Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

דור של תאי אפיתל באף אדם Spheroids למחקר הרגולטור מוליכות Transmembrane תגובותיהם סיסטיק פיברוזיס

Published: April 11, 2018 doi: 10.3791/57492
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Pediatrics, Division of Pulmonary Medicine, Cincinnati Children's Hospital Medical Center

Summary

כאן אנו מתארים שיטה להפקת ספרואיד תלת מימדי התרבויות של תאי אפיתל באף אדם. Spheroids הם גירוי ואז לנהוג סיסטיק פיברוזיס Transmembrane מוליכות הרגולטור (CFTR)-יון התלויים, הפרשת נוזלים, לכימות בשינוי הגודל luminal ספרואיד כמדד עבור פונקציה CFTR.

Abstract

בזמן כניסתה של סיסטיק פיברוזיס Transmembrane מוליכות הרגולטור (CFTR) אפנן סמים יש מהפכה טיפול ב סיסטיק פיברוזיס (CF), המודל טיפול מכוון גנוטיפ הנמצאות כעת בשימוש יש מספר מגבלות. המוטציה הראשונה, נדיר או understudied קבוצות לא יכללו מניסויים קליניים סופית. יתר על כן, כמו סמים אפנן נוספים להיכנס לשוק, יהפוך קשה למטב את הבחירות אפנן עבור נושא בודדים. שתי בעיות אלו מטופלות עם השימוש של מערכות נגזר החולה, תגובותיהם דגם פרה CFTR פונקציה, אפנון. תאי אפיתל באף אדם (HNEs) הם מקור נגיש בקלות של רקמות הנשימה מודל כזה. במסמך זה, אנו מתארים את הדור של מודל תלת מימדי ספרואיד של CFTR ותפקוד אפנון באמצעות HNEs הראשי. HNEs מבודדים מן הנבדקים בצורה פולשנית, מותנה בתנאי התיכנות, ושדרות נזרע לתוך התרבות ספרואיד. בתוך 2 שבועות של זריעה, ספרואיד תרבויות ליצור spheroids HNE זה יכול להיות מגורה עם 3', אדנוזין 5'-מחזורית monophosphate (מחנה)-יצירת אגוניסטים כדי להפעיל פונקציה CFTR. ספרואיד נפיחות לאחר מכן לכמת כמדד לפעילות CFTR. HNE spheroids לנצל מקור פולשנית, עדיין הנשימה לתאי האף כדי ליצור מודל נגיש, אישית הרלוונטיים האפיתל המשקף המחלה התחלואה והתמותה. לעומת התרבויות HNE אוויר נוזלי ממשק, spheroids הם מהיר יחסית להבשיל, אשר מפחית את שיעור הזיהום הכולל. במתכונתה הנוכחית, הדגם הוא מוגבל על ידי תפוקה נמוכה, למרות זה קוזז על ידי הקלות היחסית רקמות רכישה. HNE spheroids יכול לשמש כדי לכמת באופן אמין ולאפיין CFTR פעילות ברמת הפרט. לימוד מתמשך לקשור את כימות ויוו סמים לתגובה יקבע אם HNE spheroids הם מנבא פרה אמיתי של המטופל בתגובה CFTR אפנון.

Introduction

סיסטיק פיברוזיס (CF) היא מחלה רצסיבי קטלנית, אוטוזומלית משפיע על יותר מ 70,000 אנשים ברחבי העולם1. זו מחלה גנטית של החיים-לקיצור נגרמת על ידי מוטציות בגן מוליכות Transmembrane סיסטיק פיברוזיס הרגולטור חלבון (CFTR)2. CFTR הוא חבר של המשפחה קלטת אדנוזין טריפוספט מחייב, וכן פונקציות כערוץ יון המאפשר תנועה של ביקרבונט הכלוריד על פני הממברנות הפסגה של epithelia מקוטב מרובים כולל של מערכת העיכול, בלוטות זיעה, מערכת הנשימה עץ, בין היתר3,4. ככזה, CFTR לקוי מוביל מכשל בתפקוד אפיתל, עם רוב תמותת הנובעות מחלות נשימה1. CF בריאה, אובדן של דרכי הנשימה מונחה-CFTR משטח נוזלי (ASL) תקנה, ריר שחרור מוביל ריר מעובה, חסימה בדרכי הנשימה, דלקת כרונית, ו שיפוץ דרכי הנשימה מתקדמת ואובדן של הריאה פונקציה1,5.

למרות הזיהוי של תפקוד CFTR סיבת המחלה, טיפולים ב- CF התמקדו באופן מסורתי להפחתת התסמינים (למשל, טיפול בתחליפי האנזים בלבלב, דרכי הנשימה סיווג טיפולים)1. גישה זו הייתה מהפכה לאחרונה על ידי הופעתו של הריפוי, כינה "CFTR מאפננים," שמכוון ישירות CFTR לקוי. גישה זו עברה הנוף קליני של ניהול סימפטום למחלות שינוי מעניין אבל נושאת מספר מגבלות6,7,8,9,10. פעילות אפנן היא ספציפית הפגם חלבון המלווה כל מוטציה CFTR מוגבל לבחירת אוכלוסיות גנטי11. מגבלה זו מונעת על ידי הטבע הטרוגנית של חלבון פגמים, אלא גם את טענותיהם של ניסויים קליניים בקבוצות מוטציה נדירה. בנוסף, בין נושאים עם למד היטב אחרים (למשל, F508del/F508del CFTR, המוטציה CFTR הנפוץ ביותר), יש השתנות רחב במחלת נטל, אפנן תגובה6,7,8 9, ,11.

כדי להתגבר על שתי בעיות אלו, חוקרים הציעו את השימוש הדגמים מותאמים אישית עבור בדיקה פרה12. המושג הזה מנצל החולה הספציפי רקמות כדי ליצור מערכת מודל בפעוט שמחוץ בדיקה מורכבת, חיזוי ויוו נושא התגובה לטיפולים בצורה אישית. לאחר האימות, מודל כזה יכול לשמש על ידי רופאים לטיפול דיוק נסיעה בין גנוטיפ CFTR הבסיסית של המטופל.

האדם הסימפונות (HBE) בתאי אפיתל המתקבל explant רקמות בזמנו של השתלת הריאות הקים את האפשרות של כזה דגם CF13,14. HBEs גדל ממשק אוויר נוזלי (עלי) מאפשרים פונקציונלי כימות CFTR ישירות באמצעות בדיקות electrophysiologic או בעקיפין באמצעות מדדי ASL הומאוסטזיס13,15. מודל זה כבר קריטי להבנת CFTR בביולוגיה, היה נהג מפתח בהתפתחות CFTR מאפננים16. למרבה הצער, מודלים HBE אינם בביאולוגיה כמודל אישית בשל העיקרון החודרני של רכישה (השתלת הריאות או צחצוח הסמפונות) וחוסר דוגמאות עבור אלה עם מוטציות נדירות או מחלה קלה. לעומת זאת, רקמת המעי, המתקבל דגימות ביופסיה רקטאלית או תריסריון, ניתן למדידה הנוכחי מעיים (ICM) או assay תא צורב מבוסס-נפיחות ללמוד בפעוט CFTR פונקציה17,18, 19. מבחני תא צורב, בפרט, הם מאוד רגישים דגמי CFTR פעילות20,21,22. שני הדגמים מוגבלים על ידי מקור רקמות (רקמת המעי, אמנם רוב המחלה פתולוגיה במערכת הנשימה) ושיטת רכישת פולשנית למחצה. לחלופין, מספר חוקרים חקרו האנושי האף (HNE) תאים אפיתל דגם CFTR שיקום23,24,25. HNEs ניתן לקצור בבטחה על ידי מברשת או גרידה נושאים בכל גיל, כאשר תרבותי ב עלי, לסכם מאפיינים רבים של HBEs25,26,27,28. HNE חד שכבתי תרבויות באופן מסורתי הייתה מוגבלת על-ידי שינוי קשקשיים, הרבה זמן הפירעון29. יתר על כן, דיווח קצר מידות הנוכחי HNEs הם קטנים יותר מאלו HBEs, רומז חלון קטן יותר כדי לזהות יעילות טיפולית25.

בהתחשב בצורך מודל תרביות רקמה אישית, לא פולשנית, הנשימה של הפונקציה CFTR, חיפשנו למזג את רגישות assay תא צורב מבוסס-נפיחות, עם אופי פולשני, מערכת הנשימה HNEs. כאן, אנו מתארים את השיטה שלנו של יצירת תלת-ממדי "ספרואיד" תרבויות HNEs למחקר CFTR תגובותיהם ב- מבוסס-נפיחות assay30. HNE spheroids polarize אמינה בעלת אפיתל לכיוון מרכז כדור, או לומן. מודל זה recapitulates מאפיינים רבים אפיתל בדרכי הנשימה התחתונה, מתפתח במהירות רבה יותר מאשר עלי תרבויות. כמו assay פונקציונלי, HNE spheroids לכמת באופן אמין עם טווח של CFTR פונקציה, וכן אפנון בקבוצות מוטציה למד היטב (למשל, F508del CFTR). זה וזמינותו המבוסס על נפיחות יהפוך לרישית על מאפייני התחבורה יון/מלח CFTR, בעקיפין מדידת זרם נוזלים לתוך ספרואיד המים כדלקמן בזרימת מלח הפסגה. בצורה כזאת, spheroids מגורה עם CFTR המתפקד במלואו להתנפח robustly, בעוד אלה עם תפקוד לקוי CFTR להתנפח פחות או לכווץ. זה הוא לכמת באמצעות ניתוח תמונות של טרום ושנה 1 h פוסט-גירוי spheroids, מדידת שטח luminal וקביעת האחוזים. אמצעי זה ניתן להשוות אז קבוצות ניסיוני עבור סמים אתריים באופן ספציפי לחולה מסך.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

דוגמאות HNE היו שהשגת נושאים גייס דרך לילדים בסינסינטי החולים מרכז רפואי CF מרכז המחקר. כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי המוסדיים סקירה לוח (IRB) של המרכז הרפואי של בית החולים לילדים בסינסינטי. הסכמה בכתב היה המתקבלים בכל המקצועות לפני בדיקה.

1. מכינים הרחבה מדיה ומדיה לאנטיביוטיקה

  1. אוסף רכיבי מדיה המפורטים בטבלה1. הפשרת חומרים קפואים בטמפרטורת החדר ולהפוך פתרונות מניות הכרחי כמצוין בטבלה 1 תחת "הרחבת מדיה".
    הערה: נקוט משנה זהירות בעת טיפול רעלן כולרה, שהוא רעיל אם בולעים אותם, הוא עור, עיניים, מגרה בדרכי הנשימה. להפוך ולשלב פתרונות וכל מדיה בתנאים נקיים באבטחה הקבינט.
  2. באמצעות פיפטה serologic 50 מ ל, להסיר ולמחוק 50 מ של בסיס בינוני (Dulbecco ששינה נשר בינוני/F12) של מיכל אחד כדי לפצות על התוספת של חומרים אחרים. שופכים את כל המדיה הבסיס בעבודת יד לתוך בקבוק זכוכית בלוק 1 ליטר.
  3. באמצעות פיפטה serologic 50 מ ל או פיפטה 1 מ"ל המתאימים, להעביר כל הרכיבים הנותרים בחלק"התרחבות המדיה"של טבלה 1 לתוך בקבוק הזכוכית בלוק המכיל את המדיה. מערבולת בעדינות את הבקבוק ביד כדי לערבב.
  4. מדיה לסנן לתוך טרי, עקר 1 ליטר, מיקרומטר 0.22 polyethersulfone (פסי) לסנן את הבקבוק באמצעות הוראות היצרן ומפרשות עם "התרחבות המדיה" והתאריך.
  5. להכין מדיה לאנטיביוטיקה. להפוך את הצורך פתרונות מניות אנטיביוטי כמצוין בטבלה 1 תחת "מדיה לאנטיביוטיקה."
    1. באמצעות פיפטה סרולוגית 50 מ ל, העברה 150 מ ל מדיה הרחבה לבקבוק זכוכית בלוק טריים 250 מ.
    2. באמצעות פיפטה של 1 מ"ל, להוסיף כל הרכיבים בחלק"מדיה לאנטיביוטיקה"של טבלה 1 לתוך בקבוק הזכוכית בלוק המכיל את המדיה. מערבולת ידנית לערבב עד התקשורת יהיה אחיד במראה.
    3. מדיית סינון לתוך טרי, סטרילי 250 מל ', 0.22 מיקרומטר PES מסנן הבקבוק באמצעות הוראות היצרן, ביאור עם "אנטיביוטיקה" ומדיה תאריך.
  6. לאחסן מדיה ב 4 ° C עד לחודש, השמטת אם מעונן, רומז זיהום.

2. מכינים בידול מדיה

  1. אוסף רכיבי מדיה המפורטים בטבלה מס ' 2. הפשרת חומרים קפואים בטמפרטורת החדר ולהפוך פתרונות מניות הכרחי כמצוין בטבלה מס ' 2.
    הערה: נקוט זהירות בעת טיפול חומצה retinoic, אשר הוא רעלן הרבייה, יכול להיות רעיל אם בלע, וגורמת לגירוי העור. להפוך, aliquot, ולשלב את כל פתרונות ומדיה בתנאים נקיים באבטחה הקבינט.
  2. להסיר ולמחוק 52 מ של המדיום הבסיס של מיכל אחד כדי לפצות על התוספת של חומרים אחרים. שופכים את כל המדיה הבסיס לתוך בקבוק זכוכית בלוק 1 ליטר.
  3. באמצעות פיפטה סרולוגית 25 מ ל או פיפטה 1-mL לפי הצורך, להעביר כל הרכיבים הנותרים בטבלה 2 בקבוק הזכוכית בלוק המכיל התקשורת ו מערבולת בעדינות ביד לערבב.
  4. מדיה לסנן לתוך טרי, עקר 1 ליטר, מיקרומטר 0.22 polyethersulfone (פסי) לסנן את הבקבוק באמצעות הוראות היצרן ומפרשות עם "בידול מדיה" והתאריך.
  5. לאחסן מדיה ב 4 ° C עד לחודש, השמטת אם מעונן, רומז זיהום.

3. המעיל תרבות מנות לוח Fibroblasts מזין

הערה: ביצוע כל הצעדים בתנאים נקיים אבטחה בארון.

  1. מערבבים 0.5 מ"ל של קולגן מניות ו- 37.5 מ ל מים סטריליים צינור חרוטי 50 מ.
  2. פיפטה מ ל 4-5 של קולגן פתרון לתוך כל מנה תרבות P100 נקי, הבטחת שהשטח כולו מכוסה.
  3. מכסה מנות בשלמותם, דגירה בין לילה-CO 37 ° C ו-5%2.
  4. ב אבטחה הקבינט, להסיר כל מאכל העפעפיים. מערבולת פתרון מכסים הכלי, ולאחר מכן מחוק לגמרי.
  5. לחטא בחשיפה לאור אולטרה סגול (UV) אור ה' 1 מקום העפעפיים בחזרה על המנות, מנות מחסנית ומכסים ברדיד אלומיניום.
  6. חנות מצופה מנות ב 4 מעלות צלזיוס במשך 3-6 חודשים, לחיטוי מחדש תחת UV אור 15-30 דקות לפני השימוש התרבות תאים.
  7. 24 שעות לפני קבלת מדגם HNE, לעקר מאכל מצופה מראש ותווית כמו העכבר מתחלקים פיברובלסט (MEF) ואת התאריך.
  8. הוסף התקשורת הרחבה לכיסוי לצלחת (כ- 5 מ"ל) עם פיפטה serologic.
  9. הפשרה בקבוקון 2 x 106 מוקרן MEFs ב waterbath 37 ° C. ברגע MEFs הם הקרת, להוסיף חצי של הבקבוקון (כ 106 תאים) המנה עם פיפטה 1-mL, מתערבל ביד כדי לפזר.
  10. דגירה-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 בן לילה כהכנה HNE תרבות.
    הערה: אם נחוץ, הצעדים 3.7-3.10 יכול להיות הופיעה מאוחר ככל 60 דקות לפני ציפוי תאים, אבל בן לילה הוא אידיאלי.

4. לקבל ולעבד מדגם HNE

  1. ודא שאושרו על-ידי IRB הסכמה/סילוק מתקבל על כל הנושאים.
  2. יש אף מכה החולה כדי לנקות את הריר רופף.
  3. הצג באופן חזותי נחות turbinate משתמש של rhinoscope. להבטיח אין נגעים או פוליפים הם המתנה שאת עשויה למנוע איסוף הדגימה.
  4. לאסוף תאים האף בנחיר הראשון על ידי גרידה או צחצוח.
    1. גרידה: עיקול מגרד-האמצע שלה כדי ליצור קלה, ~ 135° זווית בעלת מן הכוס מגרד. הכנס את מגרד לתוך הנחיר ולקדם בגביע מגרד מתחת turbinate נחותים. הקש את גביע מגרד נגד נחותים turbinate ובעדינות לגרד את turbinate על ידי משיכת מגרד את קדימה, חוזר 3 - 4 פעמים בסך הכל.
    2. מברשת: מעבר ציטולוגיה מברשת מתחת נחותים turbinate, ואז לסובב ולהזיז המברשת פנימה והחוצה מעט 4 - 5 פעמים, מבלי לצאת הנחיר.
  5. המקום מגרד/מברשת ב 15 מ"ל חרוט ממולא מדיה לאנטיביוטיקה. חזור על הצעדים 4.3-4.4 בנחיר השני, הצבת מגרד/המברשת לתוך הצינור חרוט אותו.
  6. חנות חרוט על הקרח עד מוכן לעיבוד. ודא כי העיבוד מתבצע בתוך 4 שעות רכישת המדגם אבל יכול להתרחש מאוחר ככל 24 שעות לאחר הרכישה במידת הצורך.

5. תהליך ולהרחיב את התאים HNE במנות

הערה: ביצוע כל הצעדים בתנאים נקיים אבטחה בארון.

  1. באמצעות פיפטה 1-mL מדיה מדגם חרוט, לשטוף כל התאים מחוץ curettes/ציטולוגיה מברשות לתוך הצינור חרוט אותו. ברגע נקי, למחוק curettes / מברשות.
  2. צנטריפוגה חרוט ב 360 x g ו- 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
  3. תגובת שיקוע וביופסיה, דואגת שלא להפריע בגדר התא.
  4. מחדש להשעות בגדר תא ב- 3 מ"ל של פתרון ניתוק התא, pipetting עם טיפ 1 מ"ל כדי homogenize את התערובת.
  5. צנטריפוגה חרוט ב 360 x g ו- 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
  6. חזור על שלבים 5.3-5.5 פעם אחת.
  7. האחות תגובת שיקוע הנותרים, דואגת שלא להפריע בגדר התא.
  8. מחדש להשעות את צניפה ב 1 מ"ל ספירת תאים עם hemocytometer ומדיה לאנטיביוטיקה.
  9. באמצעות פיפטה של 1-mL, צלחת תאים dropwise לתוך קערה מצופה, נזרע פיברובלסט מוכן בשלב 3.10. הוסף מדיה אנטיביוטי מלא מכסים את הכלי, לפזר את התאים על פני השטח. תווית תבשיל עם התוכן ותאריך, דגירה-CO 37 ° C ו-5%2.
  10. לאחר 48 שעות, ודא כי התאים מחוברים לצלחת תרבות. האחות התקשורת והחלף מדיה לאנטיביוטיקה טריים מספיק כדי לכסות את הצלחת.
  11. לשנות מדיה 3 x שבועי, כ רפה בעברית המדיה הישנה עם קו ואקום, פסטר פיפטה, החלפת מדיה טריים מספיק כדי לכסות את הצלחת. לאחר 5 ימים במדיה לאנטיביוטיקה, לשנות את המדיה במדיה הרחבה, ממשיכים להחליף שלוש פעמים בשבוע.
    הערה: זיהום הסיכון הוא גבוה בשבוע הראשון של תרבות. לשמור דגימות טריות מגשים נפרדים כדי למזער את הסיכון של זיהום צולב.
  12. בדוק את צמיחת תאים מספר פעמים בשבוע. לאחר תאים כ 70-80% confluent, להמשיך מעבר תאים.

6. מעבר HNE תאים

  1. להכין פתרון טריפסין 0.1% חומצה ethylenediaminetetraacetic (EDTA).
    הערה: לנקוט זהירות בטיפול טריפסין, אשר הוא העור, מערכת הנשימה, ו עין מגרה.
    1. שוקל 15 מ ג של טריפסין מהלבלב חזירי צינור חרוטי.
    2. שוקל 56 מ"ג של EDTA צינור חרוטי נפרדים.
    3. בארון אבטחה, להעביר טריפסין, EDTA לתוך בקבוק זכוכית בלוק 250 מ. להשתמש aliquot קטן של מלח סטרילית באגירה פוספט (PBS) כדי לשטוף את הצינורות טריפסין/EDTA כדי להבטיח להשלים את ההעברה.
    4. הוסף PBS סטרילי כדי להביא את הפתרון הכולל 150 מ. סגור את מכסה הדוק.
    5. דגירה טריפסין פתרון waterbath 37 ° C עד התפרקה לחלוטין. בדוק כל 15 דקות ולהסיר מיד פעם התפרקה.
      הערה: אל תשאירו לא מסומן לתקופות ממושכות של זמן (למשל, בין לילה), כמו טריפסין בפתרון denature אם מחוממים במשך זמן רב מדי.
    6. לנקות את הבקבוק עם 2-3 תרסיסים של 70% אתנול וחוזרים אבטחה הקבינט.
    7. לסנן 0.1% טריפסין-EDTA פתרון לתוך רעננה, סטרילי 250 מל ', 0.22 מיקרומטר PES מסנן הבקבוק באמצעות הוראות היצרן, ביאור עם התוכן ותאריך.
    8. חנות טריפסין-EDTA פתרון ב 4 ° C עד לחודש, השמטת אם מעונן.
  2. להביא לטמפרטורת החדר למעלה מ-30 דקות נקיים עם 70% אתנול וביו -העברה אבטחה נקיים בארון בידול מדיה, פתרון טריפסין-EDTA 0.1% ו- PBS סטרילי.
  3. אבטחה הקבינט, להשתמש פסטר פיפטה ושורה ואקום כדי תשאף ולמחוק מדיה מקערה תרביות רקמה. לשטוף את הצלחת על-ידי הוספת, מתערבל וכ רפה בעברית 5 מ של PBS באמצעות פיפטה נקי סרולוגית.
  4. באמצעות פיפטה סרולוגית 5-mL, הוסף 5 מ של 0.1% טריפסין-EDTA פתרון למנה תרביות רקמה ולחזור החממה-CO של 37 ° C ו- 5%-2 למשך 5 דקות.
  5. דמיינו תאים במיקרוסקופ הפוך ב- X 4-10. בדוק התאים לנתק מתוך קערה, יתעגל, לצוף. טפח בעדינות את הצד של המנה תרבות לסלק תאים, ו/או תקופת דגירה מחדש של 5 דקות נוספות עד רוב התאים הם צמודי קרקע.
    הערה: קח זהירות כדי להסיר במהירות תאים פעם מנותקת המנה תרבות; חשיפה ממושכת 0.1% טריפסין-EDTA יפגום תא הכדאיות.
  6. באמצעות פיפטה סרולוגית 10 מ ל, הוסף 5 מ של התרחבות המדיה למנה ולאסוף כל התוכן נוזלי (סה כ 10 מ"ל) לתוך צינור חרוטי שכותרתו, סטרילי 50 מ.
  7. אם נותרו תאים חסיד לצלחת תרבות, חזור על השלבים 6.6 עד 6.4 שתי פעמים, איסוף התוכן בצינור חרוט אותו.
    1. אם נותרו תאים חסיד לצלחת תרבות אחרי שלושה סיבובים של חשיפה פתרון טריפסין, להשתמש במגרדת תא סטרילי בעדינות להסיר את השאר. לאחר גירוד המנה, לשטוף את המגרד תבשיל עם 5 מ של התרחבות המדיה ולאסוף בצינור חרוט שכותרתו זהה.
      הערה: אם passaging כדי spheroids, לשנות את הליך זה כדי לבצע trypsinization דיפרנציאלית. לאחר הוספת טריפסין פתרון (שלב 6.4.), בדוק את המנה לעתים קרובות עד fibroblasts יש תלושים (בדרך כלל 1-2 דקות), משאיר רק מצולע בתאי אפיתל המצורפת למנה. לאסוף, מניחים בצד זה supernatant, אשר יכול להיות passaged קדימה להרחבת. חזור על שלבים 6.4-6.6 באמצעות הפתרון זהה טריפסין, ולאסוף רק בתאי אפיתל הנותרים לתרבות ספרואיד.
  8. צנטריפוגה חרוט ב g x 360 עבור 5 דקות ו- 4 מעלות צלזיוס. האחות מדיה חרוט.
  9. Resuspend תא גלולה ב 1 מ"ל של הרחבה מדיה, ספירת תאים באמצעות של hemacytometer.
  10. ברגע לכמת, התאים ניתן לחלק במידת הצורך, גם passaged להעביר על גבי צלחת תרבות חדשה (כולל הכנה של פיברובלסט תרבות משותפת, שלב 3, וציפוי תאים עבור ההרחבה, צעדים 5.9-5.12) או תרבותי כמו spheroids (שלב 7).
    הערה: אם passaging לצלחת תרבות חדשה להרחבת, צפיפות זריעה של 0.5-1 × 106 תאים בצלחת P100 מומלץ.

7. זריעה תאים עבור HNE ספרואיד תרבויות

הערה: לבצע את כל ההליכים בשלב זה, מלבד צנטריפוגה, ב אבטחה נקיים בארון.

  1. הפשרת המטריקס קרום המרתף בקרח לפי הוראות היצרן (100 µL לכל ספרואיד טוב).
    הערה: לשקול ביצוע aliquots 500 µL סטרילי של המטריקס קרום המרתף על קבלה; סכום זה זרע לוח 4-טוב אחד.
  2. הפרד את המספר המתאים של תאים באופן שונה trypsinized, passaged (מתוך שלב 6.9) עבור ריכוז סופי של תאים 500,000 לכל מיליליטר המטריקס. לשימוש צלחת 4-ובכן, תאים 200,000. לאסוף צינור 1.5 מ.
  3. צנטריפוגה תערובת תא ומדיה ב g x 360 דקות 5-4 מעלות צלזיוס. לגמרי, אבל בזהירות תשאף וזורקים מדיה באמצעות פיפטה של 1 מ"ל, דואגת שלא להפריע בגדר התא.
  4. באמצעות טיפ פיפטה 1 מ"ל, להוסיף µL 100 לכל מתוכנן היטב של המטריקס קרום המרתף כדי הצינור 1.5 mL המכילות את התאים. שמור את הצינורית על קרח.
  5. פיפטה למעלה ולמטה כדי בזהירות, resuspend ביסודיות תאי המטריקס קרום המרתף. לזוז מהר להימנע התמצקות של המטריקס. להימנע לחלוטין ריקון קצהו פיפטה כדי להבטיח בועות אוויר לא הציג לתערובת מטריקס/תא.
  6. זרע 100 µL מטריקס aliquots לתוך כל טוב של צלחת תרבות IVF 4-. טוב.
    1. בעזרת זוג מספריים, לקצץ את מ מ 3-4 דיסטלי של קצה פיפטה 200 µL.
    2. משתמש הקצה החתוך, בזהירות פיפטה µL 100 של תערובת תא/מטריצה לתוך המרכז של כל טוב. פיפטה לאט, עם המטרה של הפיכת מטריצה יחיד "טיפה" במרכז של כל טוב. אל תפיל את צריכה להישאר כדורית, לא צריכים לגעת בצדדים של הבאר. בעת העברת את הצלחת, לעשות אז בזהירות כדי שלא להפריע למטופלים אלה טיפות.
    3. דגירה הטיפות מטריקס קרום המרתף-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 למשך 30 דקות, עד מוצק.
    4. בזהירות פיפטה 500 µL של בידול מדיה לתוך כל טוב, דואגת שלא להפריע הירידה מטריקס. ודא את מכסה רק של מדיה המטריקס להוריד ולהוסיף יותר במידת הצורך.

8. להבדיל ולומדים HNE Spheroids

  1. בעדינות באמצעות טיפ פיפטה 1 מ"ל, וארוקן את כל אמצעי התקשורת מן הבאר; הימנע כ רפה בעברית המטריקס, אשר spheroids בחלק הזה של המטריצה, למרות כל spheroids נשאר מאחור עשויים להישאר בר קיימא.
  2. באמצעות טיפ פיפטה טרי 1 מ"ל, להוסיף בעדינות µL 500 של בידול מדיה הבאר ברחבי המטריקס. לא לגעת את המטריקס. עם פיפטה ולהימנע מפריע הירידה מטריקס.
  3. לחזור spheroids החממה ב 37 oC ו- 5% CO2 לצמיחה מתמשכת. חזור על שלבים 8.1 8.3 עד שלוש פעמים בשבוע
  4. הערכת ספרואיד מורפולוגיה מדי יום תחת מיקרוסקופ הפוכה בגיל 20 X. Spheroids צריך ליצור בתוך 3-5 ימים של ציפוי, בשלה. תוך 10 ימים בערך.

9. pretreat, מעוררים, תמונה HNE Spheroids לניתוח

  1. Pretreat spheroids כרצונכם לפני הדמיה כמו שתואר לעיל30.
    הערה: עבור רעלני VX809, להוסיף 3 מיקרומטר של VX809 המדיה עבור 48-72 שעות לפני הדמיה. לערבב 1 µL 10 מ מ VX809 מניות (ראה טבלת חומרים) ב- 3.3 מ של מדיה זו ריכוז.
  2. שינוי אחד טוב של spheroids מ ל 1 של מדיות התמיינות טריים, כולל רעלני (שלבים 8.1-8.3) לפני הדמיה spheroids.
  3. להכין טרי גירוי פתרונות סמים (Forskolin, 3-איזובוטיל-1-methylxanthine [IBMX], VX770, ו- CFTR מעכב 172 [Inh172]) של מניות (ראה טבלת חומרים). עבור forskolin/IBMX, להוסיף 1 µL של כל מניה µL 98 סטרילי מים יחיד הנקרא צינור 1.5 מ. עבור VX770 ו- Inh172, להוסיף 1 µL של כל מניה µL 99 מים סטריליים צינורות נפרדת עם תוויות mL 1.5. להפוך את הנפח הכולל ומאפשר µL 50 של פתרון עבור נבדקה כל היטב. להכין פתרונות בתנאים סטריליים ב אבטחה הקבינט.
  4. להעביר את הצלחת ספרואיד תא incubated מוגדר כ- 37 מעלות צלזיוס ו- 5% CO2, רכוב על מיקרוסקופ הפוכה מצוידים תוכנה ללכידת תמונה אלקטרונית, שלב מכני עבור התאמה XY. הפעל את המיקרוסקופ, מצלמה, כמו גם הדמיה במחשב.
  5. לכידת תמונות בסיסית של spheroids אחד היטב.
    1. פתח את תוכנת לכידת תמונה (5.5 Slidebook על ההוראות שלהלן). לאחר שהופעל, לפתוח קובץ חדש על-ידי לחיצה על "קובץ" ולאחר מכן "חדש". בהתאם לקובץ בשם ולחץ על "שמור".
    2. בזהירות להסיר את המכסה צלחת תרבות, מרכז מטריקס טיפה מעל המטרה.
    3. מתחיל בחלק העליון של הטיפה מטריקס, להעביר ברשת כדי למצוא spheroids ב- 20 x הגדלה עם מיקרוסקופ העינית. פוקוס למעלה ולמטה כדי ללכוד לספרה בנקודה הרחבה שלה. להוסיף את המיקום של כל ספרואיד על המפה של הטיפה מטריקס לזהות מחדש לאחר דימות.
    4. התוכנה, לחץ על "לכידת התמונה". חשיפה, בחר "ידני" והזן 50 גב להבטיח אחרים הגדרות מתאימות (סל פקטור: 1 x 1, w: 512, ח': 512, X ו- Y היסט: 0). הזן שם מתאים עבור כל תמונה בתיבה "Name" (למשל, ספרואיד 1 בסיסית). לחץ על "התחל" כדי להציג תמונה בשידור חי, ו "שמור" כדי ללכוד תמונה בסיסית.
    5. חזור על צעדים 9.5.1-9.5.4 עד למספר המטרה, או מטריצה כל טיפה היא עם תמונה.
      הערה: קבוצה ההבדלים יכולים להתגלות עם כמה כמו 3-5 spheroids לכל תנאי, עם זאת, הוא הפך אצלנו כדי תמונה spheroids 10 או יותר לכל תנאי כדי להגדיל את כוח. השתנות וזמינותו היא הפגינו איור 2 בסעיף "נציג תוצאות", עם דוגמאות של 8-10 spheroids לכל נושא כדוגמה.
  6. לעורר spheroids.
    1. באמצעות פיפטה 200 µL, להוסיף 50 µL של הסם גירוי מתאים לתוך התקשורת בתוך הבאר, דואגת שלא להפריע את המטריקס.
      הערה: לאחר דילול 10-fold הזה (50 µL לתוך µL 500 של המדיה), ריכוז התרופה הסופית תהיה: forskolin 10 מיקרומטר, IBMX 100 מיקרומטר, VX770 1 מיקרומטר, Inh172 10 מיקרומטר.
    2. מחנה בלבד, הוסיפו forskolin רק/IBMX.
    3. מחנה + VX770, הוסיפו forskolin/IBMX קודם, ואז VX770 לאחר 2 דקות.
    4. תנאים עכבות, להוסיף Inh172 הראשונה, ואז forskolin/IBMX לאחר 2 דקות.
  7. מיד לאחר גירוי, לפקח ספרואיד נפיחות על ידי הדמיה timelapse לשעה. התוכנה, לחץ על "לכידת התמונה". לחץ על "Timelapse", והגדר את מרווח הזמן 30 s, עם משך של 60 דקות הזן שם מתאים ולחץ על "שמור" כדי להפעיל את timelapse.
    הערה: timelapse רגיל הוא ללכוד תמונות של ספרואיד יחיד כל 30 s כדי להבטיח וידאו באיכות גבוהה. לחלופין, לבצע לכידת התחתונה-הגדלה של הבאר כולה (למשל, 4 X), פחות תמונות שנלכדו במידת הצורך. אם שלב אוטומטיות, לבצע timelapse של כל spheroids באמצעות קואורדינטות מוגדרים מראש; אחרת, משתמשים timelapse של קבוצת משנה של spheroids כדי לספק סקירה איכותית של נפיחות, כדי להבטיח אין בעיות שיטתית להתעורר במהלך הדימות (למשל, מטריקס הניתוק מן הבאר).
  8. מיד עם סיומו של התמונה timelapse 1 h, ללכוד תמונות לאחר גירוי של כל spheroids (לכל שלב 9.5) באמצעות המפה שנוצר בשלב 9.5.3.
    1. עיין בתמונות גירוי מראש כדי להבטיח שאותו מישור המיקוד משמש עבור תמונות מעקב (איכות מוקד המקיף תאים, spheroids או פסולת במידה רבה לסייע לתהליך זה).
    2. שמור קבצים לביאור לזווג מהשלב 9.5.4 (למשל, גירוי שלאחר 1 ספרואיד).
      הערה: להשלים שלב זה מיד לאחר timelapse, כמו spheroids יכול להמשיך להתנפח.
  9. החלף המדיה הדמיה היטב עם מדיה בידול טריים.
  10. חזור על הצעדים 9.5 דרך 9.9 כל טוב/תנאי, התאמת תרופות גירוי כמצוין בתנאי הניסוי.
  11. ברגע דימות כל הושלם, לחזור spheroids החממה-CO 37 ° C ו-5%2.
    הערה: על בהתאם העקרות של התא מיקרוסקופ מתפשט, גירוי שלאחר זיהום של spheroids יכול להיות די נפוץ. לשמור spheroids שבעורך מגשים נפרדים, כדי למזער את הסיכון של זיהום צולב, או למחוק את spheroids מיד לאחר דימות.

10. לנתח HNE ספרואיד תמונות

  1. לייצא תמונות שנתפסו הכל לתבנית תואמת לתוכנת ניתוח התמונה. התוכנה, לחץ על "תצוגה", לרחף מעל "ייצוא", ובחר "ברירת מחדל נופים של כל תמונות כמו TIFF...". שמור את הכונן הקשיח או כונן הבזק לניתוח.
    הערה: A ניתוח מסחרי תוכנה (טבלה של חומרים) ו- tiff לבצע היטב, מתוארים כאן, למרות ניתוח יכול גם להתבצע באמצעות פלטפורמות אחרות. כאשר מתן שמות לקבצים, צוות ניתוח התמונות צריך להיות עיוור לתנאי הניסוי, אבל מודע אילו תמונות משויכים (קדם וגירוי שלאחר) כדי להבטיח ניתוח שווי ערך.
  2. באמצעות ניתוח תוכנה, ניסחו את האזור luminal של כל תמונה ספרואיד ולייצא לתוך תוכנת ניתוח נתונים.
    1. תוכנת ניתוח פתוח. לחץ על "קובץ" ואז "פתח", נווט אל התיקיה קבצים המכילים תמונות ספרואיד. בחר את כל התמונות לניתוח ולחץ על 'פתח'.
    2. לחץ על "מדד" ובחר "אזור מדידות". בתוך תיבת הדו-שיח מדידות אזור, בחר את droptab "תצורת" ולהבטיח "התמונה שם" ו- "אזור" תיבות מסומנות.
    3. לחץ על "יומן" ובחר "יומן נתונים פתוח". לחץ על "OK" על נתוני יומן דיאלוג תיבת ואת שם הקובץ בהתאם (למשל, תנאי X, תאריך). זה יעביר כל המדידות לגיליון אלקטרוני.
    4. בחר בלחצן כלי "עקבות אזור", בזהירות עקבות לומן של ספרואיד בתמונה הראשונה לצורך ניתוח. בתיבת הדיאלוג מדידה באזור, לחץ על "יומן נתונים" כדי להיכנס המדידה לתוך Excel.
    5. חזור על צעדים 10.2.2-10.2.4 עד spheroids כל מנותחות.
  3. לחשב שיעור שינוי (100 * [פוסט-סאונד - בסיסית] ÷ בסיסית) באזור luminal מקו עבור ספרואיד בודדים כל תמונה זוג ולעבד נתונים, לצורך ניתוחם.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

HNEs צריך לצרף המנה תרבות ויוצרים איים קטנים של תאים בתוך 72 h של זריעה; דוגמאות של היווצרות האי טוב ועניים בגיל שבוע מוצגים איור 1A ו- 1B, בהתאמה. איים אלה שכדאי להרחיב מכסים את הכלי מעל 15-30 ימים. דוגמאות קטנות או שיוצרת עשויה להימשך זמן רב, לעיתים קרובות לא תניב שימושי spheroids. זיהום עם מדבקים שמעידים מדיה עמוק צהוב/מעונן, כשל של התאים כדי לצרף המנה תרבות, ו/או פריט חזותי ישיר של פטריות/חיידקים. כל התרבויות מזוהמים צריכים להיות מושלך מיד כדי למנוע זיהום צולב.

בתוך 3-4 הימים הראשונים של תרבות המטריצה קרום המרתף, מבנים קטנים פיברוזיס צריך להתחיל טופס במטריקס. אלה שתתבגרי מעל 10 ימים בערך לתוך spheroids נפגע מפגין קיר דק, משטח luminal. אם מצופה ב צפיפות המתואר, תרבויות מוצלח יכיל spheroids 50-100 לכל מטריצה טיפה. לומן ייתכן יחסית ברור (איור 1C) או מלא פסולת הסלולר, ריר (איור 1D); הראשון הוא נפוץ יותר spheroids עם פראי-סוג CFTR (wtCFTR), ואת האחרון ב CF spheroids. מיסוך על אזור luminal של spheroids דמות 1C ו 1 D הוא הפגינו איור 1E ו- 1F, בהתאמה. דוגמאות של תרבויות ספרואיד לקוי נוצר/לא מוצלח ניתנים איור 1 ג'י ו- 1 H.

נציג נתונים פונקציונלי פראי סוג spheroids HNE homozygous F508del CFTR מוצג באיור 2A ו- 2B, בהתאמה; המידע הזה הוא נציג של > 10 דוגמאות HNE ייחודי פראי סוג ו- F508del CFTR נושאים homozygous30. בקיצור, spheroids עם CFTR פונקציונלי להתנפח, ואילו אלה עם לא מתפקדת מצוין CFTR, משמעותית פחות, או עשוי להתכווץ. באופן ספציפי, spheroids מן הנבדקים עם wtCFTR צריך לתפוח שעה כאשר גירוי, ואני צריך להתנפח פחות או לכווץ אם מגורה בנוכחות החומר המדכא CFTR Inh172. לעומת זאת, spheroids מנושא homozygous עבור F508del CFTR צריך גם לכווץ או להתנפח מאוד מעט, עם גדל נפיחות (או פחות מתכווץ) כאשר פרמקולוגית מתוקן עם מאפננים CFTR VX809 ו- VX770. ניתוחים קודמים של אמינות ספרואיד הן בתוך והן בין נושאים של גנוטיפ באותה מדגימים סגרגציה פונקציונלי של אחרים CFTR ולשינויים צנוע באמצעים חוזרות30.

רכיב המדיה פתרון מניות כמות אחסון
הרחבת מדיה
DMEM / F-12 תערובת מזון "בסיס מדיה" שימוש כמו הוא 2 x 500 מ"ל מכולות חנות-ºC 4 עד תאריך התפוגה יצרן
סרום שור עוברית שימוש כמו הוא 50 מ לאחסן ב-20 ºC עד תאריך התפוגה יצרן
טוקסין הכולרה 10 מ ג של 1 מ"ל של מים סטריליים 1 ΜL לאחסן המניה ב-20 ºC עד שישה חודשים
גורם הגדילה באפידרמיס µg 500 ב 1 מ"ל של מים סטריליים 20 ΜL לאחסן המניה ב-20 ºC עד שישה חודשים
הידרוקורטיזון 0.4 מ ג ב- 400 µL של מים סטריליים כל aliquot 400 µL להפוך טרי עם כל אצווה. חנות אבקת בטמפרטורת החדר עד תאריך התפוגה יצרן
אדנין 24 מ ג ב 1 מ"ל של מים סטריליים כל 1 מ"ל aliquot להפוך טרי עם כל אצווה. חנות אבקת בטמפרטורת החדר עד תאריך התפוגה יצרן
Y-27632 3.2 מ ג ב 1 מ"ל של מים סטריליים כל 1 מ"ל aliquot להפוך טרי עם כל אצווה. לאחסן אבקת ב-20 ºC עד תאריך התפוגה יצרן
מדיה לאנטיביוטיקה
B שהוא גוסס שימוש כמו הוא 1.2 מ חנות-ºC 4 עד תאריך התפוגה יצרן
Ceftazidime 15 מ ג של 1 מ"ל של מים סטריליים כל 1 מ"ל aliquot להפוך טרי עם כל אצווה. לאחסן אבקת ב-20 ºC עד תאריך התפוגה יצרן
Tobramycin 15 מ ג של 1 מ"ל של מים סטריליים כל 1 מ"ל aliquot להפוך טרי עם כל אצווה. לאחסן אבקת ב-20 ºC עד תאריך התפוגה יצרן
ואנקומיצין 15 מ ג של 1 מ"ל של מים סטריליים כל 1 מ"ל aliquot להפוך טרי עם כל אצווה. לאחסן אבקת ב-20 ºC עד תאריך התפוגה יצרן

טבלה 1: רכיבים של הרחבת ומדיה לאנטיביוטיקה.

רכיב המדיה פתרון מניות כמות אחסון
DMEM / F-12 תערובת מזון "בסיס מדיה" שימוש כמו הוא 2 x 500 מ"ל מכולות חנות-ºC 4 עד תאריך התפוגה יצרן
Ultroser-G 20 מ ל מים סטריליים בתוך בקבוק 20 mL יחיד, Ultroser lyophilized-G 20 מ ל כל aliquot להפוך טרי עם כל אצווה. לאחסן אבקת-ºC 4 עד תאריך התפוגה יצרן
שיבוט העובר השני שימוש כמו הוא 20 מ לאחסן ב-20 ºC עד תאריך התפוגה יצרן
דלקת עט שימוש כמו הוא 10 מ לאחסן ב-20 ºC עד תאריך התפוגה יצרן
תמצית המוח שור שימוש כמו הוא 2.48 mL לאחסן ב-20 ºC עד תאריך התפוגה יצרן
Transferrin שימוש כמו הוא 250 ΜL לאחסן ב-20 ºC עד תאריך התפוגה יצרן
אינסולין שימוש כמו הוא 250 ΜL לאחסן ב-20 ºC עד תאריך התפוגה יצרן
Ethanolamine שימוש כמו הוא 15 ΜL לשמור בטמפרטורת החדר עד תאריך התפוגה יצרן
אפינפרין 2.75 מ ג ב 1 מ"ל של מים סטריליים כל 1 מ"ל aliquot להפוך טרי עם כל אצווה. לאחסן אבקת-ºC 4 עד תאריך התפוגה יצרן
תריודוטירונין 8.4 מ ג ב- 50 µL של דימתיל סולפוקסיד כל 50 µL aliquot להפוך טרי עם כל אצווה. לאחסן אבקת ב-20 ºC עד תאריך התפוגה יצרן
הידרוקורטיזון 7.24 מ ג ב 1 מ"ל אתנול 1 ΜL לאחסן המניה ב-20 ºC עד שישה חודשים
Phsophoryletheanolamine 35.25 מ ג ב 1 מ"ל של מים סטריליים 1 ΜL לאחסן המניה ב-20 ºC עד שישה חודשים
חומצה Retinoic 3 מ"ג ב 1 מ"ל של דימתיל סולפוקסיד 1 ΜL לאחסן המניה ב-20 ºC עד שישה חודשים

טבלה 2: רכיבים של בידול בינוני.

Figure 1
איור 1 : HNE הרחבה, מאפיינים מבניים של HNE Spheroids. תמונות Brightfield של תרבויות הרחבה HNE לקחת שבעה ימים לאחר ציפוי להדגים מוצלחת (לבן חץ, פאנל A) לא מוצלח (לוח ב') HNE המושבה היווצרות על רקע פיברובלסט מזין. בהצלחה wtCFTR F508del homozygous spheroids מוצגים בחלוניות C ו- D, בהתאמה. מיסוך על אזור luminal של spheroids של C/D ניתנת פנלים E ו- F, בהתאמה. ספרואיד כושל תרבויות מאופיינים על ידי פסולת הסלולר, קטן, לא מאורגן (לוח G) ו/או לא מאורגן גושים של תאים (לוח H). סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2 : המאפיינים הפונקציונליים של HNE Spheroids. תגובות פונקציונלי נציג של wtCFTR spheroids מתורם יחיד, כאשר גירוי עם forskolin/IBMX עם או בלי הנוכחות של החומר המדכא CFTR Inh172 מוצגים בחלונית (A) לכל נקודה מייצגת את התגובה ספרואיד יחיד. תגובות פונקציונלי נציג של F508del homozygous spheroids מתורם יחיד, כאשר גירוי עם forskolin/IBMX עם או בלי הנוכחות של VX809 ו- VX770 מוצגים בחלונית (B). קווי שגיאה = ב- SEM. * * p < 0.01; p < 0.001. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

פרוטוקול זה מתאר את הדור של תרבויות ספרואיד תא האף נגזר החולה מסוגל לייצר מודל בפעוט, מסוים של פונקציה CFTR. ישנם מספר שלבים מרכזיים בתהליך זה צריך להיות נוכחת מקרוב כדי למנוע קושי. ראשית הוא רכישת מדגם טוב מן האף של המטופל. דגימה טובה צריך > 50,000 תאים, מוגבל ריר/פסולת, ולהיות מוכן לעיבוד בתוך 4 שעות (למרות ההצלחה הוא בר השגה בקלות גם עם לילה משלוח על הקרח). תרגול רכישת דגימות עם מגרד או מברשת על ידי צוות המחקר הוא הכרחי, אשר בהנחייתם של התמקדות לדוגמה רכישת לידיים של ספקי אחד או שניים כדי למקסם את הנוחות שלהם. שנית, טוב לנקות/סטרילי טכניקה של כל השלבים תרביות רקמה חיונית. מצב ראשוני של כישלון, מניסיוננו, עבור כל התרבויות HNE הוא זיהום חיידקי או פטרייתי, אשר יכול לסבך את הדוגמה הראשית וגם בתרבויות אחרות גדל בחממה. סיכון זה עולה רק עם תרבויות של נושאים עם דלקת כרונית (למשל, CF), ולכן הצלחה תלוי במידה רבה היכולת להמשיך תרבויות נפרדות ונקייה. האימון שלנו הוא לשמור חממה אחת נפרדת רק עבור תרביות זיהום נוטה בתוך 5-7 הימים הראשונים, הגנה על תרבויות ישנות יותר ומצליח מפני זיהום בהיסח הדעת. שלישית, חשוב לצפות תאים במהלך שלב הרחבה ולהימנע overconfluence מקרוב. אם התאים מותר להגיע למפגש מלא על הצלחת, יש סיכון כי התרבות או להיות senescent או תאים יתחילו למות ולנתק. לבסוף, כאשר ציפוי תאים spheroids, חשוב לפזר ביסודיות את התאים דרך המטריקס וכדי צלחת דוגמה המתפלג. גם נגמר - או תחת - population הטיפות מטריקס יוביל לכישלון תרבות, גושים גדולים של תאים לא יפיק spheroids מוצלח.

בעודו מיישם פרוטוקול זה, החוקרים עלול להיתקל כמה בעיות נפוצות. זיהום, כאמור לעיל, מומלץ על ידי ברכישת דגימה ראשונית טובה ללא ליחה ו שיטות חקלאות נקייה. אם תרבויות מצליחים באמצעות הרחבה, אך אין כדורים הבדיל נוצרות, ייתכן שאירעה מספר בעיות. אם המטריצה מופיעה בעיקר ריקות, סביר כי התאים היו נזרע נמוך מדי של צפיפות; להגדיל את צפיפות זריעה עוקבות ניסיונות בכ-20%. לעומת זאת, אם המטריצה שנראה "מלוכלך" עם שאריות תאים שופע, סביר כי התאים היו נזרע גם גבוה של צפיפות, וניסיונות עוקבות צריך להשתמש צפיפות זריעה מופחת בכ-20%. סיבוך נפוץ שתילה שלאחר האכלה ותחזוקה הוא הניתוק של המטריקס מכלי הקיבול תרבות. זו נגרמת על ידי החלפת המדיה אגרסיבית מדי, ניתן להימנע על ידי בזהירות באופן ידני שינוי המדיה עם פיפטה 1-mL, לא קיר שאיבה. אם נתקל, כדורים יכול עדיין להיות מגורה, עם תמונה, למרות שזה יכול להיות קשה אם המטריצה "צף" הבאר במהלך דימות, המחייב זהירות מיפוי של spheroids בתוך הבאר.

חוקרים עשויים לרדוף אחרי מספר שינויים בפרוטוקול, בהתאם לצרכים של המעבדה שלהם. עבור הדמיה ברזולוציה גבוהה יותר של spheroids, אנו קודם לכן ובכוח. ובכן 4 הצלחות עם אפשרויות אופטי זכוכית, כולל מנות 35 מ מ זכוכית-התחתון או שקופיות קאמרית. זה מאפשר הדמיה ברזולוציה גבוהה, חיים של spheroids, אך עשויה להפחית את תפוקת. לחלופין, כדי להגדיל את התפוקה, יכול נזרע aliquots קטן של תאים במטריצה לתוך כלי אחר (למשל, לוחות 24-ובכן תרבות). מניסיוננו, spheroids לגדול הכי טוב עם המטריצה בטופס 'droplet' בניגוד להרכיב גיליון בתחתית הבאר; ככזה, יש לנו את הטוב ביותר הצלחה עם טיפות לפחות 25 µL. חוקרים, ייתכן שתרצה לשנות את הצפיפות של מטריקס על ידי דילול עם מדיה. זה מפחית את הכמות הכוללת של מטריקס הצורך, שיפור עלות וזמינותו. זה עשוי גם, עם זאת, לשנות את ספרואיד הרכב. מניסיוננו הקודם, ריכוז נמוך יותר של קרום המרתף מטריקס להוביל שינו מבנה ספרואיד, עם היווצרות חלקית או מלאה של spheroids ב מורפולוגיה "תא-איפקס-אאוט". בתור שכזה, spheroids שנוצר באמצעות פרוטוקול שינויים בריכוז מטריקס צריך להיות בזהירות שחושבה עבור מורפולוגיה לפני בדיקות פונקציונליות מתבצע ניסיון. לבסוף, גירוי שונים או תרופות מעכבות או ריכוזים שונים של תרופות אלו, יכול להיות מועסק. Forskolin, IBMX ו- Inh172 נבחרו ללימודי שלנו בריכוזים אלה בהתבסס על ניסיון קודם בעלי תרבויות31. שימוש בסמים אחרים (למשל, isoproterenol לגירוי, GlyH101 עבור עיכוב) עשויים לחול כדאי ללמוד של חוקר. באופן דומה, באמצעות ריכוזים שונים של forskolin, IBMX או Inh172 עשוי לשנות את הטווח הדינמי של וזמינותו, אולם לא באופן שיטתי בדקנו אפשרויות אלה.

בהינתן מספר קיים שמחוץ נגזר החולה CFTR מבחני, המודל שתואר בולט מכמה סיבות מפתח. קודם כל, זה יהפוך לרישית בתאי האף כמקור שהושג בקלות של רקמת מערכת הנשימה. רכש HNE יכול להתבצע בבטחה עם הכשרה מינימלית כמעט בכל סביבה (במרפאה, או, ביקור מחקר) כל קבוצות גיל25. זה מקל דגימה חזקים רכש וחזור הדגימה במקרה הצורך עקב קשיי גידול או זיהום. . בהשוואה organoids מעיים, HNE spheroids מאופיינים פחות טוב, יופיעו יש טווח דינמי קטן בטופס הנוכחי, עם זאת, שימוש בדרכי הנשימה במקום GI רקמות יכול להיות יתרון מרכזי, כמו מנהלי מחלות CF מספר (למשל סיווג בשחרור ליחה, נתרן אפיתל ערוץ ביטוי) אינם שקולים בבטן. בניגוד לתרבויות עלי מישורי, תאי HNE, spheroids גדלים מהר יותר, וייתכן שהוא נציג יותר מהתנאים ויוו , מדידת תהליך הפיזיולוגיות (נוזל הומאוסטזיס) שעשויים להיות רלוונטיים יותר מאשר לבד אלקטרופיזיולוגיה-32. על ידי שיפור מעת הדגימה רכש בדיקות, פוטנציאל זיהום מופחת, לכן הגדלת סיכויי ההצלחה תרבות. בסופו של דבר, הטבע תלת-ממדי של המודל יכול להיות נוטה? הרומן ו/או קווים משלימים של מחקר ופיתוח דרכי הנשימה או מורפולוגיה שאינם ריאלי בתרבויות עלי (למשל, luminal ריר מעקב, מחקרים מהירה של בידול, וכו).

ישנן מספר מגבלות מפתח כדי HNE spheroids כמו וזמינותו של פונקציה CFTR. ראשית, וזמינותו הזה נשאר תפוקה נמוכה יחסית. באמצעות השיטות הנוכחי, ייבוא תמונות לוקח יותר משעה עבור כל תנאי התרבות, ולוקח ניתוח של מינימום 20-30 נוספים לכל תנאי. נוסף לכך מידת החפיפה בין תנאים מסוימים (כגון הפגינו איור2 א), אשר מחייבת מספר גדול של מדידות (חפיפה זו כשלעצמה עשויים לייצג גם מגבלה של הרגישות של זה assay). ככזה, ניסוי יחיד עם 4-6 תנאים דורש כמעט יומיים עבור השלמת. תפוקה ניתן לשפר באמצעות שימוש בשיטות של לכידת תמונה אוטומטי וניתוח; עיבודים כזה הם כעת בעיצומו. שנית, מודל זה דורש כמות גדולה של מטריקס, אשר יכול להיות יקר. כפי שהוזכר לעיל, דילול של המטריקס עשוי לסייע להתגבר על מחסום זה, אך יש לנקוט בזהירות, כמו שינויים הצמיחה מטריקס עלול לגרום שינויים ספרואיד מורפולוגיה. שלישית, מודל זה מסתמך על מדידות ספרואיד במישור XY רק ולאחר מתווי נפיחות במישור Z, אשר ייתכן להטיה. בזמן ניתוחים הפארמצבטית הקודם היה מרגיע, זה חסרון יכול להיות להתגבר על ידי השימוש הדמיה אוטומטית עם Z-המטוס סריקה כדי לחשב נפח30. לבסוף, והכי חשוב, עבודה נרחב לקשור ספרואיד התגובות ויוו סמים התגובה של הנבדק בודדים הוא עדיין להסתיים. בהעדר המתאם הזה, הערך החזוי של המודל - אמנם מבטיח - לא ברור.

דור וניתוח של HNE spheroids מאפשרים שמחוץ ניתוח של פעילות CFTR בודדים של אפנון, אשר בסופו של דבר עשוי להיות שימושי כמודל קליניים של סמים תגובה. יתר על כן, לאור ההשתנות נרחב בחומרתם מחלות CF, כזה מודל בפעוט יכולה לספק תובנות ייחודי דרכי הנשימה microenvironment של נושא. בדרך זו, מודל כזה עשוי להיות שימושי עבור לימודי ביולוגיה CFTR רחבה וסיוע בהבנת המחלה הטרוגניות. שימוש עתידי של מודל זה, כמו גם דגמים דומים אחרים של תפקוד CFTR בפעוט, מחזיקה את ההבטחה להבין טוב יותר את הביולוגיה CFTR במעבדה, ותוך כדי נסיעה אישית ורפואה דיוק במרפאה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי קרן סיסטיק פיברוזיס הרפוי, להעניק מספר CLANCY14XX0, דרך איגוד סיסטיק פיברוזיס, להעניק מספר CLANCY15R0. המחברים רוצים להודות קריסטינה ריי על הסיוע במתן החולה רגולטורי. המחברים גם רוצים להודות קבוצת העבודה HNE, נתמך על ידי קרן סיסטיק פיברוזיס, אשר סייעו בדור של HNE תרבות יכולות: פרסטון Bratcher, כותנה קלווין, מרטינה Gentzsch, אליזבת Joseloff, מייקל Myerburg, ניקולס דייב, סקוט רנדל, סטיב רואו, שלמה מרטי ג ו קתרין טאגל.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL Eppendorf Tube USA Scientific  4036-3204
150 mL Filter Flask Midsci  TP99150 To filter Media
15 mL Conical Tube Midsci  TP91015
1 L Filter Flask Midsci  TP99950 To filter Media
35 mm Glass-Bottom Dish MatTek Corporation P35G-0-20-C Optional
3-Isobutyl-1-Methylxanthine (IBMX) Fisher Scientific  AC228420010  Prepare a 100 mM stock solution of 22.0 mg in 1 mL of DMSO
50 mL Conical Tube Midsci   TP91050
Accutase Innovative Cell Technologies, Inc. AT-104 Cell detachment solution
Adenine Sigma-Aldrich A2786-25G See Table 1
Amphotericin B Sigma-Aldrich A9528-100MG See Table 1
Bovine Brain Extract (9mg/mL) Lonza  CC-4098 See Table 2
Ceftazidime hydrate Sigma-Aldrich C3809-1G See Table 1
Cell Scrapers 20 cm  Midsci  TP99010
CFTR Inh172 Tocris Bioscience 3430 Prepare a 10 mM stock solution of 4.0 mg in 1 mL of DMSO
Cholera Toxin B (From Vibrio cholerae) Sigma-Aldrich C8052-.5MG See Table 1
CYB-1 Medical Packaging Corporation CYB-1 Cytology brush
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D5879-500ML
Dulbecco's Modified Eagle Media (DMEM)/F12 Hepes  Life Technologies  11330-057 Base Medium; See Tables 1 and 2
Epidermal Growth Factor (Recombinant Human Protein, Animal-Origin Free) Thermo Fisher Scientific PHG6045 See Table 1
Epinephrine Sigma-Aldrich E4250-1G See Table 2
Ethanol Fisher Scientific  2701
Ethanolamine Sigma-Aldrich E0135-500ML 16.6 mM solution; See Table 2
Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA) TCI America  E0084
Fetal Bovine Serum (high performance FBS) Invitrogen  10082147 See Table 1
Forskolin Sigma-Aldrich F6886-50 Prepare a 10 mM stock solution of 4.1 mg in 1 mL of DMSO
Growth Factor-Reduced Matrigel Corning, Inc. 356231 Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, Phenol Red-Free, LDEV-Free, 10 mL.
Hemacytometer Hausser Scientific 1483
Human Collagen Solution, Type I (VitroCol; 3 mg/mL) Advanced BioMatrix 5007-A Collagen solution
HyClone (aka FetalClone II)  GE Healthcare  SH30066.03HI See Table 2
Hydrocortisone StemCell Technologies 07904 See Tables 1 and 2
Insulin, human recombinant, zinc solution Life Technologies  12585014 4 mg/mL solution; see Table 2
IVF 4-Well Dish, Non-treated NUNC (via Fisher Scientific) 12566350 4-well plate for spheroids; similar well size to a 24-well plate
MEF-CF1-IRR Globalstem GSC-6001G Irradiated murine embryonic fibroblasts
Metamorph 7.7 Molecular Devices Analysis Software; https://www.moleculardevices.com/systems/metamorph-research-imaging/metamorph-microscopy-automation-and-image-analysis-software for a quote
Olympus IX51 Inverted Microscope Olympus Corporation Discontinued Imaging Microscope. Replacment: Olympus IX53, https://www.olympus-lifescience.com/pt/microscopes/inverted/ix53/  for a quote
Pen Strep Life Technologies  15140122 See Table 2
Phsophoryletheanolamine Sigma-Aldrich P0503-5G See Table 2
Retinoic Acid Sigma-Aldrich R2625-50MG See Table 2
Rhinoprobe Arlington Scientific, Inc. 96-0905 Nasal curette
Slidebook 5.5 3i, Intelligent Imaging Innovations Discontinued Imaging Software. Replacement: Slidebook 6, https://www.intelligent-imaging.com/slidebook for a quote
Sterile Phosphate Buffered Saline (PBS) Thermo Fisher Scientific 20012050
Sterile Water Sigma-Aldrich W3500-6X500ML
Tissue Culture Dish 100 Techno Plastic Products 93100 Tissue culture dish for expansion
Tobramycin Sigma-Aldrich T4014-100MG See Table 1
Transferrin (Human Transferrin 0.5 mL) Lonza  CC-4205 See Table 2
Triiodothryonine Sigma-Aldrich T6397-1G 3,3′,5-Triiodo-L-thyronine sodium salt  [T3]; See Table 2
Trypsin from Porcine Pancreas Sigma-Aldrich T4799-10G
Ultroser-G Crescent Chemical (via Fisher Scientific) NC0393024 20 mL lypophilized powder; See Table 2
Vancomycin hydrochloride from Streptomyces orientalis Sigma-Aldrich V2002-5G See Table 1
VX770 Selleck Chemicals S1144 Prepare a 1 mM stock solution of 0.4 mg in 1 mL of DMSO
VX809 Selleck Chemicals S1565 Purchase or prepare a 10 mM stock solution of 4.5 mg in 1 mL of DMSO
Y-27632 Dihydrochloride  ROCK inhibitor  Enzo LifeSciences  ALX-270-333-M025  See Table 1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rowe, S. M., Miller, S., Sorscher, E. J. Cystic fibrosis. N Engl J Med. 352 (19), 1992-2001 (2005).
  2. Rommens, J. M., et al. Identification of the cystic fibrosis gene: chromosome walking and jumping. Science. 245 (4922), 1059-1065 (1989).
  3. Anderson, M. P., et al. Nucleoside triphosphates are required to open the CFTR chloride channel. Cell. 67 (4), 775-784 (1991).
  4. Boucher, R. C. Human airway ion transport. Part one. Am J Respir Crit Care Med. 150 (1), 271-281 (1994).
  5. Ehre, C., Ridley, C., Thornton, D. J. Cystic fibrosis: an inherited disease affecting mucin-producing organs. Int J Biochem Cell Biol. 52, 136-145 (2014).
  6. Accurso, F. J., et al. Effect of VX-770 in persons with cystic fibrosis and the G551D-CFTR mutation. N Engl J Med. 363 (21), 1991-2003 (2010).
  7. De Boeck, K., et al. Efficacy and safety of ivacaftor in patients with cystic fibrosis and a non-G551D gating mutation. J Cyst Fibros. 13 (6), 674-680 (2014).
  8. Moss, R. B., et al. Efficacy and safety of ivacaftor in patients with cystic fibrosis who have an Arg117His-CFTR mutation: a double-blind, randomised controlled trial. Lancet Respir Med. 3 (7), 524-533 (2015).
  9. Wainwright, C. E., et al. Lumacaftor-Ivacaftor in Patients with Cystic Fibrosis Homozygous for Phe508del CFTR. N Engl J Med. , (2015).
  10. Brewington, J. J., McPhail, G. L., Clancy, J. P. Lumacaftor alone and combined with ivacaftor: preclinical and clinical trial experience of F508del CFTR correction. Expert Rev Respir Med. 10 (1), 5-17 (2016).
  11. CFTR2 Database. , www.cftr2.org (2017).
  12. Mou, H., Brazauskas, K., Rajagopal, J. Personalized medicine for cystic fibrosis: establishing human model systems. Pediatr Pulmonol. 50 Suppl 40, S14-S23 (2015).
  13. Randell, S. H., Fulcher, M. L., O'Neal, W., Olsen, J. C. Primary epithelial cell models for cystic fibrosis research. Methods Mol Biol. 742, 285-310 (2011).
  14. Whitcutt, M. J., Adler, K. B., Wu, R. A biphasic chamber system for maintaining polarity of differentiation of cultured respiratory tract epithelial cells. In Vitro Cell Dev Biol. 24 (5), 420-428 (1988).
  15. Worthington, E. N., Tarran, R. Methods for ASL measurements and mucus transport rates in cell cultures. Methods Mol Biol. 742, 77-92 (2011).
  16. Van Goor, F., et al. Correction of the F508del-CFTR protein processing defect in vitro by the investigational drug VX-809. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (46), 18843-18848 (2011).
  17. Hug, M. J., Tummler, B. Intestinal current measurements to diagnose cystic fibrosis. J Cyst Fibros. 3 Suppl 2, 157-158 (2004).
  18. van Barneveld, A., Stanke, F., Ballmann, M., Naim, H. Y., Tummler, B. Ex vivo biochemical analysis of CFTR in human rectal biopsies. Biochim Biophys Acta. 1762 (4), 393-397 (2006).
  19. Dekkers, J. F., et al. A functional CFTR assay using primary cystic fibrosis intestinal organoids. Nat Med. 19 (7), 939-945 (2013).
  20. Dekkers, J. F., et al. Optimal correction of distinct CFTR folding mutants in rectal cystic fibrosis organoids. Eur Respir J. 48 (2), 451-458 (2016).
  21. Dekkers, R., et al. A bioassay using intestinal organoids to measure CFTR modulators in human plasma. J Cyst Fibros. 14 (2), 178-181 (2015).
  22. Zomer-van Ommen, D. D., et al. Limited premature termination codon suppression by read-through agents in cystic fibrosis intestinal organoids. J Cyst Fibros. , (2015).
  23. Bridges, M. A., Walker, D. C., Davidson, A. G. Cystic fibrosis and control nasal epithelial cells harvested by a brushing procedure. In Vitro Cell Dev Biol. 27a (9), 684-686 (1991).
  24. Di Lullo, A. M., et al. An "ex vivo model" contributing to the diagnosis and evaluation of new drugs in cystic fibrosis. Acta Otorhinolaryngol Ital. 37 (3), 207-213 (2017).
  25. Pranke, I. M., et al. Correction of CFTR function in nasal epithelial cells from cystic fibrosis patients predicts improvement of respiratory function by CFTR modulators. Sci Rep. 7 (1), 7375 (2017).
  26. Devalia, J. L., Davies, R. J. Human nasal and bronchial epithelial cells in culture: an overview of their characteristics and function. Allergy Proc. 12 (2), 71-79 (1991).
  27. Devalia, J. L., Sapsford, R. J., Wells, C. W., Richman, P., Davies, R. J. Culture and comparison of human bronchial and nasal epithelial cells in vitro. Respir Med. 84 (4), 303-312 (1990).
  28. Thavagnanam, S., et al. Nasal epithelial cells can act as a physiological surrogate for paediatric asthma studies. PLoS One. 9 (1), e85802 (2014).
  29. Jorissen, M., Van der Schueren, B., Van den Berghe, H., Cassiman, J. J. The preservation and regeneration of cilia on human nasal epithelial cells cultured in vitro. Arch Otorhinolaryngol. 246 (5), 308-314 (1989).
  30. Brewington, J. J., et al. Detection of CFTR function and modulation in primary human nasal cell spheroids. J Cyst Fibros. , (2017).
  31. Sun, H., et al. Tgf-beta downregulation of distinct chloride channels in cystic fibrosis-affected epithelia. PLoS One. 9 (9), e106842 (2014).
  32. Boucher, R. C. Evidence for airway surface dehydration as the initiating event in CF airway disease. J Intern Med. 261 (1), 5-16 (2007).

Tags

רפואה בעיה 134 סיסטיק פיברוזיס CFTR רפואה מדייקת תא צורב ספרואיד תא האף תרבית תאים
דור של תאי אפיתל באף אדם Spheroids למחקר הרגולטור מוליכות Transmembrane תגובותיהם סיסטיק פיברוזיס
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Brewington, J. J., Filbrandt, E. T., … More

Brewington, J. J., Filbrandt, E. T., LaRosa III, F. J., Moncivaiz, J. D., Ostmann, A. J., Strecker, L. M., Clancy, J. P. Generation of Human Nasal Epithelial Cell Spheroids for Individualized Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Study. J. Vis. Exp. (134), e57492, doi:10.3791/57492 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter