절연 및 동적 홍보 설치류 Microglia의 문화 Ramified 혈 청 자유로운 매체에 있는 외관

Summary

세부 사항에 microglial 함수를 이해 하는 노력 microglia 성숙한 vivo에서 속성 정리 microglial 문화 모델의 부족에 의해 방해 되어 있다. 이 프로토콜 정의 매체 조건 하에서 높은 없는 성숙한 쥐 microglia의 강력한 생존을 유지 하기 위해 설계 된 절연과 문화 접근을 설명 합니다.

Abstract

Microglia 모든 중앙 신경 시스템 (CNS) 세포의 5-10%를 대표 하 고는 점점 더 주목 그들의 공헌으로 인해 개발, 항상성, 및 질병. 세포 연구 세부에 십 년간, microglia의 특수 기능, CNS의 주민 조직 대 식 세포, 비록 성숙 microglial를 정리 하는 능력에서 제한 때문에 부분에서 크게 신비 남아 있다 문화에서 속성입니다. 여기, 우리는 성숙한 쥐 두뇌에서 순수한 microglia의 신속한 격리에 대 한 간단한 절차를 보여 줍니다. 우리는 또한 시간이 지남에 microglial 생존 능력의 높은 수준을 지 원하는 혈 청 무료 문화 조건을 설명 합니다. 이 정의 매체 조건 하에서 경작 Microglia 전시 정교한 없는 프로세스와 동적 감시 동작. 우리는 교양된 microglia에 혈 청 노출의 일부 효과 설명 하 고 이러한 혈 청 무료 문화 microglia 시내 vivo으로 혈 청 노출 문화 모두를 비교 하는 방법에 대해.

Introduction

CNS 실질의 대 식 세포로 microglia 신경 회로 폐해 신호 네트워크의 광대 한 배열을 상호 작용 합니다. 그들은 개발 및 시 냅 스의 가지 치기, apoptotic 세포 클리어런스 및 신경 프로세스^1,2과도 상호 작용을 통해 뇌의 항상 성에 중요 한 역할. Microglia는 선 동적인 응답을 조정 및 제한 출혈^3,4병 변 사이트에 그들의 길고, 얇은 프로세스를 확장 하는 신경 상해에 초기 응답자. Microglial 형태 및 기능에 변화는 급성 및 만성 CNS 상해에 유비 쿼터 스와 microglia 전시 변경 형태학, 지역화, 그리고 다양 한 질병 상태¹에 염증 성 중재자의 표현. 인간 유전자 연구는 신경 퇴행 성 질환에 대 한 위험을 변경 하는 돌연변이 종종 주로 또는 독점적으로 표현 microglia microglia 질병 병 인 또는 진행^{5에 대 한 중요 한 역할을 가리키는 그대로 CNS에 의해 나타냅니다.} . 상해 및 질병에 그들의 굴지를 감안할 때, 새로운 치료 접근을 개발 하기 위한 높은 우선 순위는 microglial 생물학의 이해 발전.

Microglial 생물학의 이해에 많은 중요 한 발전 기술과 문화 방법, 기능 정의 진 식 프로필, 등 다른 대 식 세포 인구의 학문에서 발견 하는 메커니즘을 바탕으로 발현 형태 / 상태. 대 식 세포 기능 CNS 풍경 내 놀라운 방법으로 자주 연주 일반화 microglia 스스로 매우 전문, 전시는 없는 형태 그리고 다른 조직 들을 차별 하는 독특한 유전자 식 서명 대 식 세포⁶. Microglia는 혈통은 다른 대부분의 다른 조직 대 식 세포; 그들은 원시 조의 초기 배아 파도 동안 CNS 식민지 하 고 자기 인생에 걸쳐, 최종 조⁷에서 기여의 독립 갱신. 성인 microglia의 완전히 성숙한 진 식 서명 하지 두 번째 출생 후 주⁸까지 이루어집니다. 주위 조직에서 환경 신호 특정 조직 대 식 세포 기능⁶, CNS에서 포함 하는 혈액-뇌 장벽⁹에 의해 부여 된 혈액 부담 요인에 제한 노출을 지시에 주요 역할을 한다.

완전히 microglial 기여 CNS 항상성 및 질병을 이해 하는 데 하나의 장애물은 업과 성숙한 microglia 본 비보에 순화 된 세포의 특수 속성의 어려움 생체 외에서. 많은 방법은 격리 하기 위해 개발 되었습니다 그리고 세포 생존을 지원 하기 위해 혈 청에 의존 하는 문화 그대로 microglia, 하지만 대부분의 방식. 우리는 본질적으로 가변 시 생리 활성 분자의 광대 한 배열을 포함 하는, 특히 문제가 microglia 작업 amoeboid 형태학 촉진 하기 때문에 증가 확산, 혈 청의 그 추가 나타났습니다 그리고 microglia 혈액-뇌 장벽 파괴 후 요소를 부담 하는 혈액에 노출 되 면 증가 먹어서⁹ vivo에서 수시로 보인다. 이 통계에 의해 혈 청 노출 셀 부상이 나 질병 상태, microglia 비슷하지만 이러한 변경 감소 때 microglia CSF-1 (또는 IL-34)를 포함 하는 정의 된 성장 매체, TGF-β, 콜레스테롤, 및 selenite 교양.

이 프로토콜 조건 하에서 혈 청 무료, 최근에 출판 된 작품⁹관련 청소년 쥐 microglia 경작에 대 한 세부 정보를 제공 합니다. 이 프로토콜에서 출생 후 하루 21-30 (P21-P30), 쥐를 간소화 하지만 수율과 전반적인 생존 종 및 동물의 나이 따라 달라 집니다 하지만 microglia 쥐 및 쥐의 모든 나이에서 분리를 적용할 수 있습니다. 최대한 하 고 최적의 생존 때 약간 미 숙 microglia를 사용 하 여 얻을 수 있다 (~ P9), 수율 및 점차적으로 성인 동물에 있는 저수준에 다소 가늘게 생존. Microglia 또한 마우스에서 격리 될 수 있습니다 하지만 우리는 쥐 세포 보여 상당히 높은 수익률, 생존, 그리고 없는 형태학의 복잡성 마우스 셀 세럼 무료 문화에 비교 될 때 나타났습니다. 동물 세 P50 보다 큰이 프로토콜 평가 되지 않았습니다. 이 immunopanning 격리 절차는 격리 하는 동안 microglial transcriptional 프로필에 변화를 최소화 하 고 셀의 다운스트림 생존 능력을 극대화 하기 위해 최적화 되었습니다. 이러한 기술과 미디어 공식 사용, 높은 생존 능력 주 문화는 주에 대 한 지속 수 있습니다. 이러한 조건 하에서 경작 Microglia 급속 한 확장 및 프로세스의 철회와 관련 된 매우 없는 형태를 전시 하 고 상대적으로 낮은 확산의 속도. 우리는 이러한 속성에 대 한 혈 청 노출의 중요성을 강조 하 고 힘과 다른 접근에 상대적으로이 방법의 약점을 토론.

Protocol

설치류와 관련 된 모든 절차 스탠포드 대학 지침, 국가 및 국가 법률 및 정책 준수에 맞 췄 나. 모든 동물 절차는 실험실 동물 관리에 스탠포드 대학의 행정 패널에 의해 승인 되었다.

참고: 모든 솔루션 및 버퍼 구성 재료의 테이블에에서 제공 됩니다.

1. CD11b Immunopanning (하루 0)에 대 한 페 트리 접시를 준비

참고: 모든 1-2 청소년 쥐 두뇌에 대 한 1 immunopanning 접시를 준비 합니다.

1. 15 cm 배양 접시를 50 mM Tris pH 9.5 솔루션의 25 mL를 추가 합니다.
2. 6 µ g/mL의 최종 농도 대 한 접시에 염소 반대로 마우스 IgG (체인 H + L)를 추가 합니다. 균일 하 게 배포 플레이트를 소용돌이 친다.
3. 1-3 h 37 ° c.에 대 한 접시를 품 어
4. 린스 요리 세 번 DPBS^{+ +} (인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 캘리포니아^{2 +} 그리고 마그네슘^{2 +}), 다음 1 µ g/mL OX42 항 체를 포함 하는 버퍼를 패닝의 솔루션 바꿉니다. 평평한 표면에 실 온에서 하룻밤 요리를 둡니다.

2. 조직 컬렉션 (1 일)

참고:이 프로토콜은 3 ~ 4 h 소요 됩니다.

1. 시작 하기 전에, 모든 솔루션은 살 균 및 냉장 얼음에 확인 합니다. 얼음에 모든 악기를 진정 하 고 에탄올을 사용 하기 전에 소독.
2. 적절 한 규제 절차에 따라 이산화탄소 질 식에 의해 청소년 실험실 쥐를 희생.
   참고: 또는, 젊은 동물 수 희생 케 타 민/xylazine (100-200 µ L 24 mg/mL의 마 취 제, 2.4 mg/mL xylazine)의 치명적인 복용량. 케 타 민/xylazine 동물 14 일 미만 경우 사용 되어야 한다. 여러 동물을 사용 하 여, 하나의 동물에서 조직을 추출 하 고 이후 동물에 진행 하기 전에 얼음에 미리 냉장된 DPBS^{+ +} 에 배치.
3. 핀치는 hindpaw 하 고 진행 하기 전에 동물에서 완전 한 응답을 확인 합니다.
4. Transcardially perfuse 버퍼 실행 취소 될 때까지 27½-G 바늘을 사용 하 여 차가운 관류 버퍼의 10-30 mL를 가진 동물.
   참고: 볼륨 관류 버퍼의 동물의 크기/나이 따라 달라 집니다.
5. 재 관류 후 즉시 동물의 머리를 제거 합니다. 해 부가 위, 양쪽에 후 두 관절 돌기를 잘라 척수에서 오는 될 두뇌를 손상 하지 않도록 주의 하십시오. 각 측면을 신중 하 게 절단 후 정수 리와 코 뼈를 향해 정면 뼈를 따라 한쪽을 잘라. 집게와 함께 신중 하 게 두개골의 상단을 다시 세우고, 신속 하 게 뇌 (또는 관심의 CNS 구조), 제거 고 미리 냉장된 DPBS⁺ + 얼음에 합니다.
6. 모든 나머지 동물에 대 한 반복 합니다.
   참고: 모든 진행 단계는 적절 한 무 균 조건 하에서 층 류 후드에서 수행 되어야 합니다.

3. 기계적 분리 (1 일)

1. 모든 두뇌가 수집 하 고, 차가운 메스 블레이드, 얼음에 페 트리 접시에 1 m m³ 덩어리로 한 뇌를 잘라 고 5-7 mL 차가운 douncing 버퍼와 얼음 dounce 균질 화기를 전송. 한 번에 하나의 뇌를 분리.
2. 느슨한-피팅 dounce 균질 화기와 10-20 부드럽고 불완전 한 스트로크를 사용 하 여 조직의 해리 알아서 하지 직접 분쇄, 균질 화기의 하단에 조직 하지만 대신 억지로 피스톤의 측면과 균질 화기 사이 공간을 통해 조직.
3. 조심 스럽게 기포의 소개를 방지 하기 위해 피스톤을 제거. 제대로 끊된 조직 덩어리, 균질 화기의 바닥에 정착 하 고 상쾌한 새로운 냉장된 50 mL 원뿔 튜브에 전송.
4. 신선한 douncing 버퍼에 제거 된 볼륨을 바꿉니다 고 3-4 라운드, 또는 모든 조직의 해리 되었습니다 때까지 총 3.2 및 3.3 단계를 반복 합니다. 각 두뇌에 대 한 절차를 반복 합니다.

4. 수 초 제거 (1 일)

참고: 수 초 제거 microglia P12 보다 더 오래 된 동물에서의 절연을 위해 사용 됩니다.

1. 25 mL 피 펫을 사용 하 여 50 mL 원뿔 튜브에 세포 현 탁 액을의 볼륨 측정 다음 33.5 ml 전체 볼륨을 조정 하려면 얼음 douncing 버퍼를 추가 합니다.
2. 세포 현 탁 액을 혼합 수 초 분리 버퍼 (MSB)의 10 mL 추가 철저 하 게 여러 번 튜브를 거꾸로 하 여. 이 43.5 mL의 볼륨에 MSB의 23% 최종 농도 발생 합니다.
3. 셀 느린 제동 4 ° C에서 500 x g에서 15 분 동안 원심
   참고:는 원심 분리기 감속을 약 1.5-2 분 소요 됩니다. 이 myelin 및 죽은 세포 파편, 다소 어두운 상쾌한, 그리고 라이브 셀에 대 한 풍부 하 게 더 작은 펠 릿의 상위 계층을 생성 합니다.
4. 수 초/파편과는 피 펫과 상쾌한의 상위 레이어를 제거 합니다. 그것의 다량은 가능한 제거를 보장 하기 위해 상위 계층을 분리할 때 주의 합니다.
5. 버퍼를 패닝의 12 mL에서 셀 펠 릿을 resuspend. 부드럽게 헤어 셀 수 있는 어떤 덩어리 셀 서 스 펜 션 triturate.

5입니다. Immunopanning (1 일)

1. 70 µ m 셀 거르는 큰 파편 또는 셀 덩어리 제거를 통해 세포 현 탁 액을 전달 합니다.
2. 세 번 DPBS^{+ +}와 OX42 코팅 패닝 접시를 헹 구 십시오. 접시를 허용 하지 않습니다 완전히 건조 세척 사이.
3. 마지막 DPBS^{+ +} 세척을 부 어와 패닝 접시에 필터링 된 셀 서 스 펜 션 적용. 부드럽게 셀, 배포 접시 소용돌이 다음 준수를 셀 수 있도록 20 분 동안 실 온에서 평평한 표면에 접시를 품 어. 20 분 이상 품 어 하지 마십시오 또는 셀 매우 어려운 요리에서 복구 될 것 이다.
4. 비 부착 한 세포를 제거 하 DPBS^{+ +} 와 함께 패닝 접시 10 번을 씻어. Microglia 됩니다 그래서 다른 비 부착 한 세포의 제거를 보장 하기 위해 각 린스 접시 소용돌이 플레이트에 단단히 고정 되어.
5. 마지막 DPBS^{+ +} 세척을 부 어와 15 mL DPBS^{+ +} 와 200 μ 트립 신 (1.25% 재고 솔루션)을 바꿉니다.
6. 10% CO₂ trypsinize를 37 ° C에서 ≤ 10 분 요리를 품 어.
   참고: 10 분 이상 계속 하지 마십시오 또는 microglia 제거 하기 어려운 될 것 이다.
7. Trypsinization의 10 분 후 microglia 여전히 접시에 붙어 있을 것입니다. 트립 신/DPBS^{+ +} 를 부 어와 부드럽게 씻어 트립 신을 제거, 얼음 처럼 차가운 microglia 성장 매체 (MGM)의 12 mL 바꿉니다 DPBS^{+ +} 2 x.
8. 셀/기판 상호 작용을 약하게 하 고 접시를 확인 데 접시 2 분 동안 얼음에 이동 하는 장소는 패닝 접시의 영역 밖으로 건조 하지 않도록 플랫.
9. 10 mL 피 펫 및 피펫으로 컨트롤러와 고속 패닝 접시에서 세포를 회복 하기 위해 적극적으로 플라스틱. 시도 하 고 모든 셀을 제거 피 펫에서 액체의 흐름으로 16 × 16 그리드를 그립니다.
10. 세포는 접시에서 분리 되도록 20 배 확대에 현미경으로 세포를 확인 합니다. 어디 셀 여전히 붙어 접시 위에 마크 명소 그리고 그 지역에 pipetting 반복.
11. 셀 서 스 펜션과 15 mL 원뿔 튜브 당 상쾌한의 aliquot 3-4 mL를 수집 합니다. 천천히 브레이크와 4 ° C에서 500 x g에서 15 분 회전 합니다.
    참고: 회전 하는 작은 볼륨을 통해 microglia 셀의 최대 복구 할 수 있습니다.
12. 셀 펠 릿으로 MGM의 0.5 mL를 떠나 상쾌한 발음
13. 나머지 MGM에서 각 펠 릿을 resuspend 하 고 모든 튜브에서 셀 수영장.
14. Hemocytometer 셀을 계산 합니다.
15. 6 단계-응용 프로그램에 따라 7에에서 설명 된 대로 세포를 플레이트.
16. 10% CO₂와 37 ° C에 문화 세포.
    참고: 셀 일반 미디어 변경 최대 3-4 주 또는 미디어 변경 없이 1 주일에 대 한 문화를 수 있습니다.

6. 현장 조직 문화 접시/Coverslips (주 1) 코팅

1. 24 잘 음이온/양이온 코팅된 조직 문화 접시의 중앙에 직접 콜라겐 IV 코팅의 15 µ L 플레이트 (대 한 자세한 내용은 테이블의 자료 를 참조) 및 10% CO₂와 37 ° C에서 15 분 동안 품 어.
2. 후에 MGM에 10⁵/mL x 2.3 hemocytometer 희석 셀과 셀을 카운트. 콜라겐 4 자리를 하 고 즉시이 자리;에 세포 현 탁 액의 접시 15 µ L 발음 이 3.5 x 10³ 셀/자리를 줄 것 이다. 품 어 준수,의 CO_2-500 µ L equilibrated TGF-β2/IL-34/콜레스테롤 포함 성장 매체 (TIC) 추가 셀 수 있도록 10% CO₂ 와 37 ° C에서 5-10 분 동안 부드럽게 잘 하.
3. Coverslips, 10 µ g/mL 계략-D-라이 신 (PDL) H₂O에서 RT, 1 시간에 대 한 첫 번째 코트 불 임 유리 coverslips에 도금 하는 경우 H₂O, 3 번 세척 하 고 후드 UV 빛의 밑에 건조 하자. Coverslips는 건조, 일단은 coverslips에 자리 도금 단계 6.2에서 설명 된 대로 진행.

7. RNA/단백질 격리 도금

1. 하루에 1, 코트는 24-잘 음이온/양이온의 전체 영역 콜라겐 IV 코팅 조직 배양 플레이트를 코팅에 대 일 분-1 시간 10% CO₂, 37 ° c를 품 어 다음 제거 하 고 즉시 접시 3-5 x 10⁴ 셀/CO₂ 잘 equilibrated TIC 미디어입니다.
2. 2 일에 수행 50% 미디어 변화를 각각에 대 한 준비 후 잘 날. 우물의 센터에서 클러스터, 그래서 미디어 거기에서 죽은 세포에 의하여 경향이 있다.
3. 문화를 유지 하기 위해 50% 미디어 변화 2-3 일 마다 수행 합니다. 미디어 변경 문화에 대 한 원치 않는 변수, 소개 셀 미디어 변경, 정기적인 유지 보수와 함께 3 주 이상 반대 없이 대략 1 주 동안 살아남을 수 있습니다.

Representative Results

이 프로토콜 젊은 쥐에서 문화 고 순도 ramified microglia를 방법을 설명합니다. 비슷한 결과 얻어질 수 있다, 주 미 숙 하 고 성인 동물을 사용 하 여 아래 설명 된 대로. 셀 격리는 종종 미묘한 뉘앙스와 죽을 셀에 대 한 많은 기회를 포함, 우리는 다양 한 단계에서 성공을 확인 하는 데 품질 관리 검사점을 사용. 우리는 일반적으로 셀 정지는 hemocytometer를 사용 하 여 격리 프로토콜 (그림 1A)의 여러 단계에서 모니터링 합니다. 성공적인 격리 2.5-5 10⁵ 셀/청소년 동물 배를 양보 한다. P7-P15에서에서 동물 반면 P30 보다 더 오래 된 동물에서 분리 된 세포 가까이 10⁵ 세포/동물 x 2.5 수익률 10⁵ 세포/동물, x 5에 가까운 수익률을 보여줍니다. 총 셀 모니터링 넘어 프로토콜을 통해 건의 그것은 microglia 이와에서 고립 된 문화에 처음 몇 일 동안 둥근 또는 바이 폴라 형태를가지고 있기 때문에 어려울 수 있는 격리 된 셀의 전반적인 상태를 결정 하는 것이 중요 . 여기, 우리 콩에 콩 알 10% 태아 종 아리 혈 청 (FCS) (그림 1B)를 포함 하는 격리 후 처음 6 일 동안 문화에 P25 microglia의 단계 이미지를 포함 했다.

그림 1: 격리 프로토콜 및 문화의 6 일 이상 세포 건강의 평가. (A) 위상 대조 이미지 셀 격리 절차의 지정 된 단계에서 보여주는 품질 관리 검사점. 세포 현 탁 액의 0.4 %trypan 블루는 hemocytometer에 로드 하기 전에 1 µ L로 세포 현 탁 액의 9 µ L를 혼합 하 여 몇 군데 있었다. 다른 이미지 보기 패닝 접시 자체, 그리고 모든 이미지는 20 배 확대에 하나의 필드로 표시 됩니다. 눈금 막대, 200 µ m. MGM, microglia 성장 매체. (B) microglial 형태학 상 변화와 확산 문화 혈 청 무료 TIC 성장 매체 또는 TIC 플러스 10% 태아 종 아리 혈 청 (FCS)에서 6 일 동안 시간 코스. CD11b-immunopanned 셀 자리 콜라겐 코팅 음이온/양이온 코팅된 조직 문화 접시에 도금 했다 (자세한 내용은 테이블의 자료 를 참조 하십시오)와 같은 분야는 단계 대조 바, 100 µ m. 틱, TGF-β2/IL-34 모든 24 h. 규모에 의해 몇 군데 / 콜레스테롤 포함 성장 매체입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

건강의 일상적인 평가 고립 된 세포의 생존 능력은 재현성 및 실험의 성공을 위해 중요 합니다. 여기 우리가 microglia MGM, 틱, 또는 TIC 7 일 후 체 외에서 (DIV) 생존 분석 결과 함께 10 %fcs 보충 교양된 P21 동물에서 분리 된 보여줍니다. 그러나 고립 된 문화 콩이 인위적으로의 급속 한 확산에 의해 모두 비정상적 이다 결국 혈 청의 존재 양식 7 팀 셀 근처 100% 생존 능력의 측정, 등반 후에 80-90% 생존 사이 표시 혈 청에 노출 된 세포와이 문화 (그림 2A)에서 죽은 세포의 급속 한 먹어서. 강력한 생존 뿐만 아니라 TIC 배양 세포는 또한 표시 FCS에 비교 될 때 없는 형태 치료 세포 (그림 2B, C).

그림 2: 생존 microglia MGM, 콩 또는 콩 + FCS의 문화에 7 일 동안. (A) 전지와 P21 쥐에서 고립 되었다 microglia 성장 매체 (MGM), TGF-β2/IL-34/콜레스테롤 포함 성장 매체 (TIC), 또는 틱 + 10% 태아 종 아리 혈 청 (FCS)에서 경작. 각 시간 지점에서 문화 매체 calcein 오전 (최종 1.33 µ M) 및 브로민 homodimer (최종 2.5 µ M) 15 분 각각 살아있는 세포와 죽은 세포를 보충 되었다. 셀 자동된 ImageJ 스크립트를 사용 하 여 각 필드에 포함 되었습니다. (B 와 C) 7 DIV 후 미디어 변경 없이 세포에서 자란된 TIC (B) 또는 fcs (C)가 10% 보충 TIC 위와 같이 라이브 하 고 죽은 세포를 얼룩이 했다. 대표 이미지를 10 배 (왼쪽) 또는 40 X (오른쪽) 목표를 사용 하 여 찍은 사진. 눈금 막대, 40 µ m. 오차 막대는 평균 (SEM)의 표준 오차를 나타냅니다. 이 그림에서 Bohlen 그 외 수정 된 ⁹ 허가 함께 사용. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

성공적인 격리 및 매우 순수한 microglia의 문화를 설명 하기 위하여 우리 microglia P21 쥐에서 분리 하 고 TIC 또는 8 일에 대 한 fcs가 10% 보충 TIC에서이 세포를 배양. 셀 고정 그리고 microglial 마커 (Iba 1 및 CD11b) 및 확산 마커 (Ki67, 그림 3A)으로 물 했다. 셀 표식에 대 한 얼룩을 더하여 RNA-seq 갓 고립 된 세포에는 세포의 RNA 프로 파일을 평가 하기 위한 강력 하 고 중요 한 도구를 제공 하는 수 고 문화의 시작 순도 알려 하는 것을 도울 수 있다. CD11b immunopanning CD11b의 작은 비율에 일반적으로 결과⁺ CD11b 외 호 중구/monocyte carryover⁺ microglia (그림 3B). 이 셀 틱에서 몇 일 후에 죽을 것 이다 하지만 이전 시간 포인트의 분석을 복잡 하 게 수 있습니다.

그림 3: immunohistochemistry와 RNA이 사정으로 배양된 세포의 순도 (A) Microglia P21 쥐, PDL/콜라겐 코팅 유리 coverslips에 도금 및 TGF-β2/IL-34/콜레스테롤 포함 성장 매체 (TIC)에서 8 일 동안 배양에서 고립 되었다. 셀 4 %paraformaldehyde (PFA) 실 온에서 10 분으로 고정 되었고 면역 스테인드 Iba-1 (1: 500), CD11b (1:1500), 그리고 Ki67 (1: 500). 간단히, 고정된 셀 0.1% 세제로 차단 되었습니다 (자세한 내용은 방법 표 참조) 및 10% 정상 당나귀 세럼 (NGS) 실 온에서 1 h. 셀은 다음 NGS 4 ° c.에서 하룻밤 1%와 0.1% 세제에 1 차 항 체와 인 큐베이 팅 세포는 PBS에 각 5 분에 대 한 세 번 세척 했다. 셀은 다음 incubated 이차 항 체와 모든 1: 500에 1%와 0.1% 세제 NGS 실 온에서 1 h. 셀 다시 PBS에 세 번 씻어 되었고 DAPI 포함 된 설치 매체와 함께 탑재. 대표 이미지는 40 X 확대 촬영 했다. 눈금 막대, 50 µ m. (B) 특정 녹취 록 대표 셀 형 갓 분리 및 배양 세포의 표현. Microglia P21 쥐에서 고립 되었고 RNA 격리에 대 한 immunopanning 요리에서 직접 lysed 그리고 다른 주요 CNS 세포 유형 (이다, 신경, oligodendrocytes, 및 내 피 세포)의 RNA 시퀀스 마커 표시의 최소한의 오염 CD11b-immunopanned 셀입니다. 호 중구 마커 갓 절연 셀 (블랙), 감지 하지만 혈 청 무료 문화 (회색)에서 손실 됩니다. 배양된 세포 표현 높은 수준의 일반적인 대 식 세포 마커, 하지만 전문된 microglial 서명 정의 마커는 신속 하 게 경작된 한 세포에 의해 downregulated. 오차 막대는 평균 (SEM)의 표준 오차를 나타냅니다. Bohlen 그 외 여러분 에서 데이터 수정 ⁹ 허가 함께 사용. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

생존 및 셀 마커 얼룩 생존의 결정과 셀의 순수성에 대 한 허용 하지만 문화권의 역학에 제한 된 정보를 제공 합니다. 여기 우리가 제공 P21 쥐 microglia의 시간 경과 영화 TIC 14 DIV 후. 2 주 후 혈 청 무료 문화 쇼 빠른 프로세스 확장 및 접시에 걸쳐 retractions 동적 감시 동작 ( 동영상 1참조). 또한, 우리는 이전 발견 혈 청 노출 microglia의 상태 속성을 쉬고 이러한 변환 결과 형태학 및 phagocytic 변화를 지속. 우리 콩에 microglia 5 일에 대 한 교양된의 영화를 포함 다음 10 %FCS 노출 ( 영화 2참조).

영화 1: 정의 매체 microglia 문화 표시 동적 프로세스와 없는 형태. Microglia는 P21 쥐, 자리 콜라겐 코팅 음이온/양이온 코팅된 조직 문화 접시에 도금 및 TIC에서 14 일 동안 배양에서 고립 되었다. 14 DIV에서 이미지 마다 3 분을 수집 했다. 영화에서 6 프레임/s, 재생 하 고 오른쪽 아래 모서리에 있는 타임 스탬프는 이미징의 기간 h:min.에서 영화 Bohlen 그 외 여러분 에서 재현 ⁹ 허가 함께 사용. 이 비디오를 보려면 여기 클릭 하십시오 (다운로드 오른쪽 클릭.)

영화 2: 혈 청 노출 트리거 정의 매체 microglial 문화에서 빠른 형태학 변화. Microglia는 P21 쥐, 자리 콜라겐 코팅 음이온/양이온 코팅된 조직 문화 접시에 도금 및 TIC에서 5 일 동안 배양에서 고립 되었다. 5 DIV 이미지 기준 운동 성/형태, 다음 2:55 (2 h 55 분)에 기록 된 5 분 마다 수집 된, 50% 미디어 변경 10%의 최종 농도에 FCS를 추가를 수행 했다. 셀 추가 7 h에 대 한 몇 군데 있었다. 영화에서 6 프레임/s, 재생 하 고 오른쪽 아래 모서리에 있는 타임 스탬프 이미징 h:min. 하시기 바랍니다 여기를 클릭이이 비디오를 볼의 기간을 나타냅니다. (다운로드 오른쪽 클릭.)

Discussion

Microglia CNS의 센 티 넬 면역 세포 역할을, 때문에 그들은 높은 반응 환경 변화; 따라서, 주의 그들의 고립과 문화⁸동안 셀 내에서 선 동적인 응답을 최소화 하기 위해 필요 합니다. 이것은 속도 온도 통해이 프로토콜에서 수행 됩니다. 동물 차가운 관류 버퍼 끼얹는다는 가능한 크게 저하 활성화, 모든 원심 분리 단계 4 ° C에서 열릴 때마다 얼음에 또는 4 ° C에서 세포를 유지, 그리고 프로토콜 조직 사이 시간을 최소화 간소화 되었습니다. 추출 하 고 세포의 경작입니다. 갓 고립 된 세포의 유전자 표현 패턴을 평가 하는 경우 세포 lysates trypsinization 최소한 절연 유도 된 변화를 계속 하기 전에 CD11b immunopanning 요리에서 직접 수확. 주목 해야 한다도 신중 하 게 고립 된 해당 microglia 실행의 본질적으로 격리 절차와 관련 된 피해 관련 신호 인식, 아마도 따뜻한 온도에 배치 되 고 즉시 염증 반응. 프로토콜을 성공적으로 수행한, 2.5-5 x⁵ 셀/청소년 쥐 10으로 예상 된다.

세포 격리 프로토콜 여기는 매우 CD11b + perfused CNS⁹에서 셀 분리에 대 한 구체적인 제공. 이 셀 인구 microglia 주로 이루어져 있다, 하지만 그것은 또한 혈관 주위 세포, meningeal 세포, 맥락 막 총 세포, monocytes, 호 중구¹⁰등 다른 골수성 인구의 저급을 포함 되어 있습니다. 맥락 막 관련 골수성 세포 인식 및 조직 분리 이전 맥락 막 신경 총의 제거에 의해 근본적으로 제거할 수 있습니다. Meninges도 어느 정도 제거 될 수 있다 하지만 모든 meningeal 조직의 완전 한 제거 여기에 설명 된 빠른 격리 대상 시간대 내에서 실용적이 지 않습니다. 따라서, meninges의 불완전 한 제거로 인해 변화를 제한, 우리 제거 하지 마십시오 meninges. Monocytes/호 중구 절연된 재료에 순환의 수를 최소화 하기 위해 그것은 또한 깨끗 한 관류 하는 것이 중요 하 고 우리가 일반적으로 가난 하 게 끼얹는다 조직 삭제. 도 우수한 관류, 혈액의 절대 정화를 통해 셀 펠 릿에 적혈구의 소량의 존재에 의해 분명 하 게 될 것입니다. 따라서, monocytes 그리고 호 중구의 작은 수준 공동 정화 하 고 갓 절연 셀 transcriptomic 프로필에 고유한 서명 기여. 그러나, 셀을 순환 혈 청 무료 콩 미디어에 신속 하 게 죽을 것 이다 하 고 그들은 생존 하 고 문화를 포함 하는 혈 청에서 증식을 계속할 수 있지만 영구 오염 물질을 대표 하지 마십시오.

다른 중요 한 건강 하 고, 가능한 문화를 달성 하는 점은 기계적 분리 단계 동안 돌 봐입니다. Douncing 죽 많은 뉴런, 명과, 그리고 다른 동안 CNS 셀, microglia 살아남을 상대적으로 (비록 microglia 이상 douncing에 의해 죽 ㄹ 수 있다)을 무사 히이 분리. 만약 제대로,이 프로토콜 셀 생산량 비교 분해 분리를 사용 하 여 얻은 그 결과, 염증 조직에서 변수 잠재적으로 혼동 하는 반면 높은 온도에 응답 피할 수 있습니다. 기계적 조직 분리의 연속 불완전 한 라운드를 수행 하 여 단일 셀 전체 문화에 기계적 스트레스의 양을 최소화 하면서 정지에서 수확 수 있습니다.

여기에 설명 된 immunopanning 프로토콜 microglia, 격리 하는 안정적이 고 재현 가능한 방법 이지만 다른 비교 방법을 사용할 수 있습니다. 우리 자기 활성화 셀 정렬 myelin 고갈 및 CD11b 선택 마그네틱 격리를 사용 하 여 비슷한 결과 얻은. 최고 품질 문화 날짜를 제공 하 고 덜 전문된 장비가 필요 합니다 문화 직전 셀에 산화 철 활용 된 항 체의 소개를 필요로 하지 않습니다 그것 때문에 우리가 여기 immunopanning 방법에 집중 했다. 또 다른 방법은 microglial 절연을 위해 일반적으로 사용 되는 프로토콜 다른 CD11b + 골수성 오염 물질 로부터 표면을 사용 하 여 선의 fide microglia의 정화에 대 한 존재에 현재 접근에 주요 이점이 있다 cytometry TEMEM119⁸등 서명 표식에 대 한 항 체 형광 활성화 된 세포 분류 결과 매우 순수 셀 인구, 비록 그것은 또한 셀에 추가 스트레스를 부과 하 고 낮은 생존 문화 또는 감소 된 수확량에 발생할 수 있습니다. 전반적으로, 우리는 재현성 및 셀 인구의 순도 최대화 하기 위해 레이블 없는 밀도 원심 분리와 쉐이크-오프 준비를 통해 항 체 기반 방법에 집중 한다.

이 프로토콜은 청소년 쥐 microglia의 문화에 대 한 최적화 하는 동안 사용할 수 있습니다 다양 한 연령대;에서 microglia 문화 총 셀 수익률은 1-2 주 된 쥐, microglial 확장의 피크 통과 후와 이전 조직에서 세포의 복구에 방해가 구조적 재배열 하기 전에 최대. Microglia 또한 분리 하 고 마우스 또는 인간의 epitopes 특정 적절 한 단일 클론 항 체와 CD11b 항 체를 대체 하 여 마우스 및 인간의 조직 배양 수 있습니다. 마우스와 인간의 microglia 이러한 문화 조건, 생존 하는 동안 그들은 쥐 세포에 비해 형태학 적 차이 보여줍니다. 마우스 세포 없는 형태를 유지 하지만 덜 인간의 세포는 거의 균일 한 amoeboid 형태학의 절연 하 고이 절차에 따라 경작 하는 동안 프로세스를 자세히 설명.

절연된 microglia 요구 분석에 따라 다른 방법으로 도금 될 수 있습니다. (라이브/죽은 분석 실험 및 형태학 영화 그림과 그림)으로 최적의 결과 위해 10³ 셀 x 3.5 자리"했다"로 콜라겐 IV의 10 분 코팅 후 24-잘 음이온/양이온 코팅된 조직 문화 접시의 우물의 센터에서 도금 위의 프로토콜에서 설명합니다. 또는, 셀, RNA 격리 등의 많은 수를 요구 하는 실험에 대 한 3-5 10⁴ 셀 배 수 수 도금 24-잘 접시의 당 콜라겐 IV 코팅의 1 시간에 10 분 후. 셀 약간 낮은 생존 능력을 보여 높은 밀도에서 도금 고 자리 했다 셀에 비해 덜 복잡 한 형태학 처리, 가능 하 게 염증 신호 고립에 응답에 분 비의 영향 때문. Immunohistochemistry 또는 유리 coverslips를 요구 하는 이미징, 세포 전시 최고의 생존 하 고 형태 coverslips 첫 번째 때 PDL 코팅 후 위에서 설명한 대로 콜라겐 IV에 코팅. 많은 조건 요구 분석, 대 한 세포 생존 능력 96 잘 또는 384-잘 콜라겐 코팅 접시에 고 이기도 합니다. 모든 조건에서 셀 라운드 또는 바이 폴라 밖으로 시작, 하루 3-4, 주위 프로세스를 습득 하 고 그림 1 과 영화 1에서 극대 없는 형태 전시 5-10 일이 걸릴 시작.

이 프로토콜은 동적 감시 행동과 microglia에서 vivo에서쉬고 비슷한 형태를 전시 하는 문화에서 결과, 하는 동안이 세포 완전히 microglia에서 vivo에서의 특수 유전자 식 서명 유지 하지. 많은 경작된 한 세포에 지속적인 유전자 변화의 일반적으로 배아 또는 염증이 CNS⁹본 변경 반영 합니다. 따라서,이 프로토콜 microglia 문화 및 혈 청 갖는 변화에서 살아남기 위해 필요 조건의 이해에서 전진 하지만 추가 연구 microglial 조정 CNS가 제공한 외부 신호를 이해 하는 데 필요한 속성 및 진 식입니다.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rat: Sprague-Dawley	Charles River	Cat# 400
mouse anti-rat CD11b monoclonal (clone OX42)	Bio-Rad	Cat# MCA275R	Panning: 1:1,000; Staining: 1:500
Goat polycolonal anti-Iba1	Abcam	Cat# AB5076	Staining: 1:500
Rabbit polyclonal anti-Ki67	Abcam	Cat# AB15580	Staining: 1:500
Alexa Fluor Donkey anti-mouse 594	Invitrogen	Cat# 11055	Staining: 1:500
Alexa Fluor Donkey anti-goat 488	Invitrogen	Cat# A-21203	Staining: 1:500
Alexa Fluor Donkey anti-Rabbit 647	Invitrogen	Cat# A-31573	Staining: 1:500
Triton-X (detergent in ICC staining)	Thermo Fisher	Cat# 28313
Heparan sulfate	Galen Laboratory Supplies	Cat# GAG-HS01
Heparin	Sigma	Cat# M3149
Peptone from milk solids	Sigma	Cat# P6838
TGF-β2	Peprotech	Cat# 100-35B
Murine IL-34	R&D Systems	Cat# 5195-ML/CF
Ovine wool cholesterol	Avanti Polar Lipids	Cat# 700000P
Collagen IV	Corning	Cat# 354233
Oleic acid	Cayman Chemicals	Cat# 90260
11(Z)Eicosadienoic (Gondoic) Acid	Cayman Chemicals	Cat# 20606
Calcein AM dye	Invitrogen	Cat# C3100MP
Ethidium homodimer-1	Invitrogen	Cat# E1169
DNaseI	Worthington	Cat# DPRFS
Percoll PLUS	GE Healthcare	Cat# 17-5445-02
Trypsin	Sigma	Cat# T9935
DMEM/F12	Gibco	Cat# 21041-02
Penicillin/ Streptomycin	Gibco	Cat# 15140-122
Glutamine	Gibco	Cat# 25030-081
N-acetyl cysteine	Sigma	Cat# A9165
Insulin	Sigma	Cat# 16634
Apo-transferrin	Sigma	Cat# T1147
Sodium selenite	Sigma	Cat# S-5261
DMEM (high glucose)	Gibco	Cat# 11960-044
Dapi Fluoromount-G	Southern Biotech	Cat# 0100-20
Poly-D-Lysine	Sigma	Cat# A-003-E
Primaria Plates	VWR	Cat# 62406-456
Name	Company	Catalog Number	Comments
Stock reagents
Apo-transferrin			Reconstitution: 10 mg/mL in PBS Concentration used: 1:100 Storage: -20°C
N-acetyl cysteine			Reconstitution: 5 mg/mL in H2O Concentration used: 1:1,000 Storage: -20°C
Sodium selenite			Reconstitution: 2.5 mg/mL in H2O Concentration used: 1:25,000 Storage: -20°C
Collagen IV			Reconstitution: 200 μg/mL in PBS Concentration used: 1:100 Storage: -80°C
TGF-b2			Reconstitution: 2 mg/mL in PBS Concentration used: 1:1,000 Storage: -20°C
IL-34			Reconstitution: 200 μg/mL in PBS Concentration used: 1:1,000 Storage: -80°C
Ovine wool cholesterol			Reconstitution: 1.5 mg/mL in 100% ethanol Concentration used: 1:1,000 Storage: -20°C
Heparan sulfate			Reconstitution: 1 mg/mL in H2O Concentration used: 1:1,000 Storage: -20°C
Oleic acid/Gondoic acid			Reconstitution: Gondoic: 0.001 mg/mL; Oleic: 0.1 mg/mL in 100% ethanol Concentration used: 1:1,000 Storage: -20°C
Heparin			Reconstitution: 50 mg/mL in PBS Concentration used: 1:100 Storage: -20°C
Name	Company	Catalog Number	Comments
Solutions
Perfusion Buffer			Recipe: 50 μg/mL heparin in DPBS++ (PBS with Ca++ and Mg+ +) Comments: Use when ice-cold
Douncing Buffer			Recipe: 200 μL of 0.4% DNaseI in 50 mL of DPBS++ Comments: Use when ice-cold
Panning Buffer			Recipe: 2 mg/mL of peptone from milk solids in DPBS++
Microglia Growth Medium (MGM)			Recipe: DMEM/F12 containing 100 units/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin, 2 mM glutamine, 5 μg/mL N-acetyl cysteine, 5 μg/mL insulin, 100 μg/mL apo-transferrin, and 100 ng/mL sodium selenite Comments: Use ice-cold MGM to pan microglia off of immnopanning dish.
Collagen IV Coating			Recipe: MGM containing 2 μg/mL collagen IV
Myelin Seperation Buffer			Recipe: 9 mL Percoll PLUS, 1 mL 10x PBS without Ca++ and Mg++, 9 μL 1 M CaCl2, 5 μL 1 M MgCl2 Comments: Mix well after the addition of  CaCl2 and MgCl2
TGF-b2/IL-34/Cholesterol containing growth media (TIC)			Recipe: MGM containing human 2 ng/mL TGF-b2, 100 ng/mL murine IL-34, 1.5 μg/mL ovine wool cholesterol, 10 μg/mL heparan sulfate, 0.1 μg/ml oleic acid, and 0.001 μg/ml gondoic acid Comments: Make sure to add cholesterol to media warmed to 37 °C and do not add more than 1.5 μg/mL or it will precipitate out. Do not filter cholesterol-containing media. Equilibrate TIC media with 10% CO2 for 30 min- 1 hr before adding to cells to insure optimal pH.