Summary
Abbiamo progettato un sensore di 16 canali EEG a secco-tipo che è invasivo, deformabile e riutilizzabili. Questo articolo descrive l'intero processo di produzione l'elettrodo EEG proposto alla elaborazione del potenziale evocato visivo (VEP) del segnale segnali misurati su un cuoio capelluto del mouse utilizzando un sensore di EEG multicanale non invasiva asciutto.
Abstract
Per ambienti di ricerca di cuoio capelluto EEG con topi di laboratorio, abbiamo progettato un sensore di EEG di 16 canali a secco-tipo che è invasivo, deformabile e riutilizzabili a causa dell'aspetto strutturale stantuffo-primavera-barilotto e resistenze meccaniche risultanti da metallo materiali. L'intero processo di acquisizione il VEP responses in vivo da un mouse è costituito da quattro passaggi: montaggio del sensore (1), la preparazione (2) animali, VEP (3) misura ed elaborazione del segnale (4). Questa carta presenta misurazioni rappresentative delle risposte VEP da più mouse con una risoluzione di segnale submicroniche-tensione e sub-cento risoluzione temporale di millisecondo. Anche se il metodo proposto è più sicuro e più conveniente rispetto ad altri precedentemente segnalati animali metodi incorporante di EEG, ci sono ancora problemi tra cui come migliorare il rapporto segnale-rumore e come applicare questa tecnica con animali liberi di muoversi. Il metodo proposto utilizza risorse facilmente disponibili e Mostra una risposta VEP ripetitiva con una qualità di segnale soddisfacente. Pertanto, questo metodo potrebbe essere utilizzato per studi sperimentali longitudinali e affidabile ricerca traslazionale sfruttando paradigmi non invasivo.
Introduction
Come il numero di pazienti con malattie degenerative senili del cervello come demenza, morbo di Alzheimer, sindromi parkinsoniane e ictus sono aumentati con l'invecchiamento della popolazione e una crescente speranza di vita, ha l'onere della società a lungo termine di queste malattie anche aumentato1,2,3. Inoltre, la maggior parte delle malattie dello sviluppo neurologico, come la schizofrenia e l'autismo, sono accompagnati da disturbi cognitivi e comportamentali che interessano tutta la vita di2,3,4 di un paziente. Per questo motivo, i ricercatori hanno lottato per migliorare la diagnosi, prevenzione, comprensione patologica, osservazione a lungo termine e nel trattamento delle malattie del cervello. Tuttavia, i problemi rimangono derivanti dalla complessità del cervello e le patologie di malattia non rivelati. Ricerca traslazionale può essere uno strumento promettente per identificare soluzioni perché consente il trasferimento della ricerca di base alle applicazioni cliniche entro un lasso di tempo più breve, a costi inferiori e con un più alto tasso di successo in neuroscienze campi5 ,6,7. Un altro obiettivo della ricerca traslazionale è quello di esaminare l'applicabilità nei soggetti umani, che richiede approcci sperimentali non invasivi in animali che consentono confronti con lo stesso metodo per gli esseri umani. Queste condizioni hanno portato a diverse esigenze significative per lo sviluppo di metodi di preparazione degli animali non-invasivo. Un metodo è l'elettroencefalografia (EEG), che rivela la connettività corticale cerebrale e attività è bidimensionale ad elevata risoluzione temporale, e che beneficia di un protocollo non invasivo. La registrazione di potenziale evento-correlati (ERP) è uno dei tipici paradigmi sperimentali che utilizzano EEG.
Numerosi studi autonomo non invasiva EEG metodi precedenti per il targeting soggetti gli esseri umani, considerando che i metodi invasivi, come impiantare viti ed elettrodi di tipo di palo, sono stati utilizzati in studi sugli animali8,9,10 , 11 , 12. la qualità del segnale e le caratteristiche di questi metodi dipendono in modo significativo l'invasività del posizionamento del sensore. Per successo ricerca traslazionale, Garner ha sottolineato utilizzando le stesse condizioni per studio sugli animali come quelli utilizzati per la ricerca umana13. Per la ricerca di base utilizzando animali, tuttavia, metodologie non invasive di EEG non sono prevalenti. Un metodo novello usando un sistema di sensori non invasivi del cuoio capelluto EEG concentrandosi su topi di laboratorio sarebbe uno strumento affidabile ed efficiente per la ricerca traslazionale che possa essere applicato ai paradigmi non invasivo per gli esseri umani, pure.
Numerosi studi del mouse EEG ha condotto il senso da commercializzare PCB (circuito stampato) basato su elettrodi multi-canale14,15,16. Anche se hanno adottato un metodo invasivo, avevano un numero limitato di canali (3-8), che ha reso più difficile da osservare la dinamica del cervello su larga scala. Inoltre, le applicazioni possono essere limitate dalla loro invasività e costi elevati. In un altro studio di ricerca, il KIST (Korea Institute of Science and Technology) ha sviluppato un elettrodo di film sottile di polyimide-basato 40 canale e attaccato a cranio17,18,19,20 di un mouse . Questo lavoro ha acquisito il maggior numero di canali del mouse EEG. Era, tuttavia, meccanicamente deboli e non facile da riutilizzare; di conseguenza, era inadeguato per osservazioni a lungo termine, portando a un segnale indebolito, possibilmente causato da una reazione immune. Nel frattempo, Troncoso e Mégevand acquisito un potenziale evocato sensoriale (SEP) sui teschi dei roditori con trenta-due elettrodi in acciaio inox protetti da un di21,di Poly(methyl methacrylate) (PMMA, vetro acrilico) griglia forata22 , 23. nonostante la loro qualità di segnale alto, gli elettrodi erano meccanicamente flessibili e tenera; di conseguenza, avevano difficoltà essendo applicata a esperimenti multipli. Inoltre, questo metodo era ancora minimamente invasivo. Sebbene questi metodi forniscono segnale di buona qualità, la superficie del cranio di un topo è limitata, il numero di elettrodi è pertanto limitato utilizzando un elettrodo di acciaio inox pole-tipo. Una serie di precedenti studi di EEG per topi ha mostrato diverse limitazioni. In questo studio, ci mostrerà un nuovo metodo per la misurazione EEG applicabile nella ricerca traslazionale pre-clinica, utilizzando un sensore di multi-canale a secco-tipo non invasivo.
Al fine di superare i limiti dei precedenti metodologie EEG animale, che includeva l'intrinseca complessità di preparazione degli animali, l'invasività, alti costi, sprechi e debole resistenza meccanica, abbiamo cercato di sviluppare un nuovo elettrodo che esibisce flessibilità, stato di tipo asciutto, le funzionalità multi-canale, non invasività e riutilizzabilità. Nel seguente protocollo, descriviamo il processo di misurazione registrazioni (VEP) potenziali evocate visive su un cuoio capelluto del mouse utilizzando un sensore di EEG asciutto, non invasivo, multi-canale. Questo metodo utilizza risorse facilmente disponibili, quindi abbassare la barriera di ingresso nella sperimentazione animale nel campo dell'ingegneria biomedica.
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Protocol
Gestione e cura degli animali ha seguito le linee guida istituzionale del Gwangju Institute of Science e Technology (GIST).
Nota: La procedura per l'acquisizione del segnale VEP da un topo in vivo è costituito da quattro passaggi: montaggio del sensore (1), la preparazione (2) animali, VEP (3) misura ed elaborazione del segnale (4).
1. sensor Assembly
- Preparare sedici perni per un elettrodo non invasivo.
Nota: Ogni elettrodo pin-tipo è costituito da tre parti: un pistone testa di sonda, una molla interna e un barile come mostrato in Figura 1a. La lunghezza di ciascun pin è di 13 mm e la lunghezza del pre-carico molla regolabile è di 1 mm. - Tagliare due pezzi di substrati di fibra di vetro (spessore: 1,5 mm) con la dimensione di 15 × 17 mm (larghezza × altezza).
Nota: Le funzioni di substrato dielettrico in fibra di vetro come un isolante, che separa i segnali multipli simultaneamente acquistato dal cuoio capelluto del mouse. - Praticare fori di sedici di diametro 1,2 mm ogni utilizzando una macchina di incisione di precisione, come mostrato in Figura 1 c.
- Stendere il coordinamento di sonda uniformemente ad un intervallo di 2 mm sul substrato piatto: + 7/0, + 2 /-2, + 2/0, + 2 / + 2, 0 /-4, 0 /-2, 0/0 (bregma), 0 / + 2, 0 / + 4, -2-3, -2 /-1, -2 / + 1, -2 / + 3, -4 /-2, -4/0 , -4 / + 2 (anteroposteriore e laterale con base di bregma, in mm)24,25,26.
- Stack due substrati e applicare una goccia di colla adesiva ad azione rapida tra strati di substrato, producendo un doppio strato di spessore di 3 mm sostenere sedici elettrodi paralleli e stabili durante l'acquisizione del segnale.
- Assemblare i sedici elettrodi sul substrato uno-ad-uno manualmente.
Nota: Il diametro del foro più piccolo si ferma ogni elettrodo alla stessa lunghezza. Ogni diametro del foro è leggermente inferiore al diametro più spesso di un barile all'interno di singolo pin (1,3 mm) che consente il fissaggio stretto degli elettrodi senza alcun allentamento. - Saldare e link parte di saldatura-Coppa finale di ciascun elettrodo verso il connettore di prova di tocco.
- Coprire e nascondere le giunzioni nude con tubazione degli strizzacervelli di calore per l'isolamento elettrico.
2. preparazione animale
- Anestetizzare il mouse con un'iniezione intraperitoneale (i.p.) di ketamine:xylazine 100:10 (100 mg / mL:10 mg/mL) miscela con la quantità di 10 µ l/g di peso corporeo.
Nota: Controllare che l'anestesia dell'animale è adeguata tirando una gamba o tweaking la coda prima di iniziare la preparazione. - Applicare unguento oculare per mantenere la cornea del mouse umida con un batuffolo di cotone.
- Rimuovere i peli intorno alla testa e le spalle con un tagliatore di capelli e quindi diffondere commercialmente disponibile crema depilatoria e tenerlo su quest'area per 3-4 min.
- Rimuovere il depilatorie applicata con una spatola e poi pulire il resto con salviettine umidificate applicando acqua diverse volte.
3. misura VEP
Nota: Il VEP intero processo di misura si è svolta in una gabbia di Faraday scura (larghezza x profondità x altezza: 61 × 61 × 60 cm).
- Testa del mouse sulla cornice stereotassica posizionando bar orecchio nel canale uditivo del mouse e stringerle proprio in luogo.
- Montare il sensore nel supporto elettrodo su misura (Figura 1b) e fissare il supporto del sensore sul telaio stereotassica, come mostrato nella Figura 1 d.
- Individuare il sensore flessibile di EEG, considerando sia la posizione dell'elettrodo di riferimento e la posizione di bregma27. Dopo di che, con molta attenzione abbassare il sensore in senso verticale in modo che i tuffatori allinearono elettrodo contatto del cuoio capelluto del mouse in modo uniforme sul margine ricurvo.
Nota: La distanza abbassata è inferiore a 1 mm, che è la lunghezza regolabile dello stantuffo. - Verifica che le impedenze sono nell'intervallo corretto da 100 kΩ a 2 MΩ. Riposizionare l'elettrodo quando qualsiasi valore di impedenza del pin è fuori la gamma28.
- Posizionare lo stimolatore foto 20cm lontano dagli occhi del mouse.
- Prima di iniziare l'esperimento, adattare il mouse per 10 minuti nella gabbia per adattamento visivo scuro scura.
- Impostare i parametri dei dispositivi sperimentali come segue: frequenza di campionamento: 500 Hz; Filtro notch: 60 Hz; Intervallo di Inter-stimolo: 10 s; Durata del lampo: 10 ms; numero di stimoli flash: 100 prove/soggetto.
Nota: La luce del flash è una luce bianca, illuminazione a LED che ha 550 ± 20% lx con una distanza di 20 cm.
- Impostare i parametri dei dispositivi sperimentali come segue: frequenza di campionamento: 500 Hz; Filtro notch: 60 Hz; Intervallo di Inter-stimolo: 10 s; Durata del lampo: 10 ms; numero di stimoli flash: 100 prove/soggetto.
4. le procedure di elaborazione del segnale di risposte VEP
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Epoching
- Per misura continua dei dati seriali, estrarre ogni epoca per creare singolo-trial VEP segmenti dal periodo pre-stimolo (-300 ms) per il periodo post-stimolo (600 ms), basati sull'inizio dello stimolo flash.
Nota: Poiché forniamo ripetutamente stimolo istantaneo oltre 100 prove per ogni soggetto, un totale di 100 epoche VEP per ogni mouse vengono estratti in questo passaggio. Epoching di EEG è un processo in cui specifica finestra temporale vengono estratti dai dati misurati in continuo del segnale EEG.
- Per misura continua dei dati seriali, estrarre ogni epoca per creare singolo-trial VEP segmenti dal periodo pre-stimolo (-300 ms) per il periodo post-stimolo (600 ms), basati sull'inizio dello stimolo flash.
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Ri di riferimento (media di riferimento)
- Calcolare la media dei segnali EEG attraverso tutti i elettrodo quattordici canali in ogni momento scegliere e quindi sottraggono il valore medio da ogni canale. Ripetere questa procedura per tutte le epoche VEP.
- Eseguire passa-banda di filtraggio del segnale da ~ 1-100 Hz mediante una risposta limitata di impulso (FIR) filtro.
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Correzione della linea di base
- Calcolare la media dei segnali EEG nel periodo pre-stimolo (periodo di previsione, -300 ~ 0 ms) per ogni canale, quindi sottrarre la media da ciascun punto nella forma d'onda (-300 ~ 600 ms). Questa regola l'asse di ampiezza delle risposte VEP per facilitare l'osservazione dei cambiamenti dell'onda di cervello dopo stimolazione. Ripetere questo passaggio per tutte le epoche VEP.
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Grand VEP risposte
- Media le epoche VEP singolo-trial per creare singolo-oggetto media di forme d'onda VEP per ogni canale. Quindi, calcolare la media di grand ensemble delle risposte VEP per ogni canale per quanto riguarda tutti i soggetti.
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Representative Results
Abbiamo calcolato la media di ensemble di risposte VEP da undici topi come mostrato nella Figura 2. Questo risultato mostra le risposte VEP ottenute attraverso questo esperimento dal periodo pre-stimolazione (-300 ms) per il periodo post-stimolazione (600 ms), come la stimolazione è dato al tempo 0 s. È evidente che il segnale oscilla solo per un po' di tempo (meno di 300 ms) dopo la stimolazione, mentre il segnale si stabilizza costantemente durante il periodo post-stimolazione. Inoltre, i quattordici canali possono essere classificati in diversi gruppi sulla base delle risposte VEP, rivelando morfologie simili e modelli29. Questo metodo fornisce le comprensioni nella comprensione delle dinamiche con rispetta alle qualità temporale e spaziale dell'onda di cervello.
Figura 1 : Mouse EEG sensore Descrizione e istruzioni per l'uso del sensore del mouse EEG. (a) 16 Elettrodo EEG a perno (b) su misura portaelettrodo (c) il perno di matrice di sedici elettrodi mappa; l'elettrodo di terra (GND) e l'elettrodo di riferimento (Ref) è evidenziato in nero (d), in vivo del mouse EEG misura mediante il sensore proposto e titolare su misura sulla cornice stereotassica. Questa figura è stata modificata da 29. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Evocati visivi rappresentativi potenziali risultati sperimentali da quattordici canali. Grand Media segnali potenziali evocati visivi di tutti gli undici oggetti e tutte le prove del periodo pre-stimolazione (-300 ms) per il periodo post-stimolazione (600 ms). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
In primo luogo ci siamo concentrati sul design del sensore, priorità praticità riducendo al minimo le procedure chirurgiche complesse. Il sensore di EEG deformabile è composto da sedici perni: quattordici per registrazione, uno per terra e l'ultimo per elettrodi di riferimento. Ogni elettrodo ha la struttura di stantuffo-primavera-barilotto, che si applica deformabilità sulla superficie di contatto dell'elettrodo, quindi facilitano l'acquisizione del segnale stabile e uniforme dal cuoio capelluto del mouse curvo e tenera. Considerando il benessere degli animali, abbiamo cercato di ridurre al minimo il dolore sostenuto dalla molla alleviando la pressione applicata alla pelle allargando l'area di contatto della pelle-elettrodo interfaccia29.
I singoli pin composto dell'intero multi-canale elettrodo può variabili specifiche per spessore, lunghezza, tipi di stantuffo e forza a molla. Queste varie opzioni dovrebbero essere contemplate per progettare l'elettrodo per alleviare le sofferenze del soggetto. Inoltre, la matrice di mappa di pin e il numero di elettrodi può essere modificati secondo lo scopo dell'esperimento. Il substrato di supporto e fibra di vetro dell'elettrodo può essere fatta da altre metodologie e disegni differenti, ad esempio un metodo30,31di stampa 3D.
In generale, l'impedenza di un elettrodo asciutto ha mostrato più alta impedenza e causando una qualità di segnale abbassata rispetto ad un elettrodo bagnato32,33. Abbiamo potuto confermare le posizioni appropriate di sedici elettrodi sotto la forza anche sul cuoio capelluto attraverso il controllo l'impedenza entro un intervallo corretto da 100 kΩ a 2 MΩ: la gamma era comparabile con l'elettrodo di EEG a secco-tipo commercializzato per un essere umano33 . L'impedenza i valori compresi tra 296.2 KΩ 1,522.6 KΩ (media ± DS: 825.2 ± 443,2 KΩ). Nel frattempo, la pressione meccanica del cuoio capelluto causata da molle interne eventualmente abbassato di impedenza dell'elettrodo, di conseguenza, questo può influenzare il segnale miglioramento34. Anche se è possibile migliorare la qualità del segnale attraverso l'applicazione di gel conduttore sulla superficie dei teste di spillo, ciò può causare interferenze di segnale tra perni adiacenti a causa della zona del cuoio capelluto del mouse confinati.
Al fine di dimostrare l'utilità di in vivo del sensore EEG recentemente progettato, abbiamo implementato il paradigma registrazione potenziali evento-correlati VEP, che è uno dei paradigmi tipici passivi EEG. Anche se abbiamo misurato VEP segnali sul cuoio capelluto del mouse senza qualsiasi gel bagnato lo svolgimento, il segnale era paragonabile al precedente risultato VEP di epicranica EEG dal mouse stesso specie27. Durante il VEP processo di misurazione, la messa a terra di tutte le parti individuali, come il telaio stereotassica e pinza porta elettrodo, è un processo essenziale per ridurre al minimo rumore elettrico proveniente dall'esterno. Abbiamo inoltre mantenuto topi per 10 min prima di iniziare l'esperimento VEP, per adattamento visivo scuro e adattamento sensoriale primaria35,36.
In conclusione, dimostriamo un protocollo sperimentale ripetibile per fornire potenziale evocato visivo utilizzando il sensore di cuoio capelluto EEG del secco mouse multi-canale non invasivo. Il metodo qui descritto è invasivo, pertanto non richiede alcun ulteriore preparazione chirurgica, nonché riducendo i tempi per la preparazione di gel conduttore, se vengono utilizzati gli elettrodi a secco-tipo. Inoltre, un sensore che possiede elettrodi multipli permette di misurare simultaneamente le onde di cervello da aree diverse del cuoio capelluto. Il metodo proposto per un sensore di EEG non invasivo del cuoio capelluto può contribuire ad aree di ricerca traslazionale collegamento risultati di scienza di base agli studi umani con risultati comparabili, affidabili ed efficienti. In definitiva, un approccio con queste caratteristiche significative offre convenienza e sicurezza sia per gli utenti e soggetti. Ancora, ci sono ulteriori problemi di ricerca, ad esempio migliorando la qualità del segnale, confrontando la qualità del segnale con altre metodologie di acquisizione di onde cerebrali e l'applicazione di questi metodi nel mouse liberamente commovente. Inoltre, il metodo presentato ha ulteriori possibilità per applicazione a preclinici piccolo animale EEG studi in vivo, analisi di rete di cervello su larga scala, sensoriali evocati potenziali registrazioni e combinazioni con stimolazione del cervello o metodi di registrazione elettrofisiologica superficie profonda.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato in parte dalla GIST Research Institute (GRI), il progetto di collaborazione di ricerca GIST-Caltech attraverso una sovvenzione fornita da GIST nel 2017. Supportato anche da assegno di ricerca (NRF-2016R1A2B4015381) della nazionale Research Foundation (NRF) finanziato dal governo coreano (MEST) e dal programma di ricerca di base di KBRI attraverso Corea del Brain Research Institute finanziato dal Ministero della scienza, ICT e futuro Pianificazione (17-BR-04).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine 50 Inj. (Vial) | Yuhan | - | Ketamine HCl 57.68 mg |
| Zoletil 50 Inj. | Virbac | - | Tiletamina 125 mg/ Zolazepam 125 mg |
| Rompun 2% Inj. | BAYER | - | Xylazine hydrochloride 23.32mg/mL |
| Hycell solution 2% | Samil | - | Hydroxypropylmethylcellulose 20 mg |
| Puralube Vet Ointment 3.5 mg | Pharmaderm | - | |
| Saline solution Inj. | JW Pharmaceutical | - | NaCl 9 g/1000 mL |
| Veet Hair Removal Cream – Legs & Body - Sensitive Skin | Reckitt Benckiser | - | depilatory |
| Skins - Surgical Skin Marker | Surgmed | S-3000 | STERILE - Multi-Tip Fine Marker with ruler and label set |
| Stainless Steel Micro Spatulas | HEATHROW SCIENTIFIC | HS15907 | One Round Flat End, 2L x 5/16W" |
| cotton swap | |||
| Stereotaxic, Desktop Digi Single | RWD Life Science | 68025 | |
| Mouse Adapter | RWD Life Science | 68010 | |
| Ear Bar for Mouse Non-Rupture | RWD Life Science | 68306 | |
| Mitsar-EEG 202-24 | MITSAR | amplifier | |
| EEGStudio EEG acquisition software | MITSAR | ||
| White flash stimulator | MITSAR | MITSAR Flash stimulator | |
| BCI2000 software | Schalk lab | ||
| g.USBamp | g.tec | 0216 | |
| g.Power-g.USBamp | g.tec | 0247 | |
| 441 style straight body Touch Proof connector | PlasticsOne | 441000PSW080001 | 441 - 000 PSW 80" (BLACK) |
| Standard probe | LEENO | SK100CSW | http://www.globalinterpark.com/detail/detail?prdNo=2114277241&dispNo=001851006012 |
| Precision engraving machine tools | TINYROBO | TinyCNC-6060C | |
| Heat shirink | 3M | FP301 |
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