Summary
Mitokondrier inneholder flere flavin-avhengige enzymer som kan produsere reaktive oksygen arter (ROS). Overvåking ROS er utgivelse fra enkeltområder i mitokondrier utfordrende på grunn av uønskede siden reaksjoner. Vi presenterer en enkel og rimelig metode for direkte vurdering av innfødte priser for ROS utgivelsen renset flavoenzymes og microplate fluorometry.
Abstract
Det har blitt rapportert at mitokondrier kan inneholde opptil 12 enzymatisk kilder til reaktive oksygen arter (ROS). Et flertall av disse områdene omfatter flavin-avhengige åndedretts komplekser og dehydrogenases som produserer en blanding av superoxide (O2● -) og hydrogen peroxide (H2O2). Nøyaktig kvantifisering av ROS produserer potensialet for enkeltområder i isolerte mitokondrier kan være utfordrende fordi antioksidant forsvarssystemer og siden reaksjoner som også O2● -h2O2. Bruk av uspesifikke hemmere som kan forstyrre mitokondrie bioenergi kan også skade målinger ved å endre ROS utgivelse fra andre områder i produksjonen. Her presenterer vi en enkel metode for samtidig måling av H2O2 løslate og nikotinamid adenine dinucleotide (NADH) produksjon av renset flavin knyttet dehydrogenases. For vårt formål her, har vi brukt renset pyruvate dehydrogenase kompleks (PDHC) og α-ketoglutarate dehydrogenase komplekse (KGDHC) av svin hjertet opprinnelse som eksempler. Denne metoden gir et nøyaktig mål på innfødt H2O2 utgivelse priser av individuelle områder av produksjonen ved å eliminere andre potensielle kilder av ROS og antioksidant. I tillegg gir denne metoden en direkte sammenligning av forholdet mellom H2O2 løslate og enzym aktivitet og screening av effektiviteten og selektivitet av hemmere for ROS produksjon. Samlet kan denne tilnærmingen gi detaljert vurdering av innfødte priser av ROS versjonen for individuelle enzymer før gjennomføre mer sofistikert eksperimenter med isolert mitokondrier eller permeabilized muskel fiber.
Introduction
Det endelige målet med metabolisme til næringsstoff er å gjøre adenosin trifosfat (ATP). I pattedyrceller skjer dette i mitokondrier, dobbel-membraned organelles som konverterer energi lagret i karbon til ATP. Produksjon av ATP begynner når carbon er forbrenning av mitokondrier danner to elektron bærere, NADH og flavin adenine dinucleotide (FADH2)1. NADH og FADH2 er deretter oksidert av flere delenhet åndedretts komplekser I og II, henholdsvis, og frigjort elektronene er fraktet til terminal elektron acceptor molekylær oksygen (O2) på komplekse IV1. Thermodynamically gunstige "nedover" overføring av elektroner til O2 på slutten av kjeden er koplet til eksport av protoner til intermembrane plass av komplekser jeg, III og IV. Dette skaper en transmembrane elektrokjemiske gradering av protoner (proton motiv kraft), en midlertidig form for Gibbs fri energi som er tappet av komplekse V lage ATP2. Elektron overføring reaksjoner i mitokondrier er ikke perfekt er kombinert til ATP produksjonen. På forskjellige steder i Krebs syklus og respiratoriske kjeden, kan elektroner tidlig samhandle med O2 skjemaet ROS3. Biologisk relevante ROS generert av mitokondrier er O2●- og H2O2. Selv om O2● - ofte proksimale ROS av mitokondrier, er det nå tydelig at nettsteder produksjon danne en blanding av O2●- og H2O2, som er forbundet med gratis radikale kjemi av flavin protese grupper4,5. På høye nivåer, kan ROS være farlig, skade biologiske bestanddeler kreves for celle-funksjonen som resulterer i oksidativt nød6. Men på små mengder oppfylle mitokondrie ROS viktig signalnettverk funksjoner. For eksempel har H2O2 utgivelse fra mitokondrier vært innblandet i å kontrollere T-celle aktivering, stress signalering (f.eks, induksjon av Nrf2 signalveier), induksjon av celle spredning og differensiering, insulin signalering og utgivelsen og fôring atferd7. Betydelig fremgang har blitt gjort forstå signalnettverk funksjon av ROS. Imidlertid viktig spørsmål fortsatt i forhold som enzymer i mitokondrier tjene som de viktigste kildene og hvordan produksjon er kontrollert.
ROS utgivelsen av et nettsted produksjon avhenger av flere faktorer: 1) konsentrasjonen av elektron donerer området, 2) redoks staten elektron donerer området, 3) tilgang til oksygen, og 4) den konsentrasjon og type oksidasjon substrat3, 8 , 9. i mitokondrier, andre faktorer som konsentrasjonen av NADH og membran potensielle styrke også påvirke ROS produksjon8,10. For eksempel øker hastigheten på O2●/H2O2 produksjon av renset PDHC eller KGDHC med økende NADH tilgjengelighet5,11. I dette scenariet strømme elektroner bakover fra NADH til Kjepphest center i E3 delenhet i PDHC eller KGDHC, stedet forO2● -h2O2 produksjon12. Tilsvarende har levering av NAD+ motsatt effekt, redusere ROS utgivelse fra KGDHC12. Dermed kan kontroll inngang eller utgang av elektroner fra nettsteder ROS produksjon endrehvor mye O2● -h2O2 er dannet. For eksempel blokkerer E2 delenhet i PDHC eller KGDHC med CPI-613 en lipoic syre analog, resulterer i en nesten 90% nedgang i O2● -h2O2 produksjon13. Lignende resultater kan oppnås med kjemiske S-glutathionylation katalysatorer, diamide og disulfiram, som nesten avskaffe O2●/H2O2 produksjon av PDHC eller KGDHC via Bøyning av glutation på e 2 delenhet14. The trade-off for blokkering elektron strømme gjennom E2 delenhet i PDHC og KGDHC er en nedgang i NADH produksjon som reduserer ROS dannelsen av elektronet transportkjeden (f.ekskomplekse III). Dette kan også redusere ATP produksjonen av elektronet transportkjeden. Samlet kan blokkerer elektron inngang til områder av ROS produksjon være en svært effektiv metode for å kontrollere O2● -h2O2 produksjon.
Mitokondrier kan inneholde opptil 12 potensielle O2● -h2O2 kilder6. De fleste av disse nettstedene er flavin inneholder enzymer som genererer en blanding av O2●- og H2O2. Bruk av ulike substrat og hemmer kombinasjoner har tillatt for identifikasjon som åndedretts komplekser og mitokondrie dehydrogenases tjene somhøy kapasitet O2● -h2O2 danner områder i forskjellige vev3. PDHC og KGDHC har vist seg å fungere som høy kapasitetO2● -h2O2 utslipp områder i muskler og leveren mitokondrier13,15. Beholdes imidlertid noen problemer i forhold til undersøkelse av O2● -h2O2 danner potensielle for enkeltområder i mitokondrier og virkningen som er ulike substrat og hemmer kombinasjoner på aktiviteter enzymer. Dette er på grunn av tilstedeværelsen av uønskede side reaksjoner (f.eks, dannelsen avO2● -h2O2 av nettsteder enn enzymet rundt), forurensende endogene næringsstoffer (f.eksfatty syrer) eller organeller (f.eks, peroxisomes også danner O2● -h2O2), og bruk av hemmere som mangler selektivitet og/eller bruk av forbindelser som ikke fullt den ROS produksjon. Visse hemmere kan også forandre mitokondrie bioenergi og retningen på elektron, og dette endrer ROS utgivelsen fra andre nettsteder av produksjon og forundrer resultater. Absolutt priser for O2● -h2O2 utgivelse fra enkeltområder i mitokondrier er også vanskelig å kvantifisere på grunn av den høye konsentrasjonen av O2●- og H2O2 eliminere enzymer i feltet matrise og intermembrane. Derfor kan eliminering av noen konkurrerende reaksjoner som kan forstyrre O2● -h2O2 løslate målinger være nyttig å identifiserehøykapasitets O2● -h2O2 danner nettsteder.
Her presenterer vi en enkel metode som tillater samtidig undersøkelse av O2● -h2O2 produksjon og NADH dannelse av renset flavin-avhengige dehydrogenases. Ved hjelp av renset enzymer, kan uønsket ROS danner siden reaksjoner og ROS nedverdigende enzymer fjernes slik at en mer nøyaktig måling av innfødte O2● -h2O2 produksjon priser for individuelle flavoenzymes. Denne metoden kan brukes til direkte sammenligne den O2● -h2O2 danner kapasitet av ulike renset dehydrogenases eller skjermen potensielle områdespesifikke hemmere forO2● -h2O 2 utgivelse. Til slutt, måle O2● -h2O2 og NADH Produksjonen samtidig kan gi en sanntids vurdering av forholdet mellom enzym aktivitet og ROS utgivelsen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. kjemikalier og renset enzymer
- Skaffe følgende materialer: PDHC og KGDHC av svin hjertet opprinnelse (eller en annen renset mitokondrie flavoenzyme); H2O2 (30% løsning), pyruvate, α-ketoglutarate, NAD+NADH, CoASH, Thiamin pyrophosphate (TPP), mannitol, HEPES, sukrose, EGTA, 3-metyl-2-oxo valeric acid (KMV), superoxide dismutase (TORV), pepperrotperoksidase (HRP), 10-acetyl-3,7-dihydroxyphenoxazine reagens (AUR) og CPI-613.
2. planlegge analysen og forberedelse av reagenser
- Definere analysen etter tabell 1 i en 96-brønns plate.
Merk: Det totale volumet for hver reaksjon er 200 µL. lager konsentrasjoner justeres slik at 20 µL til reagensen legges i hver brønn. Dette sikrer rask tillegg av kofaktorer og underlag til hver reaksjon godt før du starter analysen. - Forberede reaksjon buffer med 220 mM mannitol, 70 mM sukrose, 1 mM EGTA og 20 mM HEPES (pH 7.4 med HCl).
Merk: Dette kan endres avhengig av de fysiske egenskapene til ulike renset enzymer. - Undersøke den renset KGDHC eller PDHC for forurensning bruke enzym aktivitet analyser14,16,17 eller ved immunoblot eller Coomassie flekken5.
- Forberede reagenser i reaksjon bufferen som de arbeider løsning konsentrasjonene i tabell 1.
- Lagre alle reagenser som 1 mL dele på 20 ° C. Lagre pyruvate og α-ketoglutarate ved-80 ° C i 100 µL dele å hindre spontan fornedrelse auto-oksidasjon og gjentatte fryse-tine.
- Forberede AUR reagensen master aksjer i 1 mL av DMSO og deretter fortynne til 100 µM reaksjon buffer. Lagre beskyttet mot lyset.
Merk: Her 100 µM arbeider løsningen er laget fersk hver 2 til 3 uker og beskyttet mot lyset.
3. sette opp malen analysen
- Definere analysen prosedyren på en monokromatisk microplate leseren med dobbelt måling evnene.
- Definere lesing prosedyren ved å velge "PROTOCOL". Klikk "Prosedyre".
- Angi "Temperatur" 25 ° C (figur 1A).
- Klikk "START KINETIC" for å angi Les betingelser (figur 1A). Angi klokkeslett og antall lese intervaller/eksperimenter.
- Klikk "lese" (figur 1B).
Merk: Utvalg leses fra topp-posisjon med en gevinst på 50. Tid: 5 min, lese på 30-s intervaller. Kanal 1: Resorufin fluorescens - eksitasjon/utslipp = 565 nm:600 nm, bølgelengde bredden på 13,5 nm. Kanal 2: NADH autofluorescence - eksitasjon/utslipp = 376 nm:450 nm, bølgelengde bredde 20 nm. - Under "READ", Velg brønner til skjerm (f.eksA1-A4 og B1-B4).
- Velg "END KINETIC".
4. standard kurver
- Tine reagenser og lagre på is inntil nødvendig.
-
NADH standardkurve (figur 2A)
- Forberede arbeider løsningene NADH i området konsentrasjon på 0,5-10 mM reaksjon buffer.
- Legge til 20 µL dele fra hver NADH arbeider løsning konsentrasjon brønner som inneholder 180 µL reaksjon buffer. Siste konsentrasjonen av NADH i hvert tillegg er 0,05-1 mM.
- Klikk "Lese" og angi eksitasjon/utslipp = 376 nm:450 nm, bølgelengde bredde 20 nm.
Merk: Dette er et sluttpunkt skrivebeskyttet - kinetisk parametere kreves ikke.
-
AUR standardkurve (figur 2B)
- Forbered arbeidet bestandene av Hydrogenperoksid i reaksjon buffer; lager konsentrasjoner spenner fra 200-4000 nM.
- Legge til 120 µL reaksjon bufferen i hver brønn.
- Legge til 20 µL av HRP (arbeider lager konsentrasjon = 30 U/mL, siste konsentrasjon i brønnen = 3 U/mL), 20 µL av TORV (arbeider lager konsentrasjon = 250 U/mL, siste konsentrasjon i brønnen = 25 U/mL), og 20 µL AUR (arbeider lager konsentrasjon = 100 µM siste konsentrasjon i brønnen = 10 µM) til hver også inneholder reaksjon-bufferen.
- Legge til 20 µL av hver H2O2 arbeider lagerløsning hver godt som inneholder bufferen og analysen reagenser. Siste reaksjon volumet er 200 µL siste konsentrasjonen av H2O2 i hver brønn er 20-400 nM.
- Inkuber platene i 1 min i plate leseren på 25 ° C.
- Klikk "Lese" og angi eksitasjon/utslipp = 565 nm/600 nm, bølgelengde bredden på 13,5 nm. Merk at dette er et sluttpunkt skrivebeskyttet - kinetisk parametere kreves ikke.
5. måle O2● - h2 O2 Release og NADH produksjon av KGDHC og PDHC
- Se tabell 1 for ordre tillegg av ulike reagensene, konsentrasjonen av hver fungerende løsning, og volumet lagt til hver brønn.
- Legge til 40 µL reaksjon bufferen i hver brønn. For analyser KMV eller CPI-613, legge 20 µL av bufferen i hver brønn.
- Legge til 20 µL av PDHC eller KGDHC (arbeider lager av 1 U/mL, siste konsentrasjon per brønn = 0,1 U/mL) i hver brønn.
- Inkuber PDHC og KGDHC ved 25 ° C i 2 minutter.
- Legge til 20 µL av KMV (arbeider lager = 100 mM, siste konsentrasjon = 10 mM) eller 20 µL av CPI-613 (arbeider lager konsentrasjon = 1,5 mM, siste konsentrasjon = 150 µM) (tabell 2).
Merk: Dette trinnet kan utelukkes hvis hemmere ikke brukes for analyser. - Inkuber for 1 min på 25 ° C.
Merk: Dette trinnet kan utelukkes hvis hemmere ikke brukes for analyser. - Legge til 20 µL av HRP (arbeider lager konsentrasjon = 30 enheter/mL, siste konsentrasjon i brønnen = 3 enheter/mL) og 20 µL av TORV (arbeider lager konsentrasjon = 250 enheter/mL, siste konsentrasjon i brønnen = 25 enheter/mL) i hver brønn.
- Legge til 20 µL av coenzyme (arbeider lager konsentrasjon = 1 mM, siste konsentrasjon = 0,1 mM), 20 µL av TPP (arbeider lager konsentrasjon = 3 mM, siste konsentrasjon = 0.3 mM), og 20 µL nad+ (arbeider lager konsentrasjon = 10 mM, siste konsentrasjon = 1 mM) til hver w ell.
- Fjern AUR reagensen fra beskyttende tinfoil dekket og tilsett 20 µL i hver brønn.
- Legge til 20 µL av pyruvate (arbeider lager konsentrasjon fra 1-100 mM, siste konsentrasjon for analyser = 0.1-10 mM) brønner som inneholder PDHC og α-ketoglutarate (arbeider lager konsentrasjon fra 1-100 mM, siste konsentrasjon for analyser = 0.1-10 mM) til brønner som inneholder KGDHC.
- Klikk "Lese" for å starte kinetic måling.
6. dataanalyse
- Hold nede "CTRL"-knappen på tastaturet og klikk brønner for å generere en graf som inneholder alle kinetic mål tilsvarer kanal 1 (figur 3A).
- Klikk "data" i view-ikonet i øvre høyre hjørne for rå verdier for relativ fluorescens enheter (RFU) målt på ulike tidspunkt points (figur 3B).
- Eksportere verdiene for analyse (tabell 3).
- Klikk "Graph" rullegardinmenyen på øverst til høyre (figur 3B) til RFU verdier tilknyttet fluorescens kanalen 2.
- Gjenta 6.1 til 6.3 for kanal 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 3A gir RFU samlet under samtidig måling av H2O2 og NADH produksjon av renset KGDHC representant spor. RFU rådata for hvert tidsintervall er avbildet i figur 3B. RFU rådata eksporteres deretter for analyse. Ved å ekstrapolere fra standard kurver i figur 2, kan den absolutte mengden NADH og H2O2 dannet ved hver måling i 5-min periode bestemmes. Et eksempel på denne beregningen er gitt i tabell 3. Når mengden NADH og H2O2 dannet av KGDHC eller PDHC på ulike intervaller har blitt bestemt, verdiene kopieres og angitt i en grafisk/statistisk programvare for videre analyse. Bruke XY diagramtype analysen, kan mengden NADH (µmol) og H2O2 (pmol) dannet av KGDHC eller PDHC tegnes som en funksjon av tid (figur 4A). Med disse verdiene, kan frekvensen av NADH og H2O2 formasjon under substrat oksidasjon også beregnes. Som vist i figur 4B, viser KGDHC og PDHC forskjellige egenskaper i NADH og H2O2 danner evne.
En gang det er konstatert at KGDHC og PDHC er enzymatisk aktive og NADH og H2O2 formasjonen kan spores samtidig, ROS løslate egenskaper og enzym aktiviteter kan måles. Vi valgte å sammenligne KGDHC og PDHC siden de er svært homologe grunnleggende struktur og er dokumentert for å være høy kapasitet nettsteder for ROS produksjon5. Figur 5 og figur 6 demonstrere avhengighet av NADH og H2O2 produksjon på underlaget konsentrasjon. PDHC er lett mettet av lave mengder underlaget med hastighet på NADH og H2O2 produksjon nådd sitt maksimum på 0,1-0,5 mM pyruvate. KGDHC, derimot, viser gradvis øker i NADH og H2O2 produksjon med økende α-ketoglutarate (figur 5). Dette viser at KGDHC og PDHC, selv om svært homologe i grunnleggende struktur, har ulike kinetic egenskaper i forhold til hvor mye underlaget er nødvendig for å få maksimal ROS utgivelsen. Figur 5 også viser at H2O2 utgivelse fra KGDHC korrelerer sterkt med NADH produksjon og underlaget tilgjengelighet. PDHC på den andre har ikke samme kinetiske egenskaper. KGDHC og PDHC også variere i forhold til NADH og O2● -h2O2 danner kapasitet når NAD+ konsentrasjon er variert (figur 6).
Ved å utnytte fordelene av samtidige målingen av NADH og H2O2, kan potensielle områdespesifikke hemmere for ROS produksjon bli vist. Dette kan hjelpe bestemme mengden av inhibitor som kreves for å få maksimal hemming av H2O2 løslate. I tillegg ved å måle NADH produksjon samtidig, kan webområdet for hemmer handling så vel som kilden til ROS identifiseres. Tidligere studier har vist at den α-ketoglutarate analoge, KMV, er svært effektiv på å hemme ROS utgivelse fra KGDHC (≥ 90% hemming)13,15. Vi viste også at CPI-613 en lipoic syre analoge som blokkerer dihydrolipoamide av E2 delenhet i PDHC og KGDHC, kan også hemme ROS utgivelsen fra enten komplekset av ~ 90%13,14. Stedet for handling for KMV og CPI-613 vises i figur 7. CPI-613 er en svovel inneholder molekylet og det anbefales derfor at thiol-rik reduksjonsmidler (dithiothreitol; DTT) eller proteiner (albumin) er utelatt fra prosedyren13. Figur 7 viser at både KMV og CPI-613 var begge svært effektiv på å begrense både NADH og H2O2 av KGDHC. Likeledes, CPI-613 helt avskaffet H2O2 utgivelse fra PDHC (figur 7). Samlet viser disse resultatene at KMV og CPI-613 er svært effektive hemmere for H2O2 utgivelse og kan dermed brukes til eksperimenter med isolert mitokondrier. Slike en skjerm ville være svært gunstig for andre potensielle ROS-danner enzymer siden det gir en direkte vurdering av effektiviteten og selektivitet av ulike hemmere på renset flavin inneholder dehydrogenases. Samtidig måling av NADH har også den ekstra fordelen at innledende identifisering av potensielle kilde til ROS innen et enzym komplekse. Figur 7 gir en skildring av katalytisk mekanismen for KGDHC, som er svært homologe til PDHC. Observasjon at KMV og CPI-613 som blokkerer E-1 og E2 delenhet i KGDHC, nesten helt avskaffet både H2O2 og NADH produksjon, bekrefter at E3 underenheten, sannsynligvis i Kjepphest, ROS kilden 18. CPI-613 utøvde en lignende effekt på PDHC bekrefter at prinsippet området for H2O2 løslate er E3 delenhet18. En lignende tilnærming kan brukes for andre dehydrogenases. Dette vil kreve identifikasjon av hemmere som blokkerer elektron strømme gjennom ulike deler av et enzym komplekse.
Figur 1 : Representant skjermbilder for analysen oppsett. (A) skildring av prosedyren angitt for kinetic måling av endringer i NADH og resorufin fluorescens. (B) definere parameterne fluorescens for analysen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Representant standard kurver for NADH og resorufin fluorescens. Kurver benyttes for å anslå NADH og O2● -h2O2 produksjon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Representant spor for rå RFU data samlet inn under analysen. (A) kurver for hver brønn som ble lest under analysen. Plate Vis kurver genereres ved holde nede CTLEN og klikke hver brønn som blir lest. (B) For dataeksport, klikkes DATA under visning til å generere en tabell som inneholder representant RFU verdiene. Eksporter REGNEARKET deretter klikket for å eksportere rå resultatene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 : Direkte sammenligning av H2 O 2 og NADH danner priser KGDHC og PDHC. (A) samtidig måling av H2O2 og NADH danner potensielle KGDHC og PDHC. (B) Beregning av frekvensen av H2O2 og NADH dannelsen av KGDHC og PDHC. Direkte sammenligning av NADH og ROS av både flavin inneholder enzymer viser at KGDHC produserer mer H2O2 som er relatert til høyere enzymatisk kapasitet. n = 4, mener ± SEM. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5 : Samtidig måling av H 2 O 2 og NADH danner priser av KGDHC og PDHC oksiderende forskjellige substrat konsentrasjoner. Endringer i fluorescens ble målt som beskrevet tidligere bortsett fra den siste substrat konsentrasjonen var variert fra 0 mM 10 mm. Denne tilnærmingen ble brukt til å fastslå avhengighet av H2O2 løslate kinetic egenskaper av KGDHC og PDHC. n = 4, mener ± SEM. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6 : KGDHC og PDHC også vise forskjellige H2 O 2 og NADH danner egenskaper når NAD + nivåer endres. Endringer i fluorescens ble målt som beskrevet tidligere bortsett fra den siste konsentrasjonen av NAD+ var variert fra 0 mM 1 mm. Denne tilnærmingen ble brukt til å fastslå avhengighet av H2O2 løslate kinetic egenskaper av KGDHC og PDHC. n = 4, mener ± SEM. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7 : Screening av ulike områdespesifikke hemmere NADH og H2 O 2 produksjon. (A) Diagram som viser katalytisk syklusen for KGDHC og nettstedene til handling for KMV og CPI-613. Merk at PDHC har en homologe katalytisk syklus, bortsett fra at KMV ikke konkurrerer for pyruvate binding området. E1: pyruvate eller α-ketoglutarate dehydrogenase, E2: dihydrolipoamide acyltransferase, E3: dihydrolipoamide dehydrogenase. (B) effekt av KMV og CPI-613 på NADH og H2O2 produksjon av KGDHC og PDHC. Prøvene ble preincubated i KMV (10 mM) eller CPI-613 (150 µM) og deretter assayed for NADH og H2O2 produksjon. n = 4, mener ± SEM. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Reagens | Arbeider lager konsentrasjon | Volum lagt til godt | Siste konsentrasjon i godt |
| KGDHC eller PDHC | 1 enhet/mL | 20 ΜL | 0,1 enheter/mL |
| Superoxide dismutase | 250 enheter/mL | 20 ΜL | 25 enheter/mL |
| Pepperrotperoksidase | 30 enheter/mL | 20 ΜL | 3 enheter/mL |
| Thiamin pyrophosphate | 3 mM | 20 ΜL | 0,3 mM |
| Coenzyme A | 1 mM | 20 ΜL | 0,1 mM |
| NAD+ | 10 mM | 20 ΜL | 1 mM |
| 10-acetyl-3,7-dihydroxyphenoxazine | 100 ΜM | 20 ΜL | 10 ΜM |
| Substrat | 1-100 mM | 20 ΜL | 0.1-10 mM |
Tabell 1: Eksempel på en grunnleggende protokoll definert for måling av O 2 ●- /H 2 O 2 og NADH produksjon av renset PDH eller KGDH. Siden 20 µL av hver reagensen legges til hver brønn og finalen volum/reaksjon er 200 µL, siste konsentrasjonen av hver reagens er 10-fold mindre enn lager konsentrasjonen (f.ekssiste konsentrasjonen av NAD+ i reaksjonsblandingen er 1 mM ). Merk at reagenser bør legges til brønnen i denne rekkefølgen i tabellen.
| Hemmer | Mål |
| 3-metyl-2-oxo valeric acid | E1 delenhet i KGDHC |
| KPI-613 | E2 delenhet i oxo acid dehydrogenases |
Tabell 2: liste over hemmere og deres hovedturnering. Områdene av handlingen er også avbildet i Figur 8.
| NADH autofluorescence | |||||||||
| PDHC | KGDHC | ||||||||
| Tid | T ° 376,450 | A1 | A2 | A3 | A4 | A5 | A6 | A7 | A8 |
| 0:00:04 | 24,4 | 99 | 99 | 91 | 88 | 85 | 82 | 58 | 88 |
| 0:00:34 | 24,4 | 128 | 107 | 99 | 108 | 81 | 80 | 77 | 78 |
| 0:01:04 | 24,4 | 124 | 128 | 117 | 139 | 97 | 88 | 97 | 76 |
| 0:01:34 | 24,4 | 146 | 142 | 129 | 132 | 91 | 97 | 84 | 78 |
| 0:02:04 | 24,4 | 161 | 153 | 148 | 146 | 90 | 107 | 95 | 88 |
| 0:02:34 | 24,4 | 171 | 160 | 156 | 145 | 97 | 103 | 111 | 122 |
| 0:03:04 | 24,4 | 176 | 176 | 161 | 169 | 109 | 120 | 99 | 116 |
| 0:03:34 | 24,4 | 186 | 180 | 179 | 167 | 118 | 123 | 121 | 119 |
| 0:04:04 | 24,4 | 201 | 182 | 187 | 183 | 127 | 124 | 119 | 131 |
| 0:04:34 | 24,4 | 225 | 190 | 195 | 186 | 136 | 143 | 124 | 132 |
| 0:05:04 | 24,4 | 227 | 227 | 203 | 197 | 115 | 143 | 121 | 143 |
| Resorufin fluorescens | |||||||||
| PDHC | KGDHC | ||||||||
| Tid | T ° 565,600 | A1 | A2 | A3 | A4 | A5 | A6 | A7 | A8 |
| 0:00:00 | 24,4 | 204 | 178 | 169 | 152 | 148 | 113 | 107 | 90 |
| 0:00:30 | 24,4 | 224 | 188 | 167 | 152 | 144 | 116 | 124 | 112 |
| 0:01:00 | 24,4 | 212 | 186 | 178 | 161 | 153 | 114 | 122 | 120 |
| 0:01:30 | 24,4 | 212 | 188 | 165 | 164 | 160 | 132 | 127 | 116 |
| 0:02:00 | 24,4 | 222 | 203 | 190 | 169 | 154 | 128 | 133 | 127 |
| 0:02:30 | 24,4 | 217 | 198 | 193 | 179 | 165 | 129 | 147 | 130 |
| 0:03:00 | 24,4 | 223 | 218 | 202 | 179 | 183 | 142 | 145 | 137 |
| 0:03:30 | 24,4 | 239 | 223 | 208 | 188 | 179 | 150 | 155 | 148 |
| 0:04:00 | 24,4 | 236 | 219 | 202 | 183 | 180 | 163 | 156 | 153 |
| 0:04:30 | 24,4 | 249 | 220 | 214 | 177 | 199 | 149 | 150 | 167 |
| 0:05:00 | 24,4 | 251 | 232 | 225 | 196 | 211 | 170 | 169 | 161 |
Tabell 3: regnearkvisningen resultatene innhentet fra settet med eksperimenter. Rå RFU-verdiene som er generert fra eksperimentet eksporteres til et regneark for ytterligere analyse. Bruker standard kurver generert før eksperimentering, kan frekvensen av NADH og H2O2 produksjon beregnes i regnearket.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokollen er fordelaktig siden, 1) eliminerer noen konkurrerende reaksjoner som kan ellers forstyrre H2O2 gjenkjenning (f.eks, antioksidant systemer eller andre kilder til ROS), 2) gir en direkte vurdering av innfødte hastigheten på ROS utgivelsen av en flavin inneholder mitokondrie dehydrogenase, 3) tillater sammenligning av innfødte ROS utgivelsen av to eller flere renset flavin-baserte dehydrogenases, 4) kan gi en direkte sammenligning av hastigheten på ROS utgivelsen og enzym aktivitet og 5) lar screening av selektiv konkurrerende hemmere ROS utgivelsen. Vår gruppe og andre har brukt denne metoden i tidligere publikasjoner undersøke regulering av ROS av allosteric og redoks signalering mekanismer før gjennomfører eksperimenter med mitokondrier eller permeabilized muskel14,16, 17,19,20.
Endringer og feilsøking:
Denne fremgangsmåten bruker grunnleggende utstyr tilgjengelig ved nesten hver institusjon. Tilnærmingen er også lave kostnader og bruker vanlige kjemikalier er tilgjengelige gjennom ulike leverandører. Buffer sammensetningen kan variere etter enzym egenskaper - selv om vi har funnet at en grunnleggende reaksjon buffer bestående av sukrose, HEPES, mannitol og EGTA fungerer bra i de fleste programmer. Rå verdier for resorufin fluorescens er vanligvis rundt 50-500 RFU for en ROS slippe enzym utvannet til 0,1 U/mL. Høyere RFU verdier kan indikere AUR reagensen er auto-oksidert skyldes eksponering for lys eller gjentatte fryse-tine. Derfor bør AUR arbeider løsninger rutinemessig erstattes hver 2 til 3 uker (avhengig av hyppigheten av bruk). Urenheter i enzym forberedelse eller rødsprit kan føre til lavere enn normal ROS og NADH målinger. Enzym renhet bør rutinemessig overvåkes av gel geleelektroforese. Kinetisk egenskaper (Km og Vmax for substrat og NAD+) skal vurderes umiddelbart etter kjøpet eller rensing av et enzym og deretter rutinemessig overvåket etterpå. De fleste av reagensene i analysen er stabile og kan utsettes for flere fryse-Tin sykluser. Pyruvate og α-ketoglutarate skal lagres i dele 100 µL-80 ° c å unngå auto-oksidasjon. Unngå å bruke reduksjonsmidler som DTT siden den dannerO2● -h2O2 direkte gjennom radikale formasjon i PDHC og KGDHC (og potensielt andre flavoenzymes)17. Analyser kan gjennomføres på 37 ° C; vår gruppe har imidlertid funnet at gjennomføre disse eksperimenter ved 25 ° C er ideelle for å gi mer konsekvente data.
Begrensninger av teknikken:
Et stort hinder forbundet med denne teknikken er tilgang til renset flavin inneholder mitokondrie enzymer. Her brukte vi kommersielt tilgjengelige KGDHC og PDHC for å vise at denne teknikken kan brukes til direkte sammenligne ROS utgivelsen kapasitet og enzym aktiviteten til flavin inneholder mitokondrie dehydrogenases. Men de fleste ROS produsere flavin inneholder enzymer er ikke kommersielt tilgjengelig og må renses i laboratoriet. Dette kan være utfordrende vurderer noen av disse enzymene er membran bundet eller absorbere til mitokondrie interne membran. Nye protokoller for vellykket rensing av membran-bundet flavin inneholder enzymer som produserer ROS er nå tilgjengelig. Dette omfatter rensing metoder for komplekse jeg komplekse II og sn-glyserol-3-fosfat dehydrogenase21,22,23. Derfor, selv om de fleste av de oppførte ROS generatorene ikke kan være kommersielt tilgjengelig, protokoller finnes for isolasjon og rensing. Fysiologiske relevansen av resultatene innhentet med renset flavin-baserte enzymer er også en begrensning. Derfor bør funn samlet med renset enzymer følges med analyser isolert mitokondrier eller permeabilized vev. Fem separate studier benyttet denne tilnærmingen for å undersøke mekanismer for regulering av ROS utgivelsen av KGDHC og PDHC14,16,17,19,20. Foreløpige resultatene for rollen av redoks brytere kontrollere ROS utgivelsen ble opprinnelig testet renset KGDHC og PDHC, og deretter mekanismer for regulering ble ytterligere analysert i lever og hjerte mitokondrier og muskel fiber14, 16,17,20.
Betydning når det gjelder eksisterende metoder:
Måle ROS kan utgivelse fra enkeltområder produksjonen i mitokondrier være utfordrende på grunn av konkurrerende siden reaksjoner som også produsererO2● -h2O2 og antioksidant systemer som ellers kan føre til undervurdering av innfødte priser. Membran potensial kan også endre ROS utgivelsen priser fra ulike nettsteder og bruk av hemmere kan endre elektron flyt, forvirrer O2● -h2O2 formasjonen målinger. Den presenteres her tillater direkte evalueringen av ROS utgivelsen kapasitet fra personlige enzymer samtidig samtidig vurdere forholdet mellom innfødte priser O2● -h2O2 og enzym aktivitet. Denne rimelige metoden kan tjene som et verktøy for å sammenligne de opprinnelige ROS utgivelsen prisene for individuelle flavin inneholder mitokondrie enzymer før gjennomføre mer sofistikert eksperimenter med mitokondrier celler og vev. Metoden som presenteres her kan i tillegg brukes til å forhåndssortere effektiviteten og selektivitet av hemmere for ROS utgivelse før gjennomføre analyser med isolert mitokondrier.
Fremtidige programmer:
Metoden som presenteres her har vært brukt i fem separate studier undersøker kontroll over ROS utgivelse fra PDHC og KGDHC14,16,17,19,20. I disse studiene, hemmere ble vist og ROS slipp og NADH produsere priser ble vurdert renset enzymer. Resultatene innhentet med renset enzymer ble deretter bekreftet med isolert mitokondrier og permeabilized muskelfibre14,16,17,20. Denne metoden kan derfor brukes til en rekke fremtidige studier studerte innfødt ROS utgivelsen priser fra mitokondrier, celler og muskelfibre.
Avgjørende skritt i protokollen:
Enzym renhet og kinetisk egenskaper bør rutinemessig overvåkes. AUR arbeider lager reagens bør også erstattes ofte. Dette vil sikre resultatene samlet er konsistente. Rekkefølgen på tillegg av reagenser er avgjørende for å kjøre en vellykket eksperiment (tabell 1). Hemmere bør være titreres for å bestemme konsentrasjonen må framprovosere maksimal hemming av ROS utgivelsen. I denne studien vi valgte 10 mM KMV og 150 µM CPI-613 siden vi tidligere har bestemt at disse konsentrasjonene induserer maksimal hemming av ROS utgivelsen av KGDHC og PDHC13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Det er ikke noe å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble finansiert av naturvitenskap og Engineering Research Council for Canada (NSERC). Video produksjon ble gjennomført i samarbeid med senter for innovasjon i undervisning og læring (CITL) på Memorial University Newfoundland.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pyruvate dehydrogenase complex | SIGMA | P7032-10UN | purified flavoenzyme |
| alpha-ketoglutarate dehydrogenase complex | SIGMA | K1502-20UN | purified flavoenzyme |
| 30% hydrogen peroxide solution | SIGMA | HX0640-5 | reagent, standard curves |
| NAD+ | SIGMA | N0632-1G | reagent, activity/ROS release assay |
| NADH | SIGMA | N4505-100MG | reagent, standard curves |
| pyruvate | SIGMA | P2256-5G | reagent, activity/ROS release assay |
| alpha-ketoglutarate | SIGMA | 75892-25G | reagent, activity/ROS release assay |
| CoASH | SIGMA | C3019-25MG | reagent, activity/ROS release assay |
| thiamine pyrophosphate | SIGMA | C8754-1G | reagent, activity/ROS release assay |
| mannitol | SIGMA | M4125-100G | buffer component |
| Hepes | SIGMA | H3375-25G | buffer component |
| sucrose | SIGMA | S7903-250G | buffer component |
| EGTA | SIGMA | E3889-10G | buffer component |
| KMV | SIGMA | 198978-5G | reagent, ROS release inhibitor |
| CPI-613 | Santa Cruz | sc-482709 | reagent, ROS release inhibitor |
| SOD | SIGMA | S9697-15KU | reagent, ROS release detection |
| horseradish peroxidase | SIGMA | P8375-1KU | reagent, ROS release detection |
| Amplex Ultra Red | Thermofisher | A36006 | reagent, ROS release detection |
| Biotech Synergy 2 microplate reader | BioTek Instruments | microplate reader for assays | |
| Gen5 software | BioTek Instruments | software, used for collection of raw RFU | |
| Graphpad Prism | Graphpad software | software, data analysis | |
| Microsoft EXCEL | Microsoft | software, data analysis |
References
- Mailloux, R. J. Teaching the fundamentals of electron transfer reactions in mitochondria and the production and detection of reactive oxygen species. Redox Biol. 4, 381-398 (2015).
- Nicholls, D. G. Forty years of Mitchell's proton circuit: From little grey books to little grey cells. Biochim Biophys Acta. 1777 (7-8), 550-556 (2008).
- Brand, M. D. Mitochondrial generation of superoxide and hydrogen peroxide as the source of mitochondrial redox signaling. Free Radic Biol Med. 100, 14-31 (2016).
- Massey, V. Activation of molecular oxygen by flavins and flavoproteins. J Biol Chem. 269 (36), 22459-22462 (1994).
- Mailloux, R. J., Gardiner, D., O'Brien, M. 2-Oxoglutarate dehydrogenase is a more significant source of O2(.-)/H2O2 than pyruvate dehydrogenase in cardiac and liver tissue. Free Radic Biol Med. 97, 501-512 (2016).
- Sies, H., Berndt, C., Jones, D. P.
- Kuksal, N., Chalker, J., Mailloux, R. J. Review. Progress in understanding the molecular oxygen paradox - function of mitochondrial reactive oxygen species in cell signaling. Biol Chem. , (2017).
- Murphy, M. P. How mitochondria produce reactive oxygen species. Biochem J. 417 (1), 1-13 (2009).
- Wong, H. S., Dighe, P. A., Mezera, V., Monternier, P. A., Brand, M. D. Production of superoxide and hydrogen peroxide from specific mitochondrial sites under different bioenergetic conditions. J Biol Chem. , (2017).
- Harper, M. E., Green, K., Brand, M. D. The efficiency of cellular energy transduction and its implications for obesity. Annu Rev Nutr. 28, 13-33 (2008).
- Ambrus, A., et al. Formation of reactive oxygen species by human and bacterial pyruvate and 2-oxoglutarate dehydrogenase multienzyme complexes reconstituted from recombinant components. Free Radic Biol Med. 89, 642-650 (2015).
- Tretter, L., Adam-Vizi, V. Generation of reactive oxygen species in the reaction catalyzed by alpha-ketoglutarate dehydrogenase. J Neurosci. 24 (36), 7771-7778 (2004).
- Slade, L., et al. Examination of the superoxide/hydrogen peroxide forming and quenching potential of mouse liver mitochondria. Biochim Biophys Acta. 1861 (8), 1960-1969 (2017).
- O'Brien, M., Chalker, J., Slade, L., Gardiner, D., Mailloux, R. J. Protein S-glutathionylation alters superoxide/hydrogen peroxide emission from pyruvate dehydrogenase complex. Free Radic Biol Med. 106, 302-314 (2017).
- Quinlan, C. L., et al. The 2-oxoacid dehydrogenase complexes in mitochondria can produce superoxide/hydrogen peroxide at much higher rates than complex I. J Biol Chem. 289 (12), 8312-8325 (2014).
- Mailloux, R. J., Craig Ayre, D., Christian, S. L. Induction of mitochondrial reactive oxygen species production by GSH mediated S-glutathionylation of 2-oxoglutarate dehydrogenase. Redox Biol. 8, 285-297 (2016).
- Mailloux, R. J., Gardiner, D., O'Brien, M. 2-Oxoglutarate dehydrogenase is a more significant source of O2(.-)/H2O2 than pyruvate dehydrogenase in cardiac and liver tissue. Free Radic Biol Med. 97, 501-512 (2016).
- Ambrus, A., Adam-Vizi, V. Human dihydrolipoamide dehydrogenase (E3) deficiency: Novel insights into the structural basis and molecular pathomechanism. Neurochem Int. , (2017).
- Young, A., Gardiner, D., Brosnan, M. E., Brosnan, J. T., Mailloux, R. J. Physiological levels of formate activate mitochondrial superoxide/hydrogen peroxide release from mouse liver mitochondria. FEBS Lett. 591 (16), 2426-2438 (2017).
- Fisher-Wellman, K. H., et al. Mitochondrial glutathione depletion reveals a novel role for the pyruvate dehydrogenase complex as a key H2O2-emitting source under conditions of nutrient overload. Free Radic Biol Med. 65, 1201-1208 (2013).
- Kussmaul, L., Hirst, J. The mechanism of superoxide production by NADH:ubiquinone oxidoreductase (complex I) from bovine heart mitochondria. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (20), 7607-7612 (2006).
- Huang, L. S., Borders, T. M., Shen, J. T., Wang, C. J., Berry, E. A. Crystallization of mitochondrial respiratory complex II from chicken heart: a membrane-protein complex diffracting to 2.0. A. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 61 (Pt 4), 380-387 (2005).
- Yeh, J. I., Chinte, U., Du, S. Structure of glycerol-3-phosphate dehydrogenase, an essential monotopic membrane enzyme involved in respiration and metabolism. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (9), 3280-3285 (2008).
