRNA af interesse.
  2. Opsug supernatanten og cellerne vaskes med 5 mL af phosphat bufferet saltvand (PBS).
  3. Spin ned celler og Gentag trinnet vask i 8.2 fire gange (dette trin sikrer, at medierne er fri for IL-3).
  4. Opsug PBS og resuspend celler i 5 mL frisk medier uden IL-3.
  5. Tælle celler ved hjælp af en hemocytometer eller en celle levedygtighed analyzer.
  6. Frø celler i tre eksemplarer i en 6-godt vævskultur plade i en koncentration på 1 x 105 celler/mL i en samlet maengde paa 2 mL frisk medier uden IL-3.
  7. Overvåge og tælle cellerne hver 2 dage til ialt 8 dage.
    Bemærk: Ba/F3 celler mangler IL-3 typisk dø 2 dage post IL-3 sult. Det er vigtigt at medtage en negativ kontrol i analysen (typisk en ikke-målrettet vejledning bruges som kontrol).

9. screening for CRISPR på target redigering

  1. Design CRISPR screening primere opstrøms og nedstrøms af webstedet sgRNA kavalergang
    Bemærk: Brug primere mindst 100 bp fra webstedet forudsagte kavalergang for at sikre opdagelse ikke vil blive påvirket af en stor indsættelse og/eller sletning (indel) på webstedet sgRNA mål.
  2. Isolere genomisk DNA (gDNA) fra transformerede celler (enden af vækstkurven) og fra celler pre-cytokin tilbagetrækning.
    Bemærk: Altid omfatte celler overekspression guiden ikke målrettet som et kontrolelement til redigering af genet. Isolere gDNA fra celler, før og efter transformation vil identificere kloner, der var positivt udvalgt til og har en proliferativ fordel.
  3. Samle en 50 µL PCR med følgende komponenter: 25 µL af 2 x PCR mix, 1 µL af fremad primer (10 µM), 1 µL af reverse primer (10 µM), 50-100 ng gDNA og H2O op til 50 µL.
    Bemærk: Mange high-fidelity polymeraser kan bruges i trin 9.3.
  4. Køre prøver i en thermocycler ved hjælp af følgende parametre: 95° C i 1 min., 30 cykler af (94 ° C i 1 minut, 52 ° C til 30 s, 72 ° C i 30 s), og mindst 72 ° C i 10 min. Denne PCR er optimeret til de Calr primere, der er anført i tabel 3. Optimere PCR betingelser for primer parret designet i trin 9.1 baseret på prøvning sig på gDNA.
  5. Køre 5 µL af prøverne på en 2%-agarosegel på 10 V/cm ved hjælp af 1 x Tris-acetat-EDTA (TAE) buffer. Undersøge prøver for tilstedeværelse / fravær af en forstærket band svarende i størrelse til gen af interesse.
  6. Brug resten af PCR reaktion (45 µL) til at udføre en PCR rensning.
  7. Klone amplikoner med en PCR, kloning kit til en plasmid vektor. For eksempel, bruges pGEM T-let vektorer typisk.
  8. Omdanne plasmidet i Stbl3 celler eller andre kompatible celler og plade på LB agar plader med relevant antibiotika. Vælg 10-20 kolonier, mini prep, hver af dem, og er underlagt hver klon Sanger sekvensering til at karakterisere indels lavet fra CRISPR/Cas9 redigering.
    Bemærk: Hvis det ønskes, enkelt celle fluorescens aktiveret celle sortering (FACS) kunne udføres på bulk redigeret befolkning til at isolere en klon med et bestemt indel. Derudover kan næste generation sequencing (NGS) metoder bruges til mere håndfast kvantificere på target redigering bruger dyb sekventering af PCR-amplikoner spanning regionen sgRNA mål. For eksempel, kan sporing af Indels af nedbrydning eller tidevand bruges i stedet for subcloning til netop afgøre spektrum og frekvenser af målrettede mutationer genereret i en pulje af celler (https://tide.nki.nl/#about)16.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Ved hjælp af metoden beskrevet her, er målet med dette eksperiment at studere de funktionelle virkninger af at indføre indel mutationer til den endogene Calr locus på hæmatopoietisk celle transformation. CRISPR/Cas9-systemet bruges som et værktøj til at oprette endogene Calr mutationer i Ba/F3 celler. To sgRNAs blev valgt til at målrette exon 9 af Calr (figur 1), i den region, hvor indsættelser og/eller sletning (indel) mutationer opstår typisk i CALR-mutant MPN patienter17,18. Den første sgRNA (m1) blev valgt, baseret på dens høje kavalergang effektivitet og gunstige off mål scores (tabel 1). Den anden sgRNA (m2) blev valgt primært til dens placering inden for exon 9 og i mangel af yderligere sgRNAs i regionen til at redigere med høj kavalergang effektivitet og gunstige off mål scores (tabel 1). To forskellige sgRNAs (m1 eller m2) blev brugt i separate infektioner til at sikre, at de observerede virkninger skyldtes på target gen redigering. Off-target virkninger er usandsynlige deles af flere uafhængige sgRNAs. Kontrolelementet ikke-målretning (scramble) blev også brugt som en negativ kontrol. Ansættelse af Cas9 liv1975 til Calr exon 9 er forudsagt til at oprette DSBs på denne locus. DSBs vil derefter blive repareret af NHEJ, som kan generere indels af variable størrelser (figur 1).

For at udvikle in vitro- CRISPR/Cas9 system i Ba/F3 celler, blev celler, der stabilt udtrykker Cas9 protein foretaget af lentiviral-medieret transduktion ifølge protokollen beskrevet ovenfor. Stabil Cas9 udtrykket resulterer i robuste Cas9 aktivitet. Cas9 aktivitet i Ba/F3-Cas9 celler blev målt ved pXPR-011, en reporter konstruktion, der indeholder både normal god landbrugspraksis og en guide målretning NGL15. Celler, der indeholder aktive Cas9 vil resultere i en reduktion af normal god landbrugspraksis15. Normal god landbrugspraksis var målt i cellerne ved hjælp af flowcytometri. BA/F3-Cas9 celler, vises en reduktion på ca. 76% i normal god landbrugspraksis, svarende til robust Cas9 aktivitet (figur 2).

Skriv 1 cytokin receptorer, som thrombopoietin receptoren (MPL), erythropoietin receptor (EPOR) og granulocyt koloni-stimulerende faktor receptor (G-CSFR) blev hvert individuelt, stabilt udtrykt i Ba/F3-Cas9 celler til at bestemme deres cooperativity med mutant calreticulin i inducerende transformation af Ba/F3 celler. Transduktion af sgRNA konstruktioner (m1, m2 eller en scramble (ikke-targeting guide)) blev derefter gennemført i hver af Ba/F3 cellelinjer stabilt udtrykker Cas9 og receptor af interesse. Celler blev derefter valgt til 7 dage med puromycin at give mulighed for tilstrækkelig tid til CRISPR/Cas9 gen redigering. En positiv udvælgelse pres blev derefter anvendt ved at udsulte celler af cytokin (mIL-3). Målet med denne sult pres er at identificere, hvis indels i Calr exon 9, svarende til dem, der observeres i MPN patienter, er valgt for, hvilket resulterer i cytokin-uafhængig vækst og transformation af Ba/F3 celler. Vækstkurven foretog i alt 8 dage og cellerne blev optalt hver 2 dage for at måle deres transformation (figur 3)19. Celle pellets for genomisk DNA-ekstraktion blev indsamlet før starten af vækstkurven og for enden af vækstkurven redigeringsværktøjer mål og overvåge de indels, der udvides opstille cytokin sult (figur 3)19.

Cytokin uafhængige vækst blev observeret i Calr-målrettet Ba/F3-MPL-Cas9 celler (figur 4B), men ikke Calr-målrettet forældre Ba/F3-Cas9 celler (figur 4A), eller Ba/F3-Cas9 celler ectopically udtrykker EPOR (figur 4 c ) eller G-CSFR (figur 4D)19. For at bekræfte, at mIL-3 uafhængige vækst i Calr-målrettet Ba/F3-MPL-Cas9 celler var et resultat af på target gen redigering, celler blev fældet 8 dage post mIL-3 tilbagetrækning og genomisk DNA blev uddraget19. En 422 bp region spanning målwebstedet blev forstærket ved hjælp af primere, der er anført i tabel 3. Sub kloning af PCR-amplikoner blev udført og 30 enkelte kloner blev sendt til Sanger sekvensering. For m1 eller m2 Calr-målrettet Ba/F3-MPL-Cas9 celler, alle sub kloner indeholdt indels af varierende størrelser på den tilsigtede cut websted (figur 5)19. 11 ud af 13 m1 sub kloner fandtes at indeholde indels, der førte til + 1 bp frameshift mutationer (figur 5), svarende til dem fundet i patienter. For m2 Calr-målrettede celler, 10 ud af 17 sub kloner fandtes for at indeholde indels, der førte til + 1 bp frameshifts (figur 5)19. Disse data bekræfter, at CRISPR/Cas9-medieret indførelsen af + 1bp frameshift mutationer til den endogene Calr exon 9 locus er tilstrækkelig til at tillægge muterede aktivitet til Calr19. Sequencing data i figur 5 også tyder på, at indførelsen af heterozygous + 1bp frameshift mutationer til den endogene Calr locus er tilstrækkelig til at omdanne Ba/F3-MPL celler, i overensstemmelse med observationen at CALR mutationer er typisk heterozygous i MPN patienter17,18. Da NHEJ reparere resultater i høj heterogenitet mellem indels, kunne enkelt celle sortering for at isolere en klon af interesse udføres. Dette ville gøre det muligt for forskeren at studere virkningerne af specifikke mutationer lavet af CRISPR/Cas9.

Figure 1
Figur 1: Skemaet for CRISPR/Cas9 gen-redigering målretning af exon 9 af Calr. To sgRNAs var designet til at målrette en arbejdsplads inden for mus Calr exon 9 regionen svarende til, at målrettet af det + 1bp frameshift mutationer i menneskelige MPN (rød bar). Target sekvenser med PAMs (mørkeblå) er vist, og forventede websteder af spaltning af Cas9 angives med røde trekanter. DSBs genereret af CRISPR/Cas9 er derefter repareret ved NHEJ, som forventes at generere indels af variabel længde19. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Cas9 aktivitet assay. Forældrenes Ba/F3 celler og Ba/F3 celler overekspression Cas9 blev transduced med pXPR-011 til at måle Cas9 aktiviteten. En reduktion i normal god landbrugspraksis korrelerer med øget Cas9 aktivitet. Forældrenes Ba/F3 celler er ~ 100% FITC + i forhold til Ba/F3-Cas9 celler hvor FITC reduceres med ~ 76%. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: tidslinje for infektion og udvælgelse af sgRNAs i Ba/F3 celler. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Indførelse af + 1 bp frameshift mutationer i den endogene Calr locus er tilstrækkelig til at tillægge muterede aktivitet til Calr. (A-D) vækstkurver i forældrenes Ba/F3-Cas9 celler (A) Ba/F3-MPL-Cas9 celler (B), Ba/F3-EPOR-Cas9 celler (C), og Ba/F3-G-CSFR-Cas9 celler (D) viser IL-3 uafhængige vækst i Calr-målrettet Ba / F3-MPL-Cas9 celler kun19. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: Sanger sekventering verifikation. Bekræftelse af-target redigering af endogene Calr (exon 9) i Ba/F3-MPL celler. + 1 bp frameshift mutationer er angivet i sort19. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Target gen sgRNA-ID Target sekvens (5' til 3') Strand Kavalergang effektivitet Off målscoren
Calr M1 AGAGGACAAGAAGCGTAAAGAGG + 0,7 70
Calr m2 GAGGCTTAAGGAAGAAGAAGAGG + 0,3 28

Tabel 1:20-mer protospacer sekvenser herunder PAM websted (med fed) for to sgRNAs rettet mod exon 9 af Calr 19.

Primer-ID Rækkefølge (5' til 3')
M1-F CACCGAGAGGACAAGAAGCGTAAAG
M1-R AAACCTTTACGCTTCTTGTCCTCTC
m2-F CACCGAGGCTTAAGGAAGAAGAAG
m2-R AAACCTTCTTCTTCCTTAACCTC

Tabel 2: Protospacer sekvenser og deres omvendte supplerer med "CACC" og "AAAC" tilføjet til kloning i pLenti-Guide vektor ved hjælp af BsmBI begrænsning enzym 19.

Primer-ID Rækkefølge (5' til 3')
Calr_Fwd ACCACCTGTCTTTCCGTTCT
Calr_Rev GGCCTCTACAGCTCATCCTT

Tabel 3: CRISPR screening PCR primere opstrøms og nedstrøms af webstedet sgRNA kavalergang.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Her demonstrere vi brugen af CRISPR/Cas9 gen redigering til at studere den biologiske funktion af CALR mutationer i hæmatopoietisk celler. Succes i denne protokol er stærkt afhængig af flere faktorer. For det første er det vigtigt at vide hvilken slags mutationer kan være ansvarlig for fænotype, der ønskes. I denne protokol, udlæsningen er omdannelsen af Ba/F3 celler til mIL-3 uafhængighed og typerne af mutationer er indels i exon 9 af CALR. Men hvis den ønskede mutation er en enkelt basepar substitution, HDR-medieret reparation er den foretrukne metode fordi det kan indføre præcise punktmutationer eller indrykninger fra en enkelt-strenget eller dobbelt-strenget DNA donor skabelon,2, 3. Hvis det ønskes at knockout genet, så oprettelsen af storstilet genomisk sletninger målretning tidlige kodning exons er foretrukket20.

For det andet skal cellelinie cytokin-afhængige at give mulighed for positiv udvælgelse pres post cytokin tilbagetrækning. Det er vigtigt at bemærke, at ikke alle cellelinjer kan tåle stabil udtryk for Cas9 (Se trin 6.3). Dette kan skyldes blasticidin udvalg, der ikke er tåles af alle cellelinjer. I dette tilfælde, kan valg af andre Cas9 konstruktioner med forskellige udvalg kassetter være nødvendigt. En advarsel ved anvendelse af cytokin-afhængige cellelinjer, som Ba/F3 celler er at de er modtagelige for spontan cytokin uafhængige vækst, undertiden som følge af købet af mutationer i ectopically udtrykte gen af interesse efter cytokin tilbagetrækning21. Anvendelse af passende kontrol er derfor nødvendigt for at være sikker på, at den observerede cellulær transformation er-mål CRISPR gen redigering. I denne protokol, vi ikke har overholdt cellulær transformation i Ba/F3-MPL celler transduced med en ikke-målrettet sgRNA kontrol eller i Ba/F3-EPOR og Ba/F3-GCSFR celler transduced med Calr-målrettet sgRNAs. Dette giver yderligere tillid, cellulær transformation i Ba/F3-MPL celler er et resultat af-target redigering af den endogene Calr locus.

I denne protokol introducerer DNA reparation af NHEJ indels af variable størrelser, som det ses i figur 5. Analyse af Sanger sekventering blev udført på en delprøve af befolkningens hovedparten af redigerede celler for at kigge efter en udvidelse af indels, der fører til + 1 bp frameshift mutationer post cytokin tilbagetrækning. Næste generation sequencing nævnt i trin 9,9 er en mere robust måde at kvantificere target redigering for bulk cellepopulationer. Evt analyse på en bestemt klon så er enkelt celle sortering af befolkningens bulk nødvendige. Enkelt celle sortering er en fordel i at forstå de biologiske virkninger som følge af en bestemt type af mutation og er nyttig, når målet er at forstå forskellene mellem to forskellige typer af mutationer.

Eneste bekymring med CRISPR/Cas9-systemet er off-target effekter, som er kavalergang begivenheder uden for de målrettede region. At vurdere specificiteten af CRISPR/Cas9-system og for at sikre, at de transformerede befolkninger ikke indeholder nogen off-target effekter fører til den observerede transformation, ville vi skulle undersøge, om genom-redigering opstod uden for interesse. Dette kunne gøres ved at kigge efter tegn på Cas9/NHEJ-drevet genom-redigering på potentielle off target genomisk loci med betydelig sekvens lighed med den tilsigtede mål. For dette, næste generation sequencing kunne også bruges til kvantitativt at vurdere hyppigheden af off-target effekter på angivne steder langs genomet. For at mindske mulighederne for off-target effekter, kunne forskellige faktorer indarbejdes i protokollen. Som nævnt i resultaterne, sikrer at studere flere sgRNAs rettet mod det pågældende område, at Fænotypen er resultatet af en eventen. Desuden, de seneste undersøgelser har antydet, at afkortet sgRNAs med 17 nukleotider kan reducere hyppigheden af off-target kavalergang events22. Derudover kan langvarig udsættelse for Cas9 fra stabil udtryk resultere i en højere frekvens af off-target effekter. Det er vigtigt at bemærke, at en dobbelt vektorsystem, der indeholder både Cas9 og sgRNA kunne bruges i protokollen i stedet for stabil udtryk af Cas9; men disse vektorer en tendens til at være meget store og resultere i en lav lentiviral titer og lavere infektion effektivitet. Som et resultat, kunne forbigående Transfektion af Cas9 konstruktion i celler ved nucleofection bruges. Nylige rapporter har også udviklet Cas9 konstruktioner med højere specificitet for-mål redigering, såsom eSpCas9 konstruere6.

I Resumé udgør CRISPR/Cas9 en effektiv, billig og pålidelig genom engineering værktøj, giver mulighed for undersøgelse af genetiske mutationer på fysiologiske udtryk niveauer. Her anvender vi CRISPR/Cas9 gen redigering som en robust og effektiv metode til at fremme forståelsen af de funktionelle virkninger af CALR mutationer i hæmatopoietisk celler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Vi har ingen interessekonflikter, der er relateret til denne betænkning.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af NIH (R01HL131835), en Damon Runyon kliniske investigator award og Starr kræft konsortium.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BsmBI New England Biolabs R0580L
Blasticidin Sigma Aldrich 15025
Puromycin Life Technologies A1113803
Stbl3 cells Life Technologies C737303
TransIT-LT1 Thermo Fisher Scientific MIR2300
Opti-MEM Life Technologies 51985034
RPMI Thermo Fisher Scientific MT10040CV
DMEM Thermo Fisher Scientific 10-017-CV
Fetal bovine serum (FBS) Omega Scientific FB-11
Penicillin/streptomycin/L-glutamine Life Technologies 10378016
mIL-3 Peprotech 213-13
psPAX2 Addgene N/A
pCMV-VSV-G Addgene N/A
pLX_TRC311-Cas9 Addgene N/A
polybrene Sigma Aldrich H9268
pXPR-011 Addgene N/A
Phosphate Buffered Saline (PBS) Genessee Scientific 25-507
TAE buffer Thermo Fisher Scientific FERB49
LentiGuide-Puro Addgene Plasmid #52963
PNK New England Biolabs M0201S
T4 ligase New England Biolabs M0202S
PCR purification kit Qiagen 28104
Miniprep kit Qiagen 27104

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. DeWitt, M. A., et al. Selection-free genome editing of the sickle mutation in human adult hematopoietic stem/progenitor cells. Sci Trans Med. 8, 360 (2016).
  2. Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nat Biotechnol. 4, 347-355 (2014).
  3. Gaj, T., Gerbach, C. A., Barbas, C. F. ZFN, TALEN, CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends Biotechnol. 31 (7), 397-405 (2013).
  4. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  5. Wiedenheft, B., Samuel, S. H., Doudna, J. A. RNA-guided genetic silencing systems in bacteria and archea. Nature. 482 (7385), 331-338 (2012).
  6. Slaymaker, I. M., Gao, L., Zetsche, B., Scott, D. A., Yan, W. X., Zhang, F. Rationally engineered Cas9 nucleases with improved specificity. Science. 351 (6268), 84-88 (2016).
  7. Ran, F. A., et al. Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity. Cell. 154 (6), 1380-1389 (2013).
  8. Larson, M. H., et al. CRISPR interference (CRISPRi) for sequence-specific control of gene expression. Nat Protoc. 8 (11), 2180-2196 (2013).
  9. Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153 (4), 910-918 (2013).
  10. Kim, H. S., et al. CRISPR/Cas9-mediated Gene-knockout screens and target identification via Whole genome sequencing uncover host genes required for picornavirus infection. J Biol Chem. 10, 1074 (2017).
  11. Heckl, D., et al. Generation of mouse models of myeloid malignancies with combinatorial genetic lesions using CRISPR-Cas9 genome editing. Nat Biotechnol. 32 (9), 941-946 (2014).
  12. Daley, G. Q., Baltimore, D. Transformation of an interleukin 3-dependent hematopoietic cell line by the chronic myelogenous leukemia-specific bcr/abl protein. Proc Natl Acad Sci USA. 85, 9312-9316 (1988).
  13. Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).
  14. Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biol. 17, 148 (2016).
  15. Doench, J. G., et al. Rational design of highly active sgRNAs for CRISPR-Cas9-mediated gene inactivation. Nat Biotechnol. 32, 1262-1267 (2014).
  16. Brinkman, E. K., et al. Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition. Nucl Acid Res. 42, e168 (2014).
  17. Klampfl, T., et al. Somatic mutations of calreticulin in myeloproliferative neoplasms. N Engl J Med. 369, 2379-2390 (2013).
  18. Nangalia, J., et al. Somatic CALR mutations in myeloproliferative neoplasms with nonmutated JAK2. N Engl J Med. 369, 2391-2405 (2013).
  19. Elf, S., et al. Mutant Calreticulin requires both its mutant C-terminus and the thrombopoietin receptor for oncogenic transformation. Cancer Discovery. 6 (4), 368-381 (2016).
  20. Bauer, D. E., Canver, M. C., Orkin, S. H. Generation of Genomic Deletions in Mammalian Cell lines via CRISPR/Cas9. J. Vis. Exp. (95), e52118 (2015).
  21. Watanabe-Smith, K., et al. Analysis of acquired mutations in transgenes arising in Ba/F3 transformation assays: findings and recommendations. Oncotarget. 8, 12596-12606 (2017).
  22. Fu, Y., et al. Improving CRISPR-Cas nuclease specificity using truncated guide RNAs. NatBiotechnol. 32, 279-284 (2014).

Tags

Kræftforskning sag 131 CRISPR Cas9 gen redigering sgRNA calreticulin sekventering reporter
Ved hjælp af CRISPR/Cas9 gen redigering til at undersøge de muterede aktivitet af Mutant Calreticulin i cytokin afhængige hæmatopoietisk celler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Abdelfattah, N. S., Mullally, A.… More

Abdelfattah, N. S., Mullally, A. Using CRISPR/Cas9 Gene Editing to Investigate the Oncogenic Activity of Mutant Calreticulin in Cytokine Dependent Hematopoietic Cells. J. Vis. Exp. (131), e56726, doi:10.3791/56726 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter