Summary
이 문서에는 RNA 간섭 (RNAi) 곤충 먹이 체 관 부 수액에 대 한 식물의 혈관 조직을 통해 이중 가닥 RNA (dsRNA)의 구두 납품을 위해 개발 된 새로운 기술을 보여 줍니다.
Abstract
체 관 부 및 식물 sap 먹이 곤충 침략 작물과 식량 작물을 손상 하는 과정에서 영양소를 검색 하는 과일의 무결성. Hemipteran 곤충 체 관 부 수액에 먹이로 작물을 손상 하는 식물의 경제적으로 상당한 해충의 숫자에 대 한 계정. 갈색 marmorated 악취 버그 (BMSB), Halyomorpha halys (Heteroptera: Pentatomidae)와 아시아 감귤 류 psyllid (ACP), Diaphorina citri 쿠 (Hemiptera: Liviidae)는 북미 지역에서 도입 hemipteran 해충 어디 그들은 그들은 실내 집계 때 고부가가치 전문, 행, 및 주식 작물 및 감귤 류 과일의 침략 농업 유해물으로 귀찮은 해충 있습니다. 많은 종에서 살충제 저항 해충 관리 전략의 대체 방법의 개발을 주도하 고 있다. 이중 가닥 RNA (dsRNA)-중재 RNA 간섭 (RNAi)는 해충의 관리를 위한 공구로 잠재적인 응용 프로그램을 기능 게놈 연구에 대 한 메커니즘을 입을 유전자. 것 합성된 dsRNA 또는 작은 간섭 RNA (siRNA)은 동종 제시 하는 내 생 RNA의 저하를 통해 매우 효율적인 유전자 침묵 하는 것을 실행할 수 있습니다. 효과적이 고 환경으로 사용 RNAi 분자 biopesticides biocontrol hemipteran 곤충의 대 한 먹이 통해 dsRNAs 비보에 전달을 해야합니다. 여기 곤충 dsRNA의 납품을 위한 방법 제시: 침수로 녹색 콩으로 dsRNA의 로드 하 고 섭취를 통해 구두 전달 유전자 특정 dsRNA의 흡수. 우리는 또한 비-유전자 변형 식물 배달 방법을 사용 하 여 잎 스프레이, 루트 물 약, 트렁크 주사 뿐만 아니라 찰 흙과 립, 모두의 dsRNA의 지속적인된 출시에 필수적인 수 있습니다 설명 했습니다. 구두로 섭취 dsRNA에 의해 효율적인 배달 타겟된 유전자, 청소년 호르몬 산 O-methyltransferase 등 (JHAMT)와 vitellogenin (Vg)의 표현에 상당한 감소를 유도 하는 효과적인 복용량으로 확인 됐다. 이러한 혁신적인 방법 해충 관리에 대 한 환경 문제를 극복 하 고 작물 보호에 사용 하는 dsRNA의 납품에 대 한 전략을 나타냅니다.
Introduction
Hemipteran 곤충 높은 인구 증가 달성 하 여 식물에 질병을 확산 그들의 능력의 agriculturebecause의 경제적으로 가장 중요 한 해충의 일부를 구성. BMSB, H. halys 찾을, 19961에 보고 된 첫 번째 보이 질와 아시아 (중국, 대만, 한국, 그리고 일본)에서 알 렌 타운, 펜실베이니아에 서반구에 실수로 도입 된 침입 해충 이다. 그것의 소개부터 BMSB Mid-atlantic (DE, MD, 펜 실바 니 아, 뉴저지, 버지니아, 그리고 웨스트 버지니아), 뿐만 아니라 캐나다, 유럽, 가장 높은 인구가 43 개 주에서 감지 되었습니다 하 고 농업2에 잠재적인 위협을 나타냅니다. Polyphagous 해충으로 BMSB 사과, 포도, 관 상용 식물, 씨앗, 콩, 작물과 옥수수 등 고부가가치 작물을 포함 하 여 약 300 확인 된 식물 호스트 손상을 선동 수 있습니다. 피해는 어디 동물 피어 호스트 작물 영양분을 혈관 조직2,3에서 액세스 하는 바늘 같은 stylet와 lacerate 및 플러시 라고 먹이의 모드 때문에 주로 발생 합니다. BMSB 학교 등 생활 지역에 거주지를 찾을 수 있습니다 그들은 실내 해충 이기도 하 고가을 겨울2집. 화학 물질 및 aeroallergens BMSB 발표 과일 자르기 근로자에서 불법 알레르기 반응으로 보고 되었다. BMSB 또한 접촉 피부염, 결막염, 그리고 민감한 개인4,5비 염 알레르기 질환에 기여할 수 있습니다. 또 다른 hemipteran 곤충, ACP, D. citri 쿠 (Hemiptera: Liviidae), 감귤 류 과일의 심각한 해충 이며 Huanglongbing (HLB), 더 잘 알려진 원인 체 관 부-제한 된 박테리아 (Candidatus Liberibacter asiaticus)를 전송 감귤 류 녹화 질병6,7로. HLB 중국 남부에서 처음 알려졌다 고 40 다른 아시아, 아프리카, 오세아니아, 한국 및 북미 국가7확산 하고있다. 감귤 류 녹화는 경제 및 재정 손실 때문에 감귤 류의 과일 손실; 위협 세계적인 문제 따라서, ACP의 관리는 방지 하 고 HLB 제어 매우 중요 간주 됩니다.
이러한 해충의 효과적인 제어를 위한 조치는 일반적으로 비교적 짧은 화학 살충제의 응용 프로그램 살 필요 합니다. 화학 살충제 제어 전략 종종 안전 환경 관리 전략 부족 또는 유해물 인구8,9농약 저항으로 인해 민감성을 감소. 따라서, 분자 biopesticides 가진 유해물의 생물학 통제는 잠재적인 대안 이다, 하지만 그것의 사용은 세계적으로 겸손, 남아 및 parasitoids (예를 들어, Trisolcus 나무)의 다양 한 종 자연 생물으로도 효과적일 수 있습니다. 제어 합니다. RNAi 분자 biopesticides10침략 적인 해충을 관리 하기 위한 기술을 신흥 잠재력 이다. RNAi는 결국 리드는 mRNA에 유전자 발현의 규칙 순서 특정 방식에서 dsRNAs 침입 뿐만 아니라 내 생의 효과적인 posttranscriptional 유전자 입을 용이 하 게 잘 설명된 유전자 규제 메커니즘 레벨11,12. 간단히, 외 인 dsRNA는 siRNAs에 bidentate nuclease RNase III superfamily의 구성원에 의해 처리 되는 셀에 내 면, 진화론에 벌레, 파리, 식물, 균 류, 포유류13, 보존 Dicer 호출 14 , 15.이 21-25의 뉴클레오티드 siRNA duplexes 다음 해제 및 RNAs를 가이드로 RNA 유도 입을 복잡 한 (RISC)에 통합. 이 RISC RNA 복잡 한 Watson 근육 경련 기본적인 쌍 수 하는 보완 대상 mRNA; 이 결국 지도 한다 분열 Argonaute 단백질, 멀티 도메인 단백질 저하 해당 mRNA 및 단백질 번역, 그로 인하여 입을16 posttranscriptional 유전자로 이어지는 감소는 RNase H-같은 도메인을 포함 하 여 , 17 , 18.
해충 관리를 위한 RNAi siRNA 통로 활성화 함으로써 dsRNA에서 vivo에서 , 관심사의 유전자를 침묵의 도입을 필요 합니다. 곤충 및 곤충 세포 dsRNA 배달 조직의 RNAi를 유도 하기 위해 사용 된 다양 한 방법이 포함10,19,20,21, microinjection22, 사업자 리 같은 몸으로 먹이 23, 그리고24다른 기술. RNAi 화재로 unc-22 유전자 발현을 침묵 하 꼬마 선 충 에서 처음 되었고 멜로25, 최저 초파리 melanogaster26에 frizzled 유전자의 표현에 의해 따라. 초기 기능 연구 활용 곤충, Apis mellifera22,27,28 Acyrthosiphon pisum, Blattella germanica29, dsRNA를 제공 microinjection H. halys30및 (Terenius 그 외 여러분 검토 lepidopteran 곤충 31). microinjection 곤충에 대 한 관심의 사이트를 정확 하 고 정확한 복용량을 제공 하는. 비록 같은 정화 조 자국 농업 biopesticides 개발에서의 실용성을 배제 외상32, 그러므로, 때문에 면역 관련된 유전자의 표정을 유도 수 있습니다.
DsRNA에서 vivo에서 제공 하는 또 다른 방법은입니다 몸을 담근 채, 섭취 또는 흡수 dsRNA의 동물 또는 세포의 dsRNA를 포함 하는 extracellular 매체에서 일반적으로 포함. 효율적으로 침묵 C. 선 충 뿐만 아니라 하류로의 Raf1 (DSOR1) 물질 활성화 한 단백질 키 니 아 제 키 니 아 제 (MAPKK)20, 억제 하기 위해 초파리 S2 조직 배양 세포에서 RNAi를 유도 하는 데 사용 되었습니다 젖어 pos-1 진33. 그러나, 몸으로 사용 하 여 배달 dsRNA microinjection20에 비해 RNAi를 유도 하는 것 덜 효율적입니다. RNAi 중재 씹는 곤충에 입을 인공 한 천 다이어트10으로 dsRNA를 일으키는 여 서 부 옥수수 rootworm (WCR) (Diabrotica virgifera virgifera)에 먼저 보였다. 이전 보고서는 dsRNA 절지동물34특정 자연 다이어트에 주입을 제공 하는 방법을 요약 있다. 이러한 전달 방법 추가 배달;의 인위적인 수단을 대 등 하 게 효과적일 수 결정 등 어디 동등한 최저 면역 관련 유전자의 dsRNA 혈액 식사 또는 microinjected35를 통해 전달 했다 때 관찰 되었다 체체파리 비행 (Glossina morsitans morsitans)의 경우. 마찬가지로, 꿀 꿀벌38,39 뿐만 아니라 밝은 갈색 애플 엄 (Epiphyas postvittana)36, 다이아몬드 나 방 (이용한 배 xylostella) 애벌레37, 방울 통해 dsRNA의 납품 효율적인 RNAi를 유도. 호스트 식물의 혈관 조직을 통해 전달 해야 합니다 때문에, hemipteran 곤충에 dsRNA의 구두 전달 힘든 때문에 hemipteran에 가장 효과적인 RNAi 실험 dsRNA40 의 주입 활용가. 효과적인 RNAi 또한 ACP와 유리 날개 사격의 명 수 leafhopper (GWSS) Homalodisca vitripennis에서 관찰 되었다: dsRNA 감귤 류와 루트 물 약, 잎을 통해 혈관 조직으로 dsRNA를 흡수 했다 포도 덩굴을 통해 전달 했다 스프레이, 트렁크 주사, 또는 절단41,,4243,44,45,46에 의해 흡수. 이것 또한 dsRNA ACP (2016, 미국 20170211082 A1)에 대 한 첫 번째 특허 귀착되는. SiRNA 나노 입자 등 리 캐리어를 사용 하 여 dsRNA의 납품 부여 안정성, 그리고 전달된의 dsRNA 효능 증가23,,4748,49 신흥 빠르게 ,50. 나노 기반 배달 차량의 생체 외에서 그리고 vivo에서 적당 한 배달 벡터51로 치료 응용 프로그램 엄청난 잠재력을 얻으며 수 있습니다에 대 한 구체적으로 요약 했다에 대 한 핵 산에 대 한 새로운 클래스. DsRNA에 대 한 배달 차량으로 나노 입자 용 해도, hydrophobicity, 또는 제한 된 bioaccumulation52를 포함 하 여 단점 있지만 적당 한 폴리머 탈출 배달 이러한 단점을 보상 수 있습니다. 개발 및 자체 제공 뉴클레오티드의 사용 이라는 '센스 oligonucleotides', 단일 좌초 RNA/DNA 쌍 신 회로46는 등장도 하고있다.
절지동물에 vitellogenesis 키가는 체 지방; Vg 합성의 주요 inducers 복제 제어 과정 및 젊은 호르몬 (JH) 또는 ecdysone 규제, Vg는 결국 Vg 수용 체 중재 된 endocytosis53통해 개발 oocyte에 의해 촬영. Vg은 polypeptides의 그룹 합성 extraovarially vitellin54,55, 주요 계란 노 른 자 단백질의 개발을 위한 필수 이며 따라서, 재생산 및 노화56에 중요 하다. Vg은 nematodes57 에 성공적으로 침묵 되었다 뿐 아니라 꿀벌 (Apis mellifera) 어디 RNAi 중재 Vg의 고갈에서에서 성인과 계란22에서 관찰 되었다. RNAi 그것의 고갈 같은 관찰 phenotypic 영향으로 이어질 것으로 생각 되었다 때문에 시험 되었다 중재 posttranscriptional 유전자 Vg의 입을 감소 산과 통치, 잠재적으로 BMSB 제어에 도움. JHAMT 유전자 인코딩하는 S-adenosyl-L-메티오닌 (SAM)-종속 JH 산 O-methyltransferase, JH 생 합성 통로58의 마지막 단계를 catalyzes. 이 통로 farnesyl 파이 인산 (FPP)는 순차적으로 farnesol에서 farnesoic 산 JHAMT에 의해 JH 메 틸 farnesoate의 변환 다음에 변형 됩니다. 이 통로 곤충 변 태 호르몬59,,6061에 의해 규제 발달 과정에 맞게 절지동물에 보존 됩니다. B. 모리, JHAMT 유전자 발현 및 Corpora allata에 JH 생 합성 활동 제안 JHAMT 유전자의 transcriptional 억제 JH 생 합성58의 종료에 대 한 결정적 이다. 따라서, JHAMT 및 Vg 유전자 RNAi를 사용 하 여 대상된 고갈에 대 한 선정 됐다. RNAi는 ACP와 GWSS의 제어를 위한 감귤 나무에서 또한 시험 되었다. 감귤 나무 dsRNA 루트 물 약을 통해 치료 했다, dsRNAs 곤충 특정 아르기닌 키 (AK) 녹취 록42,44에 대 한와 잎 스프레이 뿐만 아니라 탭 (트렁크 주사), 줄기. 감귤 나무, 식물 혈관 조직을 통해 효율적인 납품을 나타내는 고 귀착되 었 다 ACP GWSS41,42, 에서 사망률 증가의 캐노피 온통 dsRNA의 국 소 응용 프로그램 검색 되었습니다. 45.
현재 연구에서 우리는 dsRNA 등 치료에 대 한 자연 식단 배달 방법을 확인 했습니다. 새로 개발된 된이 기술은 이후 JHAMT 및 Vg 입을 사용 되었다 mRNA 유전자 특정 dsRNAs BMSB로 nymphs에 사용 하 여 이전62시연. 여기 설명 이러한 새로운 배달 프로토콜 국 소 스프레이 또는 microinjections를 사용 하는 기존 RNA 배달 시스템을 대체 합니다. 야채와 과일, 줄기 탭, 토양에는 억 수 같이 쏟아지는, 및 찰 흙 absorbents에서 사용할 수 있습니다 전달의 dsRNA,이 중국 해충 및 병원 체 관리의 지속적인된 발전에 매우 중요.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. BMSB 양육
- 표준 실험실 연습와 앞에서 설명한63BMSB 곤충 후면.
- 유리 공장 (22 ° C) 및 자연 채광에 감귤 꽃 에 ACP (D. citri) 곤충을 올립니다. 성인 ACP를 사용 하 여, 대략 5-7 일에 게시 일수로.
2. 유전자 영역 및 체 외에서 합성 dsRNA의 선택
- 이전에 게시 transcriptome 프로필32에서 BMSB에 특정 유전자를 선택 합니다.
- 200 ~ 500의 기본적인 쌍 사이 다를 선택 하는 관심 영역을 확인 합니다.
- 연쇄 반응 (PCR) genomic DNA에서 선택 된 유전자와 관련 된 파편을 생성 하기 위해 아래 설명 된 조건을 사용 하 여 수행 합니다. 유전자 관련 oligonucleotides 표 1 을 참조 하십시오.
- PCR 반응: 0.25 mL PCR 튜브에 결합 PCR 버퍼, dNTP 혼합물 (2.5 m m 각)의 4 µ L, 2 µ L의 DNA 템플렛 (50 ng / µ L), 2.5 µ L 각 뇌관 1과 2 (10 µ M), DNA 중 합 효소 (5 U / µ L)의 0.25 µ L의 X 10의 5 µ L DNase/RNase 무료 최대 50 µ L를 물.
- PCR 조건: 10 98 ° C의 30 주기 뒤 3 분 동안 95 ° C에 관심이 증폭 PCR 반응 사이클 s, 55 ° C 30 s, 1 분 품 추가 10 분 Purify 사용 하 여 PCR 반응을 위한 72 ° C에 반응 위한 72 ° C를 정화 키트입니다.
- T7 RNA 중 합 효소 발기인 순서 측면 유전자 특정 한 뇌관으로 얻은 PCR 파편을 더 증폭 (5'-GAA 온 ATA CGA CTC 법 ATA GGG AGA-3')으로 언급 이전62.
- RNAi에 대 한 부정적인 컨트롤 (모의) LacZ 유전자를 사용 합니다.
참고: LacZ β-galactosidase (사용 하는 뇌관은 표 1에 나열 됩니다) Escherichiacoli genomic DNA에서 증폭을 인코딩하는 유전자 이다. - 설명된 이전62으로 dsRNA를 녹음 방송 생체 외에서 수행 합니다.
- 분해 하 고 150 µ L DNase/RNase 무료 물에서 결과 dsRNA를 resuspend, 측정 농도, 나중에 사용-80 ° C에서 저장.
3입니다. 배달 dsRNA 사용 녹색 콩의
- 선택 초기 4회 탈피 BMSB nymphs 동일한에서 부 화 계란 질량 그리고 dsRNA 먹이 전에 24 h에 대 한 그들을 굶 어.
- 슬림 인증된 유기 녹색 콩 (Phaseolus vulgaris L.)를 선택 하 고 5 분 0.2% 염소 용액으로 세척.
참고: 슬림 콩 콩 쉽게 2 mL microcentrifuge 튜브에 수용 될 수 있도록 선정 됐다. - DdH2O 3 번 세척 하 고 건조 공기를 허용.
- 녹두를 꽃 받침 끝에서 깨끗 한 면도날을 사용 하 여 7.5 cm의 총 길이 잘라 주세요.
- 제어 솔루션의 300 µ L을 포함 하는 뚜껑 없는 2 mL microcentrifuge 튜브에 세척 하 고 트림 녹두를 담가 (1시 10분 희석 녹색 식용 색소의 (성분: 물, 프로필 렌 글리콜, Fd & C 노란색 5, Fd & C 블루 1, 및 Propylparaben로 방부 제))입니다.
- 생체 외에서 의 확인 희석 diluting 5 µ g 또는 RNase/DNase 무료 물 0.017 µ g / µ L 또는 0.067 µ µ g/L는의 최종 농도를 각각 300 µ L에서 20 µ g LacZ, JHAMT, 또는 Vg dsRNAs 합성.
- DsRNA 솔루션 (3.6 단계)에서 300 µ L를 포함 뚜껑 없는 2 mL microcentrifuge 튜브에서 세척 하 고 트림 녹두를 담가.
- 포장 하 고 몰입된 콩 dsRNA 해결책의 증발을 방지 하 고 microcentrifuge 튜브에 들어가기에서 동물 방지를 포함 하는 microcentrifuge 튜브의 가장자리를 밀봉.
- DsRNA 솔루션 그린 빈을 통해 모 세관 작용에 의해 로드 될 수 있도록 3 시간 실 온에서 직 립 방식으로이 관을 배치 합니다.
- 깨끗 한 문화 혈관 (폴 리 프로필 렌)에이 관을 배치 합니다. 장소 3 4회 탈피 BMSB nymphs 문화 선박에 굶주렸다.
- 치료 3 동물 문화 선박 마다 각 녹색 식품 색소 또는 dsRNA 해결책을 가진 3 개의 녹색 콩을 포함. 인큐베이터에서 16 L: 8D photoperiod에서 25 ° C 및 72% 상대 습도에서 곤충을 유지 합니다.
- 5 일 동안 녹색 콩 (몰입, dsRNA를 흡수)에 공급 하는 곤충을 허용 하지만 3 일 후 dsRNA 치료 녹색 구슬의 신선한 다이어트 보충.
4. 실시간 정량 분석의 유전자 식 다음 RNAi 중재 입을 BMSB에 (정량)
- 정량에 의해 대 본 식의 수준에 RNAi의 효과 측정 합니다.
- DsRNA 치료 동물에서 총 RNA를 분리 하 고62cDNA 합성.
- 실시간 PCR 시스템 및 표 1에 나열 된 프라이 머를 사용 하 여 정량 Pcr 반응 셋업 한다. 다음 정량 사이클링 조건을 사용 하 여: 15 95 ° C의 40 주기 뒤에 10 분 동안 95 ° C s, 95 ° C 15를 포함 하 여 분리 단계와 함께 1 분 동안 60 ° C s, 1 분, 15에 대 한 95 ° C에 대 한 60 ° C s 그리고 60 ° C 15에 대 한 s.
- 정량 기준 결정: cDNA는 정량화에 대 한 참조 표준으로 정상적인 동물에서 분리 된 총 RNA에서 준비의 직렬 희석을 사용 하 여.
- 내부 표준으로 BMSB 18s RNA를 사용 하 여 조직32에서 RNA 복구에 차이 대 한 수정.
5. 잎 스프레이 응용 프로그램 큰 화분에 심은 감귤 나무 묘 목
참고: 'Carrizo' 유리창 (감귤 류 나무 XPoncirus trifoliata, 오렌지), 감귤 류의 품종의 식물 자연 채광 및 온도, 1.2 L 용기에 재배에서 유리 공장에서 유지 되었다. 식물 끊임없이 '플러시' 라는 새로운 잎 싹의 성장을 촉진 하는 정리 된 했다. ACP 피드 및 감귤 류64의 새로운 성장에 산란을 좋아한다.
- 식물 또는 묘 목을 선택 하 고 습기를 하지만 완전히 건조 건조 토양을 사용 하기 전에 2-3 일 동안 그들을 급수 하지 않는다.
- 손 펌프 스프레이 용기를 사용 하 여 낮은 캐노피 (그림 4A) 적용할 dsRNA 솔루션 (0.5 mg/mL)의 200 mL.
참고: 위의 준비 DNase/RNase 무료 물에 dsRNA 솔루션을 언급. - 후 스프레이 응용 프로그램, 적용 된 dsRNA 해결책 잎에 의해 완전히 흡수 될 수 있습니다.
참고: 감귤 나무 적용된 dsRNA를 흡수 하 고 잎 어느 새로운 성장에서 또는 전에 응용 프로그램, 적용 된 지점에서 추출 되었다; dsRNA 정량 Pcr를 사용 하 여 감지 했다 고 3-4 h44,,4546에 최고 캐노피 나뭇잎으로 조직의 움직임을 보여주었다. - 25-40 일 수집 하 여 약 10 4 분기의 끝에서 출발 후 이전 얹어 나무에서 새로운 성장 샘플. 총 RNA를 추출 하 고 반전 녹음 방송 PCR (RT-PCR)에 의해 분석 정량 Pcr 뇌관을 사용 하 여 적용된 dsRNA 트리거의 존재에 대 한 표 1에 나열 된 및 이전에 설명한 방법46.
참고: 샘플 컬렉션, 총 RNA 격리, RT-PCR과 정량 앞에서 설명한46으로 수행 했다. - 마찬가지로, 몸에 붙이기도 경종 또는 작은 화분에 심는 나무 잎의 더 낮은 지역에 10 mL dsRNA 스프레이.
참고: Hemipteran 곤충 (ACP 및 GWSS) 24 h에 일반적으로 먹이 액세스를 부여 했다, 새로운 성장 (잎)을 했다 하지 되었습니다 직접 분무, 나는 성장 주 후, 또는 전체 식물 치료를 게시. 이 곤충 3, 6, 및 10 일에 dsRNA에 대 한 테스트는 긍정적인 수 유 포스트 생산.
6. 토양/물 약 응용 프로그램에 큰 또는 작은 감귤 류 나무와 모 종 화분
- 식물 또는 묘 목을 선택 하 고 2-3 일 아니지만 습기를 밖으로 건조 하는 토양을 사용 하기 전에 그들을 급수 하지 않는다 완전히 건조 (이 공기 공간 적용 될 액체 솔루션을 만듭니다).
- 큰 화분 (약 2.5 m)의 토양에 dsRNA 솔루션 (0.2 mg/mL) 1 리터를 추가 하 고 1 시간 후 물 (체이서) 1 패를 추가.
- 100ml dsRNA 해결책 (1.33 mg/mL) 1 m 높이의 토양의 화분에 심는 나무 부분적으로 건조 토양에 적용 됩니다.
- 작은 묘 목, 콘에서 토양 또는 벌 거 벗은 뿌리 (그림 4B, C) 10 mL dsRNA 해결책 (1 mg/mL)의 적용.
- 식물을 30 분 동안 담가 수 토양 물 약으로는 dsRNA 솔루션을 받을 수 있습니다. 다음 경우 큰 화분 > 1 갤런 (20 mL 노란색 용기에 식물을 위해) 또는 100 mL 뿌리에 의해 흡수를 돕기 위해 일반 물만 치료 적용.
참고: 잎을 몸에 붙이기도 적용된 dsRNA 탐지 최대 원심 팁 3-6 h 게시물 치료, 나무를 통해 조직의 움직임을 보여주는 내 분기의 결과. 새로운 성장 분기 60-90 일 포스트 트리트먼트에 dsRNA에 대 한 긍정적인 테스트합니다. 잘라 먹이 생물 검정44dsRNA에 곤충 (ACP 및 GWSS)에 제공 됩니다.
7. 줄기 큰 화분에 심은 감귤 나무와 묘에서 응용 프로그램 탭 (트리 트렁크 주입)
- 새로운, 또는 대략 3.5 년 오래 된 식물 줄기를 사용 하 여 dsRNA를 주입에 대 한 탭 (트렁크 주사) 방법 감귤 류의 묘 목을 선택 합니다.
- 감귤 류 식물 훈련 및 2 cm, 또는 줄기의 약 절반 직경을 초과 하지 않도록 주의 복용 10 m m 드릴 비트를 사용 하 여 구멍을 드릴 합니다.
- 팁 근처 누설을 방지 하기 위하여 필름을 씰링의 0.6 cm (¼ 인치) 넓은 스트립으로 4-6 시간 각 인젝터의 구리 끝부분을 바꿈.
- 6 mL (1.7 mg/mL)에 dsRNA 솔루션 DNase/RNase 무료 물에 희석 하는 트리 트렁크 인젝터 채워 (표시 색된 솔루션으로 서 여기).
- 나무의 줄기에 솔루션을 주입 하 고 6-10 h dsRNA 해결책의 흡수 수 있도록 트렁크에 인젝터를 둡니다. 3, 10, 30 일 게시물 치료에서 치료 나무에서 절단에 피드에 곤충을 허용 합니다.
참고: 트렁크 주입 방법을 사용 하 여 주입 dsRNA 나무에서 30-60 일41,,4244의 기간에 대 한 유지. RNAi에 대 한 유효성 검사는 표 1에 나열 된 프라이 머를 사용 하 여 정량에 의해 수행 되었다.
8. dsRNA 곤충을 통해 토양으로의 배달을 위해 처리 점토 알갱이
- 튜브에 35 mL 마크 (흡수 성 찰 흙의 약 30 g) 50 mL 원뿔 관으로 흡수 성 찰 흙 밖으로 붓는 다.
- 젖은 모든 흡수 관으로 dsRNA 솔루션 DNase/RNase 무료 물 (µ g/100ml)에 희석의 20 mL를 붓으십시오. 원뿔 튜브 캡, 튜브를 제거 하는 공기, 팁 및 튜브 캡.
- 튜브 똑바로 놓고 그것은 솔루션을 흡수 하는 찰 흙 입자에 대 한 1-2 분 동안 서 보자.
- 1 갤런 냄비를 채우기 위해 토양 혼합으로 충분 한 dsRNA에 젖은 점토를 추가 합니다.
- 혼합 고 손으로 철저 하 게 토양으로 dsRNA에 젖은 흙을 혼합 하는 토양.
- 사용 하 여이 토양 repot 묘 dsRNA 치료에 대 한 선택.
- DsRNA 없이 일반 물 200 mL와 함께 토양을 물. 1 시간 30 분, 후 일반 물 100 mL를 따릅니다. 24 시간 후 정상 급수 계획에 식물을 넣어.
- 새로운 식물 성장의 가장 꼭대기 잎을 수집 하 여 4-6 잎 점토 absorbents와 dsRNA 치료 화분의 dsRNA에 대 한 각 달 게시물 치료를 테스트 합니다.
참고: 식물 또는 절단이 대우 식물에서 먹인 다 곤충에 언제 든 지 24 시간 치료를 게시 하 고 곤충 (되지 않은 데이터)를 최대 1 년을 위한 RNAi 배달 할 수 있다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
BMSB 4회 탈피 님프에 먹이 통해 야채 중재 dsRNA 배달 분자 biopesticides RNAi를 사용 하 여 침입 곤충 해충에 대 한 개발에 대 한 테스트를 했다. BMSBs 피드로 알려진 메커니즘에 의해 그들의 바늘 같은 stylets를 사용 하 여 입힌 고 플 러쉬, 어떤 작물에 상당한 손상을 초래. 슬림 유기 녹색 콩, P. vulgaris L., 영양소 또는 dsRNA 전달 될 수 있는 비보에 BMSB에 먹이3테스트에 사용 되었다. 녹두의 세그먼트는 DNase/RNase 무료 물 또는 물과 녹색 식용 색소 BMSB (그림 1A)에서 배달 테스트 솔루션에 몰두 했다. 녹색 식용 색소는 dsRNA를 모방 하는 시각적 표시로 사용 되었다. 녹색 콩의 혈관 조직 모 세관 작용62여 녹색 식용 색소는 체 관 부를 통해 녹색 색깔된 해결책의 흐름 때문으로 포화 되었다. BMSB nymphs 녹두 (그림 1B)의 혈관 조직에 그들의 stylets를 삽입 하 여 녹색 콩의 세그먼트에 먹이 것이 보였다. 녹색 컬러 배설물 방울 곤충을 전달된 소재 했다 구두로 섭취 하 고 배설 (그림 1C, D 전에 용기를 통과 녹색 식품 색소를 나타내는 포화 콩에 지 루 했다에 2, 3 일 후 관찰 되었다 ).
이후 우리는 타겟된 유전자 발현의 상당한 소모 BMSB 섭취 통해 BMSB 특정 dsRNA의 그린 빈 중재 배달 사용 하 여 달성 하는 경우 테스트. 그린 빈 세그먼트 몰입 했다 고 흡수 0.067 µ g / µ L (DNase/RNase 무료 물 300 µ L에서 20 µ g) 또는 0.017 µ g / µ L (DNase/RNase 무료 물 300 µ L에 5 µ g) 체 외 합성 dsRNA BMSB JHAMT 및 Vg의 솔루션 각각. 녹두도 각각 컨트롤로 혼자 물, 0.067 µ g / µ L 또는 0.017 µ g / µ L LacZ dsRNA (모의)에 몰두 했다. 대 본 수준 JHAMT의 그 표현이 나타내는 정량 Pcr를 사용 하 여 평가 했다 및 Vg mRNA 크게 감소 했다 vivo에서 거의 4.5-그리고 2.2-fold, 각각 (그림 2A, B). 따라서, 결과 dsRNA 성공적인 RNAi를 유도 하기 위해 녹색 콩의 혈관 조직을 통해 전달 될 수 있습니다 나타냅니다.
또 다른 hemipteran 해충, 작물 양분 또는 dsRNA 치료의 성공적인 납품 야채를 사용 하 여 전달 될 수 있는 경우 테스트 또한 콜에 손상을 일으키는 할리 퀸 버그 (HB) (Murgantia histrionica), 배달 중재. 4회 탈피 HB nymphs 아기 collard 녹색 (브라시카 올레라케아 var먹이 수 있었습니다. 풀) 물 또는 녹색 식용 색소와 물 해결책에 몰두. 결과 표시 HB 먹이 섭취 했다 분명 배설물 (그림 3) 물에 야채를 섭취 하는 HB에 비해 그들의 녹색 색된 배설물에서 분명 했다 녹색 식용 색소.
살포 또는 루트/토양 식물 조직65,66의 모든 통풍 관 dsRNA에에서 결과 몸을 담글의 dsRNA의 과도 전달에 대 한 추가 기술. Sprayable RNAi 기반 제품 개발에 있으며 곧 승인이 가능할 수 있습니다. 스프레이 또는 루트 물 약을 사용 하 여 필드에 dsRNA의 납품 침입 곤충42,67관리에 도움이 될 수 있습니다. 전체 크기의 감귤 류 나무와 모 종 잎 스프레이, 또는 토양 또는 벌 거 벗은 루트 억 수 같이 쏟아지는, 각각 (그림 4)는 dsRNA에 노출 되었다. 결과 표시 dsRNAs 하거나 스프레이 하 여 전달 또는 토양/베어 루트 물 약 7 주 게시물 dsRNA42의 2 세대의 단일 노출에 대 한 감귤 류 식물 (높이 2.5 m)에서 검출 될 수 있습니다. 배달 및 psyllid dsRNA-AK (20 ng / µ L)의 섭취 30-45% (그림 4D)42psyllid 사망률 증가.
생체 외에서 복사할 dsRNA polyphagous 곤충 때44 같은 식물에 먹이 곤충에 의해 취득 될 수 있다 식물의 혈관 조직에 직접 유전자 특정 dsRNA의 줄기 탭 (트렁크 주사)를 사용 하 여 효율적으로 배달 될 수 있습니다 (그림 5). 트렁크 주사 하 여는 dsRNA에 노출 된 감귤 류 나무에 대 한는 dsRNA에서에서 검출 될 수 세 감귤 류 식물 (약 1 m 높이) 7 주 t DNase/RNase의 솔루션에 dsRNA의 1.7 mg/mL의 6 mL를 사용 하 여 단일 노출 무료 물 (그림 5A B). Hemipteran 곤충 체 관 부 먹이 다음 dsRNA 치료 이러한 호스트 식물에 피드 허용 되었다. dsRNA는 성공적으로 주입 하 고 사망률 dsRNA AK42에 먹 일 때 시연 ACP에 의해 섭취에 대 한 감귤 류 식물의 혈관 시스템을 통해 이동 가정.
생물 검정 2012 년 2008 년부터 개발, 다양 한 화분 상영 되었고 dsRNA는 식물이 흡수 하 고 조직의 dsRNA 보급41,42 dsRNA 이동 방식으로 납품을 제공 하기 위해 표시 . 한 가지 방법은 점토 매트릭스;으로 dsRNA 흡착과 찰 흙 흡수 성 구성 요소를 사용 이 뿐 아니라 다른 흡수 성 재료, 셀 루 로스, agars, 바이오 플라스틱, 점토, 풀러의 지구, 비 석, 및 다른 사람의 광범위 한 포함 등 점토 입자 보균자 먼지 무료 핵 산 활성 성분을 전달 하는 데 사용할 수 있습니다 토양 식물 통풍 관 및 궁극적으로 곤충 (그림 6) 배달을 위한 dsRNA 등. 복잡 한 찰 흙 특정 pH 또는 이온 조건 dsRNA 출시 화학적 구성 수 있습니다 또한. 식물으로 dsRNA의 클레이 전달 방법 dsRNA에 화분에 심은 감귤 나무, 및 14 개월 (데이터 표시 되지 않음) 다른 식물을 제공 표시 되었습니다. 이 전달 시스템 등 꽃 색, 식물 높이 (압도), 또는 다른 사람 식물 특성을 변경 사용할 수 있습니다. 현재,이 방법의 기본 사용은 효과적인 곤충 해충 및 병원 체 (바이러스) 제어 또는 관리의 개발입니다. 접근은 보육원 및 주택 소유자, 비용 효과적인 수 있으며 비-유전자 변형 방법입니다.
그림 1 . 영양분 이나 녹두 통해 dsRNA의 납품. (A) 슬림 유기 녹색 콩의 몰입 했다 선분과 ddH2O 혼자 또는 ddH2O 3 h에 대 한 녹색 식용 색소와 300 µ L을 포함 하는 2 mL microcentrifuge 튜브에 솔루션을 흡수. 3 4회 탈피 BMSB nymphs 24 h에 대 한 굶 어 고 선박 당 3 녹두와 함께 문화 용기에 배치. (B) BMSB 녹두 물에 그들의 stylets와 영양소를 도달 하는 녹색 콩을 통해 피어 싱으로 몰입의 세그먼트에 피드. (C) 하루 2 생물 먹이 BMSB의 화살표 표시 배설물. (D) 주 3; (화살표로 표시) 증가 BMSB 배설물 관찰 ddH2O의 솔루션의 게시물 섭취와 녹색 식용 색소 녹색 콩을 통해. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 . JHAMT 및 BMSB에 Vg의 고갈 RNAi 중재 후 대 본의 수준을 측정 하 양적 RT-PCR 분석. 3 개별 BMSB 4회 탈피 nymphs에서 총 RNA 20 µ g (0.067 µ g / µ L), JHAMT (A)에 먹이 Vg (B) 5 µ g (0.017 µ g / µ L) dsRNAs ddH2O의 300 µ L에 녹두의 세그먼트를 통해 전달, 격리 및 대 본 수준 정량에 의해 측정 되었다. LacZ dsRNA (모의) 부정적인 컨트롤로 제공 됩니다. BMSB 18s RNA는 조직에서 RNA 복구에 차이 대 한 수정 하는 내부 표준으로 사용 되었다. 결과 보고 3 생물 복제에서 그리고 오차 막대 표시 SEM. 단방향 분산 분석 (ANOVA) 데이터, p < 0.0001의 통계적 의미에 대 한 테스트를 수행 했습니다. Ghosh 외 에서 재현 하는 결과 62 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 . 할리 퀸 버그에서 치료의 구두 전달 (M. histrionica ) 아기 collard 녹색을 사용 하 여. 오가닉 베이비 collard 녹색 했다 0.2% 염소로 세척, 손질, 및 포함 하는 (A) DNase/RNase 무료 ddH2O, 또는 (B) DNase/RNase 무료 ddH2의 솔루션의 300 µ L 2 mL 모자 없는 microcentrifuge 튜브에 O 솔루션 3 h 동안 녹색 식용 색소. 3 4 탈피 HB nymphs 24 h에 대 한 굶 어 하 고 문화 혈관에 배치 되었고 이러한 collard 녹색에 3 일 동안 먹을 수 있습니다. 흰색 화살표는 하루 3 게시물 먹이 배설물을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 . 잎 스프레이 루트 물 감귤 류 나무와 묘에서 응용 프로그램 약. 선택 된 식물 또는 묘 이전 사용 하는 토양 습기를 하지만 완전히 건조 건조 수 있도록 2-3 일 동안 물을 하지. (A) 나무 했다 처음 그리고 낮은 속의 dsRNA 솔루션 (0.5 mg/mL) DNase/RNase 무료 물이 200 mL 적용 손으로 펌프 스프레이 병. (B) 100 mL dsRNA의 솔루션 (1 mg/mL) DNase/RNase 무료 물에 부분적으로 건조 토양에서 묘 목의 토양에 적용 되었습니다. (C)의 dsRNA 솔루션 (1 mg/mL) DNase/RNase 무료 물 약 3 헤 (D)에 대 한 모 종의 벌 거 벗은 뿌리에 적용 된 100 mL ACP dsRNA 벌 거 벗은 뿌리에 의해 흡수 했다 묘 종에 먹이 ACP 사망률을 증가 보였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5 . 감귤 류의 묘 종 트리 트렁크 주입. 감귤 류의 묘 높이 약 1 m 1.7 mg/mL의 dsRNA 주입 했다. (A) 드릴 구멍에 감귤 묘 목 10 m m 직경 드릴 비트를 사용 하 여 식물의 줄기에는 인젝터를 삽입. 노출된 구리 팁 각 인젝터의 누설을 방지 하기 위하여 필름을 씰링의 0.6 cm (¼ 인치) 넓은 스트립으로 포장 했다. (B) 인젝터 컬러 솔루션의 6 mL 가득 묘 목의 줄기 (트렁크)에 적용 했다. 인젝터는 솔루션의 완전 한 이해에 대 한 약 6-10 h에 대 한 장소에 남아 있었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6 . 토양을 통해 식물에 dsRNA의 찰 흙 토양 개정 배달. 자료 제공의 새로운 라인: 점토 토양 식물 통풍 관에 대 한 dsRNA 같은 활성 성분에 사용 하기 위해 먼지 무료 핵 산 캐리어는 궁극적으로 곤충에. (A) Unbaked 찰 흙 및 (B) 구운 점토 묘사한 물 공차/보존. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 잠재적인 H. halys 대상 유전자 | |||
| 재산 가치 | 크기 | 유전자 이름/상 동 | |
| XP_014293026.1 | 491 | Vitellogenin-A1-처럼 (Vg) (가능한 isoforms: vitellogenin-2-같 은 isoform X1 XP_014291483.1; vitellogenin-2-같 은 isoform X2 XP_014291484.1). | |
| XP_014290953.1 | 545 | 청소년 호르몬 산 O methyltransferase 같은 (JHAMT) (가능한 체: 청소년 호르몬 산 O methyltransferase XP_014283772.1). | |
| 뇌관 | |||
| PCR | |||
| 유전자 이름/상 동 | 뇌관 이름 | 시퀀스 | |
| Vg | BMSB Vitellog P2 F | CAATTTGATCCACCGACTGTT | |
| Vg | BMSB Vitellog P2 R | CCGCATGAATCTTACTCTGGA | |
| JHAMT | BMSB JH P1 F | GGATGCTTATGAATAATCCAG | |
| JHAMT | BMSB JH P1 R | GTATAGGATTGCCATTTTGG | |
| T7 PCR | |||
| Vg | T7 BMSB Vitellog P2 4263 F | GAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCAAAGTTGGAAGGGAATGA | |
| Vg | T7 BMSB Vitellog P2 4753 R | GAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCGCATGAATCTTACTCTGGA | |
| JHAMT | BMSB JH T7 P1 F | GAATTAATACGACTCACTATAGGGAGAGGATGCTTATGAATAATCCAG | |
| JHAMT | BMSB JH T7 P1 R | GAATTAATACGACTCACTATAGGGAGAGTATAGGATTGCCATTTTGG | |
| LacZ | T7 LacZ RNAi F | GAATTAATACGACTCACTATAGGGAGATGAAAGCTGGCTACAGGA | |
| LacZ | T7 LacZ RNAi 연구 | GAATTAATACGACTCACTATAGGGAGAGCAGGCTTCTGCTTCAAT | |
| AK로 | dsAK-F | TAATACGACTCACTATAGGGAGTGGCATTCTTGTATGGCGTA | |
| AK로 | dsAK-R | TAATACGACTCACTATAGGGAGGCCTGCAAGAATCTGTCTCC | |
| AK로 | dsAK 50-F | TAATACGACTCACTATAGGGAGTGGCATTCTTGTATGGCGTA | |
| AK로 | dsAK 50-R | TAATACGACTCACTATAGGGAGTGAAGCCCTTGTGGTAGTC | |
| AK로 | dsAK 30-F | TAATACGACTCACTATAGGGAGACCCGGACTCTGGAGTAGG | |
| AK로 | dsAK 30-R | TAATACGACTCACTATAGGGAGGCCTGCAAGAATCTGTCTCC | |
| GFP | dsGFP-F | TAATACGACTCACTATAGGGAGCCAACACTTGTCACTACTTTCTCTT | |
| GFP | dsGFP-R | TAATACGACTCACTATAGGGAGGTAATGGTTGTCTGGTAAAAGGA | |
| 정량 | |||
| Vg | RT Vitellog P2 F | TTGATAGTTGTTTGGATTTTGAAGGT | |
| Vg | RT Vitellog p 2 R | TCTTACTTGATCAGCGCTCAGAA | |
| JHAMT | BMSB JH RT P1 F | AGGAAAACCCAAAATGGCAAT | |
| JHAMT | BMSB JH RT P1 R | ATGTATTCTTCTTTTGGATCTTTTCTTGAG | |
| 18S | BMSB 18S F3 | ATGCCCCCGCCTGTCCTTATT | |
| 18S | BMSB 18S R3 | TGAAAGCAGCCTGAATAGTGG | |
| GFP | GFP-F | GGTAAAAGGACAGGGCCATC | |
| GFP | GFP-R | TCAAGGAGGACGGAAACATC | |
| AK로 | Ak로 양의 F | CGGACTTGAGGGAGAACTGA | |
| AK로 | Ak로 양의-R | GTGGTAGATACCGCGACCAG | |
| -욕조 | -욕조-F | GCGTCTCTTCGGTTTGACGG | |
| -욕조 | -욕조-R | CACTTCACCATCTGGTTGGC | |
표 1입니다. RNAi에 대 한 oligonucleotide 시퀀스입니다. 유전자와 oligonucleotides 성적 수준을 분석 하 PCR 파편, dsRNA, 및 정량 Pcr 뇌관을 생성 하는 데 사용 되는 나열 된.
보충 비디오 1: Agars와 absorbents 납품 및 dsRNA의 지속적인된 출시로 젤. 하이드레이션 합성 또는 자연 agars 및 젤 dsRNA 솔루션을 다양 한 절지동물에 대 한 미끼 또는 다이어트로 사용할 수 있습니다. 이 비디오를 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
RNAi 입증 유전자 생물학 기능 및 규정, 해충19,,6869,70, 의 관리에 대 한 활용을 중대 한 잠재력을 탐험을 위한 중요 한 도구 71. 디자인 및 특정 곤충 종과 곤충에 해당 dsRNA(s)의 납품의 방법에 입을 위한 적절 한 gene(s)의 선택은 매우 중요 둘 다. 곤충으로 dsRNA를 제공 하기 위한 최적의 방법이 결정 되어야 합니다 경험, 배달에 대 한 상대적인 복용량 선택 함께 이점 및 기타 제한 특정 방법을 제공할 수 있습니다. 궁극적으로 환경 방출에 대 한 적합 한 수 있습니다 분자 중국의 개발, 실현, 효율적이 고 유리한 전달 방법이 필요 합니다. 예를 들어 몸에 붙이기도 적용된 dsRNA 곤충 컨트롤을 감귤 류와 포도 덩굴42,44dsRNA 배달에 대 한 효과적인 것으로 나타났습니다. 직접 섭취, 식물에 dsRNA의 국 소 응용 프로그램 또는 특정 dsRNAs 수정 유전자 변형 식물의 생산에 대 한 baits, 자당 솔루션, 효 모 또는 세균성 dsRNA 생산의 사용과 같은 혁신적인 전략의 개발을 전진 했다 효과적인 RNAi 기반 컨트롤19,72.
좋은 예는 특히 충격과 세계적인 중요성의 곤충 해충을 감소 하도록 설계 되었습니다 (그림 1 및 그림 2) dsRNA를 전달 하기 위해 녹색 콩의 사용 여기 보여 줍니다. 새로 개발된 된 식물성 중재 dsRNA 배달 프로토콜 녹두의 세그먼트를 사용 하 여 포장 및 dsRNA 포화 BMSB에 애벌레의 개발을 위해 효과적으로 대상 유전자 특정 사용 되었습니다. 녹색 콩 BMSB으로 먹어 많은 야채 중 하나 이며 그래서이 dsRNA를 전달 하는 매체로 사용 했다. DsRNA 배달의 다른 매체 테스트 (데이터 표시 되지 않음) 했지만 가능성이 혈관 질감 차이로 인해 BMSB에 영양 공급에 실패 했다. 따라서, 우리 BMSB nymphs을 생체 외에서 합성 dsRNA를 제공 세그먼트 녹두의 사용. 식물 또는 식물성 중재 기술을 통해 전달 하는 핵 산 선택 여기 BMSB (그림 2)62에서 JHAMT 와 Vg 유전자의 소모와 관찰의 곤충에 RNAi를 유도 할 수 있습니다.
이 야채 중재 dsRNA 배달 프로토콜 유도 RNAi BMSB 뿐만 아니라 비록 collard 녹색 (그림 3)를 사용 하는 HB에서 배달 전략을 성공적으로 사용 되었습니다 그리고 각 유전자 및 곤충에 대 한 메서드를 최적화 해야 합니다. 따라서, 개별적으로 관심의 여러 유전자를 대상으로 배달 또는 스택 두 개 이상 dsRNAs phenotypic penetrance 더 얻기 위해 다양 한 방법을 테스트할 것이 좋습니다. 여러 가지 방법은 dsRNA 배달 곤충 및 곤충 세포13,22,73,74,75, microinjection 및 기타 기술을 몸으로 먹이 포함 한76 에 사용 하기 위해 요약 되어 있다 dsRNA 조직의 RNAi를 유도 통풍 관입니다. 치료 비-유전자 변형 식물에 섭취에 의해 다른 곤충에 RNAi를 유도 하는 dsRNA의 구두 납품을 위한 새로운 방법도 왔다탐험된 (그림 4, 그림 5, 그림 6). 감귤 나무 dsRNAs 뿌리를 통해 흡수, 탭 (트렁크 주사), 또는 잎 스프레이42,44줄기를 증명 했습니다. 이전, 감귤 류 나무와 성숙한 포도 덩굴 ACP에 GWSS AK 유전자에 해당 하는 곤충 특정 dsRNA와 처리 되었습니다. 이러한 치료 식물까지 다양 한 길이의 시간41,45ACP 및 대 한 GWSS 사망률에서 증가 발생합니다. 함께 이러한 결과 dsRNA 공부 곤충에 특정 유전자의 표정을 방해 수 있습니다 보여 줍니다.
곤충과 침 분 비, 또는 창 자 pH는 dsRNA47의 저하에 대 한 책임이 있을 수 있습니다 창 자 조직에 주로 표현 dsRNA nucleases (dsRNases)의 고유 그룹을 포함 하는 유전자 발현의 성공적인 침묵에 영향을 주는 문제 ,,7778. 그러나, 이러한 성능 저하를 극복 하기 위해 조직의 RNAi 수 유도 될 효율적으로 곤충에 dsRNA의 높은 농도 활용 하거나 같은 저하62, 를 극복 하기 위해 유전자 특정 dsRNA의 구두 전달 다이어트에 PEG를 사용 하 여 79. 배달 및 dsRNA의 수 또한 안정화 될 운반대 분자, 나노 키토 산48같은80 , Lipofectamine 2000 Metafectene76, 같은 리의 도움으로 폴 리 에틸렌 글리콜79, 클레이 nanosheets81, 그리고 탄소 양자 점50. 연구는 유전자 특정 dsRNA를 주입 한 천 젤 조각을 사용 하 여 dsRNA의 효과적인 납품을 개선 하기 위해 진행 중에 (표시 되지 않음 데이터 추가 비디오 4참조). 이 기술은 생긴 수 지 또는 음식으로 둥지를 agar dsRNA를 수행할 수 있는 개미 dsRNA의 효과적인 복용량의 배달을 위해 사용할 수 있습니다.
DsRNA의 안정성, 뿐만 아니라 식물 조직에 dsRNA의 장기 지 속성은 농업 작물을 위해 특히 중요 합니다. 식물, 과일, 채소의 혈관 조직을 통해 dsRNA RNAi 메커니즘을 유도 하는 곤충에 의해 섭취 되 고 이전에 감소 된 효소 활동 xylem 그리고 체 관 부에 축적 수 있습니다. 그것은 해야 특정 dsRNA를 응용 프로그램 유지 짧은 기간 동안 같은 6 일 녹색 콩 이상 토양62,82 에 36 h에 대 한 환경에서 핵 산의 축적 가능성이 되도록 합니다. 그러나, 외. nanosheets로 조 저하에서 큰 dsRNAs 보호 수 시연 Neena 뿐만 아니라 중재 하십시오 잎 표면에 그들의 지속적인된 출시 적어도 30 일81의 기간 동안.
전반적으로 설명한 dsRNA 배달 전략 해충 관리에 대 한 곤충 특정 유전자를 침묵 하 사용 될 수 있습니다. 관개 물, 루트 물 약, 또는 트렁크 주입을 통해 식물에 dsRNA의 공급 루트 지류, 효율적인 제어 방법은 현재 사용할 수 있는 등 해충 곤충에 대 한 효과적인 전략이 될 수 있습니다. 캐리어를 사용 하 여 또는 찰 흙 또는 한 천 같은 매체를 안정화 dsRNA의 납품 식물 통풍 관에 대 한 토양에 직접 추가 수 있습니다. RNAi 중재 분자 biopesticides 개발에 느린 진행에 대 한 주요 원인 중 하나는 효율적인 RNAi 및 환경 조건83에서 안정성을 시작 하려면 효율적인 구두 전달 기술의 부족 되었습니다. 여기에 설명 된 방법을 미래에 사용할 수 있습니다 제공 핵 산 중재 유전자 치료 입을 공장 구두 배달 수액 먹이 씹는 곤충 세계 식량 생산에 곤충 손상을 감소 시키고 지속 가능한 생태 해충을 개발 관리입니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
저자는 기꺼이 실험 BMSB와 HB를 제공 하 고 식민지; 유지에 대 한 도널드 웨버와 메 간 헐리 히 요 (USDA, ARS 벨트 스 빌, 메릴랜드)를 인정 그리고 마리아 토니 곤잘레스, 살바도르 P. 로페즈, (USDA, ARS, 포트 피어스, 플로리다)와 재키 L. 메츠 (프로 리 다의 대학, 포트 피어스, 플로리다) 식민지 유지 관리, 샘플 준비 및 분석.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BMSB (H. halys) insects | USDA | ||
| ACP (D. citri) insects | USDA | ||
| organic green beans | N/A | ||
| Citrus plants | USDA | ||
| sodium hypochlorite solution | J.T. Baker | ||
| green food coloring | McCormick & Co., Inc | ||
| Thermo Forma chambers | Thermo Fisher Scientific | ||
| Magenta vessel (Culture) | Sigma | ||
| Primers | IDT DNA | ||
| SensiMix SYBR | Bioline | ||
| qPCR ABI 7500 | Applied Biosystems | ||
| Spray bottle | N/A | ||
| Parafilm | American Can Company | ||
| TaKaRa Ex Taq | Clontech | ||
| QIAquick | Qiagen |
References
- Hoebeke, E. R., Carter, M. E. Halyomorpha halys (Stǻl)(Heteroptera: Pentatomidae): a polyphagous plant pest from Asia newly detected in North America. , (2003).
- Leskey, T. C., Hamilton, G. C., et al. Pest Status of the Brown Marmorated Stink Bug, Halyomorpha Halys in the USA. Outlooks on Pest Management. 23 (5), 218-226 (2012).
- Peiffer, M., Felton, G. W. Insights into the Saliva of the Brown Marmorated Stink Bug Halyomorpha halys (Hemiptera: Pentatomidae). PloS one. 9 (2), e88483 (2014).
- Anderson, B. E., Miller, J. J., Adams, D. R. Irritant contact dermatitis to the brown marmorated stink bug, Halyomorpha halys. Dermatitis : contact, atopic, occupational, drug. 23 (4), 170-172 (2012).
- Mertz, T. L., Jacobs, S. B., Craig, T. J., Ishmael, F. T. The brown marmorated stinkbug as a new aeroallergen. The Journal of allergy and clinical immunology. 130 (4), 999-1001 (2012).
- McClean, A. P. D., Schwarz, R. E. Greening or blotchy-mottle disease of citrus. Phytophylactica. 2 (3), 177-194 (2012).
- Bové, J. M. Huanglongbing: a destructive, newly-emerging, century-old disease of citrus. Journal of Plant Pathology. 88 (1), 7-37 (2006).
- Kuhar, T., Morrison, R., Leskey, T., Aigner, J. Integrated pest management for brown marmorated stink bug in vegetables. , (2016).
- Tiwari, S., Mann, R. S., Rogers, M. E., Stelinski, L. L. Insecticide resistance in field populations of Asian citrus psyllid in Florida. Pest management science. 67 (10), 1258-1268 (2011).
- Baum, J. A., Bogaert, T., et al. Control of coleopteran insect pests through RNA interference. Nature Biotechnology. 25 (11), 1322-1326 (2007).
- Hannon, G. J.
- Mello, C. C., Conte, D.
- Macrae, I. J., Zhou, K., et al. Structural basis for double-stranded RNA processing by Dicer. Science(New York, N.Y.). 311 (5758), 195-198 (2006).
- Bernstein, E., Caudy, A. A., Hammond, S. M., Hannon, G. J. Role for a bidentate ribonuclease in the initiation step of RNA interference. Nature. 409 (6818), 363-366 (2001).
- Ketting, R. F., Fischer, S. E., Bernstein, E., Sijen, T., Hannon, G. J., Plasterk, R. H. Dicer functions in RNA interference and in synthesis of small RNA involved in developmental timing in C. elegans. Genes & development. 15 (20), 2654-2659 (2001).
- Agrawal, N., Dasaradhi, P. V. N., Mohmmed, A., Malhotra, P., Bhatnagar, R. K., Mukherjee, S. K. RNA interference: biology, mechanism, and applications. Microbiology and molecular biology reviews : MMBR. 67 (4), 657-685 (2003).
- Martinez, J., Patkaniowska, A., Urlaub, H., Lührmann, R., Tuschl, T. Single-stranded antisense siRNAs guide target RNA cleavage in RNAi. Cell. 110 (5), 563-574 (2002).
- Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116 (2), 281-297 (2004).
- Timmons, L., Fire, A. Specific interference by ingested dsRNA. Nature. 395 (6705), 854 (1998).
- Clemens, J. C., Worby, C. A., et al. Use of double-stranded RNA interference in Drosophila cell lines to dissect signal transduction pathways. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (12), 6499-6503 (2000).
- Saleh, M. C., van Rij, R. P., et al. The endocytic pathway mediates cell entry of dsRNA to induce RNAi silencing. Nature cell biology. 8 (8), 793-802 (2006).
- Amdam, G. V., Simões, Z. L. P., Guidugli, K. R., Norberg, K., Omholt, S. W. Disruption of vitellogenin gene function in adult honeybees by intra-abdominal injection of double-stranded RNA. BMC biotechnology. 3, 1 (2003).
- Whyard, S., Singh, A. D., Wong, S. Ingested double-stranded RNAs can act as species-specific insecticides. Insect biochemistry and molecular biology. 39 (11), 824-832 (2009).
- Huvenne, H., Smagghe, G. Mechanisms of dsRNA uptake in insects and potential of RNAi for pest control: a review. Journal of Insect Physiology. 56 (3), 227-235 (2010).
- Fire, A., Xu, S., Montgomery, M. K., Kostas, S. A., Driver, S. E., Mello, C. C. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).
- Kennerdell, J. R., Carthew, R. W. Use of dsRNA-mediated genetic interference to demonstrate that frizzled and frizzled 2 act in the wingless pathway. Cell. 95 (7), 1017-1026 (1998).
- Gatehouse, H. S., Gatehouse, L. N., Malone, L. A. Amylase activity in honey bee hypopharyngeal glands reduced by RNA interference. Journal of Apicultural. , (2004).
- Jaubert-Possamai, S., Le Trionnaire, G., Bonhomme, J., Christophides, G. K., Rispe, C., Tagu, D. Gene knockdown by RNAi in the pea aphid Acyrthosiphon pisum. BMC biotechnology. 7, 63 (2007).
- Martín, D., Maestro, O., Cruz, J., Mané-Padrós, D., Bellés, X. RNAi studies reveal a conserved role for RXR in molting in the cockroach Blattella germanica. Journal of Insect Physiology. 52 (4), 410-416 (2006).
- Bansal, R., Mittapelly, P., Chen, Y., Mamidala, P., Zhao, C., Michel, A. Quantitative RT-PCR Gene Evaluation and RNA Interference in the Brown Marmorated Stink Bug. PloS one. 11 (5), e0152730 (2016).
- Terenius, O., Papanicolaou, A., et al. RNA interference in Lepidoptera: an overview of successful and unsuccessful studies and implications for experimental design. Journal of Insect Physiology. 57 (2), 231-245 (2011).
- Sparks, M. E., Shelby, K. S., Kuhar, D., Gundersen-Rindal, D. E. Transcriptome of the Invasive Brown Marmorated Stink Bug, Halyomorpha halys (Stål) (Heteroptera: Pentatomidae). PloS one. 9 (11), e111646 (2014).
- Tabara, H., Grishok, A., Mello, C. C. RNAi in C. elegans: soaking in the genome sequence. Science (New York, N.Y.). 282 (5388), 430-431 (1998).
- Baum, J. A., Roberts, J. K. Chapter Five - Progress Towards RNAi-Mediated Insect Pest Management. Insect Midgut and Insecticidal Proteins. 47, 249-295 (2014).
- Walshe, D. P., Lehane, S. M., Lehane, M. J., Haines, L. R. Prolonged gene knockdown in the tsetse fly Glossina by feeding double stranded RNA. Insect Molecular Biology. 18 (1), 11-19 (2009).
- Turner, C. T., Davy, M. W., MacDiarmid, R. M., Plummer, K. M., Birch, N. P., Newcomb, R. D. RNA interference in the light brown apple moth, Epiphyas postvittana (Walker) induced by double-stranded RNA feeding. Insect Molecular Biology. 15 (3), 383-391 (2006).
- Bautista, M. A. M., Miyata, T., Miura, K., Tanaka, T. RNA interference-mediated knockdown of a cytochrome P450, CYP6BG1, from the diamondback moth, Plutella xylostella, reduces larval resistance to permethrin. Insect biochemistry and molecular biology. 39 (1), 38-46 (2009).
- Maori, E., Paldi, N., et al. IAPV, a bee-affecting virus associated with Colony Collapse Disorder can be silenced by dsRNA ingestion. Insect Molecular Biology. 18 (1), 55-60 (2009).
- Hunter, W., Ellis, J., Hayes, J., Westervelt, D., Glick, E. Large-scale field application of RNAi technology reducing Israeli acute paralysis virus disease in honey bees (Apis mellifera, Hymenoptera: Apidae). PLoS Pathogens. 6 (12), e1001160 (2010).
- Christiaens, O., Smagghe, G. The challenge of RNAi-mediated control of hemipterans. Current Opinion in Insect Science. 6, 15-21 (2014).
- Hunter, W. B., Hail, D., Tipping, C., Paldi, N. RNA interference to reduce sharpshooters, the glassy-winged sharpshooter, and the Asian citrus psyllid. Symposium. , 24-27 (2010).
- Hunter, W. B., Glick, E., Paldi, N., Bextine, B. R. Advances in RNA interference: dsRNA treatment in trees and grapevines for insect pest suppression. Southwestern Entomologist. , (2012).
- Hail, D. A., Dowd, S., Hunter, W. H., Bextine, B. R. Investigating the transcriptome of the potato psyllid (Bactericera cockerelli): toward an RNAi based management strategy. Proceed. 10th Annual Zebra Chip Reporting Session, San Antonio TX, , 183-186 (2010).
- de Andrade, E. C., Hunter, W. B. RNA Interference-Natural Gene-Based Technology for Highly Specific Pest Control (HiSPeC). RNA INTERFERENCE. , (2016).
- Taning, C. N. T., Andrade, E. C., Hunter, W. B., Christiaens, O., Smagghe, G. Asian Citrus Psyllid RNAi Pathway - RNAi evidence. Scientific reports. 6, 38082 (2016).
- Andrade, E. C., Hunter, W. B. RNAi feeding bioassay: development of a non-transgenic approach to control Asian citrus psyllid and other hemipterans. Entomologia Experimentalis et Applicata. 162 (3), 389-396 (2017).
- Joga, M. R., Zotti, M. J., Smagghe, G., Christiaens, O. RNAi Efficiency, Systemic Properties, and Novel Delivery Methods for Pest Insect Control: What We Know So Far. Frontiers in physiology. 7, 553 (2016).
- Zhang, X., Zhang, J., Zhu, K. Y. Chitosan/double-stranded RNA nanoparticle-mediated RNA interference to silence chitin synthase genes through larval feeding in the African malaria mosquito (Anopheles gambiae). Insect Molecular Biology. 19 (5), 683-693 (2010).
- Li-Byarlay, H., Li, Y., et al. RNA interference knockdown of DNA methyl-transferase 3 affects gene alternative splicing in the honey bee. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (31), 12750-12755 (2013).
- Das, S., Debnath, N., Cui, Y., Unrine, J., Palli, S. R. Chitosan, Carbon Quantum Dot, and Silica Nanoparticle Mediated dsRNA Delivery for Gene Silencing in Aedes aegypti: A Comparative Analysis. ACS applied materials & interfaces. 7 (35), 19530-19535 (2015).
- Nimesh, S. Recent patents in siRNA delivery employing nanoparticles as delivery vectors. Recent patents on DNA & gene sequences. 6 (2), 91-97 (2012).
- Draz, M. S., Fang, B. A., et al. Nanoparticle-mediated systemic delivery of siRNA for treatment of cancers and viral infections. Theranostics. 4 (9), 872-892 (2014).
- Swevers, L., Raikhel, A. S., Sappington, T. W. Vitellogenesis and post-vitellogenic maturation of the insect ovarian follicle. Comprehensive. , (2005).
- Tufail, M., Takeda, M. Molecular characteristics of insect vitellogenins. Journal of Insect Physiology. 54 (12), 1447-1458 (2008).
- Hagedorn, H. H., Kunkel, J. G. Vitellogenin and vitellin in insects. Annual review of entomology. , (1979).
- Brandt, B. W., Zwaan, B. J., Beekman, M. Shuttling between species for pathways of lifespan regulation: a central role for the vitellogenin gene family? Bioessays. , (2005).
- Murphy, C. T., McCarroll, S. A., et al. Genes that act downstream of DAF-16 to influence the lifespan of Caenorhabditis elegans. Nature. 424 (6946), 277-283 (2003).
- Shinoda, T., Itoyama, K. Juvenile hormone acid methyltransferase: a key regulatory enzyme for insect metamorphosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (21), 11986-11991 (2003).
- Bellés, X. Beyond Drosophila: RNAi in vivo and functional genomics in insects. Annual review of entomology. 55, 111-128 (2010).
- Nouzova, M., Edwards, M. J., Mayoral, J. G., Noriega, F. G. A coordinated expression of biosynthetic enzymes controls the flux of juvenile hormone precursors in the corpora allata of mosquitoes. Insect biochemistry and molecular biology. 41 (9), 660-669 (2011).
- Huang, J., Marchal, E., Hult, E. F., Tobe, S. S. Characterization of the juvenile hormone pathway in the viviparous cockroach, Diploptera punctata. PloS one. 10 (2), e0117291 (2015).
- Ghosh, S. K. B., Hunter, W. B., Park, A. L., Gundersen-Rindal, D. E. Double strand RNA delivery system for plant-sap-feeding insects. PloS one. 12 (2), e0171861 (2017).
- Khrimian, A., Zhang, A., et al. Discovery of the aggregation pheromone of the brown marmorated stink bug (Halyomorpha halys) through the creation of stereoisomeric libraries of 1-bisabolen-3-ols. Journal of natural products. 77 (7), 1708-1717 (2014).
- Hall, D. G., Richardson, M. L., El-Desouky, A., Halbert, S. E. Asian citrus psyllid, Diaphorina citri, vector of citrus huanglongbing disease. Entomologia Experimentalis et Applicata. 146 (2), 207-223 (2012).
- Murphy, K. A., Tabuloc, C. A., Cervantes, K. R., Chiu, J. C. Ingestion of genetically modified yeast symbiont reduces fitness of an insect pest via RNA interference. Scientific reports. 6, 22587 (2016).
- San Miguel,, K,, Scott, J. G. The next generation of insecticides: dsRNA is stable as a foliar-applied insecticide. Pest management science. 72 (4), 801-809 (2016).
- Li, H., Guan, R., Guo, H., Miao, X. New insights into an RNAi approach for plant defence against piercing-sucking and stem-borer insect pests. Plant, cell & environment. 38 (11), 2277-2285 (2015).
- Hull, D., Timmons, L. Methods for delivery of double-stranded RNA into Caenorhabditis elegans. Methods in molecular biology (Clifton, N.J.). 265, 23-58 (2004).
- Timmons, L., Court, D. L., Fire, A. Ingestion of bacterially expressed dsRNAs can produce specific and potent genetic interference in Caenorhabditis elegans. Gene. 263 (1-2), 103-112 (2001).
- Burand, J. P., Hunter, W. B.
- Rodrigues, T. B., Figueira, A. Management of Insect Pest by RNAi-A New Tool for Crop Protection. , (2016).
- Baumann, A. M. T., Bakkers, M. J. G., et al. 9-O-Acetylation of sialic acids is catalysed by CASD1 via a covalent acetyl-enzyme intermediate. Nature communications. 6, 7673 (2015).
- Araujo, R. N., Santos, A., Pinto, F. S., Gontijo, N. F., Lehane, M. J., Pereira, M. H. RNA interference of the salivary gland nitrophorin 2 in the triatomine bug Rhodnius prolixus (Hemiptera: Reduviidae) by dsRNA ingestion or injection. Insect biochemistry and molecular biology. 36 (9), 683-693 (2006).
- Wuriyanghan, H., Rosa, C., Falk, B. W. Oral Delivery of Double-Stranded RNAs and siRNAs Induces RNAi Effects in the Potato/Tomato Psyllid, Bactericerca cockerelli. PloS one. 6 (11), e27736 (2011).
- Kamath, R. S., Ahringer, J. Genome-wide RNAi screening in Caenorhabditis elegans. Methods (San Diego, Calif). 30 (4), 313-321 (2003).
- Yu, N., Christiaens, O., et al. Delivery of dsRNA for RNAi in insects: an overview and future directions). Insect Science. , (2012).
- Allen, M. L., Walker, W. B. Saliva of Lygus lineolaris digests double stranded ribonucleic acids. Journal of Insect Physiology. 58 (3), 391-396 (2012).
- Wynant, N., Santos, D., Verdonck, R., Spit, J., Van Wielendaele, P., Vanden Broeck, J. Identification, functional characterization and phylogenetic analysis of double stranded RNA degrading enzymes present in the gut of the desert locust, Schistocerca gregaria. Insect biochemistry and molecular biology. 46, 1-8 (2014).
- Ghosh, S. K. B., Gundersen-Rindal, D. E. Double strand RNA-mediated RNA interference through feeding in larval gypsy moth, Lymantria dispar (Lepidoptera: Erebidae). European Journal of Entomology. 114, 170-178 (2017).
- Baigude, H., Rana, T. M. Delivery of therapeutic RNAi by nanovehicles. Chembiochem : a European journal of chemical biology. 10 (15), 2449-2454 (2009).
- Mitter, N., Worrall, E. A., et al. Clay nanosheets for topical delivery of RNAi for sustained protection against plant viruses. Nature plants. 3, 16207 (2017).
- Dubelman, S., Fischer, J., et al. Environmental fate of double-stranded RNA in agricultural soils. PloS one. 9 (3), e93155 (2014).
- Kola, V. S. R., Renuka, P., Madhav, M. S., Mangrauthia, S. K. Key enzymes and proteins of crop insects as candidate for RNAi based gene silencing. Frontiers in physiology. 6, 119 (2015).
