Summary
Esse método pode ser usado para medir a síntese do RNA. 5-Bromouridine é adicionado às células e incorporado na RNA sintetizado. Síntese de RNA é medido pela extração do RNA imediatamente depois da rotulagem, seguido de 5-Bromouridine-alvo da imunoprecipitação de rotulados RNA e análise por transcrição reversa e reação em cadeia da polimerase quantitativa.
Abstract
Quando os níveis de estado estacionário do RNA são comparados entre duas condições, não é possível distinguir se as alterações são causadas por alterações na produção ou degradação do RNA. Este protocolo descreve um método para a medição da produção de RNA, usando 5-Bromouridine de rotulagem do RNA seguido por imunoprecipitação, que permite a investigação do RNA sintetizado dentro de um curto espaço de tempo (por exemplo, 1 h). A vantagem de 5-Bromouridine-rotulagem e imunoprecipitação sobre o uso de inibidores de transcriptional tóxicos, tais como α-amanitin e actinomicina D, é que não há nenhum ou muito baixos efeitos na viabilidade celular durante o uso a curto prazo. No entanto, porque 5-Bromouridine-imunoprecipitação captura apenas RNA produzido dentro do tempo curto de rotulagem, lentamente produzido, bem como rapidamente degradada RNA pode ser difícil de avaliar por esse método. O RNA 5-Bromouridine-rotulados capturado por imunoprecipitação-5-Bromouridine pode ser analisado por transcrição reversa e reação em cadeia da polimerase quantitativa na próxima geração de sequenciamento. Todos os tipos de RNA podem ser investigados, e o método não está limitado a medição do mRNA, tal como é apresentado neste exemplo.
Introduction
5-Bromouridine (BrU) imunoprecipitação (IP) permite o estudo da produção de RNA em células com n ou efeitos muito limitados na fisiologia de células durante o breve período1,2de rotulagem. O método baseia-se a incorporação do derivado sintético uridina BrU em RNA recém sintetizado seguido pelo IP do RNA rotulado usando anticorpos anti-BrU (Figura 1).
Tem sido conhecido por décadas a síntese de proteínas pode ser transcriptionally regulado, e a existência de factores de transcrição foi hipotetisada há mais de 50 anos3. Hoje, é conhecido que várias doenças são causadas pela desregulação de transcrição e a estabilidade do RNA (S1 Figura complementar em referência4), e a capacidade de medir as mudanças na produção do RNA é de grande importância na doença de compreensão desenvolvimento.
Por outro lado, ferramentas para regular a produção de RNA fornecem novas possibilidades para o tratamento de doenças causadas pela expressão de proteína muito pouco ou demais, ou acúmulo de proteína, como na doença de Parkinson (PD). A proteína predominante acumulando agregados como insolúveis em PD é α-synuclein, e o nível de α-synuclein está diretamente ligado à doença, como a multiplicação de gene do gene da α-synuclein causa familiar PD5. Além disso, α-synuclein agrega de forma dependente de concentração. Downregulation dos níveis de mRNA de α-synuclein, portanto, é uma estratégia terapêutica interessante, que tem sido conseguida com êxito usando a interferência do RNA para diminuir a perda de célula neuronal em modelos de roedores de PD6,7.
É importante ser capaz de medir as mudanças na produção de RNA causada por doença ou intervenções terapêuticas. Métodos de última geração para medição níveis de estado estacionário de RNA, como a transcrição reversa seguida de reação em cadeia da polimerase quantitativa (RT-qPCR), não são capazes de distinguir entre alterações causadas por regulamento transcriptional ou alterados Estabilidade do RNA. Um método amplamente utilizado para a investigação de taxas de decaimento de RNA está bloqueando da maquinaria transcricional usando compostos tais como α-amanitin ou actinomicina D, seguido por medições de RNAs os decadentes. No entanto, existem alguns problemas associados com um bloqueio geral da transcrição em células, como a indução de apoptose8,9. Ao lado dos efeitos citotóxicos, inibidores transcriptional também apresentam vários problemas técnicos, como a lenta absorção celular de α-amanitin e falta de especificidade de actinomicina D (revisto em referência10).
Para evitar o bloqueio total da transcrição, têm sido utilizados análogos de nucleotídeos, tais como uridina 5-ethynyl (5-UE), 4-thiouridine (TU-4) e BrU. Estes são prontamente ocupados por células de mamíferos e incorporadas RNA recém sintetizado, permitindo pulso-rotulagem do RNA dentro de um intervalo de tempo específico. BrU é menos tóxico do que o 5-UE e 4-TU, tornando-se o preferido análogo escolha11,12.
BrU-IP pode ser usado para investigar tanto a taxa de síntese de RNA e estabilidade e, portanto, distinguir entre as causas de alterações no RNA total. Este artigo incidirá sobre a medição de síntese de RNA e refere-se a referência2 para obter detalhes sobre a investigação da estabilidade do RNA. Para investigar a síntese do RNA, as células são brevemente rotuladas com BrU , por exemplo, para 1 h, seguido por BrU-IP1 (Figura 1). Isso permite que as medições do RNA sintetizado no curto prazo rotulagem e mudanças observadas dará uma melhor estimativa de regulamentos na síntese de RNA do que através da medição de alterações no RNA total por RT-qPCR. Deve ser mencionado, no entanto, que, apesar do tempo de rotulagem, por exemplo, apenas 1 h, degradação ainda pode ter uma influência sobre os níveis de RNA observada.
RNA de experimentos de BrU-IP são adequados para análise a jusante por tanto RT-qPCR1 ou próxima geração sequenciamento2,13. Outros métodos de detecção de RNA padrão, tais como a mancha do Norte ou ensaio da proteção ribonuclease, podem também ser aplicáveis para certos RNAs.
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Protocol
Nota: Executar todas as etapas à temperatura ambiente, salvo indicação em contrário e manter buffers no gelo ou na geladeira (exceto a partir da eluição de buffer contendo SDS). O protocolo é dividido em 5 seções: amostras de preparação do RNA; preparação dos grânulos para IP; ligação do RNA BrU-rotulados de grânulos; eluição e purificação do RNA acoplado com rótulo BrU, pela extração de fenol-fenol/clorofórmio-clorofórmio 3 passos; análise do RNA (no exemplo usando RT-qPCR)
1. preparação de amostras do RNA
- HEK293T contagem de células usando uma célula automatizada counter e sementes 3.500.000 células em um prato de petri de 10 cm em meios de crescimento de 10 mL (meio modificado águia de Dulbecco suplementada com 10% de soro fetal bezerro e 50 µ g/mL penicilina/estreptomicina) para obter um total de > 40 µ g de RNA Após 48 h extração mais tarde. Manter as células em 37 ° C e 5% de CO2.
- 48 h após a semeadura, Aspire o meio de crescimento de 8 mL e deixar 2 mL para trás para evitar que sequem as células. Adicionar 2 mM BrU e qualquer tratamento para os 8 mL aspirado meios de crescimento e remover o resíduo 2 mL das células antes de reaplicar o 8ml BrU contendo meio de crescimento. Evite o uso de mídia fresco a pedido do BrU às células, pois isto pode induzir alterações na expressão gênica.
- Incube as celulas por 1h com BrU e tratamento. Lavar as células no buffer do Hank 5ml e trypsinize as células usando a tripsina 0,05% de 2 mL. Adicione mídia de crescimento de 8 mL para parar a reação, transfira as células para um tubo de 15 mL e spin para baixo as células por 2 min a x 1.000 g.
- Remover o sobrenadante e extrair o centrifugado usando um isolamento de RNA RNA total kit (veja a Tabela de materiais) ou qualquer outro método preferencial e eluir em livre de RNase H2O. loja o RNA a-80 ° C até que esteja pronto para prosseguir.
2. preparação dos grânulos para IP
- Prepare-se para o número de amostras a ser investigado mais um extra para contabilizar a perda durante a pipetagem e girar a mistura grânulos em lotes. Resuspenda grânulos magnéticos do IgG anti-rato completamente através da mistura de turbilhão e tirar 20 grânulos µ l por amostra em um tubo de 1,5 mL RNase-livre. O tubo de 1,5 mL em um carrinho magnético e deixar aproximadamente 20 s para os grânulos de lugar para recolher no lado.
- Remover o sobrenadante, retire o tubo do suporte magnético e Resuspenda em buffer de BrU-IP 400 µ l 1 x pipetando. Girar o tubo muito brevemente para 2 s em uma centrífuga de mesa, colocá-lo de volta no suporte magnético e remover o sobrenadante. Repita a etapa de lavagem uma vez.
- Vinculação inespecífica de bloco para as contas usando heparina. Resuspenda as contas em 1 mL 1 x BrU-IP + 1 mg/mL de tampão heparina e deixe o rotacionando para lavagem de 30 min. as contas de uma vez, como no passo 2.2.
Nota: A heparina é um polímero carregado negativamente, que irá competir com RNAs para vinculação. tRNA ou outros RNAs irrelevantes também podem ser usados se o aplicativo a jusante não é sequenciamento. - Resuspenda as contas em 1 mL 1 x buffer de BrU-IP e adicionar 1,25 µ g/amostra anticorpo anti-α-Bromodeoxyuridine, que também reconhece o BrU. Incubar os grânulos por 1h rodando, ou durante a noite em temperatura ambiente.
- Lave os grânulos três vezes, como no passo 2.2. Resuspend os grânulos no buffer de BrU-IP 50 µ l da amostra/1X suplementado com 1 mM BrU e deixar rotação por 30 min diminuir a sensibilidade do anticorpo ligado aos talões e por este meio o risco de ligação inespecífica durante o IP.
- Lave os grânulos três vezes como na etapa 2.2 e ressuspender em buffer de 50 µ l da amostra/1xBrU-IP.
3. ligação do RNA BrU-rotulados de grânulos
- Medida de concentrações de RNA nos extratos do RNA da etapa 1.3 utilizando espectrofotometria ultravioleta-visível e diluir a 40 µ g/ml RNA de cada amostra livre de RNase H2O para um volume total de 200 µ l.
- Calor de amostras do RNA por 2 min a 80 ° C para desnaturar o RNA e spin brevemente em uma centrífuga do tabletop. Adicione 200 µ l 2 x inibidor de RNAse/BrU-IP + BSA.
- Adicione 50 µ l resuspended e preparado grânulos da etapa 2.6 para cada amostra e deixar a rotação lavagem de 1 h. os grânulos quatro vezes como no passo 2.2.
4. eluição e purificação de RNA pela extração de fenol-fenol/clorofórmio-clorofórmio 3 passos
-
Eluir RNA e realizar a extração do fenol
- Resuspend os grânulos no tampão de eluição 200 µ l para Eluir o RNA e rapidamente posteriormente adicionar 200 fenol µ l, pH 6,6 (cuidado: tóxica, ver nota abaixo passo 4.1.2) para remover todas as moléculas de RNA não-da amostra.
- Giro mix a amostra e rotação 3 min a 25.000 x g em uma centrífuga do tabletop.
Nota: O fenol é tóxico e deve ser tratada em uma coifa usando a proteção da pele. O pH ligeiramente ácido garante que apenas RNA e não o DNA, é extraído. O RNA permanecerá na fase aquosa superior devido à natureza hidrofílica das acusações. Os núcleos hidrofóbicos das proteínas irão Vincular de fenol e mover-se para a fase orgânica fenol inferior.
-
Realizar a extração do fenol-clorofórmio
- Aspirar o máximo superior-fase quanto possível (aproximadamente 190 µ l de 200 µ l, dependendo da experiência na manipulação) e movê-lo para um tubo com 200 µ l fenol/clorofórmio, pH 6,6 (cuidado: tóxica, ver nota). Certifique-se de aspirar a mesma quantidade através de amostras.
- Giro misturar a amostra e rotação por 3 min a 25.000 x g.
Nota: Clorofórmio é tóxico e deve ser tratado em uma coifa usando a proteção da pele. Clorofórmio é adicionado para remover o fenol, que pode afetar a análise a jusante do RNA inibindo a transcrição reversa14 e polymerase de reacções em cadeia15.
- Realizar a extração de clorofórmio aspirando a fase aquosa superior como antes (agora aproximadamente 180 µ l) e transferir para um tubo contendo 200 clorofórmio µ l. Redemoinho misturar a amostra e girar 3 min a 25.000 x g.
- Aspire a fase aquosa superior como antes (agora aproximadamente 170 µ l) e transferir para um tubo contendo 17 µ l (volume de 1/10) M 3 CH3COONa, pH 6.0. Para neutralizar e precipitar o RNA a partir da solução aquosa, adicione 2 µ l o glicogénio (20 mg/mL), que precipita juntamente com RNA e torna mais visível, a pelota do RNA.
- Adicione etanol a 96% 500 µ l para aumentar a ligação entre os íons de sal e RNA e misture por inversão do tubo algumas vezes. Deixe o tubo durante a noite a-20 ° C ou 15 min no gelo seco.
- Girar a amostra a 25.000 x g, 4 ° C por 30 min. Discard sobrenadante sem perturbar o sedimento e lave o pellet em 185 µ l 75% de etanol para remover qualquer sal residual. Girar a 25.000 x g, 4 ° C por 5 min.
- Descartar o sobrenadante completamente sem perturbar o sedimento e deixar a pelota para secar 5-10 min com uma tampa aberta. Resuspenda em 10 µ l livre de RNase H2O aplicado na lateral do tubo para evitar perturbar a pelota.
5. análise do RNA
- Preparar o cDNA usando uma transcrição reversa do cDNA kit (veja a Tabela de materiais) ou qualquer outro preferido método usando 2 µ l da amostra do RNA e RNA total de 1 µ g fermento como portador do RNA para a reação de síntese de cDNA (não é usada se o cDNA é usado para sequenciamento de próxima geração). Use 1 µ g RNA sem fermento do RNA para a preparação de cDNA de entrada correspondente.
- CDNA diluído 01:25 e mistura 9 µ l diluída cDNA com 10 µ l de qPCR mestre mistura e 1 µ l da sonda fluorogenic, ambos especificados na Tabela de materiais.
Nota: A diluição do cDNA depende da preparação do cDNA e qPCR método usado. - Execute o seguinte programa de qPCR (por exemplo, em um sistema rápido de real-time PCR 7500 ou equivalente): 2 min a 50 ° C, 20 s a 95 ° C, 40 ciclos de 3 s a 95 ° C e 30 s a 60 ° C.
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Representative Results
Nossos testes iniciais de tempo BrU-rotulagem foram realizados em células AsPC-1. As células foram tratadas com BrU para 0, 1, 2 e 4,5 h, seguido por extração de RNA total e BrU-IP. GAS5 e GAPDH foram medidos em BrU-IP do RNA, que demonstrou que a rotulagem de 1h foi suficiente para atingir uma aproximadamente 9 - e 44 vezes mudança em relação ao fundo (h 0) GAPDH e GAS5, respectivamente.
BrU-IP e a análise descrita acima foram usados para investigar se as alterações descobriram estado estacionário dos níveis de mRNA de α-synuclein em cima do Polo, como quinase 2 (PLK-2) de inibição foram causadas por alterações na síntese de mRNA1. Um tempo de 1h rotulagem foi escolhido porque este fornece suficiente rotulagem em relação ao fundo (Figura 2) e também permite que o tempo de tratamento ter um efeito. tratamento de BrU 2 mM não induzir alterações morfológicas nas células HEK293T para 1 h ou o tratamento mais de 4 h (Figura 3A).
Α-Synuclein transfectadas HEK293T células foram tratadas por 1h com DMSO ou um inibidor específico do PLK-2 (PLK-2i) na presença de BrU para rotular o RNA recém sintetizado. As células foram colhidas daqui por diante e o RNA total foi extraído. BrU-rotulados RNA produzido dentro do tratamento de 1h foi coletado usando BrU-IP ("BrU-IP" na Figura 3B) da área total do RNA ("entrada" na Figura 3B). A quantidade de RNA obtido com BrU-IP 40 µ g material começar varia entre linhagens celulares diferentes, e geralmente obtemos aproximadamente 500 ng de HEK293T células, mas apenas 10-50 ng de células HeLa. PLK-2 inibição causou um aumento no mRNA α-synuclein na entrada e BrU-IP (Figura 3B), sugerindo que o aumento no estado estacionário que RNA é causado pelo aumento da síntese de RNA. Para garantir que PLK-2i não só causa um aumento global na produção de RNA, 3 genes endógenos adicionais (ACTB, HMBS e NADH) foram medidos (Figura 4). Nenhum destes genes foi aumentada na entrada (Figura 4A) e BrU-IP (Figura 4B), tratamento de PLK-2i.
Para validar a especificidade do BrU-IP, um controle com células não-BrU tratado foi incluído. Foram comparados os níveis de 18sRNA capturado por BrU-IP de células BrU-tratados e não tratadas (Figura 5). Isto demonstra claramente que o BrU-IP é altamente específico e capta apenas uma fração muito pequena do RNA não rotuladas (Figura 5).
Porque o RNA com rótulo BrU é produzido somente dentro de 1h, é importante escolher um gene de referência adequada, uma vez que alguns genes normalmente apropriados podem ser expressa em concentrações muito baixas para ser confiável. 18sRNA foi escolhido como um gene de referência para os dados apresentados na Figura 3B e Figura 4 por causa de sua alta abundância. Vários genes de referência, no entanto, testaram-se, e alguns mostraram a ciclos limite alto (> 30) (Figura 6). Esses dados também demonstram que a diferença entre rótulo BrU IP'ed RNA e RNA total na entrada é aproximadamente 5 do Ct e alguns RNAs expressos em quantidades baixas na célula podem, portanto, não ser corretamente detectado após BrU-IP.
Figura 1: Descrição de BrU-IP para investigação da síntese do RNA. (A) RNA é transcrito em células de DNA por ARN-polimerase. (B) mediante adição para a mídia, BrU é ocupada por células e incorporado o RNA recém transcrito. (C) para medir as taxas de síntese de RNA: RNA (1) recém sintetizado é rotulado por 1h com BrU, (2) o RNA é extraído das células imediatamente depois da rotulagem, (3) BrU-rotulados RNA é immunoprecipitated usando anticorpos anti-BrU, (4) BrU-rotulados (e correspondente entrada) RNA é analisado pelo sequenciamento ou RT-qPCR. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: avaliação da rotulagem tempo. Exemplo de avaliação inicial de tempo BrU-rotulagem. AsPC-1 células cultivadas em meio de Roswell Park Memorial Institute (RPMI) suplementado com 10% de soro fetal bovino e 50 U/mL / 50 µ g/mL penicilina/estreptomicina foram tratados com BrU em uma concentração final de 2 mM por 0, 1, 2 e 4,5 h antes da extração do RNA e análise por RT-qPCR. Dados são quantificados como a 2-Cte são apresentados como a média dos técnicos triplica ± desvio-padrão, n = 1. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: resultados representativos, mostrando a entrada e BrU-IP RNA de DMSO e PLK-2i trataram células. Tratamento de BrU 1 h e 4 h 2 mM (A) não induzir alterações morfológicas visíveis nas células HEK293T. Barra de escala = 100 µm. (B) adaptado figura de referência1. 3.500.000 HEK293T células foram semeadas por prato de 10 cm e transfected com um plasmídeo expressando α-synuclein 24 h após a semeadura. células de transfeccao post 24 h foram incubadas durante 1 h com BrU na presença de DMSO ou PLK-2i, seguido pela extração do RNA e BrU-IP. Análise do RNA foi feita por RT-qPCR usando conjuntos de sonda contra humano SNCA (α-synuclein) e 18sRNA. BrU-IP e entrada SNCA foi quantificada em relação ao BrU-IP de entrada 18sRNA, respectivamente, usando o método deΔΔC -T 2. Os resultados foram normalizados para as amostras tratadas DMSO. Dados apresentados como média ± desvios-padrão. Comparações estatísticas foram realizadas utilizando o teste-t de Student não pareado, * p < 0,001, n = 3. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: medição de outros genes não alterado por PLK-2i. PLK-2i muda nem o RNA sintetizado nem total de ACTB, HMBS e NADH. (A) ACTB, HMBS e NADH RNA de entrada foram medidos em triplicado em um experimento e quantificados em relação ao 18sRNA na entrada usando o método deΔΔC -T 2. Valores foram normalizados para as amostras tratada de DMSO e barras representam a média dos triplica ± desvios-padrão, n = 1. (B) ACTB, HMBS e NADH foram também medidos no ARN BrU-IP'ed e quantificada em relação 18sRNA no BrU-PI. Valores foram normalizados para DMSO e apresentados como A, n = 1. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: especificidade do BrU-IP. Para comparação de 18sRNA capturado por BrU-IP de células BrU - e não BrU-tratados, RNA de BrU-IP foi validado em relação à entrada do RNA para dar conta de diferenças no material começar e doravante normalizada para amostras tratadas BrU. Apenas uma fração muito pequena (0,002) de não-BrU-rotulados 18sRNA foi immunoprecipitated, demonstrando que o BrU-IP é altamente específico. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: níveis de diferentes mRNAs em BrU-IP RNA comparado a entrada RNA. Testaram-se vários genes potenciais de referência porque alguns RNAs estará presentes em concentrações muito baixas em BrU-IP RNA devido a pequenas quantidades de RNA produzido dentro o h 1 tratamento BrU. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Este protocolo descreve o uso de BrU-IP para determinação da produção de RNA pela rotulagem dos recém produzido RNA 1 h com BrU, seguido pela extração de RNA imediata e imunoprecipitação de RNA com rótulo BrU. Este método tem sido descrito anteriormente na referência16, e este artigo inclui algumas etapas adicionais para aumentar a especificidade do IP e pureza de RNA, por grânulos de pré-tratamento com baixas concentrações de BrU, bem como uma etapa de purificação de fenol-clorofórmio para Aumente a pureza de RNA IP a seguir. Além disso, apresentamos também dados aqui, demonstrando a especificidade do BrU-IP, comparando o RNA capturado do BrU e não-BrU tratados células. Purificação de fenol-clorofórmio é mais barata, mas considerando as quantidades baixas de RNA rotulados com BrU, sinais de aumento na análise a jusante podem ser obtidos usando kits de limpeza de RNA em vez disso. Nossa experiência é, no entanto, que a extração mais igual do RNA através de amostras é obtida usando a purificação de fenol-clorofórmio.
BrU-rotulagem e IP são, em contraste com a análise dos níveis de RNA totais, capazes de investigar as causas de alterações nos níveis de estado estacionário do RNA. O método não tem nenhum ou limitado efeitos na fisiologia celular, em contraste ao uso de inibidores de transcriptional tais como α-amanitin e actinomicina d. Tem sido sugerido que comparação do RNA recém sintetizado para níveis de estado estacionário pode ser usada para o cálculo de taxas de decaimento de RNA17, e o método de BrU-IP descrito aqui permite a determinação simultânea de síntese de RNA e de decadência em um ensaio.
Na Figura 5, demonstrámos que o RNA é que apenas IP'ed de BrU tratados células, mostrando que existe realmente BrU incorporada o RNA em linhagem celular usado aqui. No entanto, sugerimos a realização de um teste inicial de BrU incorporação do RNA em outras linhas de células antes de executar o BrU-IP. Isso poderia, por exemplo, ser feito usando-se anticorpos anti-BrU quantificar BrU em extractos de RNA totais via borrão de ponto ou ensaio enzima-lig da imunoabsorção.
Aqui nós não apresentamos um teste de eficiência de BrU-IP através de amostras, mas isto pode ser investigado usando picos com rótulo BrU no RNA também produzido em vitro , ou de outro organismo, tais como a Drosophila melanogaster. Este RNA também pode ser usado na jusante quantificações e normalizações.
Técnicas de pipetagem corretas são cruciais ao realizar ensaios quantitativos altamente sensíveis, tais como BrU-IP e RT-qPCR, e deve ser feito um esforço especial para realizar pipetagem igual através de amostras. As extrações de fenol-clorofórmio exigem alguma experiência, mas em cima de pipetagem insatisfatória, as fases aquosas e fenol/clorofórmio podem ser re-misturadas e centrifugadas novamente.
Este protocolo sugere BrU-rotulagem por 1h quando se mede a síntese do RNA. Desta vez a rotulagem permite uma estimativa aproximada de alterações na transcrição, desde que a maioria dos humanos e ratos mRNAs foram estimados para ter o Half-Life > 6 h18,19. Cuidado, no entanto, cuidado ao interpretar os dados obtidos, uma vez que muitos RNAs têm meias-vidas <18,1 h19, tais como diversas transcrições induzida por lipídio A, que rapidamente aumentar após estimulação e recusar voltar à níveis de linha de base até 2 horas após a indução de20. Para diminuir o risco de influências da degradação do RNA, o tempo de BrU-rotulagem pode ser diminuída, no entanto, é igualmente importante rotular a RNA suficiente para ser capaz de distinguir o RNA obtido por BrU-IP de fundo (que foi obtido após a 1h rotulagem em nossas mãos ( A Figura 2)). Outra opção é para medir tanto a síntese de RNA e a decadência do gene de interesse usando BrU-rotulagem e IP, o último método é descrito em2. Os dados dessas duas abordagens complementam uns aos outros, e se uma mudança na síntese entre duas condições é medida, mas nenhuma mudança é vista nas taxas de decomposição, pode-se concluir que as alterações medidas no RNA foram devido à regulação da síntese. No entanto, é importante lembrar que ambas as técnicas apenas medem a funcionalidade de RNA estimando-se os níveis de RNA e negligenciam completamente a investigar outros mecanismos que influenciam as funções do RNA como modificações químicas14.
Uma vez que as células são incubadas com BrU para apenas 1 h, mRNAs produzidos muito lentamente pode ser difícil de medir usando o método de BrU-IP. Este é um ponto onde o uso de inibidores transcriptional tais como α-amanitin e actinomicina D pode ser preferencial em BrU-IP, no entanto, eles só podem ser usados para medir as mudanças na degradação e não diretamente medir a produção de RNA. Os baixos níveis de RNA com rótulo BrU também podem ser superados aumentando o tempo de incubação com BrU, no entanto, tempos de incubação longa aumentam o risco de influências pela degradação de RNA. Nesse caso, já não é possível saber se as alterações no RNA com rótulo BrU são causadas por alterações na produção de RNA ou deterioração.
Neste exemplo, a análise a jusante do RNA com rótulo BrU capturado é realizada usando RT-qPCR, no entanto, próxima geração sequenciamento é também um método amplamente utilizado a jusante a tela para alterações em uma grande piscina de RNAs2,13. Da mesma forma, o método não está restrita à análise dos mRNAs, mas pode analisar todos os tipos de RNAs2.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
A Fundação Lundbeck, Universidade de Aarhus, Dandrite e Lundbeck a/s com suporte a este trabalho.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ribolock Rnase inhibitor | ThermoFisher | EO0381 | |
| Dynabeads M-280 Sheep anti-mouse IgG | Life Technologies | 11202D | |
| α-Bromodeoxyuridine mouse antibody | BD Bioscience | 555627 | |
| Nanodrop 1000 | Thermo Fisher | Ultraviolet-visible spectrophotometry | |
| Water-Saturated Phenol pH 6.6 | ThermoFisher | AM9712 | |
| Phenol:Chloroform:IAA 25:24:1 pH 6.6 | ThermoFisher | AM9732 | |
| High Pure RNA isolation Kit | Roche | 11828665001 | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | ThermoFisher | 4368814 | |
| Taqman Fast Advanced Master Mix | ThermoFisher | 4444557 | qPCR Master Mix |
| Taqman RNA probes | ThermoFisher | SNCA: Hs01103383_m1, 18sRNA: Hs03928985_g1, ACTB: Hs01060665_g1, HMBS: Hs00609296, NADH: Hs01072843_m1 | Flurogenic probes |
| 7500 Fast Real-Time PCR system | Applied Biosystems | ||
| HEK293T cell line | ATCC | ||
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Lonza | BE12-604F | |
| Fetal calf serum | Biochrom | S0115 | |
| Penicillin/Streptomycin | Biochrom | A2213 | |
| Hank's buffer | 5,3 mM KCl, 0.44 mM KH2PO4, 0.2 mM Na2HPO4 and 136.8 mM NaCl pH 6.77, autoclaved. | ||
| DEPC-H2O | 0.1% diethylpyrocarbonate treated H2O | ||
| 2xBrU-IP Buffer | 40 mM Tris-HCl pH 7.5 and 500 mM NaCl in DEPC H2O | ||
| 2xBrU-IP+BSA/RNAse inhibitor | 2xBrU-IP buffer supplemented with 1 μg/μL BSA and 80 U/mL Ribolock | ||
| BrU-IP+ 1 mg/mL heparin | 2xBrU-IP buffer diluted 1:1 DEPC-H2O and supplemented with 1mg/mL heparin | ||
| 1xBrU-IP | 2xBrU-IP buffer diluted 1:1 in DEPC-H2O and supplemented with 0.5 μg/μL BSA and 20 U/mL Ribolock | ||
| Elution buffer | 0.1% SDS in RNAse-free H2O |
References
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