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Developmental Biology

दीर्घकालिक व्यवहार और कम खुराक विषालु के लिए भ्रूण जोखिम के प्रजनन परिणाम

Published: March 6, 2018 doi: 10.3791/56771
Automatic Translation
1, 2, 2, 2
1Department of Neurology, Johns Hopkins School of Medicine, 2Department of Biological Sciences, Delaware State University

Summary

पर्यावरण विषालु के लिए जोखिम तीव्रता से दीर्घकालिक प्रभाव के साथ विकास को प्रभावित कर सकते हैं । विस्तृत प्रोटोकॉल के लिए एक प्रभावी प्रयोगशाला मॉडल का उपयोग करने के लिए जल्दी भ्रूण जोखिम के प्रभाव का अध्ययन bisphenol एक रणनीति वर्णन प्रदान की जाती है हम fecundity और व्यवहार परख प्रदान करने के लिए हमारे विषाक्त जोखिम जैव की प्रभावशीलता की निगरानी परख ।

Abstract

Bisphenols, जैसे bisphenol ए (BPA) और bisphenol एस (बीपीएस) polymerizing एजेंटों व्यापक रूप से प्लास्टिक और कई रोजमर्रा का उपयोग उत्पादों के उत्पादन में इस्तेमाल कर रहे हैं । उनकी रासायनिक संरचना और एस्ट्राडियोल की तरह जैविक गुणों के आधार पर, वे अंत में स्रावी बाधित यौगिकों (EDC) के रूप में वर्गीकृत किया गया है । EDCs के लिए दीर्घकालिक जोखिम, यहां तक कि कम मात्रा में, कैंसर, व्यवहार विकारों और बांझपन सहित विभिंन स्वास्थ्य दोषों से जोड़ा गया है, जल्दी विकास के समय के दौरान संकेत अधिक जोखिम के साथ । सेलुलर और आनुवंशिक रूप से परितंत्रीय निमेटोड मॉडल के साथ आणविक अध्ययन Caenorhabditis एलिगेंस प्रदर्शन किया है कि BPA के लिए जोखिम apoptosis का कारण बनता है, भ्रूण घातकता और डीएनए की मरंमत तंत्र में व्यवधान । हम पहले से बताया है कि सी. एलिगेंस भ्रूण के विभिंन bisphenols कम खुराक के लिए जोखिम fecundity कम हो जाती है । इसके अलावा, हमें पता चला है कि विकास के बहुत प्रारंभिक दौर के दौरान जोखिम के प्रभाव वयस्कता के रूप में आदी होना व्यवहार, गैर साहचर्य सीखने का एक रूप को बढ़ाता द्वारा परख में जारी रहती है । यहां, हम भ्रूण जोखिम के लिए कम खुराक EDCs के रूप में अच्छी तरह के रूप में संबद्ध fecundity और पूर्वकाल स्पर्श आदी होना परख, प्रतिनिधि परिणामों के साथ के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं ।

Introduction

पर्यावरण विषालु के लिए जोखिम, विशेष रूप से उन है कि विकास के साथ हस्तक्षेप करते हैं, हाल के वर्षों में सावधान वैज्ञानिक जांच के तहत किया गया है यौगिकों । रोजमर्रा के उपयोग में एक हजार से अधिक रसायनों को अंत-स्रावी बाधित यौगिकों (EDC)1के रूप में वर्गीकृत किया गया है । तीव्र विकास और विकास, जो भ्रूण, शिशु और बचपन के चरणों में शामिल की अवधि के लिए विशेष रूप से भी कम खुराक EDC बचके प्रभाव के लिए संवेदनशील होना उल्लेख किया गया है । उनके प्रभाव प्रजनन और neurodevelopmental विकारों के कारण दिखाया गया है2. अमेरिकी पर्यावरण संरक्षण एजेंसी और अमेरिका के राष्ट्रीय विषविज्ञान कार्यक्रम पैनल के दिशा निर्देशों के अनुसार, एक कम खुराक एक के स्तर के नीचे किसी भी खुराक के रूप में परिभाषित किया जा सकता है कि एक चौकस जैविक परिवर्तन या क्षति के कारण सूचित किया गया है3. व्यक्तिगत EDCs के कम खुराक प्रभाव के अलावा, पर्यावरण में कम सांद्रता पर पाया विभिन्न EDCs के मिश्रण के लिए ठोस संचयी प्रभाव के कारण की क्षमता है4.

Bisphenol a (BPA या 4, 4 '-(प्रोपेन-2, 2-diyl)) एक polymerizing एजेंट पानी की बोतलें, स्टोर रसीद, दंत sealants के रूप में आमतौर पर इस्तेमाल मदों में पाया जाता है, और पेय और भोजन के डिब्बे के अस्तर5. 17 करने के लिए अपनी संरचनात्मक समानता के कारण-β एस्ट्राडियोल (ई2) और ERα और ERβ एस्ट्रोजन रिसेप्टर्स करने के लिए अपनी आत्मीयता, BPA एक अंत में खलल न डालने वाला रसायन (EDC)5,6के रूप में वर्गीकृत किया गया है । हालांकि कमजोर, BPA है एस्ट्रोजन रिसेप्टर्स के संबध दोनों लिंगों के प्रजनन प्रणाली को प्रभावित करने के लिए और खुराक है कि सुरक्षित7,8माना जाता है पर तंत्रिका कार्य बाधित दिखाया गया है । epigenetically विनियमित तंत्र के माध्यम से डीएनए मिथाइल में परिवर्तन करने के लिए देखा गया है लंबी अवधि के लिए चूहों में ंयूरॉन दोष9BPA से अवगत कराया । विशेष रूप से, BPA भी सक्रियता की वृद्धि की दर के लिए एक संभावित अपराधी के रूप में फंसाया गया है, ध्यान की कमी और एक वृद्धि की वजह से दवाओं के प्रति संवेदनशीलता में वृद्धि के लिए पुरानी जोखिम के बाद माउस अंग forebrain में डोपामाइन रिसेप्टर्स में देखा 9 , 10. मानव स्वास्थ्य पर EDCs के बचके प्रभाव पर महत्वपूर्ण सबूत सहसंबंध अध्ययन पर आधारित है मुख्यतः आबादी के पुराने जोखिम पर पर्यावरण विषालु को भी कम खुराक5पर ध्यान केंद्रित; हालांकि, मानव अध्ययन से निष्कर्ष में सीमाएं और प्रयोगात्मक नियंत्रण जोड़ तोड़ में स्वीकार किया गया है, जबकि अप्रमाणित प्रचार11,12की आलोचनाओं को संबोधित ।

इसके स्टेरॉयड हार्मोन रिसेप्टर जीन सहित ' स्तनधारियों के लिए सम्मान के साथ Caenorhabditis एलिगेंस ' जीन के संरक्षण के कारण, शोधकर्ताओं ने इस आनुवंशिक रूप से परितंत्रीय प्रयोगशाला मॉडल का उपयोग किया है EDCs के कार्यात्मक और यंत्रवत प्रभाव सुलझाना 13. C. एलिगेंस के साथ प्रयोगों से पता चला है कि BPA और बीपीएस के रूप में इन यौगिकों apoptosis, भ्रूण की मृत्यु, डबल-कतरा डीएनए तोड़ मरंमत तंत्र और तंत्रिका समारोह में व्यवधान पैदा कर सकता है14,15 ,16.

हमारी प्रयोगशाला पहले दिखाया गया है कि भी कम खुराक जोखिम जल्दी embryogenesis तक सीमित करने के लिए जीवित वयस्कों में व्यवहार घाटे के साथ fecundity कम हो जाता है15. एक दोहराया उत्तेजना के लिए आदी होना गैर का एक रूप है, मॉडल सिस्टम में साहचर्य सीखने की सी.एलिगेंस सहित, और हमारी पद्धति का उपयोग करता है गैर के इस फार्म का एक व्यवहार उत्पादन के रूप में सीखने-साहचर्य भ्रूण जोखिम के दीर्घकालिक प्रभाव के लिए विषालु17 विशेष रूप से, हम सी. एलिगेंसपर BPA जोखिम का अध्ययन करने के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं, भ्रूण मृत्यु दर और वयस्क व्यवहार पर दीर्घकालिक प्रभाव पर अपने तत्काल प्रभाव सहित, एक समग्र में चित्रित योजनाबद्ध के साथ चित्रा 1. fecundity और गैर साहचर्य अधिगम परख से प्रतिनिधि परिणाम हमारी कार्यप्रणाली की प्रभावशीलता को उजागर करने के लिए प्रदान की जाती हैं ।

Protocol

नीचे दिए गए प्रोटोकॉल को जल्दी embryogenesis के दौरान BPA जोखिम के प्रभाव का परीक्षण मानकीकृत किया गया है, और बीपीएस, BPF या अंय EDCs और विषालु पर सी. एलिगेंस भ्रूण के साथ प्रयोग के लिए संशोधित किया जा सकता है ।

1. सामग्री सेटअप

  1. निमेटोड ग्रोथ मीडिया (NGM)18 मीडिया के 1.5 g को भंग करके 500 मिलीलीटर, peptone के 1.25 ग्राम, और आगर के 8.5 ग्राम को 500 मिलीलीटर तक पानी में तैयार करें । autoclaving के बाद (121 डिग्री सेल्सियस, 15 साई, 20 मिनट), कोलेस्ट्रॉल की 0.5 मिलीलीटर जोड़ें (5 मिलीग्राम/इथेनॉल में एमएल), 0.5 मिलीलीटर की 1 मीटर MgSO4, 0.5 मिलीलीटर की 1 मीटर CaCl2 और 12.5 मिलीलीटर की 1 एम पोटेशियम फॉस्फेट बफर, पीएच 7.4 (१०८.३ g of KH2PO4 , K2HPO4, पानी 1 L के लिए ३५.६ g) ।
  2. 1 N KOH, ब्लीच के 4 मिलीलीटर, और पानी की 71 मिलीलीटर की 25 मिलीलीटर मिश्रण से हाइपोक्लोराइट समाधान तैयार करें । इस समाधान को ताजा करें ।
  3. KH2पीओ4, एनए के 6 जी2HPO4, NaCl के 5 ग्राम, MgSO4के 1 मीटर की 5 मिलीलीटर, और 1 एल के लिए पानी के 3 ग्राम मिश्रण द्वारा M9 बफर तैयार करें ।
  4. के लिए तैयार एस बफर18 को मिलाकर 0.02 M K2HPO4, 871 मिलीलीटर की KH2PO4, और NaCl के ५.८५ ग्राम ।
  5. autoclaving द्वारा M9 और एस बफ़र्स निष्फल ।
  6. Luria शोरबा (पौंड) के 20 मिलीलीटर में ई कोलाई (OP 50 तनाव) की एक रात संस्कृति बढ़ती है ।
  7. 10% इथेनॉल में BPA भंग 1 मिमी स्टॉक समाधान बनाने के लिए । 0.1 µ एम, 0.5 µ एम, 1 µ एम, 5 µ एम और एस बफर में 10 µ मीटर के बाद कमजोर पड़ने बनाओ ।
    नोट: जलीय एस बफर में कमजोर पड़ने से बहुत इथेनॉल की एकाग्रता कम कर देता है; उदाहरण के लिए, उच्चतम BPA एकाग्रता में इस प्रोटोकॉल (10 µ m) में वर्णित है, इथेनॉल की एकाग्रता 0.1% v/

2. C. एलिगेंस संवर्धन और सिंक्रनाइज़ेशन

  1. NGM मीडिया को 100 एमएम प्लेट्स में डालो (लगभग 25 एमएल/प्लेट) और इसे जमना की अनुमति दें । एक बार जम, तरल संस्कृति से ई. कोलाई OP50 के 150 µ एल फैल द्वारा प्लेटें रातोंरात उगाया । 37 डिग्री सेल्सियस रात भर में प्लेटें ।
  2. अगले दिन, 1 सेमी स्क्वायर के एक अनुमानित स्लैब हिस्सा द्वारा नई प्लेटों पर N2 कीड़े हस्तांतरण । कीड़े 20 डिग्री सेल्सियस पर 3 दिनों के लिए विकसित करने की अनुमति दें जब तक थाली अच्छी तरह से तंग आ वयस्क दिखाई भ्रूण युक्त वयस्कों के साथ आबादी है ।
  3. सिंक्रनाइज़ करने के लिए, प्लेट भर में M9 बफर के 5 मिलीलीटर तक pipetting द्वारा प्रत्येक प्लेट को धो लें । एक बाँझ 15 मिलीलीटर शंकु केंद्रापसारक ट्यूब करने के लिए तरल स्थानांतरण ।
    नोट: तुल्यकालन वयस्क कीड़े को मारने और भ्रूण है कि अपेक्षाकृत एक ही मंच है इकट्ठा करने के लिए किया जाता है ।
  4. के लिए 3,000 x g पर 4 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर करने के लिए वयस्क कीड़े की एक ढीली गोली प्राप्त करने के लिए ।
  5. एक 10 मिलीलीटर पिपेट का प्रयोग, ध्यान से supernatant इतनी के रूप में गोली बरकरार छोड़ने के लिए हटा दें । हाइपोक्लोराइट समाधान के 5 मिलीलीटर जोड़ें और धीरे मिश्रण ।
  6. 4 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 3,000 एक्स जी पर केंद्रापसारक ।
  7. एक 10 मिलीलीटर पिपेट के साथ supernatant निकालें और M9 बफर के 7 मिलीलीटर के साथ धो लो । इस चरण को दो बार दोहराएं ।

3. BPA को उजागर कीड़े

  1. ऊपर चरण 2.7 से अंतिम धोने के बाद, M9 बफर के साथ अंडे की 100 µ एल के बारे में निलंबित । 2 मिलीलीटर microfuge ट्यूबों के लिए अंडे के बारे में 50 µ एल स्थानांतरण पहले से ही उपयुक्त एकाग्रता BPA एस बफर में पतला युक्त । एस बफर की राशि को समायोजित BPA की सही अंतिम एकाग्रता सुनिश्चित करने के लिए (0.0 µ एम, 0.1 µ एम, 0.5 µ एम, 1.0 µ एम, 5.0 µ एम और 10 µ एम) ट्यूब प्रति । तालिका 1 एक तरह से इन कमजोर पड़ने बनाने के लिए दिखाता है ।
अंतिम BPA एकाग्रता के लिए स्टॉक BPA (100 माइक्रोन) S बफ़र सिंक्रनाइज़ कीड़े
0.1 माइक्रोन 1 μL μL 50 μL
0.5 माइक्रोन 5 μL 945 μL 50 μL
1 माइक्रोन 10 μL 940 μL 50 μL
5 माइक्रोन 50 μL 900 μL 50 μL
10 माइक्रोन 100 μL 850 μL 50 μL

तालिका 1: स्टॉक BPA, एस बफर और सिंक्रनाइज़ करने के लिए हमारे अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया वांछित सांद्रता प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया कीड़े ।

  1. एक प्रकार का बरतन पर ट्यूबों और धीरे 20 डिग्री सेल्सियस पर 4 एच के लिए हिला, 25 rpm पर एक रोटरी शेखर या के लिए 25 झुकाव/
  2. 4 एच के बाद, ट्यूब धारकों में जगह ट्यूबों और कीड़े बसने के लिए अनुमति देते हैं ।
  3. supernatant और स्थानांतरण कीड़े (OP50 ई. कोलाईके साथ NGM प्लेटें) वरीयता प्राप्त प्लेटों को त्यागें । तरल OP50 ई. कोलाई संस्कृति के रूप में 1.5 और बीज में कहा गया प्लेटें 2.1 में कहा गया है ।
  4. 20 डिग्री सेल्सियस में 60 एच के लिए कीड़े बढ़ने दो । संदूषण के लिए हर दिन प्लेटों की जांच । दूषित NGM प्लेटें आमतौर पर फीका और व्यक्तिगत कालोनियों के साथ कर रहे हैं । भीड़ के लिए माइक्रोस्कोप के तहत कीड़े की जांच करें । छोटे स्थानों में OP50 ई. कोलाई लॉन और केंद्रित कीड़े की कमी भीड़ को दर्शाता है ।

4. पूर्वकाल स्पर्श आदी होना परख

  1. स्थानांतरण लगभग 10 सिंक्रनाइज़ युवा वयस्क कीड़े एक आग का उपयोग कर नई unअस्तव्यस्त NGM प्लेटों के लिए 30 जी प्लेटिनम वायर उठाओ । छोड़ कीड़े 5 मिनट के लिए परेशान उंहें समय के लिए नई थाली को acclimatize अनुमति देते हैं ।
  2. आदी होना प्रतिक्रिया के लिए, एक भौं एक लकड़ी के कटार या दंर्तखोदनी के अंत से जुड़ी बालों का उपयोग करें, और 70% इथेनॉल में डूबा द्वारा निष्फल । एक साफ एक प्रकार का वृक्ष-मुक्त ऊतक के साथ पोंछ और इथेनॉल के लिए 1 मिनट के लिए बंद वाष्पीकरण के लिए रुको । धीरे सिर पर कीड़ा स्पर्श (ग्रसनी बल्ब के पूर्वकाल) भौं बालों का उपयोग । स्पर्श दोहराएं, अनुमति के बीच में 10 एस छू क्रम में कीड़ा ठीक करने की अनुमति के लिए ।
  3. स्पर्श करने के लिए जारी रखें (10 एस उत्तेजना अंतराल की अनुमति) जब तक कीड़ा अब पीछे की ओर ले जाता है । इस बिंदु पर, कीड़ा उत्तेजना को आदत है । habituate करने के लिए कृमि के लिए आवश्यक छू की संख्या रिकॉर्ड.
  4. Tukey की पोस्ट हॉक परीक्षण के बाद एक-तरफ़ा ANOVA का उपयोग करके इलाज और अनुपचारित नियंत्रणों का माध्य आदी होना दरों के बीच अंतर का विश्लेषण करें ।

5. कृमि Fecundity परख

  1. एक प्लैटिनम उठाओ का उपयोग कर एक ताजा और बीज प्लेट के लिए व्यक्तिगत L3 कीड़े स्थानांतरण । सुनिश्चित करें कि प्रति प्लेट केवल एक वर्म रखा गया है ।
    नोट: L3 लार्वा चरण के बाद, कीड़े L4 लार्वा चरण और वयस्कता में विकसित । उंहें जल्दी उठा में सुविधाजनक है कि वे व्यक्तिगत पशुओं के हस्तांतरण के लिए काफी बड़े है जबकि यह सुनिश्चित करना है कि वे पहले से ही किसी भी अंडे जो अंयथा गिनती में याद किया जाएगा नहीं रखी है ।
  2. हर 12 रखी अंडे की संख्या गिनती-24 एच. मतगणना के बाद पैरेंट वर्म को एक नई प्लेट में ट्रांसफर करें । जब तक कीड़ा अंडे बिछाने बंद हो जाता है, आमतौर पर 5 दिनों के बाद जब 20 डिग्री सेल्सियस पर मशीन दोहराएँ ।
    नोट: औसत पर, एक जंगली प्रकार कृमि 300 अंडे के लिए करना कर सकते हैं; इसलिए, एक नई थाली के लिए माता पिता के स्थानांतरण दैनिक भीड़ रोकता है ।
  3. इलाज और अनुपचारित नियंत्रण द्वारा रखी अंडे की औसत संख्या के बीच अंतर का विश्लेषण एक तरह से ANOVA Tukey की पोस्ट हॉक परीक्षण के बाद का उपयोग कर ।

Representative Results

सी. एलिगेंस के साथ पहले अध्ययन में बताया गया है कि उच्च BPA सांद्रता के लिए नित्य जोखिम (≥ 1 मिमी) भ्रूण विकास और वयस्कता में कम हो जाती है fecundity14. बाद में हमारे प्रयोगशाला से रिपोर्ट के अध्ययन से पता चला है कि भ्रूण कि 4 एच की एक सीमित अवधि के लिए अपने विकास की शुरुआत चरणों में BPA से अवगत कराया गया है व्यवहार्य अंडे की संख्या में कमी से पता चला है वयस्कों के रूप में रखी15 (चित्रा 2) । पद्धति के दो प्रमुख विशेषताएं थे कि (i) BPA इस्तेमाल किया सांद्रता काफी कम थे (0.1 µ एम को 10 µ एम रेंज) और (ii) जोखिम जल्दी भ्रूण अवधि तक ही सीमित था । इसके अलावा कम मात्रा में भी fecundity की कमी हुई, हमारे आदी होना परख से पता चला है कि कीड़े के लिए भ्रूण और उत्तेजनाओं की आवश्यकता के रूप में आदत हो जब अकेले वाहन से अवगत कराया कीड़ों की तुलना में करने के लिए आवश्यक ( चित्रा3) । इन प्रभावों में उल्लेखनीय है कि वे कम खुराक BPA जोखिम पर आधारित हैं, तर्क है कि आकृति विज्ञान स्पष्ट नहीं किया जा सकता है कि ंयूरॉंस समारोह पर subtler प्रभाव व्यवहार परिवर्तन के माध्यम से प्रत्यक्ष होने की संभावना है के बाद । संक्षेप में, प्रतिनिधि परिणाम यहां प्रस्तुत तथ्य यह है कि एक भ्रूण प्रभाव के लिए BPA जोखिम के हानिकारक प्रभावों को अपने विकास, ंयूरॉंस समारोह है कि C. एलिगेंसमें वयस्क व्यवहार परख के माध्यम से मूल्यांकन किया जा सकता है सहित, को रेखांकित । प्रोटोकॉल यहां प्रदान की कम खुराक परीक्षण के रूप में के रूप में अच्छी तरह से अंत में स्रावी विघटनकारी यौगिकों सहित अंय संभावित विषालु के दीर्घकालिक प्रभाव के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

Figure 1
चित्रा 1: प्रयोगात्मक डिजाइन के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व. परिपक्व कीड़े एकत्र किए गए और हाइपोक्लोराइट समाधान के संपर्क में आदेश सिंक्रनाइज़ भ्रूण इकट्ठा करने के लिए । भ्रूण तो 4 एच के लिए BPA के विभिंन सांद्रता के संपर्क में थे । उजागर भ्रूण बीज NGM प्लेटों पर स्थानांतरित कर रहे थे, जहां वे 20 डिग्री सेल्सियस पर 60 ज के लिए विकसित करने की अनुमति दी गई । आदेश में विकास के प्रारंभिक दौर के दौरान जोखिम की प्रभावशीलता का परीक्षण करने के लिए, L4 कीड़े व्यक्तिगत प्लेटों को हस्तांतरित और fecundity के लिए परीक्षण किया गया है, और युवा वयस्कों पूर्वकाल स्पर्श आदी होना के साथ परीक्षण किया गया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: Fecundity BPA द्वारा कम है । 1 µ मीटर और BPA के उच्च सांद्रता के लिए एक्सपोजर काफी नियंत्रण की तुलना में रखी अंडे की संख्या में कमी आई (क्षैतिज रेखा द्वारा प्रतिनिधित्व किया; n = 10, *p < 0.05) । त्रुटि पट्टियों को निरूपित SEM. Analysis ANOVA, Tukey की पोस्ट हॉक टेस्ट का प्रयोग किया. यह आंकड़ा Mersha एट अल., 201515से संशोधित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3: भ्रूण BPA जोखिम के दीर्घकालिक प्रभाव वयस्क व्यवहार में प्रतिबिंबित होते हैं । कम के रूप में 0.1 µ m के रूप में BPA सांद्रता को उजागर भ्रूण वयस्कों में गैर-साहचर्य पूर्वकाल स्पर्श आदी होना को प्रभावित करता है (n = 60, * p < 0.05) । त्रुटि सलाखों SEM निरूपित; ANOVA, Tukey की पोस्ट हॉक की परीक्षा । यह आंकड़ा Mersha एट अल., 201515से संशोधित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Discussion

embryogenesis के रूप में तेजी से विकास और विकास के चरणों विशेष रूप से विभिन्न अंत – स्रावी-बाधित यौगिकों के हानिकारक प्रभावों के लिए संवेदनशील हैं, BPA सहित. हम सी. एलिगेंस invertebrate मॉडल में BPA या अंय विषालु के लिए जोखिम के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं, जो सांद्रता की एक सीमा के सुविधाजनक अनुमापन भ्रूण व्यवहार्यता पर इसके प्रभाव का आकलन करने के लिए अनुमति देता है (चित्रा 2) . वयस्कों कि भ्रूण है कि BPA की कम खुराकों को उजागर कर रहे थे से विकसित करने पर व्यवहार प्रयोगों का पालन करें लंबी अवधि के प्रभाव को परख ंयूरॉन समारोह पर (चित्रा 3) । इस समाचार पत्र का केन्द्रीय विचार सी. एलिगेंस मॉडल में प्रारंभिक embryogenesis अवधि के दौरान विभिन्न विषालु को भ्रूण को उजागर करने के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करना है; इसके 11.5 घंटे भ्रूण विकास अवधि के पहले 4 एच खिड़की (20 डिग्री सेल्सियस से कम) प्रसार अवधि है, जो organogenesis द्वारा पीछा किया जाता है के लिए मेल खाती है । इस अंत की ओर, हम fecundity और गैर साहचर्य अधिगम परख के माध्यम से अंत अंक के सत्यापन प्रदान की है । जबकि bpa और अंय bisphenols की कार्रवाई के यंत्रवत आधार पवित्र कंघी बनानेवाले की रेती की ओर है, जो इस क्षेत्र में अनुसंधान के उद्देश्य से है, हम इस पद्धति में BPA की कार्रवाई के लिए एक यंत्रवत विवरण की पेशकश करने का प्रयास नहीं किया है लेख केंद्रित । हालांकि, हम बताते है कि सी. एलिगेंस मॉडल एक आदर्श प्रणाली को आगे कार्रवाई के तंत्र काटना प्रदान करता है चाहूंगा । उदाहरण के लिए, bpa कार्रवाई का गूढ़ तंत्र पर भविष्य के काम में, C. एलिगेंस म्यूटेंट उत्पन्न किया जा सकता है और bpa के प्रभाव के लिए एक प्रतिरोध के लिए जांच की और इस तरह मार्ग गूढ़ रहस्य के लिए रास्ता प्रशस्त. इसके अतिरिक्त, हमारे साथी रीढ़ में तंत्रिका नेटवर्क synchrony स्तर पर BPA के प्रभाव के साथ कागज सौदों, एक और अवसर प्रदान करने के लिए विषाक्त प्रभाव के लिए संभावित तंत्र की जांच के लिए आधार समझ19।

इस पत्र में विस्तृत कार्यप्रणाली में, कुछ महत्वपूर्ण कदम है कि निष्पादित किया जाना चाहिए के अतिरिक्त ध्यान से निंनलिखित शामिल हैं: अच्छी तरह से तंग आ गया के साथ एक थाली का चयन सी. एलिगेंस वयस्क के साथ परिपक्व अंडे विच्छेदन माइक्रोस्कोप के नीचे दिखाई महत्वपूर्ण है, और इस कदम का पालन करने में नाकाम रहने EDC जोखिम प्रयोग के लिए भ्रूण के एक अपर्याप्त नमूना आकार में परिणाम होगा । यह भी सुनिश्चित करें कि हाइपोक्लोराइट समाधान ताजा करने के लिए एक unसिंक्रनाइज़ जनसंख्या है कि जल्दी embryogenesis के दौरान BPA जोखिम प्रदर्शन करने की क्षमता के साथ हस्तक्षेप करेंगे प्राप्त करने से बचने के लिए महत्वपूर्ण है । M9 के साथ वाशिंग छर्रों (हाइपोक्लोराइट एक्सपोजर के बाद) भी एक बहुत ही महत्वपूर्ण कदम है । यदि ठीक से नहीं किया, ब्लीच के उच्च एकाग्रता मृत भ्रूण में परिणाम हो सकता है । इसके अतिरिक्त, भ्रूण 4 एच के बाद वरीयता प्राप्त NGM प्लेटों को हस्तांतरित किया जाना चाहिए । यदि समय की एक विस्तारित अवधि के लिए BPA समाधान में छोड़ दिया, भ्रूण लंबे समय से रहते थे dauer लार्वा में विकसित होने की संभावना है । यह काफी दोनों fecundity परख और व्यवहार परख के साथ हस्तक्षेप करेगा । यदि इन चरणों में से कोई भी याद किया जाता है, यह बहुत शुरुआत से प्रक्रिया शुरू करने के लिए सलाह दी जाती है । अगर किसी भी कारण से, कीड़े के साथ NGM प्लेट दूषित है या पर्याप्त भोजन नहीं है, यह कीड़ों पर तनाव बढ़ जाएगा जिससे एकत्र डेटा विषम । इस तरह के प्लेटों को छोड़ दिया जाना चाहिए और प्रयोग में नहीं किया जाना चाहिए ।

पहले, एक उल्लेखनीय अध्ययन सफलतापूर्वक सी. एलिगेंस मॉडल का इस्तेमाल किया है कि गुणसूत्र को BPA के कारण germline में डीएनए की मरंमत मशीनरी के टूटने की वजह से असामान्यताओं को प्रदर्शित करने के लिए14। तथापि, यह उल्लेखनीय है कि उपरोक्त अध्ययन डिजाइन सी. एलिगेंस के निरंतर bpa जोखिम का इस्तेमाल किया था अपनी उंर में bpa की उच्च खुराक के लिए । हमारी पद्धति जल्दी embryogenesis के दौरान BPA जोखिम की कम खुराक का अध्ययन करने के लिए डिज़ाइन किया गया था, इसलिए के रूप में भ्रूण व्यवहार्यता पर अपने प्रभाव परख और बचे पर दीर्घकालिक प्रभाव subtler । हमारे ज्ञान के लिए, कोई पद्धति के लिए समय की एक निर्दिष्ट अवधि के लिए सीमित BPA के बहुत कम खुराक के लिए जल्दी चरण भ्रूण बेनकाब विकसित किया गया है; इस प्रकार, बनाने की विधि यहां प्रस्तुत उपंयास ।

इसके अलावा, यहां दिए गए प्रोटोकॉल को embryogenesis के प्रसार चरण के दौरान अंय EDCs के प्रभावों का अध्ययन करने के लिए आसानी से अनुकूलित किया जा सकता है । हालांकि, देर से भ्रूण चरणों का अध्ययन करने के लिए, प्रोटोकॉल ध्यान के तहत विकास के महत्वपूर्ण समय खिड़की के लिए महत्वपूर्ण संशोधनों की आवश्यकता होगी । इसके अलावा, हमारे प्रोटोकॉल विषाक्त जोखिम की अब समय की आवश्यकता के प्रयोगों के लिए उपयुक्त नहीं होगा, क्योंकि यह ऊपर वैकल्पिक विकास के परिणामस्वरूप मार्ग की संभावना को खोलता है लंबे समय से दूसरे molting चक्र है, जो प्रतिरोधी है में dauer गिरफ्तारी रहते थे कठोर शर्तों को20। इसके अलावा संशोधनों और शोधन एक खाद्य स्रोत है कि क्षमता के लिए नहीं है के साथ पूरक के माध्यम से अब जोखिम समय के लिए आवश्यक हो जाएगा metabolize या EDC उदा autoclaved ई. कोलाई। अंत में, हमारी कार्यप्रणाली fecundity पर और invertebrate मॉडल प्रणाली सी. एलिगेंस में न्यूरॉन्स समारोह पर विभिन्न अंत में स्रावी बाधित रसायनों के प्रभाव का आकलन करने के लिए उपयोग किया जा सकता है ।

Disclosures

लेखकों ने एलान किया कि उनका खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

NSF द्वारा सहायता (EPSCoR EPS-०८१४२५१) और NIH (1P20GM103653-01A1) को मार्केट और एचएसडी, डेलावेयर राज्य विश्वविद्यालय के संस्थागत छात्र सहायता करने के लिए एमडीएम (शीर्षक III HBGI) और KRS (NIH-INBRE) आभार स्वीकार किया है । सी. एलिगेंस आनुवंशिक केंद्र के लिए धंयवाद (NIH कार्यालय द्वारा अनुसंधान अवसंरचना कार्यक्रम P40 OD010110) सी. एलिगेंस जंगली प्रकार N2 तनाव के लिए ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NaCl Fisher 7647-14-5
Peptone Fisher S25761B
Agar Fisher BP1423-500
Cholesterol Alfa Aesar A11470
MgSO4 Fisher 7487-88-9
CaCl2 Fisher C79-500
KH2PO4 Fisher P286-1
K2HPO4 Fisher 7758-11--4
KOH Fisher 1310-58-3
Bleach Clorox n/a
Na2HPO4 Fisher BP332-500
LB Fisher BP1426-500
BPA Sigma-Aldrich 239658-250g
BPS Sigma-Aldrich 103039-100g
EtOH Sigma-Aldrich 64-17-5
E.coli OP50 CGC Repository at U of Minnesota
N2 (Wild-type C. elegans) worms CGC Repository at U of Minnesota
Platinum wire pick Genesee Scientific 59-AWP
Petri plates Fisher 07-202-011
Dissection Microscope AmScope SM-2TYY

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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विकासक जीवविज्ञान अंक 133 Bisphenol ए Bisphenol एस Caenorhabditis एलिगेंस अंत-स्राव बाधित यौगिक विकास Embryogenesis व्यवहार आदी होना गैर साहचर्य सीखना Fecundity
दीर्घकालिक व्यवहार और कम खुराक विषालु के लिए भ्रूण जोखिम के प्रजनन परिणाम
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Mersha, M. D., Sanchez, K. R., Temburni, M. K., Dhillon, H. S. Long-term Behavioral and Reproductive Consequences of Embryonic Exposure to Low-dose Toxicants. J. Vis. Exp. (133), e56771, doi:10.3791/56771 (2018).

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