Summary
이 프로토콜 설명 caspase 분자 형광 보완성 (BiFC); 그들의 활성화에 있는 첫걸음은 초기자 caspases의 유도 근접을 시각화 하는 데 사용할 수는 영상 기반 방법입니다.
Abstract
프로 테아 제 caspase 제품군 apoptosis와 타고 난 면제에 필수적인 역할을 한다. 이 중, 초기자 caspases로 알려진 네가이 경로에서 활성화 될 먼저 있습니다. 이 그룹 포함 caspase-2,-8, 및-9, 뿐만 아니라 염증 caspases, caspase-1,-4, 그리고-5. 초기자 caspases 모두 다음 모집 활성화 플랫폼 이라고 하는 특정 multiprotein 복합물을 이합체 화에 의해 활성화 됩니다. Caspase 분자 형광 보완성 (BiFC)은 어디 caspases 초기자 caspases 그들의 활성화 플랫폼 및 그 결과의 채용을 시각화 하는 데 사용 되는 시작자를 융합 하는 형광 단백질을 분할 영상 기반 접근 유도 근접입니다. 이 형광 판독을의 초기자 caspase 활성화에 필요한 초기 단계 중 하나를 제공 합니다. 다양 한 다른 현미경-기반 접근을 사용 하 여,이 기술은 caspase 활성화 크기 및 caspase 활성화의 활동 인구 수준에 caspase 활성화의 효율성에 양적 데이터를 제공할 수 있습니다. 셀 당 기초에 있는 복합물
Introduction
Caspase 프로 테아 제 가족은 apoptosis와 타고 난 면제 1에 그들의 중요 한 역할에 대 한 알려져 있다. 그들의 중요성 때문에 결정 언제, 어디서, 그리고 어떻게 효율적으로 특정 caspases 활성화 활성화 경로 caspase의 메커니즘에 대 한 중요 한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 여기에 설명 된 이미징 기반된 프로토콜 caspase 활성화 폭포의 가장 이른 단계 시각화 수 있습니다. 이 기술은 활용 동적 단백질: 단백질 상호 작용의 그 드라이브 caspase 활성화.
Caspases는 두 그룹으로 분할 될 수 있다: 초기자 caspases (caspase-1,-2,-4,-5,-8,-9,-10, 및-12)와 사형 집행 caspases (caspase 3-6과-7). 사형 집행 caspases 미리 형성한 이합체로 셀에 존재 하 고 크고 작은 소 단위 2사이 분열에 의해 활성화 됩니다. 활성화 되 면, 그들은 apoptosis 3의 결과로 수많은 구조 및 규제 단백질을 쪼개 다. 초기자 caspases는 통로에서 활성화 될 및 일반적으로 사형 집행 caspases의 활성화를 방 아 쇠를 첫 번째 caspases. 사형 집행 caspases, 달리 초기자 caspases 이합체 화 4,5에 의해 활성화 됩니다. 이 이합체 화 활성화 플랫폼으로 알려진 특정 큰 분자량 단지를 비활성 단위체의 채용에 의해 촉진 된다. 정품 인증 플랫폼의 특정 단백질: 단백질 상호 작용의 일련에 의해 규율 됩니다. 이러한 보존된 단백질 상호 작용 주제 시작자 caspase의 proform에 의해 중재 되 고 죽음 도메인 (DD), 죽음 이펙터 도메인 (DED) 및 caspase 신규 모집 도메인 (카드) 6 (그림 1A)를 포함 합니다. 정품 인증 플랫폼은 일반적으로 수용 체 단백질과 접합 기 단백질을 포함. 수용 체는 일반적으로 수많은 분자의 oligomerization 수 있도록 구조적 변화를 유도 한 ligand의 바인딩 시 활성화 됩니다. 수용 체 다음 중 채용 caspase 직접 또는 어댑터 분자는 차례로 caspase는 복잡 합니다. 따라서, 수많은 caspase 분자 이합체 화를 허용 하는 가까이에 서. 이 유도 근접 모델 7이라고 합니다. 일단, dimerized는 caspase autoprocessing 활성 효소 4,8을 안정화 하는 역할을 겪 습. 예를 들어 Apaf1 apoptosome의 시 토 크롬 c 미토 콘 드리 아 외 막 permeabilization (MOMP) 라는 프로세스에서 미토 콘 드리 아에서 출시를 다음에 의해 트리거됩니다. Apaf1는 차례로 caspase-9 카드 두 단백질 9에 의해 중재 되는 상호 작용을 통해 보충 한다. CD95 죽음의 복잡 한 신호 유도 (디스크) caspase-8 활성화; 리드 어셈블리에 비슷한 단백질 상호 작용 결과 caspase-2;를 활성화할 수 있습니다 PIDDosome 그리고 다양 한 inflammasome 단지 caspase-1 정품 인증 10,,1112을 시작 하는. 따라서, 초기자 caspases는 유도 근접 고 이합체 화 없이 활성화를 발생 하지 것입니다 일반적인 메커니즘에 의해 특정 활성화 플랫폼을 채용.
Caspase 분자 형광 보완성 (BiFC)는 초기자 caspases의 활성화에서이 첫 번째 단계를 측정 하기 위해 개발 된 영상 기반 분석 결과 caspase 유도 근접 다음 활성화 플랫폼의 직접 시각화 어셈블리입니다. 이 방법은 분할 형광 단백질 비너스의 속성 활용합니다. 금성은 더 밝고 비 형광과 약간 겹치는 두 조각으로 분리 될 수 있다 노란 형광 성 단백질 (YFP)의 더 photostable 버전: 금성 금성 N (VN), 비너스 (금성 C 또는 VC)의 C-말단의 N terminus. 이 파편 refold 될 때 근접 13에 형광을 유지 합니다. 각 비너스 조각 활성화 플랫폼을 caspase의 최소 부분입니다 caspase의 prodomain에 융합 이다. 그러면 그는 caspases 효소 활동을 유지 하지 않습니다 및 따라서 생 이벤트와 관련 된 다운스트림 이벤트의 동시 분석 가능 하다. 금성 파편 refold caspase prodomains 활성화 플랫폼을 채용 하 고 유도 근접을 받 다. (그림 1B)입니다. 결과 금성 형광 정확 하 고 구체적으로 subcellular 지 방화, 활동, 그리고 단일 셀에서 초기자 caspase 활성화 플랫폼의 조립의 효율성을 모니터링 하는 데 사용할 수 있습니다. Confocal 현미경 검사 법에 의해 또는 표준 형광 현미경 검사 법에 의해 취득 될 수 있다 데이터 이미징 및 다른 현미경 방법 등의 숫자에 적응 시킬 수 있다: 실시간으로; caspase 활성화 추적 시간 경과 영상 subcellular 지 방화;의 정확한 결정을 위한 고해상도 이미징 그리고 활성화의 효율성의 끝점 정량화입니다.
이 기술은 caspase-214의 활성화를 조사 하기 위해 처음 개발 되었다. Caspase-2에 대 한 정품 인증 플랫폼은 PIDDosome 생각 된다, 하는 동안 구성 된 수용 체 PIDD (죽음 도메인으로 유도 하는 p53 단백질)와 RAIDD (죽음 도메인 RIP 관련 ICH-1/CAD-3 동종 단백질), 어댑터 PIDDosome-독립적인 caspase-2 정품 인증 보고 되었습니다. 이 caspase-2에 대 한 추가 활성화 플랫폼 존재 15,16나왔다. 모르고 caspase-2 활성화 플랫폼의 전체 구성 요소, 불구 caspase BiFC 기술은 분자 수준 14,17caspase-2 신호 통로의 성공적인 심문을 위해 허용 했다. 우리 또한 성공적으로이 프로토콜 염증 caspases (caspase-1,-4,-5-12)에 대 한 적응 18 , 원칙적으로, 동일한 접근 마찬가지로 나머지 초기자 caspases의 각각을 분석 하는 것을 충분 해야 한다. 이 프로토콜 마찬가지로 적응 될 수 있는 다른 경로 조사 이합체 화는 주요 활성화 신호 했다. 예를 들어, STAT 단백질 이합체 화 Janus 키 니 아 제 (JAK) 19에 따라 인 산화에 의해 활성화 됩니다. 따라서, BiFC 시스템 합계 활성화 뿐만 아니라 많은 다른 경로 동적 단백질 상호 작용에 의해 규제에 대 한 시각화 사용 될 수 있습니다. 다음 프로토콜 이미지 수집 및 분석을 위한 방법론 뿐만 아니라 세포로 기자 들의 도입에 대 한 단계별 지침을 제공합니다.
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Protocol
1입니다. 셀 및 문화 요리 준비
참고: 조직 문화 층 류 두건에 1-3 단계를 수행 합니다. 장갑을 착용 한다.
- 경우 유리 하단 요리에 사용 하 여, fibronectin 함께 유리 코트. 플라스틱 접시를 사용 하 여 경우 1.2 단계를 건너뜁니다.
- Fibronectin의 0.1 mg/mL 해결책 확인: 1 X PBS의 9 mL에 1 mg/mL fibronectin 솔루션의 1 mL를 희석.
- 0.5-1 각의 유리 하단 커버 fibronectin mL 및 실 온에서 1-5 분 동안 품 어.
- Fibronectin 솔루션을 수집 하 고 4 ° c.에서 저장 한 피 펫을 사용 하 여,
참고: fibronectin 솔루션 여러 번 다시 사용할 수 있습니다. - 일단 1-2 mL 1 X PBS 가진 유리를 세척 하 고 PBS에서 발음.
- 플레이트 1 x 105 셀 해당 셀의 2 ml에서 6 잘 플레이트의 당 문화 미디어 (다른 크기의 웰 스에 대 한 사용 하 여 셀 번호 표 1 참조). 셀 라인을 안정적으로 표현 하는 caspase BiFC 구성 요소 (내용 참조)를 사용 하 여 2 x 105 셀 접시 하 고 치료 단계 (3 단계)를 진행 합니다.
- 조직 문화 인큐베이터에서 37 ° C에서 하룻밤 접시에 셀 수 있습니다.
2. 세포의 transfection caspase BiFC 구성 요소를 소개 하
- 적절 한 transfection 시 셀 transfect
참고:이 프로토콜은 최소한의 독성에 대 한 최적화 된 Lipofectamine 2000에 대 한 지침을 설명 합니다. 이 프로토콜은 Hela 세포 MCF7 세포, LN18 세포에 성공적으로 사용 되었습니다. 추가 사용 하는 경우 transfection 시 약 제조업체의 지침에 따라 하 고 필요에 따라 최적화.- 무 균 튜브에 감소 된 혈 청 미디어의 750 µ L를 transfection 시 약의 12 µ L를 추가 합니다.
- 5 분 동안 실 온에서 품 어.
- 10 추가 기자 플라스 미드 (형광 단백질, 예를 들어 빨간색 형광 단백질 [RFP], transfected 세포 레이블을 것입니다 인코딩 플라스)의 ng 페 수를 각 잘 살 균 1.5 mL 튜브에.
- 20 추가 각 caspase BiFC 플라스 미드의 ng (예를 들어, 20 caspase-2 prodomain [C2 프로]의 ng-VC 및 20 ng C2 프로-VN의) 각 관 (표 2).
- 감소 된 혈 청 미디어를 추가 하 여 100 µ L의 총 볼륨까지 각 튜브를가지고.
- P200 피 펫을 사용 하 여 추가 transfection 시 약 해결책의 100 µ L 단계 2.1.2에서에서 플라스 미드 혼합물에 dropwise 방식.
- 실 온에서 20 분에 대 한 플라스 미드 transfection 시 믹스를 품 어.
- 미디어는 피 펫을 사용 하 여 셀에서 또는 흡입으로 발음 하 고, 우물의 측면 아래로 부드럽게 혈 청 자유로운 미디어의 800 µ L 플라스틱 p1000 피 펫을 사용 하 여.
- P200 피 펫을 사용 하 여, 각 잘에 dropwise DNA-지질 복합체의 200 µ L를 추가 합니다.
- 셀 3 h에 대 한 37 ° C에서 조직 문화 인큐베이터에 품 어.
- 단층을 방해 하지 않도록 주의 복용는 피 펫 또는 포부 흡입을 사용 하 여 DNA 지질 복합물을 포함 하는 혈 청 무료 미디어를 제거.
- 각의 측면 아래로 부드럽게 미리 따뜻하게 (37 ° C) 완전 한 성장 매체의 2 mL 플라스틱
- 최적의 단백질 표정을 위한 24-48 h에 대 한 조직 문화 인큐베이터에서 37 ° C에서 세포를 품 어.
3입니다. caspase 활성화 유도
- 약물 또는 caspase 활성화 약 24 h 후 transfection 유도 자극으로 치료.
- 원하는 농도의 약물을 미리 예 열 (37 ° C) 이미징 미디어 (완전 한 성장 매체 보충 Hepes [20 m m, pH 7.2-7.5]와 2-mercaptoethanol [55 μ M])와 섞어 부드럽게 추가 (표 3).
- 미디어는 피 펫을 사용 하 여 셀에서 또는 흡입으로 발음 하 고, 우물의 측면 아래로 부드럽게 3.1.1에서 솔루션의 2 mL 플라스틱을 피 펫을 사용 하 여.
- 치료 컨트롤 한 잘에 약물 없이 영상 미디어를 추가 합니다.
- 37 ° C에서 조직 문화 인큐베이터에 셀을 품 어 또는 단계 4.3 시간 경과 실험에 대 한 진행.
4입니다. Caspase BiFC 데이터 수집
-
한 번 포인트 획득을 위한 Caspase BiFC
- 현미경 및 형광 광원 제조업체의 지침에 따라 설정.
- RFP 필터 및 리포터 유전자 형광에 초점에서 세포를 찾아.
- 손을-집계 카운터를 사용 하 여 시야에 RFP 긍정적인 세포의 모든 계산. 수를 기록 합니다.
- 같은 시야를 유지 하면서는 GFP (YFP 필터 또는 사용 가능한 경우)로 전환 하 고, 녹색은 또한 적혈구의 수를 세 손을 집계 카운터를 사용 하 여 (금성 양성). 레드 셀만 금성 양성에 대 한 평가 되도록 두 필터 간에 앞뒤로 전환 합니다. (그림 3) 번호를 기록 합니다.
- 각 접시의 세 가지 개별 영역에서 적어도 100 RFP 긍정적인 세포를 계산 합니다.
- 각 지역에서 금성-긍정적인 transfected 세포 (즉, 레드 셀 또한 녹색)의 비율을 계산 합니다. 평균 표준 편차를 결과 백분율.
-
Caspase BiFC의 3-차원 영상
- 제조업체의 지침에 따라 현미경 켜고 수집 소프트웨어 시작.
- 60 x 63 x 오일 목표를 선택 하 고 목적에 오일 한 방울을 배치
- 올바른 플레이트 홀더를 사용 하 여 현미경 스테이지에 문화 접시를 놓습니다.
- Using epifluorescence 광원 및 현미경 눈 조각 또는 confocal 레이저와 컴퓨터 화면, 관심 분야를 탐색 합니다.
- RFP 레이저 또는 필터를 사용 하 여 기자 형광에 초점.
- 이 시점까지 epifluorescence를 사용 하는 경우 confocal 레이저 광원 전환 하 고 카메라에 의해 획득 및 인수 소프트웨어 컴퓨터 화면에 표시 되는 셀의 라이브 이미지를 시각화.
- 조이스틱 제어 및 초점 휠 using, 미세 조정 초점 및 셀의 위치는 셀 뷰 파인더의 중앙에. 서로에서 분리 되어 하 고 중복 되지 셀을 선택 합니다.
- 실험에 사용할 최적의 설정을 결정 하는 출발점으로 비너스와 RFP에 대 한 입력 100 ms에 노출 시간을 50% 비율 레이저 파워.
- 결과 이미지와 함께 디스플레이 히스토그램 두 채널에 대 한 검사 및 라이브 캡처를 켭니다.
- 신호는 낮은 경우 이미지 만들 어렵다 증가 이미지에서 신호까지 증가 백분율 레이저 파워 및 노출 시간 좋아 보인다.
- 신호 포화를 도달 하지 않는 확인 하십시오. 뚜렷한 피크는 각 형 석에 대 한 표시 되도록 디스플레이 히스토그램을 검사 합니다. 피크 포함 전체 히스토그램 표시, 경우 낮은 레이저 전원 및 노출 설정 (그림 2)를 입력 합니다.
- 신호가 특정 되도록 동일한 조건 하에서 제어 (치료 비 페) 세포를 시각화 합니다.
참고: 단일 색상 transfectants 사용할 수 있습니다 또한 제어 크로스 오버, 그러나 신호는 고유 공간 (예: cytosolic 대 미토 콘 드리 아) 하는 경우이 필요 하지 않습니다. - 선택 하거나 현미경 소프트웨어에서 Z 스택 모듈을 엽니다.
- 초점 손잡이 사용 하 여 대략적인 해당 하는 셀의 중심 초점 위치.
- 셀이 더 이상 표시 될 때까지 한 방향으로 초점을 조정, 최고 위치이 옵션을 선택 합니다.
- 셀이 더 이상 다시 표시 될 때까지 반대 방향으로 초점을 조정 하 고 선택이 하단에 위치 합니다.
- 최적의 스텝 크기 (일반적으로 약 20 µ m)을 선택 하 고 자동으로 각 위쪽 및 아래쪽 위치 사이 20 µ m 단계에서 각 채널에 단일 이미지를 데리고 카메라에 수집을 시작 합니다.
- 3D 렌더링 소프트웨어를 사용 하 여 3D 이미지 (그림 4영화 1) 재구성.
-
Caspase BiFC의 시간 경과 영상
- 실험 전에 적어도 1 시간 현미경 켜고 설정 온도 37 ° c
- 40 x 60 x, 또는 63 x 오일 목표를 선택 하 고 목적에 오일 한 방울을 배치.
- 올바른 플레이트 홀더를 사용 하 여 현미경 스테이지에 문화 접시를 놓습니다.
- CO2 소스를 사용할 수 있는 접시 홀더 위에 CO2 배달 장치 (일반적으로 CO2를 제공 하는 튜브에 부착 된 플 렉 시 유리 뚜껑)를 배치 합니다. 5% CO2 수준을 설정 하 고 소프트웨어에서 CO2 컨트롤러를 켭니다. CO2 소스를 사용할 수 없는 경우 20 mM Hepes 미디어 버퍼를 포함 합니다.
- 이동 transfected 세포 분야 하 고 카메라에 의해 획득 및 인수 소프트웨어 RFP 레이저를 사용 하 여 컴퓨터 화면에 표시 되는 셀의 라이브 이미지를 시각화.
- 다음 단계 4.2.8-4.2.12, RFP 레이저에 대 한 백분율 레이저 전원 및 노출 시간에 대 한 설정을 입력 합니다. 가능한 한 낮은 형광 신호를 감지할 수 이러한 값을 유지.
- 긍정적인 통제를 사용 하 여 샘플 (예제 표 3 참조 하십시오), 따라 YFP 레이저 빛에 대 한 백분율 레이저 전원 및 노출 시간에 대 한 설정을 입력 하려면 단계 4.2.8-4.2.12. 가능한 한 낮은 아직도 금성 신호를 감지할 수 있는 동안 이러한 값을 유지.
- 접시의 각 음에 대 한 다양 한 기자를 표현 하는 하나 이상의 셀을 포함 하는 다른 위치를 선택 합니다.
- 촬영 프레임의 시간 경과 및 총 수의 각 프레임 사이의 시간 간격을 입력 합니다. 확인 시간 전에 다음 프레임은 받을 것 이다 모든 선택한 위치를 얻으려고 합니다.
- 각 위치를 다시 방문 하 고 수정 하 고 필요에 따라 초점을 업데이트.
- 온도 또는 외부 진동의 변화에서 발생할 수 있는 초점 드리프트를 수정 하려면 초점 드리프트 보정 시스템 (사용 가능한 경우)를 켭니다.
- 시간 시작 하 고 데이터를 저장.
- (그림 5영화 2) 사용할 수 있는 이미징 소프트웨어를 사용 하 여 데이터를 분석 합니다.
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Representative Results
DNA 손상에 의해 유도 된 caspase-2 BiFC의 예는 그림 3에 표시 됩니다. Camptothecin는 topoisomerase 나 억제제, DNA 손상 및 caspase-2 활성화를 유도 하는 데 사용 되었다. 빨간 형광 단백질 mCherry 셀 BiFC 프로브 표현 게재 하 고 셀의 총 수를 시각화 하기 기자로 서 사용 되었다. 금성 형광 녹색으로 표시 됩니다 및 큰 puncta는 caspase-2 대표 근접을 유도. 이 세포는 금성-긍정적인 세포의 백분율을 결정 하기 위해 계산 수 있습니다. Subcellular 지 방화에 대 한 결론도 같은 이미지를 만들 수 있습니다. 예, caspase-2 유도 근접 세포질 17에서 또한 핵소체에서 발견 되었다. 복잡 한 caspase 활성화의 subcellular 지 방화의 고해상도 시각화를 제공 하려면 단일 셀 3 차원에 몇 군데 있습니다. 그림 4 는 이러한 3D 이미지를 대표 하는 두 가지. 첫 번째 셀의 3 차원 재구성을 생성 하는. 예에는 녹색과 빨간색으로 핵의 camptothecin 유도 caspase-2 BiFC 보여 줍니다. 3D 재구성 셀에 걸쳐 두 fluorophores의 상대 지역화를 보여 줍니다. 이 유형의 결과 디스플레이 (동영상 1) 단일 축을 셀 회전, 동영상으로 선물 될 때 특히 효과적입니다. 두 번째 패널은 동일한 셀의 직교 보기입니다. 이 셀에는 특정 시점에서 셀의 xy, xz, yz 시각화를 제공합니다. 2 차원 형식으로 표시 하는 3D 데이터를 해석 하기가 이와에서 결과의 묘사는 종이 프레 젠 테이 션과 같은 저널의 기사에 더 적합 하실 수 있습니다. 그림 5 에서는 프로테아좀 억제제 bortezomib로 대우 세포종 세포 라인에 caspase-2 BiFC의 시간 경과 화상의 예를 보여 줍니다 ( 영화 2참조). 그래프 셀 셀 ( 20에서 적응)에 걸쳐 평균 당 평균 금성 강도 증가 보여 줍니다. 이러한 유형의 데이터의 단일 셀 추적 한 그래프에 숫자로 표시할 수 있습니다. 예, caspase 유도 근접의 발병 치료에 따라 약 2 시간입니다.
그림 1: caspase 구조 및 분자 형광 보완성 (BiFC) 방법론의 도식. (A)는 초기자 caspase의 일반적인 구조. Prodomain, 크고 작은 소 단위와 액티브 사이트 시스테인을 포함 하는 보존된 QACRG 모티브로 그려져 있습니다. (B) BiFC 분할 형광 단백질을 혼자 형광은 형광 분자 상호 작용 단백질에 융합 때 개혁 연결할 수 있습니다 사용 합니다. Caspase BiFC, prodomain (프로)에 대 한 전체 길이 caspase는 N 맨끝 반 퓨즈가 사용 또는 (금성-N) 및 C-터미널 절반 금성 (금성 C). 단위체 상태로 caspase 융해 단백질은 형광. PIDDosome, 같은 활성화 플랫폼 채용 시 같이, 비너스의 두 반쪽의 협회 적용 됩니다 나타내는 금성 형광에는 증가 측정 된 caspase 유도 근접. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 대표 이미지 인식 디스플레이 히스토그램을 사용 하 여 채도를. 최적의 (상단 패널)과 포화 신호 (하단 패널)의 예 표시 됩니다. 금성 (노란색 피크)와 RFP (빨간색 피크) 신호 표시 됩니다. X 축 강도 나타내고 y 숫자는 픽셀의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: Caspase 2 분자 형광 보완성 (BiFC) DNA 손상 다음. Caspase-2 BiFC 구성 요소를 표현 하는 Hela 세포 치료 (A) 왼쪽 또는 camptothecin (100 µ M)으로 치료 qVD OPH (20 µ M)의 (B) . mCherry 공동 형광 기자로 표현 했다입니다. 대표 이미지는 caspase-2 BiFC camptothecin 치료 세포 치료 따르는 16 h (녹색)와 셀 (빨간색)을 표시 합니다. 스케일 바 대표 20 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: caspase 2 분자 형광 보완성 (BiFC)의 지역화. 헬러 세포 caspase-2 BiFC 구성 요소와 형광 핵 기자 qVD OPH (20 µ M)의 camptothecin (20 µ M)으로 치료 했다. 0.1 μ m 직렬 confocal 이미지부터 z에서 3 차원 복원 구성-셀 24 h 후 만들어진 평면과 녹색에서 빨간색과 caspase-2 BiFC에 핵을 표시. 왼쪽된 패널 표시 3 차원 최대 강도 투영 렌더링 재건 (영화 1 참조). 오른쪽 패널 같은 셀의 직교 분할 영역 보기를 보여 줍니다. 중간 상자 (블루)은 xy 평면, 오른쪽 상자 (노란색) yz 평면 이며 최고 상자 (흰색)은 xz 평면. Xz 그리고 yz 평면 교차는 십자선에 따라. 스케일 바 대표 10 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: caspase 분자 형광 보완성 (BiFC)의 시간 경과 (A) LN18 세포종 세포 페 caspase-2 BiFC 구성 요소와 빨간색 형광 미토 콘 드 리아 마커 (DsRed-미토, 빨간색) bortezomib로 치료 했다 (15 nM) qVD OPH (20 µ M)의 존재. 37 ° C에서 confocal 현미경에 셀 배치와 이미지를 찍은 시간 경과 쇼 두 caspase-2 BiFC 컴포넌트의 유도 근접 금성 형광 ( 증가 귀착되는에서 대표 셀의 8 헤 이미지에 대 한 모든 2 분 녹색) 시간이 지남에. (B) 각 시간 지점에서 각 셀에 금성의 평균 강도 측정 했다. 금성 형광 bortezomib 치료 후 시간이 지남에 따라 증가합니다. 부문 치료에 레이저 빛 (그림 20에서 적응)에서 낮은 또는 무시할 독성 상태 표시. 스케일 바 대표 20 µ m. 오차 막대 8 (제어)의 평균 (SEM)의 표준 오차 및 14 (bortezomib) 개별 셀을 나타냅니다 (영화 2 참조). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 접시의 크기 | 셀의 개수 | 미디어의 볼륨 |
| 6 잘 플레이트 | 1 x 105 세포/잘 | 2 mL |
| 12 잘 플레이트 | 5 x 104 의 세포/잘 | 1 mL |
| 24 잘 플레이트 | 2.5 x 104 셀 / 잘 | 0.5 mL |
| 4 챔버 요리 | 2.5 x 104 셀 / 챔버 | 1 mL |
| 8 챔버 요리 | 104 셀 x 1.25 / 챔버 | 0.5 mL |
표 1: 플레이트에 셀의 숫자에 대 한 지침. 안정적 caspase 분자 형광 보완성 (BiFC) 구성 요소를 표현 하는 세포를 사용 하는 경우 접시는 여기에 표시 된 금액을 두 번.
| 접시의 크기 | Transfection 시 약 | 감소 된 혈 청 미디어 | 기자 플라스 미드 | Caspase 프로 VC 플라스 미드 | Caspase 프로 VN 플라스 미드 | 감소 된 혈 청 미디어 플라스 미드 믹스에 추가 | Transfection 시 약 해결책 플라스 미드 믹스에 추가 | 혈 청 무료 미디어 셀에 추가 |
| 6 잘 플레이트 | 12 µ L/플레이트 | 750 Μ L | 10 기 | 20 기 | 20 기 | 총 100 µ L를 | 100 Μ L | 800 Μ L |
| 12 잘 플레이트 | 12 µ L/플레이트 | 750 Μ L | 5 기 | 10 기 | 10 기 | 총 50 µ L를 | 50 Μ L | 400 Μ L |
| 24 잘 플레이트 | 12 µ L/플레이트 | 750 Μ L | 2.5 ng | 5 기 | 5 기 | 총 25 µ L를 | 25 Μ L | 200 Μ L |
| 4 챔버 요리 | 4 µ L/플레이트 | 250 Μ L | 2.5 ng | 5 기 | 5 기 | 총 25 µ L를 | 25 Μ L | 200 Μ L |
| 8 챔버 요리 | 4 µ L/플레이트 | 250 Μ L | 1.25 ng | 2.5 ng | 2.5 ng | 총 12.5 µ L를 | 12.5 Μ L | 100 Μ L |
표 2: 시 약 과도 transfection 사용의 권장. 참고: 제안 하는 플라스 미드의 금액만 출발점입니다. 신호가 감지 되 면, 6 잘 플레이트의 당 20-200 ng에서 플라스 미드를 적정 하는 것이 좋습니다.
| Caspase | 치료 | 농도 | 시간 | 예상된 결과 |
| Caspase-1 | -표현된 ASC | 6 잘 플레이트의 250 ng/잘 | 48 h | 50 %BiFC 긍정적인 |
| Caspase-2 | -표현된 RAIDD | 6 잘 플레이트의 500 ng/잘 | 24 h | 90 %BiFC 긍정적인 |
| Camptothecin | 100 Μ M | 16 h | 30-60 %BiFC 긍정적인 | |
| 열 충격 | 45 ° C에서 1 시간 | 16 h | 80 %BiFC 긍정적인 | |
| Caspase-4 | Overexpressed NALP1 | 6 잘 플레이트의 250 ng/잘 | 48 h | 30 %BiFC 긍정적인 |
| Caspase-5 | Overexpressed IPAF | 6 잘 플레이트의 250 ng/잘 | 48 h | 15 %BiFC 긍정적인 |
표 3: caspase 분자 형광 보완성 (BiFC)에 대 한 긍정적인 컨트롤의 예. 조건 및 예상된 결과 기반으로 14,,1718생성 프로 사용 하 여 게시 된 데이터에. 공동 표현된 플라스 미드 BiFC 플라스 미드 (단계 2.1.4) 함께 페 한다
영화 1: caspase 2 분자 형광 보완성 (BiFC)의 3D 지역화. 3D 재구성, y주위 회전-축 z통해 공초점 이미지의-비행기는 헬러의 세포 표현 caspase-2-BiFC 구성 요소와 형광 핵 기자 16 h에 대 한 camptothecin (20 µ M)로 치료 했다. 영화는 caspase-2 BiFC (녹색), 그리고 핵 (빨간색)를 보여줍니다. 이 비디오를 보려면 여기 클릭 하십시오 (다운로드 오른쪽 클릭.)
영화 2: caspase 2 분자 형광 보완성 (BiFC)의 시간 경과. LN18 세포종 caspase-2 BiFC 구성 요소와 페 전지와 bortezomib로 치료 (15 nm) 8 h에 대 한 모든 2 분을 촬영 했다. 영화는 caspase-2 BiFC (녹색), 그리고 미토 콘 드리 아 (빨간색)를 보여줍니다. 이 비디오를 보려면 여기 클릭 하십시오 (다운로드 오른쪽 클릭.)
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Discussion
이 프로토콜 caspase 유도 근접 측정을 분할 형광 단백질의 사용을 설명 합니다. 때문에 매우 밝은, 높은 photostable는 refolding 이며 빠른 13분할 금성이이 기술을 위해 선택 되었다. 따라서, caspase 유도 근접 시 refolding 비너스의 분석은 caspase 단백질 상호 작용 역동성의 실시간 의견 가까이 제공할 수 있습니다. 금성 금성 (비너스-N 또는 VN) 구성 아미노산 1-173의 N terminus 두 약간 겹치는 조각으로 분할 하 고 C 터미널 조각 (금성 C 또는 VC) 이루어진 잔류물 155-239. 다른 분할 형광 단백질 존재 하지만 분할 mCherry 같은 일부 refolding 21에 대 한 최대 2 h 4 ° C에 외피를 필요 합니다. 추가 분할 형광 단백질 리안 (청록색 형광 단백질의 버전) 분할 등 고 멀리 빨간 분할 mLumin 아직이 컨텍스트 13,22에서 테스트. 궁극적으로, 만약 이러한 형광 단백질 증명 caspase 유도 근접 측정에 적합,이 여러 caspases의 동시 평가 대 한 허용 됩니다.
일반적으로 caspase의 prodomain (프로) 지역 분할 형광 조각에 융합 이다. 이 지역 활성화 플랫폼에 바인딩하는 데 필요한 caspase의 최소한의 부분을 포함 하 고 카드 또는 공격 한 상호 작용 주제를 포함. 사용 하는 prodomain의 장점은 셀에 어떤 효소 활동을 소개 하지입니다. 내 생 caspase 인해 다운스트림 이벤트의 동시 모니터링 가능 합니다. 최신 연구 활동 및 caspase BiFC는 prodomain와 전체 길이 caspase 14사이 지역화에 약간의 차이 보이고 있다. 그러나, 전체 길이 구문 플라스 미드 DNA의 증가 금액의 transfection 필요로 낮은 효율으로 표현 하는 경향이 있다. 또한, 식 시 caspase 유도 된 apoptosis를 방지 하기 위해 떠들고 하 촉매 시스테인을 변형 하는 것이 좋습니다. 이러한 단점에도 불구 하 고 특정 조사는 촉매 도메인의 유무에 유도 하는 caspase에 맞는 차이 결정 전체 길이 BiFC 쌍의 동시 분석을 요구할 수 있습니다.
이 프로토콜은 특히 HeLa 세포에 대 한 적응. 동일한 프로토콜 추가 부착 셀 라인 유 방 암 세포 선, MCF-7, 세포종 세포 선, LN18, 및 마우스 미 발달 섬유 아 세포 (MEF) 잘 작동 합니다. 새로운 셀 형식에이 프로토콜을 적응 때 사용자 도금과 transfection 조건을 최적화 하는 것이 좋습니다. 프로토콜 설명 셀을 평가 하는 데 사용할 수 두 가지 주요 현미경 검사 법 방법: epifluorescence 그리고 confocal 현미경 검사 법. Confocal 현미경 검사 법, 사용 하는 경우에 함께 confocal 현미경 검사 법에에서 사용 되는 높은 수 가늠 구멍 목표의 대다수는 플라스틱 접시 또는 유리 슬라이드의 두께 침투 하지 것입니다 때문에 세포를 유리 coverslips에 도금 해야 합니다. 따라서, 최적의 coverslip 두께가 0.17 m m의 임베디드 no. 1.5 유리 coverslips와 요리를 사용 하는 것이 좋습니다. 이 접시의 다른 종류의 수 있습니다 표준 크기 다 잘 판 챔버 슬라이드에서 개별 3 cm, 범위. 표 1 및 2 다른 잘 크기에 대 한 도금 및 transfection 지침을 적용 하는 방법을 설명 합니다. epifluorescence에 대 한 여기 설명 즉 이미징 (4.1), 표준 플라스틱 조직 문화 접시는 충분 한으로 현미경은 긴 패스 목표를 갖추고.
이 접근은 caspase 활성화를 측정 하는 "표시등" 방법을 효과적으로, 때문에 형광 기자 포함 하기 전에 또는 caspase 리포터의 활성화의 부재에서 셀의 시각화를 허용 하 고 식별 하 필수적 이다 transfected 세포, 과도 transfection 사용 하는 경우. 다른 기자 들의 숫자를 사용할 수 있으며 유일한 하나를 선택할 때 기준은: 1)는 fluorophore는 충분히 밝은 이미징 프로토콜;에 의해 쉽게 검출 될 수 있다 그리고 2) 형광 스펙트럼이 YFP의 중첩 되지 않습니다. 예를 들어 녹색 형광 단백질 (GFP) 해야 사용할 수 없습니다 기자로 서 그것은 YFP 필터 또는 금성을 감지 하는 데 사용 하는 레이저에 의해 검출 될 것입니다 때문에. 이것은 두 개의 fluorophores의 스펙트럼 오버랩입니다. 특정 세포 기관이 localizes fluorophore 선택 추가 질적 정보를 제공할 수 있습니다. 예를 들어 사용 하 여 단백질의 대상 미토 콘 드리 아, 빨간 형광 단백질 DsRed-미토, 같은 셀의 전반적인 생존 능력에 추가 정보를 제공할 수 있습니다. 미토 콘 드리 아 세포 죽음 23 의 초기 단계 동안 분열 (분열)를 받아야 하는 경향이 고이 DsRed-미토 같은 기자와 구상 될 수 있다. 기자로 서 세포 기관이 마커를 사용 하 여 또한 caspase 만들어질 BiFC의 subcellular 지 방화에 대 한 결론을 허용할 수 있습니다.
다양 한 방법으로 caspase BiFC 데이터 취득 되 고 분석 될 수 있다. 결정 하는 어떤 방법을 사용 해야 탐험 하는 매개 변수에 의해 결정 됩니다 (단일 셀 위치 또는 운동 정보 대 끝점 인구 분석) 및 계측 및 이미징 소프트웨어의 가용성. 이 프로토콜은 caspase BiFC 시간 포인트 및 시간 데이터에 대 한 실험의 결과 수집 하는 몇 가지 현미경-기반 접근을 설명 합니다. 그러나, 주목 해야 하는 다양 한 변화와 창조 caspase 활성화 경로 심문 하는 데 사용할이 방법의 조합.
데이터 수집 (4.1)은 caspase에 포함 된 셀의 비율을 결정 하는 데 사용 됩니다 한 번 포인트 유도 근접 한 시간에. 이 프로토콜에 대 한 하나는 단순히 금성 양성 transfected 세포의 수를 셉니다. 따라서, 고도로 전문화 된 장비는 필요 하지 않습니다 그리고 GFP (또는 YFP) 가장 기본적인 epifluorescence 현미경 RFP 필터와 손 집계 카운터 필요 하다. 일부 이미징 시스템을 자동으로 접시의 당 수 이미지의 자동화할 수 있습니다. 이러한 계측을 사용할 수 있는 경우 인수 이미지 셀 마찬가지로 시력 검사에 의해 계산 될 수 있는 또는 quantitated 이미징 소프트웨어를 사용 하 여. 3-차원 영상 (4.2) 셀의 초점 비행기 내내 BiFC caspase의 고해상도 이미지를 제공합니다. 비너스와 RFP (또는 선택한 transfection 기자) 흥분 하는 레이저 confocal 현미경 및 Z-스택 기능 필요. 3D 렌더링 소프트웨어 모듈의 숫자를 사용할 수 있는 데이터를 시각화 하는 다른 방법을 제공 하는. 모두 이러한 종류의 분석, 대 한 세포 및 이미지를 수정 하거나 나중에 그들을 평가 가능 하다. 그러나, 정착의 과정 분석에 아티팩트를 추가할 수 있는 비너스 신호 감소지 않습니다 및 따라서이 방법을 권장 하지 않습니다. 시간 경과 영상 (4.3)은 caspase BiFC의 동시 운동 및 위치 분석을 제공 하기 위해 사용할 수 있습니다. 전동된 스테이지를 갖춘 현미경 이미지 여러 위치의 고도 동일한 실험에서 다른 치료 그룹을 비교 설정할 수 있습니다.
에 대 한 시간 경과, 다양 한 추가 고려 사항에 고려 되어야 한다. 레이저 빛 phototoxicity 또는 photobleaching 유물 수 있고 둘 다에 대 한 통제 될 필요가. 일반적으로, 둘 다 빛 (단계 4.3.6-4.3.7에서 입력된 낮은 비율 레이저 파워 및 짧은 노출 시간)의 가장 낮은 가능한 금액을 사용 하 여 피할 수 있습니다. Phototoxicity 결과 레이저 광 세포에서 죽음을 유도 하 고 동일한 조건 하에서 치료 세포 이미징 및 세포 분열을 정상적으로 진행을 확인 하 여 대 한 제어할 수 있습니다. Photobleaching 발생 할 때 같은 셀의 촬영 한 여러 개의 이미지는 형광 감소. 금성 형광 단백질은 그래서 이것이 실제로 문제가 거의 아주 photostable, 이다.입니다. Photobleaching의 효과 금성-긍정적인 세포의 수많은 순차적 이미지 고 형광 안정 유지 확인 하 여 확인할 수 있습니다. 모든 실험에 사용 되는 동일한 레이저 파워 및 노출 설정으로이 한 번 해야 할 필요 합니다. Phototoxicity 또는 photobleaching 효과 또한 캡처한 이미지의 총 수를 줄이면 완화 수 있습니다. 이 길이 또는 캡처 (단계 4.3.9) 사이의 시간 간격을 단축 하 여 얻을 수 있습니다. 16 h 경과 이상 5 ~ 10 분 간격을 사용 하 여 시작 하는 좋은 장소입니다. 경우 없는 photoxicity는 관찰 또는 실험 시간 단축의 필요, 프레임 사이의 간격을 줄일 수 있습니다. Caspase 활성화 급속 한 경우에, 짧은 시간 간격으로 짧은 실험을 사용할 수 있습니다. 예를 들어 10 분 간격으로 16 h 실험에 대 한 총 192 이미지 연결 됩니다 (각 fluorophore 96). 1.5 m 간격으로 2 시간 실험 160 이미지를 얻을 것입니다. 따라서, 길고 짧은 실험 것 각 노출 셀 레이저 빛의 비슷한 총 금액을. 짧은 기간 동안 실험에 대 한 자극을 활성화 하는 caspase (단계 3에서 단계 대신 4.3.11) 후 시간 경과 캡처의 개시 직전 미디어에 직접 추가할 수 있습니다. 이 위해 접시에서 뚜껑을 제거 하 고 부드럽게 자극을 피 펫을 사용 하 여 포함 하는 솔루션에 드롭. 알아서 하지 접시 고자 하 고 신속 하 게 세포는 여전히 초점을 계속 하기 전에 확인.
시간 경과 실험을 수행 하는 경우 그것은 또한 조직 문화 인큐베이터의 유사 세포의 즉시 환경 다는 것을 확인 하는 중요 한. 다양 한 환경 제어 다른 현미경 세트에서 사용할 수 있는 ups. 작은 무대 최고 incubators로 환경 챔버 전체 현미경을 캡슐화 하는 포함 됩니다. 이러한 장치 모두 일반적으로 제공 열, CO2, 그리고 습도 정확 하 게 제어할 수 있는 방식으로 챔버를 합니다. 예기치 않은 온도 변동 초점 드리프트와 CO2 의 부재를 이어질 수 있는 세포에 독성이 될 수 있는 상승 미디어의 산도 때문에 CO2 와 온도의 정확한 제어 실험의 성공에 필수적 이다. CO2 소스를 사용할 수 없는 경우 미디어 Hepes (단계 3.1.1 참조)의 추가 의해 버퍼링 될 수 있습니다. CO2 소스를 사용할 수 있는 경우에 세포 건강을 유지 하는 여분의 조치로 Hepes 영상 매체에서 포함 하는 것이 좋습니다. 그러나, Hepes, 존재도 시간의 연장된 기간에 대 한 CO2 의 부재 세포 죽음을 발생할 수 있습니다. 따라서, 그것은 동일한 조건과 pH 안정 유지가 되도록 실험의 결론에 미디어의 색상에서 몇 군데 치료 세포를 검사 하는 것이 중요. Note는 페 놀 레드 금성 신호에 autofluorescence의 기여 최소 이므로이 프로토콜에 사용 되는 매체에서 생략 될 필요는 없습니다.
시간 경과 실험에서 결과 영상 데이터를 분석에 사용할 수 있는 방법 수가 있습니다. Transfected 세포 당 금성 픽셀의 평균 농도 측정 caspase 유도 근접의 타이밍을 분석 하는 가장 간단한 방법입니다. 그림 3, , 그림 4 그림 5에서처럼 caspase-2 BiFC는 종종 다른 subcellular 구획에 있는 하나 이상의 puncta로 나타납니다. 이미징 분석 접근 foci, 개체 크기, 또는 추가 유사한 요인의 측정 번호 이러한 구조에 대 한 유익한 양적 데이터를 얻을 수 있습니다. 모든 caspase BiFC puncta로 나타납니다. 예를 들어 염증 caspases 확산 형광, filamentous 구조 및 셀 18당 하나 또는 여러 개의 puncta를 포함 하 여 다른 BiFC 패턴화를 나타났습니다. 이러한 패턴 업스트림 활성화 신호 뿐만 아니라 활성화 된 caspase에 의존 했다. 따라서, 분석 시간 경과 결과 대 한 가장 적합 한 유형의 주로 관찰은 형광 패턴의 종류에 의해 규정 됩니다.
이 프로토콜을 사용 하 여 분석 caspase를 통해 직접 또는 간접적으로 다른 세포 죽음 통로 참여 하 여 apoptosis 유도 할 때 평가 치료 자극의 많은. 그러면 셀 축소 하 여 셀을 이미지를 매우 어렵고 caspase BiFC의 어떤 특정 지역화가 결정 하는 것은 거의 불가능 하 게 하는 접시에서 분리 됩니다. 팬 caspase 억제제의 포함은이 세포 죽음을 방지 합니다. 그들의 활성화 플랫폼 및 관련 된 caspase caspases의 모집 BiFC는 caspase의 촉매 활동에 종속 되지 않습니다. 따라서, caspase 억제가이 단계에는 영향을 주지 않습니다 하지만 플라즈마 멤브레인 무결성에서 blebbing, 분리, 및 궁극적인 손실 포함 하는 apoptosis의 다운스트림 물리적 특성을 억제 합니다. 따라서, 만약 끝점 분석 (4.1 단계) 또는 Z 스택 (4.2 단계) 수행, caspase 억제제를 포함 필수적입니다. 시간 경과 실험 반대로 MOMP, annexin V 바인딩을 (phosphatidyl 떠들고 노출 감지) 또는 propidium 요오드 화물 통풍 관 (플라즈마 멤브레인 permeabilization 검색) 등 apoptosis 관련 이벤트 caspase BiFC, 함께 분석 되어야 하는 경우에 caspase 억제제는 이러한 이벤트의 저해를 방지 하기 위해 생략 한다. QVD OPh (10-20 µ M) 등 caspase 억제제 apoptosis 유도 자극 (3.1.1 단계)를 포함 하는 미디어에서에 추가 되어야 합니다. 공동 caspase BiFC 구성 요소와 함께 프로 apoptotic 단백질 표현, caspase 억제제 단계 2.1.12에 추가 한다.
Caspase BiFC 라이브 셀에서 caspase 활성화 경로에 이벤트를 시각화 하는 데 사용할 수 있습니다 몇 가지 가능한 방법 중 하나는, 이러한 실험을 설계할 때 계정에 다양 한 고려 사항을가지고 한다. 이 방법은 overexpression 기반 이므로, 특이성에 대 한 컨트롤이 중요 하다. 이 두 가지 방법 중 하나로 수행할 수 있습니다. 첫째, 카드 또는 prodomain 그들은 caspase의 활성화 플랫폼 사이의 바인딩을 방해는 caspase의 공격 한 단일 지점 돌연변이의 소개 caspase BiFC의 강도 및 금성 확실성의 비율 감소 한다 셀입니다. 예를 들어 caspase-1의 prodomain에서 전자 D59 잔류물의 돌연변이 어댑터 단백질 ASC (apoptosis 관련 스펙 같은 단백질 카드 포함)에 대 한 바인딩을 방해합니다와 동등 하 게 ASC 유도 caspase-1 BiFC 18,24 방해 . 둘째, 모집 활성화 플랫폼 caspase 어댑터 단백질 결핍은 세포의 사용은 특정 BiFC 신호를 줄일 것 이다. 이 달성 가능한 경우, 녹아웃 셀을 사용 하 여 또는 siRNA를 사용 하 여 또는 어댑터의 세포를 고갈 접근 CRISPR/Cas9-기반. 따라서, caspase-2 접합 기 단백질 RAIDD의 고갈 완전히 열 충격 또는 DNA 손상 14,17에 의해 유도 된 caspase-2 BiFC 차단. 이 실험에 대 한 녹아웃 또는 최저의 셀 일치 제어 셀 (즉, 일치 하는 쓰레기 야생 타입 MEF 또는 제어 최저의)와 비교 해야 하 고, 새로운 셀 라인을 사용 하는 경우 최적의 transfection 조건 평등 보장 하기 위해 평가 되어야 합니다. 식 셀 라인에 걸쳐 BiFC 기자입니다.
이 방법의 두 번째 제한, 과도 transfection를 사용할 때 그것은 각 셀 각 단백질의 동등한 양으로 표현 하 고는 되도록 어려운입니다. 식은 동일 하지 않으면 한 비너스 조각 더 높은 주파수에서 플랫폼에 모집 수 있습니다. 이 전체 형광 신호를 마스크 하 고 틀린 부정적인 결과로 이어질 수 있습니다. 이 문제를 해결 하려면 caspase BiFC 기자 안정적인 셀 라인 세대의 새로운 버전은 최근에 보고 된 17이었다. 바이러스 2A 자체 cleaving 펩 티 드 25구분 단일 열려있는 독서 프레임에 C2 프로 BiFC 구성 요소를 표현 하는 구문이 새로운 버전에 의하여 이루어져 있다. 따라서, BiFC 구성 요소 같은 발기인에서 단일 mRNA로 변하게 하지만 VC 및 VN 융해 단백질의 stoichiometrically 동일한 금액을 생산으로. 안정적으로이 구조를 표현 하기 위해 생성 된 셀 라인 뚜렷이 표현 기자 활성화의 유사한 동향을 설명 하지만 모두 더 과민 하 고 표시 된 배경 형광 낮은. 따라서, 위의 프로토콜 기자 셀 라인을 안정적으로 표현 하는 caspase BiFC 구성 요소와 함께 사용 하는 경우 크게 단순화 될 수 있다.
데이터 날짜를 제안 caspase BiFC 구성 요소와 생 단백질 간의 최소한의 간섭. 예를 들어 caspase-2 알려져 있다 MOMP의 상류 활성화 하지만 caspase-2 BiFC MOMP 14의 진행을 차단 하지 않았다. 따라서, 이러한 기자 행동 지배적인 부정적인 패션에 표시 되지 않습니다. 그러나, 다운스트림 이벤트를 동시에 평가 하는 경우이 해야 조사 실험의 각 집합 내에서. 실험에서 잘 비 페 컨트롤을 포함 하 여이 접근 하는 가장 좋은 방법은 이다. 세포 죽음의 활동 또는 caspase 센서의 표현 없이 변경 되지 않습니다, 만약 이것 caspase BiFC 구성 요소 생 기능 방해 되지는 표시 됩니다. 반대로, 내 생 caspase 수 가능성이 영향을 BiFC 판독 효율 또는 크기 또는 모양 구조. 표현 하는 세포는 caspase에 대 한 결핍에서 기자는이 대 한 제어 합니다.
이러한 제한에도 불구 하 고 caspase BiFC 기술 caspase 활성화 경로 보완 하 고 초기자 caspase 활성화를 측정 하는 기존의 접근 방식에도 향상 시킬 수 있는가 유용한 방법입니다. 측정 유도 근접, 활성화에 있는 첫걸음으로이 기술을 측정 하는 caspase 자동 처리 활성화와 관련 된 나중 단계와 관련 된 문제를 극복 한다. 예를 들어 서쪽 오 점 모니터를 사용 하는 사형 집행 caspases의 분열, 동안 caspase 3 및 caspase-7 제공 합니다 정품 인증 2, 초기자 caspases 결함이 있을 수 있습니다에 대 한 동일한 접근 방식을 사용 하 여 정확한 측정을. 이 때문에 개시자 caspases의 분열 활성화 4,,2627에 대 한 충분 하지 않습니다. 사실, 많은 초기자 caspases는 죽 습 apoptosis 동안 caspase 3 효소 활성 28를 생산 하지 않고. 마찬가지로, 특정 caspases의 대상으로 설계 된 펩 티 드 기질을 사용 하 여 기반 기술 caspases 29에 대 한 이러한 시퀀스의 겹치는 특이성을 고려 해야 합니다. 이 같은 접근 caspase 활성화를 측정 하기 위해 사용할 수 없습니다 하지만 결과 해석할 때 인정 해야 하는 단점을 의미 하지 않는다. Caspase BiFC 더 전통적인 방법을 사용 하 여 결과 확인 하는 것을 도울 수 있는 다른 접근을 제공 합니다. 또한, 실시간으로 caspase 활성화 단지의 어셈블리를 추적 하 고 분명히 결정 크기, 모양 및 복합물의 지역화 기능 다른 방법으로 평가할 수는 없습니다이 기술의 중요 한 이점입니다.
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Disclosures
저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.
Acknowledgments
우리는 모든 이전 멤버 Bouchier 헤이즈 연구소의이 기술 개발에 기여를 인정 하 고 싶습니다. 이 작품 LBH 텍사스 아동 병원 소아 파일럿 수상에 의해 부분적으로 투자 되었다. 우리는 그녀의 팀과 함께 공동에서 출판 된 데이터를 포함 하는 허가 Joya 찬드라 (MD 앤더슨, 휴스턴, 텍사스) 감사 합니다. NIH (NIAID P30AI036211, NCI P30CA125123, 및 NCRR S10RR024574)와 조 엘 M. Sederstrom의 원조 자금 Cytometry 베일 러 의과대학에서 셀 정렬 코어에 의해 설명 하는 시 약의 개발 지원
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-well Uncoated No. 1.5 20 mm glass bottom dishes | Mattek | P06G-1.5-20-F | |
| Human Plasma Fibronectin Purified Protein | Millipore | FC010-10MG | |
| DPBS | Sigma | D8537-6x500ML | |
| Lipofectamine 2000 reagent | Invitrogen | 11668019 | |
| OPTI MEM I | Invitrogen | 31985088 | |
| C2-Pro VC plasmid | Addgene | 49261 | |
| C2-Pro VN plasmid | Addgene | 49262 | |
| Inflammatory caspase BiFC plasmids | available by request from LBH | ||
| HeLa cells stably expressing the C2-Pro BiFC components | available by request from LBH | ||
| DsRed mito plasmid | Clontech | 632421 | similar plasmids that can be used as fluorescent reporters can be found on Addgene |
| HEPES | Invitrogen | 15630106 | |
| 2 Mercaptoethanol 1000X | Invitrogen | 21985023 | |
| q-VD-OPH | Apex Bio | A1901 |
References
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