Summary
Inzicht in de invloed van milieuorganochloorbestrijdingsmiddelen (OCPs) op de mitochondriale functie bij hepatocyten is belangrijk bij het verkennen van het mechanisme van OCPs die stofwisselingsstoornissen veroorzaken. Dit document presenteert gedetailleerde methoden voor het opsporen van levermitaire functie.
Abstract
Dit document presenteert gedetailleerde methoden voor het opsporen van levermitaire functie voor een beter begrip van de oorzaak van metabole aandoeningen veroorzaakt door milieuorganochloor pesticiden (OCPs) in hepatocyten. HepG2-cellen werden gedurende 24 uur blootgesteld aan β-hexachloormohexaan (β-HCH) bij een equivalente dosis interne blootstelling in de algemene populatie. Ultrastructuur in hepatocyten werd onderzocht door transmissie elektronenmicroscopie (TEM) om de schade van mitochondriën aan te tonen. Mitochondriale functie werd verder geëvalueerd door mitochondriale fluorescentieintensiteit, adenosine 5'-triphosfat (ATP) niveaus, zuurstofverbruik (OCR) en mitochondriaal membraan potentieel (MMP) in HepG2 cellen geïncubeerd met β-HCH. De mitochondriën fluorescentie intensiteit na gekleurd door mitochondriale groene fluorescerende sonde werd waargenomen met een fluorescentie microscopie. De luciferin-luciferase reactie werd gebruikt om atp niveaus te bepalen. De MMP werd gedetecteerd door de kationische kleurstof JC-1 en geanalyseerd onder stroom cytometrie. OCR werd gemeten met een extracellulaire flux analyzer. Samengevat, deze protocollen werden gebruikt bij het opsporen van mitochondriale functie in hepatocyten met mitochondriën schade te onderzoeken.
Introduction
De effecten van organochloorbestrijdingsmiddelen (OCP's) op de gezondheid, zoals reproductieve interferentie, immunologische toxiciteit, metabolische veranderingen zijn eerder onderzocht1,2,3. De methoden om cellulaire metabolisme te detecteren en erachter te komen mitochondriale disfunctie hebben wetenschappers in staat gesteld om de rol van mitochondriale functie te begrijpen (d.w.z., mitochondriale STAT3-niveaus, lactaat, pyruvaat, lactaat-naar-pyruvaatverhouding, co-enzym Q10, mitochondriaal protonlek, bio-energetiek, biogenese en dynamica) op gebieden zoals veroudering, obesitas, diabetes, cardiovasculaire functie, kanker en veiligheidstoxiciteit4,,5,,6,7. In dit artikel beschrijven we de methoden voor het beoordelen van mitochondriale disfunctie veroorzaakt door OCPs.
We stelden HepG2-cellen bloot aan β-hexachloormohexaan (β-HCH), een representatieve OCP's, voor 24 uur bij een dosis die gelijk is aan interne blootstelling van de mens. Ten eerste werd TEM toegepast om de ultrastructuur van hepatocyten te observeren, zoals kernen, mitochondriën en endoplasmatisch reticulum8. Vergeleken met gewone microscopen maakt TEM het mogelijk om de 2D en 3D ultrastructuur van cellen en celcomponenten (cellijnen of weefsel), de morfologie, chemische samenstelling en functie van natuurlijke of kunstmatige materialen die een centrale rol spelen in de moderne wetenschap en technologie te verkennen. Mitochondriale functie werd verder geëvalueerd door mitochondriale fluorescentie intensiteit, adenosine 5'-triphosfat (ATP) niveaus, zuurstofverbruik (OCR) en mitochondriaal membraan potentieel (MMP)in HepG2 cellen geïncubeerd met β-HCH. Mito-tracker groen is een mitochondriën groene fluorescerende sonde die kan worden gebruikt voor levende cel mitochondriaal-specifieke fluorescerende vlekken. De mitochondriën in hepatocyten werden gekleurd door mito-tracker groene oplossing en mitochondriale fluorescentie intensiteit, aantal en patroon werden waargenomen met een confocale microscopie9. Mitochondriale groene fluorescerende sonde kan worden gebruikt om levende cellen te bevlekken. Vergeleken met rhodamine 123 of JC-1 is mitochondriaal groene fluorescerende sonde niet afhankelijk van mitochondriaal membraanpotentieel voor mitochondriale vlekken. ATP-niveaus werden bepaald door een luciferase-luciferin kit en genormaliseerd door eiwitconcentratie. ATP-testkit kan worden gebruikt om ATP-niveaus te detecteren in gemeenschappelijke oplossingen, cellen of weefsels. Deze kit is gebaseerd op firefly luciferase gekatalyseerd door fluoresceïne om fluorescentie te genereren, wanneer ATP nodig is om energie te leveren. Wanneer de vuurvlieg luciferase en fluoresceïne buitensporig zijn, is de generatie van fluorescentie evenredig met de concentratie van ATP. Daarnaast is deze kit speciaal ontworpen om de chemiluminescentie van ATP te optimaliseren. ATP, als de belangrijkste energiemoleculen, speelt een belangrijke rol in de verschillende fysiologische of pathologische processen van cellen. Veranderingen in ATP-niveaus kunnen defecten in de celfunctie weerspiegelen, met name de productie van mitochondriale energie. Meestal onder apoptose, necrose of in een giftige toestand, cellulaire ATP niveaus verminderd 10. MMP's test kit met JC-1 is een kit die JC-1 gebruikt als een fluorescerende sonde om cellen, weefsels of gezuiverde MMP's snel en gevoelig te detecteren. Het kan worden gebruikt voor vroegtijdige opsporing van apoptose. De kationische kleurstof JC-1 is een fluorescerende sonde die wordt gebruikt om de MMP die kan worden geanalyseerd onder stroom cytometrie aangegeven door veranderingen van groene en rode fluorescentie verhouding te detecteren. Wanneer het MMP hoog is, wordt JC-1 samengevoegd in de matrix van de mitochondriën tot een polymeer (J-aggregaten), dat rode fluorescentie produceert. Wanneer het MMP laag is, kan JC-1 zich niet ophopen en vormt monomeer die groene fluorescentieproduceert 11. Dus de verhouding van rode en groene fluorescentie kan het niveau van MMP weerspiegelen. De OCR van cellen is een cruciale indicator van de normale cellulaire functie12. Het wordt beschouwd als een parameter voor onderzoek mitochondriale functie. Cell mito stress test kit biedt een stabiele methode voor het analyseren van de belangrijkste parameters van mitochondriale functie. De kit biedt kwaliteitscontrole en voorspellende reagentia, evenals een standaardmethode voor het uitvoeren van cel mitochondriale stresstest. Het kan worden gebruikt om alle celtypen te detecteren, inclusief primaire cellen, cellijnen, zwevende cellen, en ook voor eilandjes, aaltjes, gisten en geïsoleerde mitochondriën.
OCR-meting kan waardevol inzicht geven in de fysiologische status of veranderingen van cellen. Het werd bepaald met een extracellulaire flux analyzer om ademhaling baseline, proton lek, maximale luchtwegen, ATP omzet en reserve capaciteit te detecteren. Kortom, na basismetingen van OCR werd OCR gedetecteerd nadat het achtereenvolgens had toegevoegd aan oligomycine (ATP Coupler), FCCP (mitochondriale oxidatieve fosforylatie uncoupler) en antimycine A/rotenone (een remmer van zuurstofverbruik)per put.
In een poging om de ontwikkeling van meer specifiek protocol voor het opsporen van mitochondriale functie in hepatocyten in vitro te vergemakkelijken, presenteren we hier experimenten door TEM, confocale microscopie, luminometer, stroomcytometrie en extracellulaire flux analyzer met toekomstige toepassing bij het bestuderen van mitochondriën schade gerelateerde nadelige resultaten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle experimenten en de experimentprotocollen werden uitgevoerd in overeenstemming met relevante richtlijnen en voorschriften en goedgekeurd door de lokale Ethische Commissie van de Nanjing Medical University.
1. Mitochondriale ultrastructuur door TEM
- Het verzamelen van HepG2 cellen
- Seed HepG2 cellen in 100 mm gerechten. Bewaar bij 37 °C en 5% CO2.
- Verteren cellen met 0,25% EDTA in 1,5 mLEP buis.
- Centrifuge op 1000 x g gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur (RT). Gooi de supernatant weg.
- Verzamel 4-6 x 105 HepG2 cellen.
- Voeg 1 mL glutaraldehyde (Oplosmiddel: dubbel gedestilleerd water) toe met pipetten en incubeer bij 4°C gedurende 2 uur.
- Voeg toe en was in 4 veranderingen van 1 mL fosfaatbuffer (met Na2HPO4,KH2PO4, NaCl en KCl, pH 7.4), 15 min per stuk. Zuig fosfaatbuffer met pipetten eruit.
- Voeg 200 μm van 1% osmium (Oplosmiddel: dubbel gedestilleerd water) en incubbate bij 4 °C gedurende 2 uur toe aan zwart monster.
Let op: Osmium is zeer giftige en vluchtige stof. Het moet zorgvuldig worden bediend in de medicijnkast. - Voeg toe en was in 2 veranderingen van 1 mL fosfaatbuffer, 5 min per stuk. Zuig fosfaatbuffer eruit.
- Vlek in 2% uranylacetaatoplossing (Oplosmiddel: dubbel gedestilleerd water en azijnzuur) in 1,5 mL EP buis gedurende 2 uur.
- Dehydraat en onderdompel door 50% aceton, 70% aceton, 90% aceton (Oplosmiddel: dubbel gedestilleerd water), 2 veranderingen van absolute aceton, 15 min per stuk.
- Penetreer in 2 druppels aceton (100%)/inbeddingsmiddel (1:1) voor 1,5 uur bij RT. Epon812 inbedding agent, het recept is als volgt: A: Epon812, 62 mL en DDSA, 100 mL; B: Epon812, 100 mL en MNA 89 mL. A:B=2:8 (v:v, in de winter), A:B=1:9 (v:v, in de zomer). Inbedding in het inbedden van mallen (Zachte plastic plaat met geruit rooster).
- Incubate achtereenvolgens bij 37 °C voor 12 uur, 45 °C voor 12 uur en vervolgens 60 °C voor 48 uur.
- Bereid ultradunne secties (het grootste gebied mag niet meer dan 0,5 mm × 0,3 mm) voor door ultradunne secties machine en TEM (2 μm en 500 nm).
2. Mitochondriale fluorescentieintensiteitsdetectie
- Zaad 2x 104 HepG2 cellen in 6-well platen. Voeg β-HCH toe voor 24 uur.
- Voeg watervrije DMSO toe om een uiteindelijke concentratie van 1 mM mitochondriale groene fluorescerende sonde te formuleren.
- Voeg 1 mL mitochondriale groene fluorescerende sondeoplossing (uiteindelijke concentratie: 200 nM) toe aan elke put van 6-putplaten, incubeer bij 37 °C gedurende 45 minuten.
- Verwijder de mitochondriale groene fluorescerende sondeoplossing en voeg vers bereid celkweekmedium (DMEM) toe bij 37 °C voorafgaand aan de beeldvorming.
- Observeer mitochondriale groene fluorescentie door een fluorescentiemicroscoop (10x). De maximale excitatiegolflengte bij detectie is 490 nm en de maximale emissiegolflengte is 516 nm.
3. Test van de cellulaire ATP-niveaus
- Seed HepG2 cellen in 6-well platen. Voeg β-HCH toe voor 24 uur.
- Voeg 200 μL lysebuffers van de luciferase-luciferin ATP-testkit toe aan elke put van 6-putplaten. Centrifuge bij 12.000 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C, verzamel de supernatant met pipetten in nieuwe buizen.
- Verdun het ATP-detectiereagens met de ATP-verdunning bij een verhouding van 1: 5, als ATP-detectiebuffer.
- Standaardcurvebepaling voorbereiden: verdun de ATP-standaardoplossing van 0,5 mM tot 10, 5, 1, 0,5, 0,1, 0,05, 0,01 μM door ATP lysis-buffers.
- Voeg 100 μL ATP-detectiebuffer toe in een 96-putplaat gedurende 5 minuten bij RT en voeg 100 μL supernatant van de cel toe, detecteren door een luminometer (chemiluminescentiedetector). Bereken atp-concentratie (nmol/L) hoewel de standaardcurve.
- Detecteer de eiwitconcentratie door een BCA Protein Assay Kit met multimode reader.
- Bereid de standaardcurvebepaling voor: verdun de 5 mg/mL eiwitstandaardoplossing tot 0, 0,025, 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4 en 0,5 mg/mL met dubbel gedestilleerd water.
- Voeg 1 μL supernatant van de cel in een 96-put plaat en voeg 19 μL van dubbel gedestilleerd water.
- Voeg 200 μL BCA-detectieoplossingen toe voor elke put. Incubeer bij 37 °C gedurende 30 min. Detecteer de OD-waarde (optische dichtheid) door een multimodelezer met 562 nm. Bereken de eiwitconcentratie (mg/mL) hoewel de standaardcurve.
- Corrigeer het ATP-gehalte per mg eiwitconcentratie (eenheid: ATP-concentratie/eiwitconcentratie, nmol/mg).
4. Mitochondriale membraan potentieel (MMP) beoordeling door JC-1
- Verzamel HepG2 cellen gezaaid in 6-well platen. Verteren cellen met 0,25% EDTA in 1,5 mL EP buis, centrifuge op 1000 x g gedurende 3 min, gooi de supernatant en cellen te verzamelen.
- Voeg 50 μL JC-1 (200X) toe aan 8 mL gedestilleerd water aan vortex en meng. Voeg 2 mL VAN JC-1 (5X) kleuring verven buffer als JC-1 detectie oplossing.
- Incubeercellen met een mengsel van 0,5 mL celkweekmedium en 0,5 mL JC-1 detectieoplossing voor 20 min bij 37 °C.
- Centrifuge bij 600 x g gedurende 3 min bij 4 °C. Gooi de supernatant weg.
- Spoel in 2 veranderingen van 1 mL van JC-1 (1X) verven buffer, centrifuge op 600 x g gedurende 3 min bij 4 °C. En gooi de supernatant weg.
- Stel cellen op in 0,5 mL van JC-1 (1X) verven buffer, analyseren via stroom cytometrie om groene en rode fluorescentie te detecteren. Wanneer het JC-1-polymeer wordt gedetecteerd, stelt u het excitatielicht in op 490 nm en het emissielicht op 530 nm. Wanneer het JC-1-polymeer wordt gedetecteerd, stelt u het excitatielicht in op 525 nm en het emissielicht op 590 nm.
5. Metingen van het zuurstofverbruik (OCR)
- Seed HepG2 cellen in celcultuur microplaten van 96-goed bij een dichtheid van 4500 cellen/100 μL per put. Zorg ervoor dat cellen bedekt met elke put na 24 uur.
- Voeg volgens eerdere literatuur13het juiste volume van de bereide reagentia toe aan de juiste injectiepoort . Poort A: 25 μL 1 μM oligomycine (ATP Coupler); Poort B: 25 μL 0,75 μM FCCP (Electronic Throttle Control, ETC Accelerator); Poort C: 25 μL 0,5 van μM antimycine A/rotenone (mitochondriale remmer A en mitochondriale remmer B).
- Bewaar de cartridge in een 37 °C incubator zonder CO2 tot het gebruiksklaar is.
- Maak een middelgrote verandering van de celplaat door het verwijderen van het lopende medium van elke put en toe te voegen aan de nieuwe DMEM. Het uiteindelijke volume voor elke put is 180 μL.
- Bewaar de celplaat in een couveuse van 37 °C zonder CO2 gedurende 1 uur voor de test.
- Neem OCR automatisch op via software.
- Open de OCR-software.
- Kies Cell Mito Stress Test Kit in de vervolgkeuzelijst Apps.
- Klik op de knop App starten.
- Klik op de knop Stresstest uitvoeren. Het scherm Celstresstestinstelling wordt weergegeven.
- Voert de volgende stappen uit:
- Voer het aantal cellen per put in de box Cell seeding # in.
- Voer de gemiddelde OCR in het vak Gemiddelde basale OCR in.
- Voer de uiteindelijke werkconcentratie voor elk reagens in en injecteer de reagentia.
OPMERKING: De gemiddelde basale OCR-waarde voor de cel moet zijn gedetecteerd voordat de optimalisatietest wordt uitgevoerd bij het optimaliseren voor celzaaiconcentratie. - Klik op de knop Volgende. Het scherm groepsinfo wordt weergegeven.
- Wijs een groep toe aan de niet-toegewezen putten door een kleur te kiezen en een naam te geven en vervolgens op de juiste putten te klikken.
OPMERKING: De verschillende groepen worden gedefinieerd als verschillende behandelingen voorafgaand aan het uitvoeren van de Cell Mito Stress Test. Alle putten van microplaten krijgen dezelfde reagens injecties wanneer de stresstest wordt uitgevoerd. - Klik op de knop Volgende. Het scherm StressTest Injection Layout wordt weergegeven.
- Klik op Start. De Stress Test wordt nu uitgevoerd op de Analyzer. Wanneer de run voorbij is, volg de punt s in de software, verwijder en gooi de cartridge en de celplaat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De mitochondriën cristae van HepG2 cellen blootgesteld aan β-HCH werden aanzienlijk beschadigd. Verspreide mitochondriën waren licht tot duidelijk uitgebreid, onregelmatig gevormd, en mitochondriale nok verdwenen met relatief abnormale mitochondriale architectuur (Figuur 1).
De gemiddelde mitochondriale groene fluorescentieintensiteit, die de mitochondriën vertegenwoordigt, daalde in HepG2-cellen die zijn blootgesteld aan β-HCH(figuur 2), evenals in ATP-niveaus (figuur 3). De fluorescentieintensiteit en het ATP-niveau daalden geleidelijk met toenemende blootstellingsconcentraties. Mogelijk veroorzaakte de vermindering van het mitochondriëngetal, of beschadigde mitochondriën, de waargenomen mitochondriale fluorescentieintensiteit, en bijgevolg de verminderde productie van ATP.
De resultaten van flow cytometrie toonden aan dat de verhoudingen van rood/groene JC-1 fluorescentie in de β-HCH-groep aanzienlijk lager waren dan in de controle(figuur 4). OCR van HepG2 cellen werd op een dosis-afhankelijke manier verminderd na β-HCH blootstelling. In vergelijking met de controlegroep werden de basale ademhalingspercentages, het protonlek, de maximale ademhalingscapaciteit en de ATP-omzet aanzienlijk verminderd in HepG2-cellen die zijn blootgesteld aan β-HCH (figuur 5). Deze resultaten gaven aan dat de mitochondriale functie werd aangetast na blootstelling aan β-HCH.
Alle instrumenten die bij deze experimenten werden gebruikt, werden weergegeven in supplementaire figuur 1.
Figuur 1: Representatieve TEM-micrografen van HepG2-cellen die zijn blootgesteld aan β-HCH (A: 6000×, B: 25000×). Typische schade toonde licht vergrote mitochondriën (M), elektron-lucent matrices, beschadigde cristae en losse organelle hiaten. M: mitochondriën. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Detectie van mitochondriale fluorescentie in HepG2-cellen behandeld met β-HCH13. De hoeveelheid, de locatie en de fluorescentieintensiteit van mitochondriën (A) werden aangetoond in fluorescentiemicroscopische beelden en kwantitatieve niveaus van mitochondriale fluorescentieintensiteit waren gebaseerd op mitochondriale groene fluorescentie per cel (B). *: P < 0,05, ***: P < 0,001 vergeleken met het besturingselement. Elk gegevenspunt was het gemiddelde ± SEM uit drie afzonderlijke experimenten. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: ATP-niveaus in HepG2-cellen13. ***: P < 0,001 vergeleken met het besturingselement, ##: P < 0,01 vergeleken met 10 ng/mL β-HCH.Data werden gepresenteerd als gemiddelde ± SEM van drie afzonderlijke experimenten. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: Effecten op mmp door JC-1 kleuring en stroom cytometrie13. (A) Stroom cytometriepercelen. De Y-as toonde de verhouding van rood tot groene fluorescentie. PE: Rode fluorescentie, FITC: Groene fluorescentie. (B).**: P < 0,01 in vergelijking met de controle. Elk gegevenspunt was het gemiddelde ± SEM uit drie afzonderlijke experimenten. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: Detectie van het cellulaire zuurstofverbruik (OCR). (A) Het effect van β-HCH op cellulaire OCR werd gemeten door de extracellulaire flux analyzer. De vier periodes vertegenwoordigen cellulaire basale ademhaling, ATP-synthase-geremde snelheid, maximale ontkoppelde snelheid, en rotenone-of antimycine-A-geremd tarief. B) Kwantitatieve histogrammen van OCR-resultaten voor uitgangssituatie, protonlek, maximale ademhalingscapaciteit, ATP-omzet en reservecapaciteit. *: P < 0,05, **: P < 0,01, ***: P < 0,001 vergeleken met het besturingselement. Elk gegevenspunt was het gemiddelde ± SEM uit drie afzonderlijke experimenten. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Aanvullende figuur 1: Alle instrumenten die in protocollen worden gebruikt. (A) Transmissieelektronenmicroscopie. (B) Laser scanning confocale microscoop. (C) Luminometer. (D) Multimode lezer. (E) Stroomcytometrie. (F) Extracellulaire fluxanalyser. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Cruciaal voor het succes van het detectieprotocol is het gebruik van een verscheidenheid aan experimentele methoden die zijn behandeld de studie van fenotype tot mechanisme. In deze studie werden HepG2-cellen gekweekt in DMEM met penicilline en streptomycine en 10% foetaal runderserum. Wanneer cellen 40-50% samenvloeiing bereikten, werden β-HCH (0, 10, 100 ng/mL) toegevoegd en voor 24 uur geïncubeerd. We gebruikten eerst TEM die de ultrastructurele veranderingen in hepatocyte toonde veroorzaakt door de representatieve OCPs, β-HCH, die de aantasting van de mitochondriënstructuur vertoonde (figuur 1). Verder werden fluorescerende kleuringstest (figuur 2), luciferase-luciferin ATP-test (Figuur 3), JC-1 -test (figuur 4) en cel mito stresstesttesttest (figuur 5), die gewoonlijk mitochondriën disfunctie beoordelen, uitgevoerd. Deze resultaten dienen als basis voor het onderzoek van de onderliggende moleculaire mechanismen.
In de bovenstaande methoden, onderzoekers moeten aandacht besteden aan voorzorgsmaatregelen in sommige stappen. Bijvoorbeeld, bij de voorbereiding van elektronenmicroscopiecel, moet het aantal cellen aandacht worden besteed, om slechte fixatie veroorzaakt door te groot weefsel of celblok te voorkomen. 5% glutaraldehyde fungeert als een fixatief, is het beter om niet meer dan een half jaar op te slaan om falen van detectie te voorkomen. Vaste monsters worden gedurende 24 uur of tot 1 maand voor de volgende stap op 4 °C geplaatst. Mitochondriale groene fluorescerende kleurstof is gemakkelijk te blussen, en licht moet worden vermeden om de fluorescentie te vertragen. In cellulaire ATP-niveaus testen, bij gebruik van een multifunctionele luminometer die chemiluminescentie kan detecteren, ondoorzichtige schoolbord of whiteboard 96-put platen moeten worden gebruikt om wederzijdse interferentie tussen aangrenzende gaten te voorkomen. ATP, specifiek decolleté van ATP in het monster is niet stabiel bij kamertemperatuur, en het experiment moet worden uitgevoerd bij 4 °C of op ijs. ATP kan stabiel zijn op ijs voor maximaal 6 uur. Bij de voorbereiding van jc-1 detectieoplossing kan JC-1 kleuringsbuffer (5X) worden toegevoegd nadat de JC-1 (200X) grondig is opgelost en gemengd met het ultrazuivere water, zodat JC-1 detectieoplossing gemakkelijk volledig kan worden opgelost. JC-1 sonde moet binnen 30 minuten worden geladen en gewassen en bij 4 °C of ijs worden bespaard om de vervolgtest te voltooien. In OCR-metingen moet de gemiddelde basale OCR-waarde voor de cel worden gedetecteerd vóór de optimalisatietest, bij het optimaliseren voor celzaaiconcentratie.
Er zijn enkele beperkingen van deze methoden. OCR-meting door een extracellulaire flux analyzer is beperkt tot celexperimenten. De detectie van mitochondriale functie is niet diep genoeg, omdat de metabole producten door mitochondriën niet worden gemeten, zoals het meten van vetzuren en metabolieten in TCA-cycli in hepatocyten. Bovendien kan de expressie van genen en eiwitten met betrekking tot levervetzuursynthese en -afbraak worden gedetecteerd door real-time polymerasekettingreactie en westelijke vlek, die de moleculaire aandoeningen van het metabolisme van vetzuren en mitochondriale disfunctie13verder kan bevestigen. Digitale beelden van mitochondriën kunnen worden vastgelegd in levende cellen onder confocale microscopie en geanalyseerd op veranderingen van mitochondriale morfologie op basis van form factor (FF) en aspect ratio (AR) waarden. De metabolische functie van mitochondriën werd ook beoordeeld door het meten van extracellulaire verzuring (ECAR) met behulp van een bio-enterische analyzer14. Sommige mitochondriale markerantilichamen (cytochrome c, HSP60, PHB1, SOD1, VDCA en STAT3) kunnen worden gemeten door westelijkevlek 4,,15,,16,17. De activiteiten van enzymen met respect voor de mitochondriale functie en de tricarboxylzuurcyclus (TCA), zoals malic dehydrogenase, beknopte dehydrogenase, citraatsynetase, ATPase, isocitrate dehydrogenase en α-ketoglutaraat dehydrogenase zijn aangetoond18. Functie van de elektronentransportketen in cellen en in geïsoleerde levermitochondriën wordt gedetecteerd met behulp van respirometrie met hoge resolutie19.
Onze protocollen richten zich op de detectie van mitochondriale morfologie, structuur, locatie, hoeveelheid, capaciteit, membraanpotentieel en ademhalingsketenfunctie. Deze zijn in principe in staat om mitochondriale functie te evalueren van verschillende aspecten. Bovendien zijn deze methoden eenvoudig en eenvoudig te bedienen. Mitochondriale functiestudies zijn op grote schaal uitgevoerd in verschillende gebieden, zoals lever20, darmmicrobiota21, pluripotente stamcellen22, en in sommige veel voorkomende ziekten, zoals type 2 diabetes23, de ziekte van Parkinson24 en inflammatoire darmziekte25. Er kunnen meer ziekten geassocieerd met mitochondriën, en onze protocollen kunnen nuttig zijn bij het onderzoek van relevante mechanismen. Daarnaast is er ook verder empirisch werk nodig op de omvang van de omvang van deze effecten met meer experimentele methoden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (Grant Nos. 81573174, 81570574); het Uitstaande Jeugdfonds van de provincie Jiangsu (SBK2014010296); het onderzoeksproject van het Chinese ministerie van Onderwijs (213015A); de Priority Academic Program Development van Jiangsu Higher Education Institutions (PAPD), het vlaggenschip van de belangrijkste ontwikkeling van jiangsu instellingen voor hoger onderwijs; en het Open Project Program van het State Key Laboratory of Environmental Chemistry and Ecotoxicology (KF2015-01).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Transmission electron microscope | FEI | Tecnai G2 Spirit Bio TWIN | High-contrast, high-resolution imaging, Low-dose observation and imaging, Low-temperature observation, Outstanding analytical performance, Automation for convenience and performance |
| Mito-Tracker Green | Beyotime | C1048 | Mito-Tracker Green is a mitochondrial green fluorescent probe that can be used for live cell mitochondrial-specific fluorescent staining. |
| Laser scanning confocal microscope | Zeiss | 700B | The design is compact, stable, light path is the shortest, high light precision, creative technology and sophisticated scanning technology together to produce a perfect 3-dimensional specimen image. |
| Enhanced ATP Assay Kit | Beyotime | S0027 | Enhanced ATP Assay Kit can be used to detect ATP (adenosine 5'-triphosphate) levels in common solutions, cells or tissues. Cells and tissue samples can be split to complete the sample preparation, detection sensitivity up to 0.1nmol / L, chemiluminescence can be sustained for 30 minutes. |
| Luminometer | Berthold | Centro LB 960 | Luminometer is chemiluminescence detector, the test sample itself can be light, do not need to stimulate. Luminometer is the instrument that detects chemiluminescence. |
| BCA Protein Assay Kit | Beyotime | P0012 | BCA Protein Assay Kit is one of the most commonly used methods for detecting protein concentrations. |
| Multimode reader | TECAN | InfiniteM200 | Multimode reader be used to detect protein consentration. |
References
- Rantakokko, P., et al. Persistent organic pollutants and non-alcoholic fatty liver disease in morbidly obese patients: a cohort study. Environ Health. 14, 79 (2015).
- Mrema, E. J., et al. Persistent organochlorinated pesticides and mechanisms of their toxicity. Toxicology. 307, 74-88 (2013).
- Dirinck, E., et al. Obesity and persistent organic pollutants: possible obesogenic effect of organochlorine pesticides and polychlorinated biphenyls. Obesity (Silver Spring). 19 (4), 709-714 (2011).
- Genini, D., et al. Mitochondrial dysfunction induced by a SH2 domain-targeting STAT3 inhibitor leads to metabolic synthetic lethality in cancer cells. Proc Natl Acad Sci U S A. , (2017).
- Korovljev, D., Trivic, T., Drid, P., Ostojic, S. M. Molecular hydrogen affects body composition, metabolic profiles, and mitochondrial function in middle-aged overweight women. Ir J Med Sci. , (2017).
- Gonzalez-Franquesa, A., Patti, M. E.
- Cheng, J., et al. Mitochondrial Proton Leak Plays a Critical Role in Pathogenesis of Cardiovascular Diseases. Adv Exp Med Biol. 982, 359-370 (2017).
- Cheville, N. F., Stasko, J. Techniques in electron microscopy of animal tissue. Vet Pathol. 51 (1), 28-41 (2014).
- Nazmara, Z., Salehnia, M., HosseinKhani, S. Mitochondrial Distribution and ATP Content of Vitrified, In vitro Matured Mouse Oocytes. Avicenna J Med Biotechnol. 6 (4), 210-217 (2014).
- Clapier, C. R., Iwasa, J., Cairns, B. R., Peterson, C. L. Mechanisms of action and regulation of ATP-dependent chromatin-remodelling complexes. Nat Rev Mol Cell Biol. , (2017).
- Reitman, Z. J., et al. Cancer-associated isocitrate dehydrogenase 1 (IDH1) R132H mutation and d-2-hydroxyglutarate stimulate glutamine metabolism under hypoxia. J Biol Chem. 289 (34), 23318-23328 (2014).
- Nelson, J. A. Oxygen consumption rate v. rate of energy utilization of fishes: a comparison and brief history of the two measurements. J Fish Biol. 88 (1), 10-25 (2016).
- Liu, Q., et al. Organochloride pesticides impaired mitochondrial function in hepatocytes and aggravated disorders of fatty acid metabolism. Sci Rep. 7, 46339 (2017).
- Tien, T., et al. High Glucose Induces Mitochondrial Dysfunction in Retinal Muller Cells: Implications for Diabetic Retinopathy. Invest Ophthalmol Vis Sci. 58 (7), 2915-2921 (2017).
- Dussmann, H., Perez-Alvarez, S., Anilkumar, U., Papkovsky, D. B., Prehn, J. H. Single-cell time-lapse imaging of intracellular O2 in response to metabolic inhibition and mitochondrial cytochrome-c release. Cell Death Dis. 8 (6), 2853 (2017).
- Jaiswal, M. K. Riluzole But Not Melatonin Ameliorates Acute Motor Neuron Degeneration and Moderately Inhibits SOD1-Mediated Excitotoxicity Induced Disrupted Mitochondrial Ca2+ Signaling in Amyotrophic Lateral Sclerosis. Front Cell Neurosci. 10, 295 (2016).
- Song, E., et al. Lenti-siRNA Hsp60 promote bax in mitochondria and induces apoptosis during heat stress. Biochem Biophys Res Commun. 481 (1-2), 125-131 (2016).
- Li, Y., et al. Tea tree oil exhibits antifungal activity against Botrytis cinerea by affecting mitochondria. Food Chem. 234, 62-67 (2017).
- Grunig, D., Felser, A., Bouitbir, J., Krahenbuhl, S. The catechol-O-methyltransferase inhibitors tolcapone and entacapone uncouple and inhibit the mitochondrial respiratory chain in HepaRG cells. Toxicol In Vitro. 42, 337-347 (2017).
- Mayor, F., et al. G protein-coupled receptor kinase 2 (GRK2) as an integrative signalling node in the regulation of cardiovascular function and metabolic homeostasis. Cell Signal. , (2017).
- Clark, A., Mach, N. The Crosstalk between the Gut Microbiota and Mitochondria during Exercise. Front Physiol. 8, 319 (2017).
- Robicsek, O., et al. Isolated Mitochondria Transfer Improves Neuronal Differentiation of Schizophrenia-Derived Induced Pluripotent Stem Cells and Rescues Deficits in a Rat Model of the Disorder. Schizophr Bull. , (2017).
- Akinrotimi, O., et al. Shp deletion prevents hepatic steatosis and when combined with Fxr loss protects against type 2 diabetes. Hepatology. , (2017).
- Rosa, A. I., et al. Novel insights into the antioxidant role of tauroursodeoxycholic acid in experimental models of Parkinson's disease. Biochim Biophys Acta. , (2017).
- Matondo, A., Kim, S. S. Targeted-Mitochondria Antioxidants Therapeutic Implications in Inflammatory Bowel Disease. J Drug Target. , 1-30 (2017).
