Summary
该方法可用于测量 RNA 的合成。5-Bromouridine 被添加到细胞中, 并纳入合成 RNA。rna 的合成是通过标记后立即提取 rna 来测量的, 其次是标记 rna 的 5 Bromouridine 靶向免疫沉淀, 并通过反向转录和定量聚合酶链反应进行分析。
Abstract
当在两种情况下比较稳态 RNA 水平时, 不可能区分变化是由生产的改变还是 RNA 的退化引起的。该协议描述了一种测量 rna 生产的方法, 使用了 rna 的 5 Bromouridine 标签, 然后是免疫沉淀, 它能够在短时间内对合成的 rna 进行调查 (例如, 1 小时).5-Bromouridine 标签和免疫沉淀在使用有毒转录抑制剂, 如α amanitin 和放线菌 D 的优点是, 在短期使用中, 对细胞的生存能力没有或非常低的影响。然而, 由于 5-Bromouridine-免疫沉淀只捕获在短标签时间内产生的 rna, 缓慢产生, 以及迅速退化的 rna 可能难以测量的方法。由 5-Bromouridine-免疫沉淀捕获的 5-Bromouridine 标记 RNA 可以通过反向转录、定量聚合酶链反应和下一代测序来分析。可以对所有类型的 RNA 进行研究, 该方法不限于本例中所示的测量 mRNA。
Introduction
5-Bromouridine (老兄) 免疫沉淀 (IP) 允许在简短的标签期间, 对细胞生理学没有或非常有限影响的细胞中 RNA 的产生进行研究 1, 2.该方法的基础是将合成苷衍生物老兄纳入新合成的 rna, 然后使用抗老兄抗体的标记 RNA 的 IP (图 1)。
几十年来, 人们已经知道蛋白质合成可以被转录调控, 转录因子的存在在50年前被推测为3。今天, 已知一些疾病是由转录和 rna 稳定性的失调引起的 (补充图 S1 在参考4), 并且测量 RNA 生产的变化的能力在了解疾病是非常重要的发展。
另一方面, 调控 RNA 生产的工具为治疗因过少或过多的蛋白质表达或诸如帕金森氏病 (PD) 等蛋白质积累而引起的疾病提供了新的可能性。由于α-synuclein 基因的增殖导致家族 pd5, synuclein 中的主要蛋白质积累为不溶性聚集体, α-synuclein 的水平与该病直接相关。此外, α synuclein 聚集在浓度依赖性的方式。下调的α synuclein mRNA 水平是一个有趣的治疗策略, 已经成功地获得了利用 RNA 干扰, 以减少神经元细胞损失的 PD 啮齿动物模型6,7。
重要的是要能够测量 RNA 生产的变化引起的任何疾病或治疗干预。测量 RNA 稳态水平的艺术方法, 如反向转录和定量聚合酶链反应 (RT-qPCR), 不能区分转录调节引起的变化或改变RNA 的稳定性。一种广泛应用的 RNA 衰变率调查方法是使用诸如α amanitin 或放线菌 D 等化合物的转录机械阻断, 然后再测量衰变 rna。然而, 在细胞中转录的整体堵塞, 如诱导凋亡8,9, 也存在一些问题。除细胞毒作用之外, 转录抑制剂还存在几个技术问题, 例如 amanitin 细胞的缓慢摄取和放线菌 D 缺乏特异性 (参考文献10)。
为了避免转录的整体堵塞, 核苷酸类似物已经被使用, 如 5-乙炔苷 (5-欧盟), 4-thiouridine (4) 和老兄。这些都很容易被哺乳动物细胞吸收并纳入新合成的 rna 中, 从而在特定的时间范围内对 rna 进行脉冲标记。老兄的毒性低于 5-欧盟和 4, 使其成为首选的模拟选择11,12。
老兄可以用来研究 rna 合成的速率和稳定性, 从而区分总 rna 变化的根本原因。本文将重点研究 rna 合成的测量, 并参考2 , 以了解 rna 稳定性的研究情况。为了研究 RNA 的合成, 细胞用老兄例如1 小时的简单标记, 后跟老兄-IP1 (图 1C)。这使得在短标签时间内合成的 rna 的测量和观察到的变化将比通过 qPCR 测量总 rna 的变化来更好地估计 rna 合成中的规则。然而, 应该提到的是, 即使标签时间, 例如, 只有1小时, 退化仍然可能对观察到的 RNA 水平产生影响。
老兄-IP 实验的 RNA 适用于 RT qPCR1或下一代测序2,13的下游分析。其他标准 rna 检测方法, 如北印迹或核糖核酸保护试验, 也可能适用于某些 rna。
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Protocol
注: 在室温下执行所有步骤, 除非另有说明, 并在冰上或冰箱中保持缓冲 (除含有 SDS 的洗脱缓冲液)。该协议分为5个部分: RNA 样品的制备;制备用于 IP 的珠子;老兄标记 RNA 与珠子的结合;3步苯酚-苯酚/氯仿-氯仿萃取分离纯化老兄标记 RNARNA 分析 (在这个例子中使用 RT qPCR)
1. RNA 样品的制备
- 使用自动细胞计数器和种子350万细胞计数 HEK293T 细胞在 10 cm 培养皿10毫升生长培养基 (Dulbecco 的改良鹰的培养基补充10% 胎小牛血清和50µg/毫升青霉素/链霉素), 以获得总 > 40 µg RNA48小时后提取。保持单元格在37°c 和 5% CO2。
- 48小时后播种, 吸8毫升生长培养基, 并留2毫升后, 以避免干燥的细胞。添加2毫米老兄和任何治疗8毫升吸气生长培养基, 并从细胞中取出剩余2毫升, 然后再应用含有生长介质的8毫升老兄。避免使用新鲜的媒介在应用老兄对细胞, 因为这可能导致基因表达的变化。
- 用老兄和治疗方法孵化细胞1小时。用2毫升0.05% 胰蛋白酶将5毫升的胰蛋白酶处理中的细胞洗净。添加8毫升的生长培养基以停止反应, 将细胞转移到15毫升管, 并在 1000 x g 上将细胞向下旋转2分钟。
- 使用 RNA 隔离套件 (请参阅材料表) 或任何其他首选方法, 从细胞颗粒中取出上清并提取总 RNA, 并在无 RNase 的 H2中洗脱将 RNA 存储在-80 摄氏度, 直到准备好进行。
2. 制备用于 IP 的珠子
- 在吹打和旋流混合过程中, 为要调查的样品数加上一个额外的损失, 准备批珠。并用重悬抗鼠 IgG 磁性珠彻底的旋流搅拌和取出20µL 珠每样品在一个 RNase 免费1.5 毫升管。放置1.5 毫升管在一个磁性立场和离开大约二十年代为珠子收集在边。
- 取出上清液, 从磁支架取出管, 在400µL 1x 老兄 IP 缓冲器中并用重悬吹打。在台式离心机中非常简单地旋转管子2秒, 将其放回磁性支架中, 取出上清。重复洗涤步骤一次。
- 用肝素阻止不特异的珠子绑定。并用重悬珠在1毫升1x 老兄-IP + 1 毫克/毫升肝素缓冲, 并离开旋转30分钟. 洗涤珠一次, 如在步骤2.2。
注: 肝素是一种负电荷聚合物, 它将与 rna 竞争以进行装订。如果下游应用程序没有排序, 也可以使用 tRNA 或其他不相关的 rna。 - 并用重悬1毫升1x 老兄 IP 缓冲器中的珠子, 并添加1.25 µg/样本抗α Bromodeoxyuridine 抗体, 这也承认老兄。在旋转时孵化1小时的珠子, 或在室温下过夜。
- 在步骤2.2 中洗三次珠子。并用重悬在50µL/样品1x 老兄-IP 缓冲器补充1毫米老兄和离开旋转30分钟, 以降低抗体的灵敏度与珠, 从而在 IP 期间不特异绑定的风险。
- 将珠子洗净三倍于步骤 2.2, 并用重悬50µL/样本 1 xbru IP 缓冲器。
3. 老兄标记 RNA 对珠子的约束力
- 用紫外可见分光光度法测量步骤1.3 中 rna 提取物中的 rna 浓度, 并将 RNase 中的每个样品中的40µg rna 稀释为200µL 的总体积.
- 热 rna 样品2分钟在80°c 到变性 RNA 并且简要地旋转在桌上离心机。添加200µL 2x 老兄-IP + BSA/RNAse 抑制剂。
- 添加50µL 悬浮和准备珠从步骤2.6 到每个样品和离开旋转 1 h. 洗涤珠四倍, 在步骤2.2。
4. RNA 的洗脱和纯化3步苯酚-苯酚/氯仿-氯仿萃取
-
洗脱 RNA 和执行苯酚提取
- 并用重悬在200µL 洗脱缓冲液中的珠子洗脱 RNA, 然后迅速添加200µL 苯酚, pH 6.6 (警告: 毒性, 见步骤 4.1.2) 删除任何非 RNA 分子从样本。
- 旋转混合样品, 并旋转3分钟在 2.5万 x g 在一个台式离心机。
注: 苯酚是有毒的, 应处理在通风罩上, 佩戴皮肤保护。稍微酸性的 pH 值可以确保提取的只是 RNA, 而不是 DNA。由于电荷的亲水性性质, RNA 将留在上水相中。蛋白质的疏水性核心会结合苯酚, 并移动到较低的有机酚相。
-
执行苯酚-氯仿萃取
- 吸入尽可能多的上部阶段尽可能 (大约190µL 200 µL, 根据经验在处理) 和移动它到一个管子与200µL 苯酚或氯仿, pH 6.6 (警告: 毒物, 看见注意)。请确保在样品中吸出相同的量。
- 旋转混合样品和旋转3分钟在 2.5万 x g。
注: 氯仿是有毒的, 应处理在通风罩上, 佩戴皮肤保护。氯仿是添加到去除苯酚, 这可能影响到下游分析 RNA 通过抑制反向转录14和聚合酶链反应15。
- 执行氯仿萃取通过吸水上阶段之前 (现在约180µL), 并转移到一个管含有200µL 氯仿。旋转混合样品和旋转3分钟在 2.5万 x g。
- 吸入水上相之前 (现在约170µL) 和转移到一个管, 其中包含17µL (1/10 卷) 3 米 CH3COONa, pH 6.0。从水溶液中中和并沉淀 RNA, 加入2µL 糖原 (20 毫克/毫升), 与 RNA 沉淀在一起, 使 rna 颗粒更加可见。
- 添加500µL 96% 乙醇, 以增加盐离子和 RNA 之间的结合, 并通过反转管几次。在干冰上将管子在-20 摄氏度或15分钟内过夜。
- 旋转样品在 2.5万 x g, 4 °c 为30分钟丢弃上清, 不干扰颗粒和洗涤颗粒在185µL 75% 乙醇去除任何残余盐。旋转 2.5万 x g, 4 °c 5 分钟。
- 完全放弃上清, 不干扰球团, 使颗粒干燥5-10 分钟, 用开盖。并用重悬在10µL 无 RNaseH2 O 应用在管的一侧, 以避免干扰颗粒。
5. RNA 分析
- 利用 cdna 反向转录试剂盒 (参见材料表) 或任何其他首选方法, 使用2µL rna 样本和1µg 酵母总 rna 作为载体 rna 进行 cdna 合成反应 (如果用 cdna 进行下一代测序), 则使用该基因制备 cdna。使用1µg rna 没有酵母 rna 为对应的输入的 cDNA 准备。
- 稀释 cdna 1:25 和混合9µL 稀释 cdna 与10µL qPCR 主混合和1µL 荧光探针, 两者都在材料表中指定。
注: cdna 稀释依赖于 cdna 的制备和 qPCR 方法的应用。 - 运行以下 qPCR 程序 (例如,在7500快速实时 PCR 系统或等效项): 2 分钟在50°c, 二十年代在95°c, 40 个周期 3 s 在95°c 和三十年代在60°c。
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Representative Results
我们在 AsPC-1 细胞中进行了老兄标记时间的初步测试。细胞老兄0、1、2、4.5 h, 其次为总 RNA 提取和老兄。GAS5 和 GAPDH 的老兄-IP RNA, 这表明 1 h 标签足以达到约9和44倍的变化相比, GAPDH 和 GAS5 的背景 (0 小时) 分别。
老兄和上述分析被用来研究是否在α synuclein mrna 的稳态水平上发现的类似于马球样激酶 2 (PLK-2) 抑制的变化是由 mRNA 合成的变化引起的1。选择了1小时标签时间, 因为这提供了与背景 (图 2) 相比较的足够标签, 还允许治疗时间产生效果。2毫米老兄治疗没有诱发 HEK293T 细胞的任何形态学改变, 无论是1小时或更长的 4 h 治疗 (图 3A)。
用亚砜或特定的 PLK-2 抑制剂 (PLK-2i) 对 Synuclein 转染的 HEK293T 细胞进行了1小时的治疗, 老兄标记了新合成的 RNA。细胞以后被收获和总 RNA 被提取。在 1 h 处理中产生的老兄标记 rna 是使用老兄 ip (图 3B中的 "老兄 ip") 从 RNA 的总池 (图 3B中的 "输入") 中收集的。从40µg 起始材料中获得的 RNA 数量在不同的细胞系之间变化, 通常从 HEK293T 细胞中获得约500的老兄, 但从 HeLa 细胞中只有 10-50 ng。PLK-2 抑制导致α-synuclein mRNA 在输入和老兄 IP (图 3B) 中的增加, 表明稳态 rna 的增加是由 RNA 合成的增加引起的。为确保 PLK-2i 不只是导致 RNA 产量的全面增加, 测量了3个额外的内源基因 (ACTB、HMBS 和 NADH) (图 4)。在 PLK-2i 治疗的输入 (图 4A) 和老兄 IP (图 4B) 中, 这些基因都没有增加。
为了验证老兄 IP 的特异性, 包括了非老兄处理细胞的控制。比较了由老兄处理和未治疗的细胞老兄的18sRNA 捕获的水平 (图 5)。这清楚地表明, 老兄 IP 是高度特定的, 只捕获非标记 RNA 的很小一部分 (图 5)。
因为老兄标记的 RNA 只在1小时内产生, 所以选择合适的参考基因是很重要的, 因为一些正常的基因可能会被表达得太低浓度而不可靠。18sRNA 被选择为图 3B和图 4中提供的数据的参考基因, 因为它的丰度很高。然而, 一些参考基因被测试, 一些显示高阈值周期 (> 30) (图 6)。这一数据还表明, 老兄标记的 IP ' ed rna 和总 rna 在输入中的差异大约是 5 Ct, 而在细胞中低量表达的 rna 在老兄后可能无法正确检测。
图 1: 用于研究 RNA 合成的老兄的描述.(A) rna 是由 rna 聚合酶在 DNA 细胞中转录的。(B) 在媒体之外, 老兄由细胞占用, 并纳入新转录的 RNA 中。(C) 用于测量 RNA 合成速率: (1) 新合成的 rna 被标记为 1 h 与老兄, (2) rna 从细胞被标记后立刻提取, (3) 老兄被标记的 rna immunoprecipitated 使用抗老兄抗体, (4) 老兄标记 (和相应的输入) RNA 是通过 RT qPCR 或测序来分析的。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2: 标记时间的评估.老兄标签时间的初步评估示例。在罗斯威尔公园纪念研究所 (RPMI) 培养基中生长的 AsPC-1 细胞, 辅以10% 胎牛血清和 50 U/毫升/50 µg/毫升青霉素/链霉素, 在 RNA 提取和分析前最后浓度为2毫米, 0、1、2和 4.5 h。qPCR。数据被量化为 2-Ct, 并以技术 triplicates 的平均值为标准偏差, n = 1。请单击此处查看此图的较大版本.
图 3: 显示来自亚砜和 PLK-2i 处理过的细胞的输入和老兄 IP RNA 的代表性结果.(A) 1 小时和4小时2毫米老兄治疗并没有诱发 HEK293T 细胞的任何可见形态学改变。缩放条 = 100 µm (B) 根据参考1调整了图形。350万 HEK293T 细胞种子每10厘米盘和转染的质粒表达α-synuclein 24 小时后播种。24 h 后转染细胞在亚砜或 PLK-2i 的存在下孵化为1小时, 其次是 RNA 提取和老兄老兄。用 qPCR 对人 SNCA (α synuclein) 和18sRNA 的探针组对 RNA 进行了分析。老兄 ip 和输入 SNCA 是相对于老兄 ip 和输入18sRNA 进行量化的, 分别使用 2ΔΔCT方法。结果对亚砜处理后的样品进行了规范化。数据被显示为平均标准偏差。统计比较是使用学生的配对 t 检验, * p < 0.001, n = 3。请单击此处查看此图的较大版本.
图 4: PLK-2i 未更改的其他基因的测量.PLK-2i 不改变 ACTB、HMBS 和 NADH 的总 RNA 和合成核糖核酸。(A) 从输入中 ACTB、HMBS 和 NADH RNA 以一项实验进行三项测量, 并使用 2ΔΔCT方法在输入中量化相对18sRNA。值被规范化对亚砜处理的样品和酒吧代表 triplicates 的标准偏差的平均值, n = 1。(B) ACTB、HMBS 和 NADH 也在老兄 ip ' ed RNA 中测量, 并在老兄 ip 中量化相对于18sRNA。值被规范化为亚砜, 并呈现为A, n = 1。请单击此处查看此图的较大版本.
图 5: 老兄的特殊性.为了比较从老兄和非老兄处理细胞中提取的18sRNA 的老兄, 从老兄 ip 中提取的 rna 是相对于输入 rna 进行验证的, 以说明起始材料的差异以及以后对老兄处理样品的规范化。只有很小一部分 (0.002) 的非老兄标记的18sRNA 是 immunoprecipitated, 表明老兄 IP 是高度明确的。请单击此处查看此图的较大版本.
图 6: 与输入 rna 相比, 老兄 IP RNA 中不同基因的级别.一些潜在的参考基因被测试, 因为一些 rna 将存在极低浓度的老兄 IP rna 由于少量的生产 RNA 在1小时老兄治疗。请单击此处查看此图的较大版本.
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Discussion
该协议描述了使用老兄-IP 来确定 rna 生产通过标签新产生的 rna 1 小时与老兄, 然后立即 RNA 提取和免疫沉淀老兄标记 rna。此方法以前在引用16中进行了描述, 本文还包括一些附加步骤以提高 IP 特异性和 RNA 纯度, 方法是先处理低浓度老兄的珠子以及苯酚-氯仿净化步骤, 以增加 RNA 纯度跟随 IP。此外, 我们还通过比较老兄和非老兄治疗细胞中捕获的 RNA, 来展示老兄的特异性。苯酚-氯仿净化是便宜的, 但考虑到低数量的 RNA 标签与老兄, 增加信号在下游分析可能会获得使用 RNA 清理套件代替。然而, 我们的经验是, 通过苯酚-氯仿纯化, 获得了最平等的 RNA 在样品中的提取。
与总 rna 水平的分析相反, 老兄标记和-IP 是能够调查稳定的状态 RNA 水平变化的根本原因。该方法对细胞生理学没有或有限的影响, 与使用转录抑制剂, 如α amanitin 和放线菌 D。据建议, 将新合成的 rna 与稳态水平进行比较可用于计算 rna 衰变率17, 这里描述的老兄 IP 方法可以同时测定 rna 的合成和衰变。
在图 5中, 我们演示了 rna 只是从老兄处理过的细胞中提取的 IP, 表明在这里使用的细胞线中的 rna 确实有老兄。然而, 我们建议在执行老兄 IP 之前, 对老兄在其他细胞系中的 RNA 进行初步测试。例如, 可以通过使用抗老兄抗体, 通过斑点印迹或酶联免疫吸附试验来量化老兄在总 RNA 提取物中的含量。
在这里, 我们没有提出一个跨样本的老兄 IP 效率的测试, 但这可以用老兄标记的尖峰进行调查, 无论是生产的在体外或从其他有机体, 如果蝇。这种 RNA 也可以用于下游 quantifications 和标准化。
正确的吹打技术是至关重要的, 当执行高度敏感的定量分析, 如老兄和 RT-qPCR, 并应作出特别努力, 以执行平等吹打跨样本。苯酚-氯仿提取需要一些经验, 但在不满意的吹打, 水和苯酚/氯仿相可以重新混合和离心再次。
该协议建议在测量 RNA 合成时老兄1小时的标签。这个标签时间可以粗略估计转录的变化, 因为大多数人类和小鼠基因估计有半衰期 > 6 h18,19。但是, 在解释获得的数据时应谨慎, 因为许多 rna 有半衰期 < 1 h18,19, 例如由脂 A 引起的数个转录, 在刺激后迅速增加并减少回感应20后2小时内的基线级别。为了降低 rna 降解的影响风险, 老兄标签时间可以减少, 但是, 标记足够的 rna, 以便能够区分老兄从背景中获得的 rna 是很重要的 (这是在我们手中 1 h 标签后获得的) (图 2))。另一个选择是用老兄标记和 IP 来测量感兴趣基因的 RNA 合成和衰变, 后一种方法在2中描述。这两种方法的数据相互补充, 如果测量两个条件的合成变化, 但在衰变率上没有变化, 可以得出结论, RNA 的测量变化是由于对合成的调节。然而, 重要的是要记住, 这两种技术只测量 rna 的功能, 通过估计 rna 水平和完全忽视调查其他机制影响 rna 功能, 如化学修改14。
由于细胞的孵化与老兄仅1小时, 非常缓慢地生产基因可能难以测量使用老兄 IP 方法。这是一个点, 使用转录抑制剂, 如α amanitin 和放线菌 D 可能是首选超过老兄 IP, 但是, 它们只能用来测量退化的变化, 而不是直接测量 RNA 的生产。老兄标记 rna 的低水平也可以通过增加老兄的潜伏期来克服, 但是长时间潜伏期会增加 rna 降解的影响风险。在这种情况下, 不再可能知道老兄标记的 rna 的变化是由 rna 生产或衰变的变化引起的。
在本例中, 捕获的老兄标记的 RNA 的下游分析是使用 RT qPCR 执行的, 但是, 下一代测序也是一种广泛使用的下游方法, 用于在大池的 rna2、13中筛选变化。同样, 该方法不仅限于分析基因, 而且可以分析所有类型的 rna2。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
Lundbeck 基金会、奥胡斯大学、Dandrite 和 Lundbeck 支持这项工作。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ribolock Rnase inhibitor | ThermoFisher | EO0381 | |
| Dynabeads M-280 Sheep anti-mouse IgG | Life Technologies | 11202D | |
| α-Bromodeoxyuridine mouse antibody | BD Bioscience | 555627 | |
| Nanodrop 1000 | Thermo Fisher | Ultraviolet-visible spectrophotometry | |
| Water-Saturated Phenol pH 6.6 | ThermoFisher | AM9712 | |
| Phenol:Chloroform:IAA 25:24:1 pH 6.6 | ThermoFisher | AM9732 | |
| High Pure RNA isolation Kit | Roche | 11828665001 | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | ThermoFisher | 4368814 | |
| Taqman Fast Advanced Master Mix | ThermoFisher | 4444557 | qPCR Master Mix |
| Taqman RNA probes | ThermoFisher | SNCA: Hs01103383_m1, 18sRNA: Hs03928985_g1, ACTB: Hs01060665_g1, HMBS: Hs00609296, NADH: Hs01072843_m1 | Flurogenic probes |
| 7500 Fast Real-Time PCR system | Applied Biosystems | ||
| HEK293T cell line | ATCC | ||
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Lonza | BE12-604F | |
| Fetal calf serum | Biochrom | S0115 | |
| Penicillin/Streptomycin | Biochrom | A2213 | |
| Hank's buffer | 5,3 mM KCl, 0.44 mM KH2PO4, 0.2 mM Na2HPO4 and 136.8 mM NaCl pH 6.77, autoclaved. | ||
| DEPC-H2O | 0.1% diethylpyrocarbonate treated H2O | ||
| 2xBrU-IP Buffer | 40 mM Tris-HCl pH 7.5 and 500 mM NaCl in DEPC H2O | ||
| 2xBrU-IP+BSA/RNAse inhibitor | 2xBrU-IP buffer supplemented with 1 μg/μL BSA and 80 U/mL Ribolock | ||
| BrU-IP+ 1 mg/mL heparin | 2xBrU-IP buffer diluted 1:1 DEPC-H2O and supplemented with 1mg/mL heparin | ||
| 1xBrU-IP | 2xBrU-IP buffer diluted 1:1 in DEPC-H2O and supplemented with 0.5 μg/μL BSA and 20 U/mL Ribolock | ||
| Elution buffer | 0.1% SDS in RNAse-free H2O |
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