Summary
نقدم بروتوكول لاستخدام الفحص المجهري STED في نفس الوقت الصورة أكتين الهياكل وميكروتوبوليس، والبروتينات ميكروتوبولي بالإضافة إلى نهاية الملزمة في الخلايا ب التي انتشرت في كوفيرسليبس المغلفة بالأجسام المضادة لمستقبلات الخلية ب، ونموذج للمرحلة الأولى تشكيل المشبك محصنة.
Abstract
ب الخلايا التي تربط المستضدات غشاء محدد (مثلاً، على سطح خلية عرض مستضد) تشكيل المشبك منأى، بنية خلوية متخصصة التي يحسن إشارات مستقبلات (المركز) ب-الخلية واقتناء مستضد المركز بوساطة. كلا يعيد البناء cytoskeleton أكتين وإعادة توجيه الشبكة microtubule نحو الموقع الاتصال مستضد ضرورية لتشكيل المشبك محصنة. يعيد البناء من cytoskeleton أكتين في حلقة المحيطية كثيفة من أكتين و يرافق الاستقطاب مركز تنظيم microtubule نحو المشبك محصنة. البروتينات ميكروتوبولي بالإضافة إلى نهاية الملزمة، فضلا عن البروتينات القشرية نهاية بالإضافة إلى التقاط التوسط التفاعلات الفيزيائية بين سيتوسكيليتونس أكتين وميكروتوبولي، التي تسمح لهم بإعادة تنظيمها بطريقة منسقة. توضيح آليات أن تحكم عملية إعادة التنظيم هذه سيتوسكيليتال، فضلا عن فهم كيف أن هذه الهياكل cytoskeletal تشكيل تشكيل المشبك محصنة ويشير إلى المركز، يمكن أن توفر أفكاراً جديدة في تنشيط الخلية ب. وهذا قد ساعد بوضع نهج مجهرية فائقة القرار التي تكشف عن تفاصيل جديدة عن شبكة سيتوسكيليتال المنظمة. يصف لنا هنا طريقة لاستخدام الميكروسكوب استنفاد (STED) حفز الانبعاثات في نفس الوقت الصورة أكتين الهياكل وميكروتوبوليس، والبروتينات transfected microtubule معلم بروتينات فلورية خضراء بالإضافة إلى نهاية الملزمة في الخلايا باء. نموذج الأحداث المبكرة في تشكيل المشبك محصنة، نسمح للخلايا ب ينتشر في كوفيرسليبس المغلفة مع الغلوبولين المناعي المضادة (مكافحة-Ig) الأجسام المضادة، التي تبدأ إشارات المركز وإعادة عرض cytoskeleton. نحن نقدم البروتوكولات خطوة بخطوة للتعبير عن التجارة والنقل الانصهار البروتينات في الخلايا A20 ب-سرطان الغدد اللمفاوية للخلية التي يسببها Ig مكافحة انتشار وتثبيت الخلية اللاحقة وإيمونوستاينينج، والحصول على الصور والخطوات deconvolution صورة. الصور عالية الدقة التي تم الحصول عليها باستخدام هذه الإجراءات تسمح بتصور في نفس الوقت هياكل أكتين وميكروتوبوليس والبروتينات بالإضافة إلى نهاية الملزمة microtubule التي قد تربط هذه الشبكات سيتوسكيليتال اثنين.
Introduction
عند ربط الخلايا ب الاستقطاب صفائف مستضدات (مثلاً، عرض على سطح عرض مستضد الخلايا (Apc))، مستقبلات ب-الخلية الناتجة (المركز) مما يشير إلى تشكيل بنية المشبك محصنة ضد الكلاسيكية، الذي كان أول وصف في محركات الأقراص تي الخلايا1،2،3،4،5،6،،من78،9،10، 11،،من1213. في البداية، ميكروكلوستيرس نموذج بكرس مستضد زمنياً في المحيط الموقع الاتصال ب الخلية: آسيا والمحيط الهادئ. ثم نقل هذه ميكروكلوستيرس نحو مركز الموقع مستضد الاتصال، حيث أنهم بلورتها في تنشيط supramolecular وسط كتلة (كسماك) الذي يشكل جوهر المشبك محصنة. يحسن المركز مما يشير إلى تشكيل المشبك محصنة ويسهل استخراج مستضد المركز بوساطة من الغشاء APC14. يسمح هذا الاستحواذ مستضد، التي تبعتها مستضد المركز بوساطة التدخيل وتجهيز مستضد اللاحقة، خلايا ب تقديم الببتيد: MHC المجمعات الثاني لخلايا تي، والتماس مساعدة خلية T14. ونظرا لأن يعزز تشكيل المشبك محصنة تنشيط الخلية ب، توضيح الآليات التي تنشئ يمكن توفير هذا النمط الوظيفي للمنظمة مستقبلات جديدة ثاقبة الاستجابات المناعية خلطيه كيف بدأت تنظم.
إعادة تنظيم سيتوسكيليتونس أكتين وميكروتوبولي على السواء أمر ضروري لتشكيل المشبك محصنة. يدفع المركز مترجمة إشارات تحفزها مجموعة الأقطاب مكانياً من مولدات المضادات سريعة ودرامية يعيد البناء من1،سيتوسكيليتون أكتين15. تشكيل هياكل أكتين الجذعية في محيط الخلية بتمارس قوي دفع في غشاء البلازما ويعزز نشر الخلية ب. هذا يسمح للخلية بالي مسح مساحة أكبر من سطح مستضد الحاملة، ويزيد عدد بكرس التي تربط المستضد وتنشيط المركز مما يشير إلى مسارات. في الوقت نفسه، بعد وشبكة ميكروتوبولي بتوجيه نحو موقع الاتصال مستضد. مع اقتراب بعد الموقع الاتصال مستضد، microtubules المنبثقة عن بعد تمتد على طول الوجه الداخلي لغشاء البلازما في مجال التفاعل بين الخلية ب و تحمل مستضد السطح16،17. ثم يمكن أن تعمل هذه ميكروتوبوليس جوكستاميمبراني كمسارات للحركة المركزي دينين بوساطة مستضد زمنياً بنك ميكروكلوستيرس18، مما يؤدي إلى تشكيل كسماك.
إعادة توجيه والاستقطاب من بعد نحو المشبك المناعي يتطلب أكتين سليمة وسيتوسكيليتونس ميكروتوبولي، وغالباً ما يعتمد على التفاعل بين الأكتين القشرية الشبكة وميكروتوبوليس16،17، ،من 1920. يمكن التقاط القشرية البروتينات أكتين-ملزمة، مثل IQGAP1، ميكروتوبوليس من خلال التفاعل مع البروتين المجمعات التي تزين نهايات الجمع microtubule21. وتشمل هذه المجمعات الحيوية للبروتينات بالإضافة إلى نهاية الملزمة EB1 ومقطع-170، التي يشار إليها مجتمعة وصفه ميكروتوبولي بالإضافة إلى نهاية تتبع البروتينات (+ نصائح)21،22. + يمكن ربط نصائح في نهايات microtubules البروتينات المرتبطة بغشاء البلازما أو cytoskeleton أكتين القشرية. هذا يسمح لآليات توليد القوة (مثلاً، الناقص-النهاية توجيه حركة دينين كورتيكالي ترتكز على طول microtubules) بذل سحب القوات في ميكروتوبوليس ومن ثم تغيير موضع بعد. ربط البروتين السقالات المرتبطة أكتين IQGAP123قصاصة-170، وقد أظهرنا أن كلا من هذه البروتينات مطلوبة من أجل الاستقطاب الناجم عن المركز بعد نحو المشبك محصنة ضد17. هذا التفاعل IQGAP1-القصاصة-170 قد تلعب دوراً رئيسيا في تنسيق إعادة عرض cytoskeleton الأكتين مع إعادة تنظيم شبكة microtubule في المشبك محصنة ب-الخلية.
وكشفت مجهرية الفلورية التقليدية المثيرة إعادة تنظيم سيتوسكيليتونس أكتين و microtubule أثناء تشكيل المشبك محصنة خلية ب2. ومع ذلك، لا يمكن حل هذا النهج الهياكل الخلوية الصغيرة بالتفصيل بسبب الحد حيود الضوء، الذي، وفقا للقانون لأبي، ويعتمد على الطول الموجي للضوء المستخدمة لإلقاء الضوء على العينة وفتحه موضوعية24. يقيد هذا الحد حيود القرار مجاهر الخفيفة التقليدية إلى 200-300 نانومتر في الاتجاه الأفقي و 500-700 نانومتر في اتجاه محوري25. ولذلك، سوبسيلولار هياكل أصغر حجماً، فضلا عن التفاصيل الدقيقة سيتوسكيليتونس أكتين وميكروتوبولي، يمكن فقط ملاحظة باستخدام الميكروسكوب الإلكتروني. التصوير بالميكروسكوب الإلكتروني سيتوسكيليتون هو مضيعة للوقت، ويتطلب عينة قاسية وتثبيت وإعداد البروتوكولات التي يمكن أن تغير الهياكل البيولوجية، ويقتصر على الكشف عن الأجسام المضادة بوساطة. القدرة على إيمونوستاين وفي نفس الوقت صورة بروتينات متعددة أو الهياكل الخلوية ميزة كبيرة للفحص المجهري الأسفار. وعلاوة على ذلك، معربا عن البروتينات الفلورية الانصهار في الخلايا يتيح التصوير في الوقت الحقيقي ومفيد عندما لا تتوفر الأجسام المضادة الفعالة ل immunostaining بروتين الفائدة.
الأخيرة التقدم التكنولوجي في مجال مجهرية فائقة القرار التغلب على حدود حيود الضوء والسماح لهم التصور من النانو الهياكل الخلوية24. مثل أسلوب مجهرية فائقة القرار واحد يسمى مجهرية استنفاد (STED) حفز الانبعاثات. وتوظف STED اثنين من أشعة الليزر، حيث ليزر واحد يثير في فلوروفوري وليزر ثانية مع نقش على شكل دونات بشكل انتقائي يمنع انبعاث fluorescence حولها فلوروفوري. هذا يقلل من انتشار نقطة الدالة (منطقة الظاهرة) من الجسيمات الفلورية واحد ويوفر حيود الفرعية حد صورة فلورسنت25،26. كما تستخدم استنزاف الأرض-دولة مجهرية التقنيات المستندة إلى الأسفار للحصول على صور فائقة الدقة. ومع ذلك، مرات اقتناء والتعمير في الصورة طويلة وهناك عدد محدود فقط من فلوروفوريس التي يمكن استخدامها والتصوير عالي الدقة المتزامنة من عدة مكونات cytoskeletal يمثل تحديا تقنيا للحفاظ على هياكل أكتين و microtubule يتطلب إجراءات مختلفة من التثبيت. ولذلك، STED مزايا متعددة أكثر من المجهر الإلكتروني ونهج أخرى مجهرية فائقة القرار حيث أنه يوفر الحصول على الصور السريعة، ولديه الحد الأدنى من متطلبات تجهيز، وتوظف فلوروفوريس نفسه وتلطيخ تقنيات التي يتم استخدامها الفلورية التقليدية الفحص المجهري لعينات ثابت26.
الآن وقد استخدم مجهرية فائقة القرار لتصور الهياكل أكتين على المشبك المناعي في الخلايا (ناغورني كاراباخ) القاتل الطبيعي وتي الخلايا26،27،،من2829،30، 31-بيد تصوير القرار فائقة من سيتوسكيليتون ميكروتوبولي، وكذلك تنسيق إعادة تنظيم سيتوسكيليتونس أكتين و microtubule أثناء تشكيل المشبك المناعية، إلا في الآونة الأخيرة عنها17. كنا مجهرية STED الصورة ب الخلايا التي كان قد سمح لتنتشر في كوفيرسليبس المغلفة مع الغلوبولين المناعي المضادة (مكافحة-Ig) الأجسام المضادة، مما حفز المركز الإشارات والشروع في عملية إعادة التنظيم cytoskeleton. عندما مطلي على الأجسام المضادة-Ig المعطل تداولها، خلايا ب الخضوع درامية أكتين-تعتمد على الانتشار، الذي يلخص الأحداث الأولى أثناء تشكيل المشبك محصنة. الأهم من ذلك، الفحص المجهري STED كشف التفاصيل الدقيقة لعصابة الجذعية من أكتين و أشكال في المحيط المناعة المشبك وأظهرت أن بعد، فضلا عن microtubules المرتبطة به، قد انتقلت قريبة من موقع الاتصال مستضد17. هذه microtubules الموسعة إلى الخارج نحو الحلقة المحيطية من أكتين و. وعلاوة على ذلك، تصوير STED متعدد الألوان من توليفات مختلفة من F-أكتين، توبولين، IQGAP1، ومعلم بروتينات فلورية خضراء مقطع-170 + نصائح بينت أن microtubule زائد-ينتهي تميزت CLIP-170-التجارة والنقل ارتباطاً وثيقا مع meshwork أكتين الطرفية، ومع IQGAP1، التقاط القشرية البروتين17.
نقدم هنا، بروتوكول مفصل للتصوير سيتوسكيليتونس أكتين وميكروتوبولي في المشبك محصنة ضد استخدام الفحص المجهري STED. وقد تم تحسين هذه الأساليب باستخدام الخط مورين بالخليه A20، والتي استخدمت على نطاق واسع لدراسة المركز الإشارات والمشبك محصنة ضد تشكيل17،،من3233،،من3435 , 36 , 37 , 38 , 39-نظراً لأن الأجسام المضادة التجارية إلى القصاصة-170 لا تعمل جيدا بالنسبة إيمونوستاينينج في التجارب السابقة، يصف لنا بالتفصيل التعبير عن معلم بروتينات فلورية خضراء مقطع-170 في الخلايا A20، جنبا إلى جنب مع تلطيخ البروتوكولات لتصور في نفس الوقت تصل إلى ثلاثة مكونات cytoskeletal أو البروتينات المرتبطة سيتوسكيليتون. أساليب لاستخدام STED المجهري للصورة أكتين في ناغورني كاراباخ الخلايا المناعية نهايات منذ الموصوفة سابقا40. هنا، نحن تمديد هذا للحصول على صور متعددة الألوان فائقة القرار سيتوسكيليتونس أكتين وميكروتوبولي على السواء في الخلايا ب.
يتم استخدام أحد الاعتبارات الهامة مجهرية فائقة القرار إجراءات التثبيت المناسبة للحفاظ على الهياكل الخلوية ومنع الأضرار بالبروتينات الفلورية. لقد تم تحسين التثبيت وتلطيخ الأساليب المقدمة في هذه الوثيقة الاحتفاظ بالأسفار التجارة والنقل وتوفير تصوير عالي الدقة من شبكات أكتين وميكروتوبولي. عند التعبير عن البروتينات الفلورية، تجدر الإشارة إلى أن الخلايا ب يصعب عادة ترانسفيكت. استخدام هذا البروتوكول، 20-50% من A20 يعرب الخلايا عادة البروتين فيوجن التجارة والنقل ترانسفيكتيد وبين هذه الفئة من السكان هي مستويات البروتين التعبير المتغير. ومع ذلك، تصوير فائقة القرار أكتين وميكروتوبوليس باستخدام الإجراءات التي يمكننا وصف قوية جداً وهي سهولة الحصول على صور عالية الجودة. وعلى الرغم من صغر حجمها بالنسبة إلى الخلايا A20، نظهر أن هذه الإجراءات يمكن أيضا استخدامها لصورة الشبكة ميكروتوبولي في الخلايا ب الأولية التي قد تم تفعيلها بإيجاز مع lipopolysaccharide (LPS). وقد أظهرنا أن لبس تنشيط الخلايا ب الابتدائي يمكن تكون transfected مع سيرناس في كفاءة عالية نسبيا (أي، مثل أن نضوب البروتين يمكن الكشف عنها بواسطة immunoblotting)، يجعلها بديلاً جيدا لاستخدام خطوط الخلايا ب لبعض الدراسات 17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وافق جميع الإجراءات الحيوان بالجامعة "اللجنة الرعاية الحيوانية في مقاطعة كولومبيا البريطانية".
1-الإعراب عن البروتينات بروتينات فلورية خضراء-الانصهار في الخلايا A20 ب-سرطان الغدد الليمفاوية
- الثقافة A20 الخلايا في إكمال ربمي المتوسطة (ربمي-1640 تستكمل مع 10% معطل الحرارة الجنيني البقري المصل (FBS)، 50 ميكرومتر 2-mercaptoethanol، الجلوتامين 2 مم، بيروفات 1 مم، 50 يو/مليلتر البنسلين و 50 ميكروغرام/مل ستربتوميسين) عند 37 درجة مئوية في حاضنة استنبات الأنسجة مع 5 % CO2.
- تحضير الكاشف تعداء (انظر الجدول للمواد) وفقا لإرشادات الشركة المصنعة.
ملاحظة: قد تم تحسين هذا البروتوكول الكواشف محددة وبروتوكول تعداء الموصوفة في الجدول للمواد. لم تؤد الكواشف تعداء الأخرى التي حاولنا كافية تعداء الكفاءة. - عد الخلايا باستخدام هيموسيتوميتير. أجهزة الطرد المركزي 2.5 × 106 A20 الخلايا (لكل تعداء) لمدة 5 دقائق في 525 x غ. ريسوسبيند الخلايا في 100 ميليلتر من تعداء الكاشف الذي يحتوي على 1-2.5 ميكروغرام من بلازميد الحمض النووي. للحمض النووي ترميز مقطع-170-بروتينات فلورية خضراء23، استخدام 2.5 ميكروغرام كل تعداء. المزيج بلطف.
- نقل الخلايا إلى بئر للوحة 6-جيدا، وضبط مستوى الصوت إلى 2 مل مع حرارة قبل المتوسطة ربمي كاملة. ثقافة الخلايا ح 18 في 37 درجة مئوية للسماح بالتعبير البروتين.
2-عزل الخلايا الأولية الماوس ب وتفعيل لهم بلبس
- استخدام أدوات جراحية معقمة لإزالة الطحال من ماوس، عقب البروتوكولات التي وافقت عليها "اللجنة العناية بالحيوان" للمؤسسة.
- في هود زراعة الأنسجة، وضع مصفاة خلية عقيمة 70-ميكرومتر في طبق استنبات الأنسجة 35 ملم تحتوي على 3 مل من درجة حرارة الغرفة PBS العقيمة. استخدم الجزء المطاط من المكبس من حقنه 5 مل لسحق الطحال من خلال مصفاة الخلية.
- بيبيت تعليق خلية واحدة من سبلينوكتييس إلى أنبوب 15 مل العقيمة وأجهزة الطرد المركزي في 525 x ز لمدة 5 دقائق.
- استخدام عزل مغناطيسي على أساس حبة بخليه كيت (انظر الجدول للمواد) للحصول على عدد سكانها ب خلايا التخصيب.
- ريسوسبيند الخلايا ب إلى 3 × 106/mL في كامل ربمي المتوسطة وتستكمل مع 2.5 ميكروغرام/مل لبس زائد 5 نانوغرام/مل بخليه تنشيط عامل (باف؛ سيتوكين البقاء على قيد الحياة).
- الثقافة الخلايا للموارد البشرية 6 عند 37 درجة مئوية.
3-طلاء الزجاج كوفيرسليبس مع الأجسام المضادة-Ig
- إعداد الحل جسم لطلاء كوفيرسليبس. تمييع الحل الأسهم من أجسام Ig الماعز-مكافحة--الماوس في درجة حرارة الغرفة PBS العقيمة لجعل حل 12.5 ميكروغرام/مل؛ 400 ميليلتر من جسم الحل مطلوب لكل ساترة.
ملاحظة: استخدام الماوس لمكافحة الماعز مفتش A20 الخلايا؛ استخدام الماوس الماعز المضادة IgM الابتدائي ب الخلايا. الأجسام المضادة "مفتش الماعز" لا تربط جيدا لمستقبلات Fc الماوس. بيد لتجنب أي ملزم مستقبلات Fc المحتملة، أحد استخدام الأجزاء2 F(ab) أو F(ab') للماوس المضادة IgG أو الأجسام المضادة IgM الماوس المضادة. - تراجع ساترة #1.5 زجاج جولة 18 ملم في 100 ٪ الميثانول وأتركها تجف تماما (~ 10 دقيقة).
- استخدام الملقط، ضع ساترة المجففة في زراعة الأنسجة جيدا 12 لوحة وبيبيت 400 ميليلتر 12.5 ميكروغرام/مل جسم الحل (5 ميكروغرام المجموع؛ 2 ميكروغرام/سم2) على ساترة حتى أن تشكل فقاعة في مركز ساترة وينتشر إلى الحواف.
- كن حذراً لتغطية ساترة كامل، ولكن لا تسمح بحل جسم تمديد الماضي حافة ساترة زجاجية وعلى البلاستيك زراعة الأنسجة. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
- أغسل كوفيرسليبس حسب بيبيتينج 1 مل من PBS العقيمة إلى يسفط جيدا ومن ثم الخروج الحل. كرر مرتين أخريين إزالة الأجسام المضادة غير منضم.
- أضف 1 مل PBS العقيمة إلى التقرير كذلك تتضمن ساترة المغلفة بالأجسام المضادة حتى الخلايا على استعداد لإضافة.
ملاحظة: يمكن الاحتفاظ كوفيرسليبس في درجة حرارة الغرفة، مغطاة ببرنامج تلفزيوني، لاستخدامها في نفس اليوم.
4-خلية بينتشر في Ig المغلفة مكافحة كوفيرسليبس
- إعداد تعديل هيبيس مخزنة المالحة (مهبس): 25 مم هيبيس، الرقم الهيدروجيني 7.2، 125 ملم كلوريد الصوديوم، 5 ملم بوكل، 1 مم كاكل2، 1 مم نا2هبو4، 0.5 مم MgSO4، 1 ملغ/مل سكر العنب، الجلوتامين 2 مم، بيروفات صوديوم 1 مم، و 50 ميكرون 2-ميركابتوثانول). فلتر تعقيم هذا الحل وتخزينها في 4 درجات مئوية.
- في يوم التجربة، تجعل 50 مل مهبس مع 2% FBS (مهبس-FBS) بإضافة 1 مل من الحرارة إبطال FBS مهبس 50 مل. الحارة في مهبس FBS إلى 37 درجة مئوية قبل الاستخدام.
- الطرد المركزي A20 transfected الخلايا أو الخلايا ب الأولية التي قد تم مثقف مع باف بالإضافة إلى لبس في 525 x ز لمدة 5 دقائق.
- ريسوسبيند الخلايا الموجودة في 1 مل من مهبس-FBS، عد الخلايا باستخدام هيموسيتوميتير، وتمييع الخلايا إلى 2 × 105 خلايا/مل في مهبس-FBS.
- استخدام الملقط، نقل ساترة من لوحة زراعة الأنسجة إلى قطعة من الفيلم البارافين.
- إضافة 250 ميليلتر من خلايا ب (5 × 104 خلايا) لكل ساترة.
- احتضان كوفيرسليبس في 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة في الظلام للسماح للخلايا ب لتنتشر على السطح المغلفة مفتش مكافحة.
5-تحديد وإيمونوستينينج الخلايا
- إعداد تثبيت الحل بتمييع الحل الأسهم بارافورمالدهيد 16% وحل الأسهم glutaraldehyde 50% في الماء المقطر بدرجة حرارة الغرفة تسفر عن تركيزات نهائية من 3 ٪ glutaraldehyde بارافورمالدهيد و 0.1 في المائة. إعداد الحل التثبيت في اليوم إلى استخدامها، وتجاهل أي فائض.
تنبيه: بارافورمالدهيد و glutaraldehyde الأسهم يجب فقط استخدام الحلول في غطاء الأبخرة كيميائية. اتبع الإرشادات التي تظهر في صحيفة بيانات سلامة المواد (MSDS). - إعداد المخزن المؤقت بيرميبيليزيشن/حجب (BSA 3% و 0.1% X-100 تريتون المخفف في برنامج تلفزيوني). فلتر تعقيم هذا الحل وتخزينها في 4 درجات مئوية. في يوم التجربة، الحارة المبلغ المطلوب لدرجة حرارة الغرفة.
- إعداد المخزن المؤقت المصبوغة (1% صابونين جيش صرب البوسنة و 0.1 في المائة في برنامج تلفزيوني). هذا الحل باستخدام عامل تصفية 0.2 ميكرون تعقيم وتخزين في 4 درجات مئوية. في يوم التجربة، الحارة المبلغ المطلوب لدرجة حرارة الغرفة.
- بيبيت 350 ميليلتر محلول التثبيت على كل ساترة، ضمان أن تغطي السطح تماما. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق في الظلام.
- إزالة تثبيت الحل من ساترة يسفط بعناية من حافة ساترة استخدام ميكروبيبيت.
تنبيه: يجب أن يتم تجاهل الحل التثبيت كالنفايات الكيميائية الخطرة. - أغسل كوفيرسليبس مرة واحدة مع 500 ميليلتر permeabilization/حجب المخزن المؤقت. بيبيت قبالة السائل.
- بيرميبيليزي وكتلة الخلايا بإضافة 250 ميليلتر permeabilization/حجب المخزن المؤقت لكل ساترة، وحضانة لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
- تمييع أرنب tubulin المضادة الأجسام المضادة 1: 100 في تلطيخ المخزن المؤقت.
- نضح إيقاف المخزن المؤقت حظر/بيرميبيليزيشن من كوفيرسليبس، وإضافة 50 ميليلتر من الحل المخفف tubulin المضادة جسم لكل ساترة. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة في الظلام.
- إعداد الحل الثانوي جسم/أكتين وصمة عار بإضعاف كل من الماعز مترافق أليكسا فلور 532 أرنب المضادة مفتش الثانوي جسم ومترافق 568 فلور أليكسا فالويدين 1: 100 في تلطيخ المخزن المؤقت.
- تغسل في كوفيرسليبس 3 مرات لإزالة الأجسام المضادة الأولية الزائدة بإضافة 500 ميليلتر لتلطيخ المخزن المؤقت وثم يسفط عليه.
- إضافة 50 ميليلتر الحل الثانوي جسم/أكتين وصمة عار لكل ساترة، واحتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
- تغسل في كوفيرسليبس 3 مرات لإزالة الأجسام المضادة الثانوية الزائدة بإضافة 500 ميليلتر لتلطيخ المخزن المؤقت وثم يسفط عليه.
- إضافة 10 ميليلتر من كاشف المتصاعدة على شريحة مجهر. جبل ساترة على شريحة المجهر مع الجانب خلية لأسفل.
ملاحظة: وسيلة متزايدة "تتلاشى المضادة" (انظر الجدول للمواد) ينصح بشدة للحفاظ على كثافة الأسفار من البروتينات فيوجن التجارة والنقل. تجنب استخدام تركيب الكواشف التي تحتوي على DAPI، التي يمكن أن تتداخل مع تصوير فلوروفوريس عند استخدام الليزر STED. - السماح بأن الشرائح الجافة بين عشية وضحاها في الظلام. صورة الشرائح في اليوم التالي.
ملاحظة: التصوير الشرائح بمجرد ساترة الجافة ينصح بشدة، كما ستنخفض fluorescence التجارة والنقل مع مرور الوقت.
6-التصوير باستخدام مجهر STED
ملاحظة: يرجى ملاحظة أن جميع البرامج الخطوات الموضحة أدناه الخاصة بالمجهر والبرمجيات المستخدمة ونحن (انظر الجدول للمواد). الخطوات والإعدادات سوف تحتاج إلى تعديل إذا كان يتم إجراء التصوير باستخدام مجهر/برامج مختلفة.
- تشغيل المجهر STED وتنشيط بأشعة الليزر ومصباح إضاءة ابيفلوريسسينسي، وبدء برنامج المجهر.
- تعيين المعلمات لاستنفاد STED الليزر.
ملاحظة: هذا سيتوقف على المجهر المحددة المستخدمة والليزر التي هي مجهزة. وأوصى بعض الإعدادات هي الضوء الأبيض (ذ) 70 في المائة؛ 592 نانومتر ليزر 80%؛ 660 نانومتر ليزر 80%. - تنشيط إعدادات STED ومحاذاة أشعة الليزر STED استخدام الهدف X 100.
- باستخدام العدسة، تركز النموذج وحدد خلية مع معتدلة بروتينات فلورية خضراء التعبير.
ملاحظة: التعبير انخفاض بروتينات فلورية خضراء لن تكون مرئية ل STED يقلل كثافة الانبعاثات. على العكس من ذلك، يدفع التعبير عالية من قصاصة-170-التجارة والنقل عفوية تشكيل التكتلات الكبيرة، التي لا تعكس microtubule العادي بروتين زائد في نهاية معقدة مورفولوجيا والتوزيع. تحديد خلية مع معتدلة بروتينات فلورية خضراء التعبير ضروري لدقة التصوير هياكل سيتوسكيليتال في موقع الاتصال مستضد. - تكبير الخلية المحددة واختر منطقة اهتمام تصويرها. ضبط التركيز حيث أن الطائرة س-ص بالخليه الأقرب إلى ساترة في التركيز.
- للقيام بذلك، نقل الهدف تدريجيا أقرب إلى ساترة حيث أن هياكل cytoskeletal خلية بموضع التركيز، وثم انتقل من التركيز. ثم تدريجيا نقل الهدف في الاتجاه المعاكس حتى هياكل cytoskeletal خلية باولا العودة إلى التركيز.
- تحسين الإعدادات بما في ذلك السلطة الليزر وشعاع الإثارة، والكشف عن النطاق. تبدأ مع الإعدادات الموصى بها حسب إرشادات الشركة المصنعة. قم بعمل التعديلات اللازمة لتحسين الإشارة للعينات. صورة جميع العينات مقارنتها ببعضها البعض بنفس الإعدادات.
- ضمن علامة التبويب "اكتساب" من البرنامج، تعيين الحصول على صورة لاقتناء الإطار متسلسلة في اللوحة اليسرى السفلي "التفحص متسلسلة" بالتحقق من الخيار "بين الإطارات".
- تعيين تسلسل حيازتها.
ملاحظة: نكتسب fluorescence بروتينات فلورية خضراء أولاً لتفادي تدهور إشارة التجارة والنقل.
اعتماداً على مزيج فلوروفوريس التي يتم استخدامها بالإضافة إلى التجارة والنقل، التصوير إشارة fluorescence الطول الموجي الأطول أولاً قد تسفر عن نتائج أفضل. ومع ذلك، ينبغي أن يكون الأمثل بالترتيب الذي تعرض ليحث إذاعة استنزاف fluorophores أو بروتينات الفلورسنت وتصويرها الحصول على إشارات fluorescence أقوى وأفضل قرار. - تحديد وتعيين السلطة الليزر STED لكل فلوروفوري تحت علامة التبويب "الحصول على" البرمجيات، واستخدام شريط التمرير ل 592-نانومتر أو الليزر STED 660 نانومتر لضبط قوة الليزر. ضبط السلطة الليزر من استنفاد 592-شمال البحر الأبيض المتوسط للتجارة والنقل و 532 فلور أليكسا. ضبط قوة الليزر من استنفاد 660 نانومتر 568 فلور أليكسا.
- لزيادة دقة وتقليل الإشارات الخلفية، انتقل إلى إعدادات "حيازة" ضمن علامة التبويب "اكتساب" من البرنامج، زيادة على الخط و/أو الإطار المتوسط عن طريق تحديد قيمة أكبر من 1 باستخدام القائمة المنسدلة لكل خيار.
- أيضا، الحصول على إشارة الفلورية استخدام بوابات الوقت STED بالتحقق من الخيار النابضة ل fluorophore تحت علامة التبويب "اكتساب"، وتعيين القيم للساعة النابضة (راجع الملاحظة أدناه). زيادة قوة الليزر STED لتعزيز القرار، على الرغم من أن هذا سيزيد من فوتوبليتشينج فلوروفوريس.
ملاحظة: سوف تحتاج إلى الوقت النابضة الأمثل للمجهر وعينه، وفلوروفوريس المستخدمة. الساعة النابضة من 0.3 إلى 6 يوصي ns. بعد التثبيت، التجارة والنقل حساس بشكل خاص لليزر عالية الطاقة. للحد من فوتوبليتشينج للتجارة والنقل، وينبغي تطبيق النابضة الوقت وينبغي خفض قوة الليزر STED. - لالتقاط صور STED 3D، استخدم شريط التمرير لتغيير النقطة انتشار الدالة (PSF) إلى "STED ثلاثي الأبعاد".
- الحصول على صور متعددة لضمان إمكانية تكرار نتائج يدوياً. ديكونفولفي الصور (انظر الشكل 1) استخدام برمجيات deconvolution حزمة41(انظر الجدول للمواد).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ب خلايا تنتشر في Ig مكافحة المعطل تداولها، يوفر STED المجهري تستخدم بالاقتران مع برامج deconvolution الصور دقة أعلى من هياكل سيتوسكيليتال من الفحص المجهري [كنفوكل]. وهذا واضح في الشكل 1، حيث كانت تصور الشبكة أكتين و استخدام بروتوكول الموصوفة أعلاه. مقارنة بين [كنفوكل] وصور فائقة الدقة STED من نفس العينة تبين أن الصور STED من دقة أعلى، وتكشف عن أكثر تفصيلاً هياكل cytoskeleton أكتين (الشكل 1). كما يبين هذا الشكل أن deconvolution ضروري للحصول على صور ذات جودة عالية STED التي أكتين خيوط بأكثر وضوح. على الرغم من أن deconvolution صور [كنفوكل] غلة تحسنا كبيرا في دقة الصورة، ديكونفولفيد STED الصور معلومات أكثر تفصيلاً الهيكلية من الصور [كنفوكل] ديكونفولفيد. على وجه الخصوص، هو كشف الهيكل الجذعية من الطوق واكتين الطرفية بمزيد من التفصيل بالفحص المجهري STED (الشكل 1 و الشكل 2). وكان تصويرها الشبكة ميكروتوبولي في موقع الاتصال مستضد أيضا استخدام إعداد العينة والتصوير البروتوكول المذكورة أعلاه (الشكل 3). ميكروتوبوليس تنبع من نقطة مركزية، وهي بعد، وتصدر إلى الخارج نحو هامش الخلية. في هذه التجربة، سمح للخلايا ب ينتشر في Ig المغلفة المضادة كوفيرسليبس لمدة 15 دقيقة (الشكل 3)، نقطة وقت الذي تحركت بعد نحو موقع الاتصال مستضد17. يمكن رؤية مجموعات CLIP-170-التجارة والنقل أن علامة زائد-نهايات microtubules في نهايات ميكروتوبوليس هو مبين في الشكل 3. عند إعداد العينة وتصوير STED شبكة microtubule الأمثل والمستمر ومتميزة لاحظ microtubules، مع قصاصة-170-بروتينات فلورية خضراء المترجمة على طول في ميكروتوبوليس أو في نهايات الجمع (الشكل 3A). ميكروتوبولي دون المستوى الأمثل تلطيخ، الذي لوحظ عند استخدام تركيزات أقل من تلطيخ أجسام مضادة أو دفعات من α-tubulin الأجسام المضادة التي أكثر من سنة واحدة، النتائج في microtubules الظهور كأبواب متقطع أن تحل سيئة عند deconvolution (الشكل 3B؛ وانظر الشكل 5). على الرغم من أن جميع الأسفار CLIP-170-التجارة والنقل في هذه الصور المرتبطة مع هياكل α-توبولين-إيمونوستينيد، أحد لا يميز ما إذا كانت القصاصة-170-التجارة والنقل يقع في نهايات زائد، أو على طول microtubules، بسبب تلطيخ غير مكتملة من microtubules. ومن ثم فمن المهم أن جسم α-tubulin تخزينها تحت الشركة المصنعة أوصى بظروف التخزين واستخدامها خلال سنة واحدة.
باستخدام هذا البروتوكول، وصور ذات جودة عالية STED متعدد الألوان التي تظهر على تنظيم وهيكله cytoskeleton أكتين وشبكة ميكروتوبولي، فضلا عن البروتينات مثل IQGAP1 ومقطع-170 التي تربط بهذه سيتوسكيليتونس اثنين17، ويمكن الحصول عليها. وتظهر الصور STED في الشكل 4 الحلبة الطرفية الجذعية أكتين، فضلا عن ميكروتوبوليس التي تنبثق من موقع مركزي في الخلية حيث تلطيخ أكتين أقل بكثير من الكثافة. قصاصة-170-بروتينات فلورية خضراء في نهايات هذه microtubules يرتبط ارتباطاً وثيقا بالأجهزة الطرفية والاكتين. هذا البروتوكول يسمح أحد لتصور الهياكل سيتوسكيليتال على المشبك محصنة ضد استخدام لون واحد STED التصوير (الشكل 2) أو متعدد الألوان STED التصوير (رقم 3 و رقم 4). ومع ذلك، تجدر الإشارة إلى أن التصوير STED بلون واحد (الشكل 2) قد تسفر عن قرار أفضل من هياكل أكتين و microtubules في الخلايا ب من STED متعدد الألوان (الشكل 4). قد يكون هذا بسبب فوتوبليتشينج الناجمة عن اقتناء الصورة STED متسلسلة ل fluorophores مختلفة. للحصول على أفضل الصور القرار فائقة، والجمع بين فلوروفوريس والبروتينات الفلورية المحدد، فضلا عن تسلسل فيها أنهم يتم تصويرها باستخدام الليزر الإثارة واستنفادها، ينبغي أن يكون الأمثل للعينة. ومع ذلك، يوفر التصوير STED متعدد الألوان الصور دقة أعلى من هذه الهياكل سيتوسكيليتال من الفحص المجهري [كنفوكل] التقليدية. بالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام STED لون واحد للحصول على صور ثلاثية الأبعاد فائقة القرار شبكة الخلية بأكملها باكتين أو ميكروتوبولي (فيلم 1).
عند استخدام الخلايا transfected مع البروتينات الفلورية الانصهار، تحقيق مستويات التعبير الأمثل وتجنب القطع الأثرية بسبب أوفيريكسبريشن اعتبارات هامة. في الخلايا حيث يتم أوفيريكسبريسيد كليب-170-التجارة والنقل، تتشكل مجاميع كبيرة من قصاصة-170-التجارة والنقل (الشكل 5A). وبالإضافة إلى هذا ميسلوكاليزيشن كليب-170-التجارة والنقل، كان فقط جزء من شبكة ميكروتوبولي في هذه الخلية داخل المستوى البؤري الأقرب إلى ساترة (الشكل 5 (ب)). وهذا يوحي بأن overexpression CLIP-170 قد تعوق أيضا الاستقطاب الناجم عن المركز بعد. على العكس من ذلك، لأن إشارات قوية fluorescence مطلوبة عادة للحصول على صور ذات جودة عالية STED، ينتج التعبير منخفضة من البروتينات الفلورية الانصهار مثل قصاصة-170-بروتينات فلورية خضراء (الشكل 5) في رداءة نوعية الصور. ومن ثم، عند استخدام الخلايا التي قد تم transfected مع البروتينات الفلورية، من المهم أن الصورة فقط تلك الخلايا مع المستويات المثلى للتعبير البروتين الانصهار. من المهم أيضا أن نلاحظ أن البروتوكول الذي تم استخدامه ل A20 تعداء الخلايا (انظر الجدول للمواد) عادة النتائج في 20-50% من التعبير عن البروتين transfected الخلايا. بلازميد الحمض النووي (بدلاً من سيرناس)، الترددات تعداء للابتدائي ب الخلايا غالباً الكثير أقل من الخلايا A20، التي تتطلب استخدام خطوط الخلية ب. ومع ذلك، صور STED ذات جودة عالية من العناصر سيتوسكيليتال في الخلايا ب الابتدائي أونترانسفيكتيد يمكن الحصول على استخدام هذا البروتوكول (الشكل 6).
رقم 1: مقارنة من [كنفوكل] وتصوير STED أكتين و. [كنفوكل] (أعلى) والصور STED (أسفل) خلية A20 التي انتشرت في المغلفة مفتش مكافحة كوفيرسليبس لمدة 15 دقيقة قبل يجري ملطخة مترافق 532 فلور أليكسا فالويدين. استخدام مجهر STED [كنفوكل]، نفس الخلية تم تصويرها أولاً بالفحص المجهري [كنفوكل] ثم STED. الأولى [كنفوكل] وصور STED تظهر، جنبا إلى جنب مع نفس [كنفوكل] والصور STED بعد deconvolution. شريط الحجم: 5 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: cytoskeleton أكتين في موقع الاتصال مستضد. كانت ملطخة مترافق 568 فلور أليكسا فالويدين A20 الخلايا التي تم السماح بانتشار على المغلفة مفتش مكافحة كوفيرسليبس لمدة 15 دقيقة وتصويرها بالمجهر STED. كانت ديكونفولفيد الصور STED الأولى. لوحات ألف وباء ولوحات جيم-هاء إظهار صور الممثل من خلايا مختلفة اثنين. تظهر لوحة ه إجراء توسيع X 3 للمنطقة في المربع الأبيض في لوحة ج. شريط مقياس للوحات ألف-دال: مقياس بار ميكرومتر. 5 للوحة الإلكترونية: 1 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: صور STED شبكة ميكروتوبولي ومقطع-170-التجارة والنقل- الخلايا A20 معربا عن القصاصة-170-التجارة والنقل سمح بانتشار المغلفة مفتش مكافحة كوفيرسليبس لمدة 15 دقيقة قبل أن يجري إصلاح وإيمونوستينيد مع جسم α-tubulin بالإضافة إلى جسم ثانوي مترافق 532 فلور أليكسا. (أ) صورة الممثل عرض إيمونوستينينج شبكة ميكروتوبولي، مع قصاصة-170-بروتينات فلورية خضراء تقع أساسا في الجمع-نهايات microtubules. (ب) تلطيخ دون المستوى الأمثل والقرار من ميكروتوبوليس بسبب استخدام الأسهم التي عفا عليها الزمن من جسم α-tubulin. تغيير حجم أشرطة: 5 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: صور STED سيتوسكيليتونس أكتين و microtubule. الخلايا A20 معربا عن القصاصة-170-بروتينات فلورية خضراء سمح بانتشار على المغلفة مفتش مكافحة كوفيرسليبس لمدة 15 دقيقة قبل أن ثابت والملون مع مترافق 568 فلور أليكسا فالويدين لتصور واكتين وجسم α-tubulin بالإضافة إلى أليكسا فلور 532-مترافق جسم الثانوية لتصور microtubules. ألواح د ألف ولوحات ه و إظهار الصور الممثل من خلايا مختلفة اثنين. لوحة د إجراء توسيع X 3.5 للمنطقة في المربع الأبيض في لوحة ج. تغيير حجم أشرطة: 5 ميكرون للوحات ألف إلى جيم و هاء--واو؛ 1 ميكرومتر للفريق د. الصورة في لوحة نفس الصورة المستخدمة في الشكل 3 ألف ولكن يشمل التراكب للقناة واكتين. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 5: أمثلة للصور STED نوعية رديئة بسبب أوفيريكسبريشن أو التعبير غير كافية من البروتين الانصهار بروتينات فلورية خضراء- الخلايا A20 معربا عن القصاصة-170-التجارة والنقل سمح بانتشار على المغلفة مفتش مكافحة كوفيرسليبس لمدة 15 دقيقة قبل أن ثابت والملون كما في الشكل 4. (أ) (ب) موقع نتائج أوفيريكسبريشن كليب-170-التجارة والنقل في مجاميع كبيرة وغير طبيعية CLIP-170-التجارة والنقل (A) والبصر بعد الاستقطاب نحو جهة الاتصال مستضد (ب). (ج) تعويض عن التعبير غير كافية للقصاصة-170-التجارة والنقل عن طريق زيادة نتائج طاقة الليزر في رداءة نوعية STED الصور. تغيير حجم أشرطة: 5 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 6: صورة STED cytoskeleton microtubule في خلايا أولية ب. خلايا أولية ب الطحال مثقف ح 6 مع 5 نانوغرام/ميليلتر باف بالإضافة إلى 2.5 ميكروغرام/مل لبس، وثم السماح بانتشار لمدة 15 دقيقة على كوفيرسليبس التي قد تم المغلفة بالأجسام المضادة IgM. الخلايا ثم الثابتة وملطخة بجسم α-tubulin بالإضافة إلى جسم ثانوي مترافق أليكسا فلور 568 لتصور microtubules. يتم عرض صورة تمثيلية. شريط الحجم: 5 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الفيلم 1: 3D التعمير شبكة microtubule الخلية ب. الخلايا A20 سمح بانتشار المغلفة مفتش مكافحة كوفيرسليبس لمدة 15 دقيقة قبل أن يجري إصلاح وإيمونوستينيد مع جسم α-tubulin بالإضافة إلى جسم ثانوي مترافق 488 فلور أليكسا. تم القبض على شرائح Z في 0.2 ميكرون خطوة أحجام لما مجموعة 37 الإطارات. تم إعادة إعمار 3D استخدام مجهر STED في برامج التصوير. من فضلك انقر هنا لمشاهدة هذا الفيديو. (انقر بالزر الأيمن التحميل.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يمكن الحصول على صور مفصلة للهياكل سيتوسكيليتال باستخدام مجهرية فائقة القرار STED، الذي يمكن نظرياً أن التوصل إلى قرار 50 نانومتر، مقارنة بالفحص المجهري [كنفوكل] التقليدية، الذي هو قرار حيود محدودة ~ 200 nm 24-كما تم تعزيز القدرة على حل الهياكل الدقيقة باستخدام البرمجيات deconvolution لحساب الموقف الأكثر احتمالاً لمصدر الضوء الأصلي من إشارة الملاحظة fluorescence "غير واضحة". ويصف هذا البروتوكول أساليب لاستخدام STED بصورة سيتوسكيليتونس أكتين وميكروتوبولي، فضلا عن البروتينات المرتبطة سيتوسكيليتون.
تنشيط الخلية بالحث على إعادة عرض cytoskeleton أكتين وشبكة ميكروتوبولي، مع تنظيم منسق سيتوسكيليتونس اثنين يجري مهم للمناعة المشبك تشكيل17،42. تم الأمثل للتصوير في نفس الوقت سيتوسكيليتونس أكتين وميكروتوبولي في موقع الاتصال مستضد STED متعدد الألوان باستخدام الطريقة التي نقدم، ولكن ينطبق بالمثل على STED أحادية اللون. وتنظم الدراسات السابقة التي أجريناها على تسليط الضوء على سيتوسكيليتون خلية بان STED يمكن أن يوفر رؤى جديدة في هياكل كيف الخلوية وكيفية تفاعلها مع بعضها البعض. باستخدام مجهر الأسفار الداخلية [كنفوكل] ومجموع (TIRF)، قد لاحظنا أن microtubules الاتصال حلقة أكتين و في محيط موقع الاتصال مستضد17. استخدام الفحص المجهري STED، كنا قادرين على إظهار أن نهايات microtubules التي اتسمت بالإضافة إلى + نصيحة CLIP-170 المعاون عن كثب مع شبكة أكتين الجذعية في محيط الخلية (انظر الشكل 4).
عدة عوامل تؤثر على تقنية التصوير التي هي الأكثر ملاءمة لتطبيق معين. وتشمل هذه القرار المطلوب، الهياكل التي يتم تصويرها، تقنية وضع العلامات والإشارات إلى الضجيج نسبة (أي، التباين)، شراء الوقت، سهولة إعداد العينات، وإمكانية تكرار نتائج. إعداد نموذج ل STED لا تختلف اختلافاً كبيرا من أجل الفحص المجهري [كنفوكل]، وأنه يجمع بين الدقة العالية مع الحصول على الصور السريع. ومن مزايا رئيسية ل STED هو هو عملية ضوئية التي تكتسب الصورة مباشرة من العينة، ويمكن تعديلها القرار بتغيير قوة الليزر STED24. خلافا للدولة الأرض استنفاد القرار فائقة مجهرية، الذي يعيد الصور من آلاف صور المتعاقبة يلتقط والمعالجة الحسابية واسعة النطاق ليس مطلوباً ل STED وتجنب الأخذ بالتحف التعمير الصورة 24-بيد أن التباين في الصور STED هو غالباً منخفضة24، في أي معالجة الصور بعد انتهاء القضية باستخدام برامج مثل إيماجيج قد تكون ضرورية لتعزيز التباين. وهذا أهمية خاصة بالنسبة للصور مع هياكل كثيفة، مثل شبكة أكتين الجذعية. لتحسين تباين الصورة أثناء الحصول على الصور، واحدة يمكن الحد من استنزاف قوة الليزر و/أو تطبيق خط أو الإطار المتوسط. عن طريق بوابة الوقت STED، الذي يلتقط الفوتونات بعد تأخير زمني مجموعة المستخدم، يمكن زيادة دقة بتقليل المنطقة التي هي الفوتونات التي جمعت24،43. نوصي بالاستفادة المثلى من تصوير STED هياكل cytoskeletal على المشبك محصنة باستخدام مزيج من هذه الطرق لتحسين التباين والقرار.
حاليا، فلوروفوريس ليست كلها الأمثل للتصوير مع STED، وليس جميع تركيبات فلوروفوري مناسبة للحصول على صور STED متعدد الألوان. التكيف حذراً من النطاقات كشف أمر مهم لضمان الحد الأدنى خلال تنزف من فلوروفوريس إلى القنوات المجاورة. مزيج فلوروفوريس المستخدمة في هذا البروتوكول (أيالتجارة والنقل، 532 فلور أليكسا واليكسا فلور 568) الأمثل لتصوير فائقة القرار STED متعدد الألوان. مقارنة بإضاءة منظم مجهرية (SIM) وأساليب التعريب جزيء مفرد (سملم)، مثل تنشيط صور التعريب مجهرية (النخيل)، STED ليست عادة مثالية لتصوير متعدد الألوان. ومع ذلك، نعرض هنا أن التشبع المفرط طفيف للكشف عن فلوروفوري، المقترنة مع أدوات معالجة الصور البسيطة، يمكن تسليم الاستبانة متعدد الألوان من سيتوسكيليتونس أكتين و microtubule.
هذا البروتوكول لتصوير STED هياكل cytoskeletal كشفت تفاصيل جديدة عن العمارة سيتوسكيليتال في المشبك المناعية الخلية ب. على الرغم من أننا الأمثل هذا البروتوكول للتصوير سيتوسكيليتونس أكتين وميكروتوبولي في موقع مستضد-اتصل ب الخلايا، هذه الأساليب ينبغي أن تنطبق على أنواع الخلايا الأخرى، لا سيما الخلايا المناعية (الخلايا T، ناغورني كاراباخ الخلايا، خلايا ماست، إلخ) التي تشكل الاشتباكات العصبية المناعية. وعلاوة على ذلك، يمكن توسيع الأداة المساعدة لهذا البروتوكول لطلاء كوفيرسليبس مع غيرها يغاندس أو ركائز لاصقة. ومع ذلك، من المهم أن البروتوكول وإعدادات اقتناء الصورة لنوع الخلية وتركيب تجريبي على النحو الأمثل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
ونحن نشكر "مرفق التصوير معهد علوم الحياة جامعة كولومبيا البريطانية" (LSI) لدعم وصيانة المجهر STED. تم تمويل هذا العمل بمنحه #68865 من "المعاهد الكندية للبحوث الصحية" (M.R.G.). ونشكر الدكتور كوزو كايبوتشي (جامعة ناغويا، ناغويا، اليابان) على بلازميد CLIP-170-التجارة والنقل.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture | |||
| A20 mouse B-lymphoma cells | ATCC | TIB-208 | Murine B-cell lymphoma of Balb/c origin that expresses an IgG-containing BCR on its surface |
| RPMI-1640 | Thermo Fisher Scientific | R0883 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 12483020 | Heat inactivate at 56 oC for 30 min |
| 2-mercaptoethanol | Millipore Sigma | M3148 | |
| Glutamine | Millipore Sigma | G5763 | |
| Sodium pyruvate | Millipore Sigma | P5280 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Liquid, 10,000 units |
| Additional materials for primary B cells | |||
| 70-µm cell strainer | Corning | 352350 | |
| Magnetic bead-based B cell isolation kit | Stemcell Technologies | 19854 | EasySep Mouse B cell Isolation kit |
| Lipopolysaccharide (LPS) | Millipore Sigma | L4391 | LPS from E. coli 0111:B4 |
| B cell-activating factor (BAFF) | R&D Systems | 2106-BF-010 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Transfection | |||
| Plasmid encoding CLIP-170-GFP | Gift from Dr. Kozo Kaibuchi (Nagoya Univ., Nagoya, Japan); described in Fukata et al. Cell 109:873-885, 2002 | ||
| Recommended transfection reagents and equipment | |||
| Amaxa Nucleofection kit V | Lonza | VCA-1003 | Follow the manufacturer's directions for mixing the transfection reagents with the DNA |
| Amaxa Nucleofector model 2b | Lonza | AAB-1001 | Program L-013 used |
| Falcon 6-well plates, TC treated, sterile | Corning | 353046 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Coating coverslips | |||
| 18-mm diameter round #1.5 cover glasses | Thomas Scientific | 1217N81 | Similar product: Marienfield-Superior catalogue #117580 |
| Forceps | Fisher Scientific | 1381242 | Dissecting extra fine splinter forceps |
| Falcon 12-well sterile tissue polystyrene tissue culture plate | Corning | 353043 | |
| 100% methanol | Fisher Scientific | A412-4 | |
| Sterile phosphate buffered saline (PBS) without calcium or magnesium | Thermo Fisher Scientific | 10010049 | |
| Goat-anti-mouse IgG antibody | Jackson ImmunoResearch | 115-005-008 | For A20 cells |
| Goat-anti-mouse IgM antibody | Jackson ImmunoResearch | 115-005-020 | For primary mouse B cells |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Staining | |||
| Paraformaldehyde (16% stock solution) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Dilute with PBS to working concentration |
| Glutaraldehyde (50% stock solution) | Millipore Sigma | 340855 | Dilute with PBS to working concentration |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | |
| Saponin | Millipore Sigma | S2149 | |
| Bovine serum albumin (BSA), Fraction V | Millipore Sigma | 10735094001 | |
| Rabbit anti-tubulin antibody | Abcam | ab52866 | 1:250 dilution recommended but should be optimized |
| Alexa Fluor 532-conjugated goat anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | A11009 | 1:100 dilution recommended but should be optimized |
| Alexa Fluor 568-conjugated phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12380 | 1:100 dilution recommneded but should be optimized |
| Prolong Diamond Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36970 | Without DAPI |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Parafilm | VWR | P1150-2 | |
| HEPES | Millipore Sigma | H3375 | |
| NaCl | Fisher Scientific | BP358 | |
| KCl | Millipore Sigma | P9333 | |
| CaCl2 | Millipore Sigma | C1016 | |
| Na2HPO4 | Fisher Scientific | S374-500 | |
| MgSO4 | Fisher Scientific | M63 | |
| Dextrose | Fisher Scientific | D16-500 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscopy | |||
| Leica SP8 TCS STED microscope | Leica | ||
| Huygens deconvolution software | Scientific Voume Imaging | See https://svi.nl/HuygensProducts |
References
- Harwood, N. E., Batista, F. D. The cytoskeleton coordinates the early events of B-cell activation. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (2), a002360 (2011).
- Batista, F. D., Treanor, B., Harwood, N. E. Visualizing a role for the actin cytoskeleton in the regulation of B-cell activation. Immunol Rev. 237 (1), 191-204 (2010).
- Harwood, N. E., Batista, F. D. Early events in B cell activation. Annu Rev Immunol. 28, 185-210 (2010).
- Batista, F. D., Harwood, N. E. The who, how and where of antigen presentation to B cells. Nat Rev Immunol. 9 (1), 15-27 (2009).
- Kumari, S., et al. T cell antigen receptor activation and actin cytoskeleton remodeling. Biochim Biophys Acta. 1838 (2), 546-556 (2014).
- Dustin, M. L. Visualization of Cell-Cell Interaction Contacts: Synapses and Kinapses. Self Nonself. 2 (2), 85-97 (2011).
- Dustin, M. L., Chakraborty, A. K., Shaw, A. S. Understanding the Structure and Function of the Immunological Synapse. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2 (10), a002311 (2010).
- Dustin, M. L. Modular design of immunological synapses and kinapses. Cold Spring Harb Perspect Biol. 1 (1), a002873 (2009).
- Dustin, M. L. Visualization of cell-cell interaction contacts-synapses and kinapses. Adv Exp Med Biol. 640, 164-182 (2008).
- Dustin, M. L. Hunter to gatherer and back: immunological synapses and kinapses as variations on the theme of amoeboid locomotion. Annu Rev Cell Dev Biol. 24, 577-596 (2008).
- Dustin, M. L. T-cell activation through immunological synapses and kinapses. Immunol Rev. 221, 77-89 (2008).
- Grakoui, A., et al. The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation. Science. 285 (5425), 221-227 (1999).
- Monks, C. R., et al. Three-dimensional segregation of supramolecular activation clusters in T cells. Nature. 395 (6697), 82-86 (1998).
- Yuseff, M. I., et al. How B cells capture, process and present antigens: a crucial role for cell polarity. Nat Rev Immunol. 13 (7), 475-486 (2013).
- Mattila, P. K., Batista, F. D., Treanor, B. Dynamics of the actin cytoskeleton mediates receptor cross talk: An emerging concept in tuning receptor signaling. J Cell Biol. 212 (3), 267-280 (2016).
- Kuhn, J. R., Poenie, M. Dynamic polarization of the microtubule cytoskeleton during CTL-mediated killing. Immunity. 16 (1), 111-121 (2002).
- Wang, J. C., et al. The Rap1-cofilin-1 pathway coordinates actin reorganization and MTOC polarization at the B cell immune synapse. J Cell Sci. 130 (6), 1094-1109 (2017).
- Schnyder, T., et al. B cell receptor-mediated antigen gathering requires ubiquitin ligase Cbl and adaptors Grb2 and Dok-3 to recruit dynein to the signaling microcluster. Immunity. 34 (6), 905-918 (2011).
- Nath, S., et al. Dynein Separately Partners with NDE1 and Dynactin To Orchestrate T Cell Focused Secretion. J Immunol. 197 (6), 2090-2101 (2016).
- Combs, J., et al. Recruitment of dynein to the Jurkat immunological synapse. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (40), 14883-14888 (2006).
- Akhmanova, A., Steinmetz, M. O. Control of microtubule organization and dynamics: two ends in the limelight. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (12), 711-726 (2015).
- Akhmanova, A., Steinmetz, M. O. Microtubule +TIPs at a glance. J Cell Sci. 123 (20), 3415-3419 (2010).
- Fukata, M., et al. Rac1 and Cdc42 capture microtubules through IQGAP1 and CLIP-170. Cell. 109 (7), 873-885 (2002).
- Wegel, E., et al. Imaging cellular structures in super-resolution with SIM, STED and Localisation Microscopy: A practical comparison. Sci Rep. 6, 27290 (2016).
- Huang, B., Bates, M., Zhuang, X.
- Mace, E. M., Orange, J. S. Dual channel STED nanoscopy of lytic granules on actin filaments in natural killer cells. Commun Integr Biol. 5 (2), 184-186 (2012).
- Ritter, A. T., et al. Actin depletion initiates events leading to granule secretion at the immunological synapse. Immunity. 42 (5), 864-876 (2015).
- Tamarit, B., et al. Membrane microdomains and cytoskeleton organization shape and regulate the IL-7 receptor signalosome in human CD4 T-cells. J Biol Chem. 288 (12), 8691-8701 (2013).
- Brown, A. C., et al. Super-resolution imaging of remodeled synaptic actin reveals different synergies between NK cell receptors and integrins. Blood. 120 (18), 3729-3740 (2012).
- Dupre, L., et al. T Lymphocyte Migration: An Action Movie Starring the Actin and Associated Actors. Front Immunol. 6, 586 (2015).
- Rak, G. D., et al. Natural killer cell lytic granule secretion occurs through a pervasive actin network at the immune synapse. PLoS Biol. 9 (9), e1001151 (2011).
- Lin, K. B., et al. The Rap GTPases regulate the migration, invasiveness and in vivo dissemination of B-cell lymphomas. Oncogene. 29 (4), 608-615 (2010).
- Lin, K. B., et al. The rap GTPases regulate B cell morphology, immune-synapse formation, and signaling by particulate B cell receptor ligands. Immunity. 28 (1), 75-87 (2008).
- McLeod, S. J., et al. The Rap GTPases regulate integrin-mediated adhesion, cell spreading, actin polymerization, and Pyk2 tyrosine phosphorylation in B lymphocytes. J. Biol. Chem. 279 (13), 12009-12019 (2004).
- Christian, S. L., et al. Activation of the Rap GTPases in B lymphocytes modulates B cell antigen receptor-induced activation of Akt but has no effect on MAPK activation. J Biol Chem. 278 (43), 41756-41767 (2003).
- Batista, F. D., Iber, D., Neuberger, M. S. B cells acquire antigen from target cells after synapse formation. Nature. 411 (6836), 489-494 (2001).
- Treanor, B., et al. Dynamic cortical actin remodeling by ERM proteins controls BCR microcluster organization and integrity. J Exp Med. 208 (5), 1055-1068 (2011).
- Mattila, P. K., et al. The actin and tetraspanin networks organize receptor nanoclusters to regulate B cell receptor-mediated signaling. Immunity. 38 (3), 461-474 (2013).
- Yuseff, M. -I., et al. Polarized Secretion of Lysosomes at the B Cell Synapse Couples Antigen Extraction to Processing and Presentation. Immunity. 35 (3), 361-374 (2011).
- Mace, E. M., Orange, J. S. Visualization of the immunological synapse by dual color time-gated stimulated emission depletion (STED) nanoscopy. J Vis Exp. (85), (2014).
- Russ, J. C. The Image Processing Handbook, Sixth Edition. , CRC Press. (2011).
- Stinchcombe, J. C., et al. Centrosome polarization delivers secretory granules to the immunological synapse. Nature. 443 (7110), 462-465 (2006).
- Vicidomini, G., et al. Sharper low-power STED nanoscopy by time gating. Nat Methods. 8 (7), 571-573 (2011).
