Isolering och kultur av gnagare mikroglia att främja en dynamisk förgrenad morfologi i serumfritt Medium

Summary

Ansträngningar för att förstå mikrogliala funktion i detalj har hindrats av bristen på mikrogliala kultur modeller som sammanfatta egenskaperna för mogna i vivo mikroglia. Det här protokollet beskriver en isolering och kultur strategi för att upprätthålla robusta överlevnad av starkt förgrenat mogen råtta mikroglia definieras-medium villkor.

Abstract

Mikroglia utgör 5-10% av alla celler i centrala nervsystemet (CNS) och drar alltmer uppmärksamhet på grund av deras bidrag under utveckling, homeostas och sjukdom. Även om makrofager har studerats i detalj för årtionden, specialiserade funktioner av mikroglia, vävnad bosatta makrofager i CNS, har förblivit i stort sett mystiska, delvis på grund av begränsningar i förmågan att sammanfatta mogen mikrogliala boenden i kultur. Här visar vi ett enkelt förfarande för snabb isolering av ren mikroglia från mogna gnagare hjärnan. Vi beskriver också serumfritt odlingsbetingelser som stöder höga nivåer av mikrogliala lönsamhet över tid. Mikroglia odlade under dessa definieras-medium förhållanden uppvisar genomarbetade förgrenat processer och dynamisk övervakning beteende. Vi illustrerar vissa effekter av serumexponering på odlade mikroglia och diskutera hur dessa serumfritt kulturer jämfört med såväl serum-exponerade kulturer som mikroglia i vivo.

Introduction

Som makrofager av CNS parenkymet, mikroglia interagera med ett brett spektrum av neuronala kretsar och gliaceller signalering nätverk. De spelar avgörande roller i utveckling och homeostas av hjärnan via synaptic beskärning, apoptotiska cell clearance och övergående interaktioner med neuronala processer^1,2. Mikroglia är tidiga responders till neurologiska skador, utvidga deras långa, tunna processer till lesion platser att samordna inflammatoriskt svar och begränsa blödning^3,4. Förändringar i mikrogliala morfologi och funktion är allestädes närvarande i både akuta och kroniska CNS-skador och mikroglia utställning förändrad morfologi, lokalisering och uttryck av inflammatoriska mediatorer i ett varierat utbud av sjukdom stater¹. Människans genetiska studier visar att mutationer som förändrar risken för neurodegenerativa sjukdomar uttrycks ofta huvudsakligen eller uteslutande av mikroglia i intakt CNS, pekar till en kritisk roll för mikroglia i sjukdomspatogenes eller progression⁵ . Med tanke på deras framträdande i skador och sjukdom, är främja förståelsen av mikrogliala biologi en hög prioritet för att utveckla nya behandlingsmetoder.

Många viktiga framsteg för förståelsen av mikrogliala biologi har uppstått genom att extrapolera tekniker och mekanism upptäcktes i studier av andra makrofag befolkningar, inklusive kultur metoder, gen uttryck profiler och definitioner av funktionella / morfologiska stater. Även om generell makrofag funktioner spelar ofta på överraskande sätt inom CNS landskapet, mikroglia är själva mycket specialiserad, uppvisar ett förgrenat morfologi och en unik gen uttryck signatur som skiljer dem från andra vävnader makrofager⁶. Mikroglia har en härstamning som skiljer sig från de flesta andra vävnad makrofager; de kolonisera CNS under en tidig embryonal våg av primitiva blodbildningen och själv förnya hela livet, oberoende av bidrag från slutgiltig blodbildning⁷. Fullt mogen gen uttryck signaturen av adult mikroglia uppnås inte förrän den andra postnatala vecka⁸. Miljömässiga ledtrådar från den omgivande vävnaden spela en viktig roll i dikterar vävnadsspecifika makrofag funktioner⁶, vilket i CNS inkluderar begränsad exponering för blodburna faktorer som beviljats av den blood - brain barriär⁹.

Ett hinder för att fullt ut förstå mikrogliala bidrag till CNS homeostas och sjukdom är svårigheten att går igenom specialiserade egenskaper för mogna mikroglia sett i vivo med renat celler in vitro-. Många metoder har utvecklats för att isolera och kultur intakt mikroglia, men de flesta metoder förlitar sig på serum att stödja cellöverlevnad. Vi har visat att tillägg av serum, som är ett inneboende variabel reagens som innehåller en stor mängd bioaktiva molekyler, är särskilt problematiskt när man arbetar med mikroglia eftersom det främjar en amoeboid morfologi, ökad spridning, och ökad fagocytos⁹ ses ofta i vivo när mikroglia utsätts för blodburna faktorer efter störningar av den blod - hjärnbarriären. Av dessa mätvärden, serum-exponerade celler liknar mikroglia i skador eller sjukdomstillstånd, men sådana förändringar reduceras när mikroglia odlas i definierade odlingsmedium som innehåller CSF-1 (eller IL-34), TGF-β, kolesterol och selenit.

Detta protokoll ger Detaljer för odling juvenil råtta mikroglia serumfritt villkor relaterade till nyligen publicerade arbete⁹. Detta protokoll har effektiviserats för råttor från den 21-30 (P21 - P30), men kan anpassas till isolera mikroglia från råttor och möss i alla åldrar, även avkastning och övergripande lönsamhet varierar beroende på art och djurets ålder. Maximal avkastning och optimal lönsamhet uppnås när du använder något omogen mikroglia (~ P9), avkastning och livskraftiga gradvis avsmalnande till något lägre nivåer i vuxna djur. Mikroglia kan också isoleras från möss, men vi har funnit att råtta celler visar betydligt högre avkastningen, livskraft och komplexiteten i förgrenat morfologier, jämfört med musen celler i serumfritt kulturer. Djur år större än P50 har inte utvärderats med detta protokoll. Proceduren immunopanning isolering har optimerats att minimera förändringar i mikrogliala transkriptionell profiler under isolering och maximera nedströms livskraften hos cellerna. Använda dessa tekniker och medier formuleringar, kan hög-livskraft primära kulturer upprätthållas i veckor. Mikroglia odlade under dessa förhållanden uppvisar ett starkt förgrenat morfologi som involverar snabba förlängning och indragning av processer och låga relativt priser för spridning. Vi framhålla betydelsen av serum-exponering på dessa egenskaper och diskuterar styrkor och svagheter med denna metod i förhållande till andra metoder.

Protocol

Alla förfaranden som rör gnagare överensstämde till Stanford University riktlinjer, som uppfyller nationella och statliga lagar och politik. Alla djur förfaranden godkändes av Stanford University administrativa panelen på laboratorium djur vård.

Obs: Alla lösning och buffert kompositioner finns i Tabell för material.

1. Förbered en petriskål för CD11b Immunopanning (dag 0)

Obs: Förbereda 1 immunopanning maträtt för varje 1-2 juvenil råtta hjärnor.

1. Tillsätt 25 mL 50 mM Tris pH 9,5 lösning till en 15-cm petriskål.
2. Lägg till get antimus IgG (H + L kedjor) till skålen för en slutlig koncentration på 6 µg/mL. Snurra runt plattan att jämnt fördela.
3. Inkubera skålen för 1-3 timmar vid 37 ° C.
4. Skölj rätter tre gånger med DPBS +⁺⁺ (fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS) med Ca^{2 +} och Mg^{2 +}), Ersätt med en lösning av panorering buffert innehållande 1 µg/mL OX42 antikropp. Lämna rätterna över natten i rumstemperatur på en plan yta.

2. vävnad samling (dag 1)

Obs: Detta protokoll bör ta ~ 3-4 h.

1. Innan du börjar, se till att alla lösningar är sterila och kylda på is. Chill alla instrument på is och sterilisera med etanol före användning.
2. Följande lämpliga rättsliga förfaranden, offra en juvenil laboratorium råtta av koldioxid kvävning.
   Obs: Alternativt yngre djur kan offras med en dödlig dos av ketamin/xylazin (100-200 µL av 24 mg/mL ketamin, 2,4 mg/mL xylazin). Ketamin/xylazin måste användas om djur är mindre än 14 dagars ålder. Om du använder flera djur, extrahera vävnad från ett djur och placera den i förväg kylda DPBS⁺⁺ på is innan du fortsätter till efterföljande djur.
3. Nyp en hindpaw och säkerställa komplett svarar från djuret innan du fortsätter.
4. Transcardially BEGJUTA djuret med 10-30 mL iskallt perfusion buffert med 27½-G nål tills bufferten är klart.
   Obs: Volymen av Perfusion bufferten kommer att variera beroende på djurets storlek/ålder.
5. Ta bort huvudet av djuret omedelbart efter perfusion. Kommer från ryggmärgen klippa den occipital condylen på varje sida med dissektion sax, vara noga med att inte skada hjärnan. Efter styckning varje sida noga, skär upp ena sidan längs parietala och pannbenet mot näsben. Med pincett försiktigt dra tillbaka toppen av skallen, snabbt bort hjärnan (eller CNS strukturer av intresse) och placera i förväg kylda DPBS⁺⁺ på is.
6. Upprepa för alla återstående djur.
   Obs: Alla förfarande åtgärder ska utföras i en LAF under rätt sterila förhållanden.

3. mekaniska Dissociation (dag 1)

1. När alla hjärnor har samlats, hugga en hjärna i 1 mm³ bitar i en petriskål på is med en kall skalpell blad och överföra till en iskall dounce Homogenisatorer med 5-7 mL iskallt douncing buffert. Separera en hjärna i taget.
2. Separera vävnaden med 10-20 mild och ofullständig linjer med en löst sittande dounce Homogenisatorer. Se till att inte direkt krossa vävnaden längst ned på homogenisatorn, men istället impel vävnaden genom utrymmet mellan sidorna av kolven och homogenisatorn.
3. Ta försiktigt bort kolven för att förhindra införandet av luftbubblor. Tillåta dåligt dissocierade vävnad bitar sedimentera till botten av homogenisatorn, och överför supernatanten till en ny kyld 50 mL koniska tub.
4. Ersätta den borttagna volymen med färska douncing buffert och upprepa steg 3.2 och 3.3 för totalt 3-4 rundor eller tills alla vävnad har varit separerade. Upprepa proceduren för varje hjärna.

4. myelin borttagning (dag 1)

Obs: Myelin borttagning används för isolering av mikroglia från djur äldre än P12.

1. Mäta volymen av cellsuspensionen i 50 mL koniska röret med 25 mL pipett och sedan lägga till iskall douncing buffert för att justera den totala volymen till 33,5 mL.
2. Tillsätt 10 mL av myelin separation buffert (MSB) till cellsuspension och blanda noggrant genom att vända rör flera gånger. Detta kommer att resultera i en slutlig koncentration för 23% av MSB i en volym av 43,5 mL.
3. Centrifugera celler för 15 min vid 500 x g vid 4 ° C med långsam bromsning.
   Obs: Centrifugen bör ta cirka 1,5-2 min att avta. Detta genererar ett övre lager av myelin och döda cellfragment, en något skumma supernatanten och en mindre pellets som är berikad för levande celler.
4. Ta bort det översta lagret av myelin/skräp och supernatanten med en pipett. Var försiktig när du tar bort det översta lagret att säkerställa som mycket av det tas bort som möjligt.
5. Återsuspendera cellpelleten i 12 mL panorering buffert. Försiktigt pulverisera cellsuspensionen att bryta upp eventuella klumpar av celler som kan finnas kvar.

5. Immunopanning (dag 1)

1. Passera en 70 µm cell SIL ta bort stora skräp eller cell klumpar cellsuspension.
2. Skölj OX42-belagda panorering skålen tre gånger med DPBS +⁺⁺. Tillåt inte plattan helt torr mellan tvättarna.
3. Häll av den sista DPBS⁺⁺ tvättningen och applicera den filtrerade cellsuspensionen till panorering skålen. Försiktigt snurra på plattan för att distribuera cellerna och sedan Inkubera plattan på en plan yta i rumstemperatur i 20 min så att celler att följa. Inkubera inte längre än 20 min eller celler kommer att bli mycket svårt att återhämta sig från skålen.
4. Skölj panorering skålen med DPBS +⁺⁺ 10 gånger att ta bort icke-anhängare celler. Mikroglia kommer att vara ordentligt fastsatt till plattan, så snurra plattan med varje skölj att säkerställa avlägsnande av andra icke-anhängare celler.
5. Häll av den sista DPBS⁺⁺ tvättningen och ersätta med 15 mL DPBS +⁺⁺ och 200 μL trypsin (1,25% stamlösning).
6. Inkubera skålen för ≤10 min vid 37 ° C med 10% CO₂ att trypsinize.
   Obs: Fortsätter inte längre än 10 min eller mikroglia kommer bli svåra att avlägsna.
7. Efter 10 min av trypsinization, kommer mikroglia fortfarande att fastna till plattan. Häll av trypsin/DPBS +⁺⁺ och försiktigt tvätta 2 x med DPBS +⁺⁺ att ta bort trypsin, ersätta med 12 mL iskallt mikroglia odlingsmedium (MGM).
8. Plats panorering maträtt på is i 2 min för att försvaga cell/substrat interaktion, och se till att skålen är platt till förhindrar uttorkning av områden av panorering skålen.
9. Pipettera kraftigt med en 10 mL pipett och Pipettera controller på hög hastighet att återställa celler från panorering skålen. Rita en 16 x 16 rutnät med strömmen av vätska från pipetten att försöka ta bort alla celler.
10. Markera celler i Mikroskop på 20 X förstoring så att cellerna har lösgjort från plattan. Mark fläckar ovanpå skålen där celler är fortfarande fast, och upprepa pipettering i dessa områden.
11. Samla cellsuspension och alikvotens 3-4 mL av supernatanten per 15 mL koniska rör. Snurra för 15 min vid 500 x g vid 4 ° C med långsam bromsning.
    Obs: Spinning mikroglia genom en liten volym möjliggör maximal återvinning av celler.
12. Aspirera supernatanten, lämnar 0,5 mL av MGM med cellpelleten.
13. Återsuspendera varje pellet i återstående MGM och pool cellerna från alla rören.
14. Räkna celler med hemocytometer.
15. Platta celler som beskrivs i steg 6 - 7 beroende på applikation.
16. Kultur celler vid 37 ° C med 10% CO₂.
    Obs: Cellerna kan vara kultur för upp till 3-4 veckor med regelbunden media ändringar eller en vecka utan media ändringar.

6. plats beläggning vävnadsodling plattor/Coverslips (dag 1)

1. Platta 15 µL av kollagen IV beläggning direkt i mitten av en 24-väl anjoniska/katjoniska belagda vävnadsodling tallrik (se Tabell av material för detaljer) och inkubera i 15 minuter vid 37 ° C med 10% CO₂.
2. Späd cellerna till 2,3 x 105/ml i MGM efter räknar celler med hemocytometer. Aspirera kollagen IV spot och omedelbart plattan 15 µL cellsuspension till denna plats; Detta ger 3,5 x 10³ celler/plats. Inkubera i 5-10 min vid 37 ° C med 10% CO₂ att tillåta celler att följa, tillsätt 500 µL av CO_{2 -}jämviktas TGF-β2/IL-34/kolesterol innehållande odlingsmedium (TIC) försiktigt till brunnen.
3. Om plätering på coverslips, första coat sterilt glas coverslips med 10 µg/mL ploy-D-lysin (PDL) i H₂O för 1 h på RT, tvätta 3 gånger med H₂O och låt torka i en huva i UV-belysning. När coverslips är torra, fortsätta med spot plätering på coverslips som beskrivs i steg 6,2.

7. plätering för RNA och Protein isolering

1. Dag 1, coat det hela området av en 24-väl anjoniska/katjoniska belagda vävnadsodling plattan med kollagen IV beläggning och inkubera för 10 min - 1 h vid 37 ° C med 10% CO₂, sedan bort och omedelbart tallrik 3-5 x 10⁴ celler per brunn i CO₂ jämviktas TIC media.
2. Dag 2, utför en 50% media förändring för var väl dagen efter beredning. Döda celler tenderar att kluster i mitten av brunnen, så ta media därifrån.
3. Utföra en 50% media förändring varje 2-3 dagar för att upprätthålla kulturer. Om media ändringar införa en oönskad variabel för kulturerna, kan celler överleva i ca 1 vecka utan media förändringar, i motsats till över 3 veckor med regelbundet underhåll.

Representative Results

Det här protokollet beskriver en metod att kultur hög renhet förgrenad mikroglia från juvenila råttor. Liknande resultat kan erhållas med hjälp av omogna, perinatal och vuxna djur, som diskuteras nedan. Eftersom cellen isoleringar innehåller ofta subtila nyanserna och många möjligheter för cellerna att dö, använde vi kvalitetskontroll kontrollpunkter för att fastställa framgång vid olika steg. Vi övervakas vanligtvis cellsuspensioner använder en hemocytometer på flera steg i protokollet isolering (figur 1A). Framgångsrika isoleringar bör ge 2,5-5 x 10⁵ celler/unga djur. Djur från P7 - P15 visar avkastningen närmare till 5 x 10⁵ celler/djur, medan celler som isolerats från djur äldre än P30 visar avkastningen närmare till 2,5 x 10⁵ celler/djur. Utöver övervakning summacell räknas i hela protokollet, är det viktigt att fastställa övergripande hälsa för isolerade celler, som kan vara svårt eftersom mikroglia isolerade på detta sätt har en rundad eller bipolär morfologi under de första dagarna i kultur . Här har vi inkluderat fas bilder av P25 mikroglia i kultur under de första 6 dagarna efter isolering i TIC och TIC som innehåller 10% fetalt kalvserum (FCS) (figur 1B).

Figur 1: utvärdering av cell hälsa under protokollet isolering och över 6 dagar av kultur. (A) faskontrast bilder som illustrerar kvalitetskontroll kontrollpunkter på de utsedda steg av förfarandet cell isolering. Cellulära suspensioner var avbildade genom att blanda 9 µL av den cellulära suspensionen med 1 µL 0,4% trypan blå innan lastning på en hemocytometer. Andra bilder visar panorering skålen själv, och alla bilder visas som ett fält på 20 X förstoring. Skalstapeln, 200 µm. MGM, mikroglia odlingsmedium. (B) tidsförloppet för mikrogliala morfologiska förändringar och spridning över 6 dagar av kultur i serumfritt TIC tillväxt medium eller TIC plus 10% fetalt kalvserum (FCS). CD11b-immunopanned celler var fläck pläterade på kollagen-belagd anjoniska/katjoniska belagda vävnadsodling tallrik (se Tabell av material för detaljer), och samma fält fotograferades av fas-kontrast varje 24 h. skala bar, 100 µm. TIC, TGF-β2/IL-34 / Kolesterol som innehåller odlingsmedium. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Rutinmässig utvärdering av hälsa och livskraft isolerade celler är viktigt för reproducerbarhet och framgången för experiment. Här visar vi mikroglia som isolerats från ett P21 djur odlade i MGM, TIC eller TIC kompletteras med 10% FCS efter 7 dagar i vitro (DIV) med en lönsamhet analysen. Om isoleringen var framgångsrik, Visa kulturer mellan 80-90% livskraft i TIC efter 7 DIV. celler odlade i närvaro av serum så småningom klättra till nära 100% lönsamhet genom denna åtgärd, men detta är konstlat båda snabba utbredningen av serum-exponerade cellerna och snabba fagocytos av döda celler inom dessa kulturer (figur 2A). Förutom robust överlevnad Visa TIC odlade celler också ett förgrenat morfologi jämfört med FCS behandlade celler (figur 2B, C).

Figur 2: överlevnad av mikroglia i MGM, TIC eller TIC + FCS under sju dagar i kultur. (A) celler isolerades från P21 råttor och odlade i mikroglia odlingsmedium (MGM), TGF-β2/IL-34/kolesterol innehållande odlingsmedium (TIC), eller TIC + 10% fetalt kalvserum (FCS). Vid varje tidpunkt kompletterades odlingsmedium med calcein AM (1.33 µM slutlig) och etidiumbromid homodimer (2,5 µM slutliga) för 15 min till etikett levande och döda celler respektive. Cellerna räknades i varje fält med ett automatiserat skript för ImageJ. (B och C) efter 7 DIV, utan media ändringar, celler odlas i TIC (B) eller TIC kompletteras med 10% FCS (C) var målat etikettera levande och döda celler som ovan. Representativa bilder togs med en 10 X (vänster) eller 40 X (höger) objektiv. Skalstapeln, 40 µm. felstaplar representera standardavvikelsen för medelvärdet (SEM). Denna siffra ändrades från Bohlen o.a. ⁹ och används med tillstånd. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

För att demonstrera framgångsrika isolering och kultur av högt rent mikroglia, vi isolerade mikroglia från P21 råttor och odlade dessa celler i TIC eller TIC kompletteras med 10% FCS för 8 dagar. Cellerna var sedan fixeras och färgas med mikrogliala markörer (Iba-1 och CD11b) och spridning markör (Ki67, figur 3A). Utöver färgning för cell markörer, RNA-seq på nybakade isolerade celler kan ger en kraftfull och känslig verktyg för att utvärdera RNA profilen av cellerna, och kan hjälpa till att informera start renheten av kulturer. CD11b immunopanning vanligtvis resulterar i en liten andel av CD11b⁺ neutrofiler/monocyt överföring förutom CD11b⁺ mikroglia (figur 3B). Dessa celler kommer att dö i TIC efter några dagar, men kan försvåra analyser av tidigare tidpunkter.

Figur 3: renhet av odlade celler bedömdes av immunohistokemi och RNA-följande (A) mikroglia isolerades från P21 råttor, pläterade på PDL/kollagen belagda glas coverslips och odlade i TGF-β2/IL-34/kolesterol innehållande odlingsmedium (TIC) i 8 dagar. Cellerna var fast med 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) under 10 minuter vid rumstemperatur och immun-färgade med Iba-1 (1: 500), CD11b (1: 1500), och Ki67 (1: 500). Kort, fast celler blockerades med 0,1% tvättmedel (se metoder tabell för detaljer) och 10% normala åsna serum (NGS) för 1 h i rumstemperatur. Cellerna var sedan inkuberas med primära antikroppar i 0,1% tvättmedel med 1% NGS övernattning vid 4 ° C. Celler spolades tre gånger för 5 min varje i PBS. Cellerna var sedan inkuberas med sekundära antikroppar alla 1: 500 i 0,1% tvättmedel med 1% NGS för 1 h i rumstemperatur. Cellerna var igen sköljs tre gånger i PBS och monterad med DAPI-innehållande monteringsmedium. Representativa bilder togs på 40 X förstoring. Skala bar, 50 µm. (B) uttryck för representativa cell-typ specifika avskrifter av nymalet-isolerade och odlade celler. Mikroglia var isolerade från P21 råttor och lyserat direkt från immunopanning skålen för RNA isolering och RNA-följande punkter markörer för andra stora CNS celltyper (astrocyter, nervceller, oligodendrocyter och endotelceller) Visa minimal nedsmutsning av CD11b-immunopanned celler. Neutrofila markörer identifieras i färska-isolerade celler (svart), men förlorade i serumfritt kulturer (grå). Odlade celler uttrycker höga nivåer av gemensamma makrofag markörer, men markörer som definierar den specialiserade mikrogliala signaturen är snabbt nedreglerade av odlade celler. Felstaplar representera standardavvikelsen för medelvärdet (SEM). Data ändras från Bohlen o.a. ⁹ och används med tillstånd. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Färgning för livskraft och cell markörer möjliggör bestämning av överlevnad och renhet av cellerna, men ger begränsad information om dynamiken i kulturen. Här har vi tillhandahållit en time-lapse film av P21 råtta mikroglia efter 14 DIV i TIC. Efter två veckor, serumfritt kulturer Visa dynamisk övervakning beteende, med snabb process tillägg och retractions hela skålen (se film 1). Dessutom har vi tidigare funnit att serumexponering omvandlar dessa vilar staten egenskaperna hos mikroglia, vilket resulterar i bestående morfologiska och fagocytos förändringar. Vi har inkluderat en film av mikroglia odlade i 5 dagar i TIC, sedan utsätts för 10% FCS (se film 2).

Film 1: definierade-medium mikroglia kulturer Visa förgrenat morfologi med dynamiska processer. Mikroglia isolerades från en P21 rat, spot pläterade på kollagen-belagd anjoniska/katjoniska belagda vävnadsodling plattor, och odlade i 14 dagar i TIC. På 14 DIV samlades bilder varje 3 min. Filmen spelar på 6 bildrutor/s och tidsstämpeln i det nedre högra hörnet anger varaktigheten av imaging h:min. filmen återges från Bohlen o.a. ⁹ och används med tillstånd. Vänligen klicka här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ner.)

Movie 2: serumexponering utlöser en snabb morfologisk förändring i definierade-medium mikrogliala kulturer. Mikroglia isolerades från en P21, spot pläterade på kollagen-belagd anjoniska/katjoniska belagda vävnadsodling plattor, och råtta odlade under 5 dagar i TIC. Vid 5 DIV, bilder samlades varje 5 min. baslinjen motilitet/morfologi spelades, sedan vid 2:55 (2 h, 55 min), en 50% media förändring genomfördes för att lägga till FCS till en slutlig koncentration på 10%. Cellerna var avbildade för en ytterligare 7 h. Filmen spelar på 6 bildrutor/s och tidsstämpeln i det nedre högra hörnet anger varaktigheten av imaging i h:min. vänligen klicka här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ner.)

Discussion

Eftersom mikroglia fungera som sentinel immunceller i CNS, är de mycket lyhörda för förändringar i miljön; Därför krävs stor omsorg för att minimera inflammatoriska reaktioner i cellerna under deras isolering och kultur⁸. Detta sker i detta protokoll genom fart och temperatur. Att hålla cellerna på is eller vid 4 ° C närhelst möjligt minskar aktiveringen, så alla centrifugering steg ske vid 4 ° C, djuren är perfusion med iskall perfusion buffert och protokollet har effektiviserats för att minimera tiden mellan vävnad utvinning och odling av celler. Om bedömningen av gen uttrycksmönster av nymalet-isolerade celler, skörda cell lysates direkt från CD11b immunopanning skålen före trypsinization att hålla isolering-inducerad förändringar på ett minimum. Det bör noteras att även noggrant-isolerade mikroglia köra ett inflammatoriskt svar omedelbart efter placeras i varma temperaturer, förmodligen på grund av erkännande av skador-associerade signaler oupplösligt samband med förfarandet för isolering. Om protokollet utfördes framgångsrikt, förväntas 2,5-5 x 10⁵ celler/juvenil råtta.

Cell isolering protokollet föreskrivs här är mycket specifika för att isolera CD11b +-celler från perfunderade CNS⁹. Även om denna cell befolkning består huvudsakligen av mikroglia, innehåller den även låga nivåer av andra myeloisk populationer såsom perivaskulär makrofager, meningeal makrofager, plexus koroidea makrofager, monocyter och neutrofiler¹⁰. Åderhinnan-associerade myeloida celler kan elimineras huvudsakligen genom erkännande och borttagning av plexus koroidea före vävnad dissociation. Hjärnhinnorna kan också tas bort i viss utsträckning, men fullständig eliminering av alla meningeal vävnad är inte praktiskt inom de tidsramar som måltavlan för snabb isolering beskrivs här. Därför för att begränsa variationen på grund av ofullständig borttagning av hjärnhinnorna, ta vi inte hjärnhinnorna. För att minimera antalet cirkulerande monocyter/neutrofiler i det isolera materialet, det är också viktigt att ha en ren perfusion och vi kassera vanligtvis vävnad som är dåligt perfusion. Även med utmärkta perfusion är clearance av blod inte absolut, som kommer att framgå av närvaron av en liten mängd erytrocyter i cell pellets hela rening. Alltså små nivåer av monocyter och neutrofiler Co renas och bidra en distinkt signatur transcriptomic profiler av nymalet-isolerade celler. Dock cirkulerande celler snabbt kommer att dö i serumfritt TIC media och representerar inte långlivade föroreningar, även om de kan fortsätta att överleva och föröka sig i serum som innehåller kulturer.

En annan viktig punkt att uppnå en sund och livskraftig kultur är att ta hand under stegen mekaniska dissociation. Medan douncing dödar många nervceller, glia och andra överleva CNS celler, mikroglia denna dissociation relativt oskadda (även om mikroglia kan också dödas av över-douncing). Om gjort korrekt, detta protokoll resulterar i cell avkastning jämförbar med dem som erhålls med hjälp av proteolytiska dissociation, medan potentiellt störande variabler från vävnad inflammatoriska svar vid förhöjda temperaturer undviks. Genom att utföra konsekutiva ofullständiga rundor av mekaniska vävnad dissociation, kan enstaka celler skördas från suspensionen samtidigt minimera mängden mekanisk stress på den övergripande kulturen.

Det immunopanning-protokollet som beskrivs här är tillförlitliga och reproducerbara sätt att isolera mikroglia, men finns andra jämförbara metoder. Vi har fått liknande resultat med magnetiska isolering med magnetiska-aktiverad cell sortering myelin utarmning och CD11b urval. Här har vi fokuserat på metoden immunopanning eftersom den har gett de högsta kvalitet kulturerna hittills, kräver mindre specialiserad utrustning och kräver inte införandet av järnoxid-konjugerade antikroppar till cellerna omedelbart före kultur. En annan metod som vanligen används för mikrogliala isolering är flödescytometri, som har en stor fördel över den nuvarande strategin i detta protokoll finns för rening av bona fide mikroglia från andra CD11b + myeloisk föroreningar med surface antikroppar mot signatur markörer såsom TEMEM119⁸. Även om fluorescens-aktiverad cell sortering resulterar i en extremt ren cell befolkning, det också medför ytterligare betonar att cellerna och kan resultera i lägre lönsamhet kulturer eller minskad avkastning. Sammantaget fokuserar vi på antikroppsbaserade metoder över etikett-fri densitet centrifugering och shake-off preparat att maximera reproducerbarhet och renhet av cell befolkningen.

Medan detta protokoll är optimerad för kulturen i juvenil råtta mikroglia, kan den användas till kultur mikroglia från olika åldrar. summacell avkastningen är maximal från 1 - 2 veckor gamla råttor, efter toppen av mikrogliala expansion har passerat och innan strukturella omflyttningar som störa återhämtningen av celler från äldre vävnad. Mikroglia kan också vara isolerade och odlade från mus och mänsklig vävnad genom att ersätta CD11b antikroppen med en lämplig monoklonal antikropp som är specifik för musen eller mänskliga epitoper. Medan både mus och mänskliga mikroglia överleva under dessa odlingsbetingelser, visar de morfologiska skillnader jämfört med råtta celler. Mus celler behåller ett förgrenat morfologi men har mindre utveckla processer, medan mänskliga celler har en nästan enhetlig amoeboid morfologi när isolerade och odlade enligt detta förfarande.

Isolerade mikroglia kan pläteras på olika sätt beroende på de analyser som krävs. För optimalt resultat (som illustreras i live/dead analyser och morfologiska filmer visas här), var 3,5 x 10³ celler ”fläck” klädd i mitten av brunnen av en 24-väl anjoniska/katjoniska belagda vävnadsodling plattan efter en 10-minuters beläggning av kollagen IV som beskrivs i protokollet ovan. Alternativt, för experiment som kräver stort antal celler, såsom RNA isolering, 3-5 x 10⁴ celler kan beläggas per brunn 24-well platta efter 10 min till 1 h av kollagen IV beläggning. Celler pläterade vid högre tätheter visade något lägre lönsamhet och mindre komplicerad morfologi jämfört med celler som var fläck behandlas, möjligen till följd av inflammatoriska signaler utsöndras som svar på isoleringen. För immunhistokemi eller imaging kräver glas coverslips, celler uppvisar bästa överlevnad och morfologi när coverslips var första belagda med PDL sedan belagd i kollagen IV som beskrivs ovan. För analyser som kräver ett stort antal villkor, är cellernas viabilitet också hög i 96 brunnar eller 384-väl kollagen-belagda plattor. Under alla förhållanden, cellerna börjar runda eller bipolär, börja att förvärva processer runt dag 3-4, och ta 5-10 dagar att ställa ut maximally förgrenat morfologi illustreras i figur 1 och film 1.

Medan detta protokoll resulterar i en kultur som uppvisar dynamisk övervakning beteende och morfologi liknar vilar mikroglia i vivo, misslyckas dessa celler helt behålla specialiserade gen uttryck undertecknandet av mikroglia i vivo. Många av de ihållande genförändringar som observerats i odlade celler återspeglar förändringar som normalt ses i embryonala eller inflammerad CNS⁹. Som sådan, detta protokoll utgör ett steg framåt i förståelsen av omständigheter mikroglia kräver för att överleva i kultur och serum-evoked förändringar, men vidare studier behövs för att förstå de yttre signaler som tillhandahålls av CNS som finjusterar mikrogliala egenskaper och gen uttryck.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rat: Sprague-Dawley	Charles River	Cat# 400
mouse anti-rat CD11b monoclonal (clone OX42)	Bio-Rad	Cat# MCA275R	Panning: 1:1,000; Staining: 1:500
Goat polycolonal anti-Iba1	Abcam	Cat# AB5076	Staining: 1:500
Rabbit polyclonal anti-Ki67	Abcam	Cat# AB15580	Staining: 1:500
Alexa Fluor Donkey anti-mouse 594	Invitrogen	Cat# 11055	Staining: 1:500
Alexa Fluor Donkey anti-goat 488	Invitrogen	Cat# A-21203	Staining: 1:500
Alexa Fluor Donkey anti-Rabbit 647	Invitrogen	Cat# A-31573	Staining: 1:500
Triton-X (detergent in ICC staining)	Thermo Fisher	Cat# 28313
Heparan sulfate	Galen Laboratory Supplies	Cat# GAG-HS01
Heparin	Sigma	Cat# M3149
Peptone from milk solids	Sigma	Cat# P6838
TGF-β2	Peprotech	Cat# 100-35B
Murine IL-34	R&D Systems	Cat# 5195-ML/CF
Ovine wool cholesterol	Avanti Polar Lipids	Cat# 700000P
Collagen IV	Corning	Cat# 354233
Oleic acid	Cayman Chemicals	Cat# 90260
11(Z)Eicosadienoic (Gondoic) Acid	Cayman Chemicals	Cat# 20606
Calcein AM dye	Invitrogen	Cat# C3100MP
Ethidium homodimer-1	Invitrogen	Cat# E1169
DNaseI	Worthington	Cat# DPRFS
Percoll PLUS	GE Healthcare	Cat# 17-5445-02
Trypsin	Sigma	Cat# T9935
DMEM/F12	Gibco	Cat# 21041-02
Penicillin/ Streptomycin	Gibco	Cat# 15140-122
Glutamine	Gibco	Cat# 25030-081
N-acetyl cysteine	Sigma	Cat# A9165
Insulin	Sigma	Cat# 16634
Apo-transferrin	Sigma	Cat# T1147
Sodium selenite	Sigma	Cat# S-5261
DMEM (high glucose)	Gibco	Cat# 11960-044
Dapi Fluoromount-G	Southern Biotech	Cat# 0100-20
Poly-D-Lysine	Sigma	Cat# A-003-E
Primaria Plates	VWR	Cat# 62406-456
Name	Company	Catalog Number	Comments
Stock reagents
Apo-transferrin			Reconstitution: 10 mg/mL in PBS Concentration used: 1:100 Storage: -20°C
N-acetyl cysteine			Reconstitution: 5 mg/mL in H2O Concentration used: 1:1,000 Storage: -20°C
Sodium selenite			Reconstitution: 2.5 mg/mL in H2O Concentration used: 1:25,000 Storage: -20°C
Collagen IV			Reconstitution: 200 μg/mL in PBS Concentration used: 1:100 Storage: -80°C
TGF-b2			Reconstitution: 2 mg/mL in PBS Concentration used: 1:1,000 Storage: -20°C
IL-34			Reconstitution: 200 μg/mL in PBS Concentration used: 1:1,000 Storage: -80°C
Ovine wool cholesterol			Reconstitution: 1.5 mg/mL in 100% ethanol Concentration used: 1:1,000 Storage: -20°C
Heparan sulfate			Reconstitution: 1 mg/mL in H2O Concentration used: 1:1,000 Storage: -20°C
Oleic acid/Gondoic acid			Reconstitution: Gondoic: 0.001 mg/mL; Oleic: 0.1 mg/mL in 100% ethanol Concentration used: 1:1,000 Storage: -20°C
Heparin			Reconstitution: 50 mg/mL in PBS Concentration used: 1:100 Storage: -20°C
Name	Company	Catalog Number	Comments
Solutions
Perfusion Buffer			Recipe: 50 μg/mL heparin in DPBS++ (PBS with Ca++ and Mg+ +) Comments: Use when ice-cold
Douncing Buffer			Recipe: 200 μL of 0.4% DNaseI in 50 mL of DPBS++ Comments: Use when ice-cold
Panning Buffer			Recipe: 2 mg/mL of peptone from milk solids in DPBS++
Microglia Growth Medium (MGM)			Recipe: DMEM/F12 containing 100 units/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin, 2 mM glutamine, 5 μg/mL N-acetyl cysteine, 5 μg/mL insulin, 100 μg/mL apo-transferrin, and 100 ng/mL sodium selenite Comments: Use ice-cold MGM to pan microglia off of immnopanning dish.
Collagen IV Coating			Recipe: MGM containing 2 μg/mL collagen IV
Myelin Seperation Buffer			Recipe: 9 mL Percoll PLUS, 1 mL 10x PBS without Ca++ and Mg++, 9 μL 1 M CaCl2, 5 μL 1 M MgCl2 Comments: Mix well after the addition of  CaCl2 and MgCl2
TGF-b2/IL-34/Cholesterol containing growth media (TIC)			Recipe: MGM containing human 2 ng/mL TGF-b2, 100 ng/mL murine IL-34, 1.5 μg/mL ovine wool cholesterol, 10 μg/mL heparan sulfate, 0.1 μg/ml oleic acid, and 0.001 μg/ml gondoic acid Comments: Make sure to add cholesterol to media warmed to 37 °C and do not add more than 1.5 μg/mL or it will precipitate out. Do not filter cholesterol-containing media. Equilibrate TIC media with 10% CO2 for 30 min- 1 hr before adding to cells to insure optimal pH.