Summary
Desthiobiotin merking av en syntetisk 25-nukleotid RNA oligo, som inneholder en adenine-rik element (er) motiv, kan bestemt binding av cytosolic er uforpliktende protein.
Abstract
Den i vitro RNA-nedtrekk brukes fortsatt i stor grad i de første trinnene i protokoller som tar sikte på å identifisere RNA-bindende proteiner som gjenkjenner bestemte RNA strukturer og motiver. I denne RNA-nedtrekk protokollen, kommersielt syntetisert RNA sonder er merket med en modifisert form av biotin, desthiobiotin, endestasjonen 3 RNA strand, som reversibel binder seg til streptavidin og dermed lar elueringsrør proteiner under mer fysiologiske forhold. RNA-desthiobiotin er immobilized gjennom samspill med streptavidin på magnetiske perler, som brukes til å trekke ned proteiner som spesielt samhandler med RNA rundt. Non-denaturert og aktiv proteiner fra cytosolic brøkdel av mesothelioma celler brukes som kilde til proteiner. Metoden beskrevet her kan brukes for å oppdage samspillet mellom kjent RNA bindende proteiner og en 25-nukleotid (nt) lang RNA sonde som inneholder en sekvens av interesse. Dette er nyttig å fullføre funksjonelle karakterisering av stabilisere eller destabilisere elementer i RNA molekyler ved hjelp av en reporter vektor analysen.
Introduction
Genuttrykk og endelig nivå av gene produktet kan være tett regulert av påvirker mRNA stabilitet og mRNA oversettelse rate1. Disse post-transcriptional regulatoriske mekanismene er utøvde gjennom samhandling ikke-koding RNA og/eller RNA-bindende proteiner (RBPs) med målrettet mRNA. Det er vanligvis 3 uoversatt regionen mRNA (3' UTR - tilhører delen ikke-koding av genomet2) som inneholder bestemte cis-regulatoriske elementer (Grobunn), som er anerkjent av trans-fungerende faktorer som miRNA eller RBPs 3. den best studerte cis-element i de 3' UTR, er adenine-rik element (er) motivet, som er anerkjent av spesifikke AU-bindende proteiner (AUBP), og, igjen, induserer enten mRNA nedbrytning/deadenylation (er-formidlet decay) eller mRNA stabilisering4.
Størrelsen av den 3-' UTR i av calretinin mRNA (CALB2) er 573 bp lang og inneholder en antatte AUUUA pentamer, som spådd av AREsite2, en bioinformatic verktøyet5. Samsvar med tilstedeværelse av antatte er motivet, pmirGLO vektor-reporter analysen viste en stabilisering rolle av dette elementet i CALB2 mRNA6. Til slutt, den i vitro RNA-nedtrekk ble brukt til å identifisere AUBP som stabiliserer calretinin mRNA gjennom er motivet.
Siden alle ikke-koding RNAs samhandle med proteiner7, den i vitro RNA-rullegardinmenyen er en god måte og første av valget analysen identifisere RNA-interaktører å hjelpe tyde molekylære mekanismer. I denne metoden er RNA-rullegardinmenyen, ble kommersielt syntetisert RNA sonder, som ble merket med en modifisert form av biotin (desthiobiotin) på 3 terminus RNA strand, brukt. RNA-desthiobiotin er immobilized gjennom samspill med streptavidin på magnetiske perler, som brukes til å trekke ned proteiner som spesielt samhandler med bundet-RNA rundt. Non-denaturert og aktiv proteiner fra cytosolic brøkdel av mesothelioma celler brukes som kilde til proteiner. Slike RNA-bundet proteiner er elut fra de magnetiske perlene, kjøre gjennom en 12% SDS side gel, overført til en membran og analysert med forskjellige antistoffer.
I den standard streptavidin-biotin affinity rensing prosedyren, harde rødsprit betingelsene må være forstyrre sterk irreversibel biotin-streptavidin bånd for å elute bundet proteiner8, som kan føre til av protein komplekser. I motsetning til biotin, desthiobiotin reversibel binder seg til streptavidin og er konkurransedyktig fordrevet med en bufferløsning til biotin, gir milde tilsettes proteiner, og unngå isolering av naturlig biotinylated molekyler9, antyder at teknikken er ideelt for å isolere innfødt protein komplekser under innfødt forhold.
In vitro bindende betingelser og stringens, som bestemmes av saltkonsentrasjon, reduksjonsmidler og vaskemiddel prosent, bør være nær de tilstedeværende i mobilnettet sammenheng for å identifisere ekte i vivo interaksjoner. Bindende betingelser implementert her har tidligere vist som passer til å identifisere HuR som en AU-bindende protein10. Denne tilnærmingen kan spare tid, siden optimalisering av riktig bindende betingelser kan være tidkrevende og utfordrende. Dessuten, denne metoden kan brukes som en start protokoll for noen RNA-nedtrekk eksperimentet og gradvis kan optimaliseres ved å endre konsentrasjon av salter og vaskemidler, endre ønsket glyserol og legge til andre salter. Videre har vi vist at selv en kort 25-nukleotid RNA-sonde skjuler en pentamer er-motiv kan brukes til å vise interaksjon med en bestemt AUBP.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. utarbeidelse av Cytosolic og kjernefysiske Protein fraksjon
- Plate 4 x 106 ACC-MESO-4 celler i en T150 celle kultur kolbe dyrket i RPMI - 1640 medium supplert med 10% FBS, 1 x penicillin/streptomycin (100 x) og 2 mM L-glutamin (200 mM). Når celler når en samløpet av 80-90% (~5-5.5 x 106 celler), Fortsett med protein utvinning av kjernefysiske og cytosolic fraksjon.
Merk: ACC-MESO-4 celle linje er Hentet fra RIKEN BioResource sentrum11. - Sug opp medium, vaske cellene ved å legge til 15 mL 1 x PBS, tilt platen forsiktig noen ganger og Sug opp 1 x PBS. Legge 3 mL 0,25% Trypsin-EDTA og Inkuber kultur kolbe ved 37 ° C i 3 minutter.
Merk: Se på cellene under mikroskop for avdeling; Hvis fortsatt festet trykk kolbe mot håndflaten av hånden 3 ganger. - Legge 7 mL av RPMI-1640 medium med 10% FBS, 1 x penicillin/streptomycin (100 x) og 2 mM L-glutamin (200 mM), samle cellene i en 15 mL tube og Nedspinning 200 x g i 5 min.
- Sug opp medium resuspend celle pellets med 1,5 mL 1 x PBS, og overføre cellene til en 1,5 mL microcentrifuge tube. Nedspinning 500 x g og 4 ° C i 5 min. Forkast nedbryting.
Merk: Dette trinnet og utover, utføre alle sentrifugering trinn på 4 ° C og holde reagenser på is. - Resuspend celle pellets med iskald 1,5 mL 1 x PBS og Nedspinning cellene på 500 x g og 4 ° C for 3 min. kast nedbryting.
Merk: Den nødvendige mengden CER jeg CER II og NER reagenser er 10, 0,55 og 5 mengder anslagsvis celle pellet pakket volum. følgende protokollen forutsetter et volum på 20 µL. Vi anbefaler forbereder bare den nødvendige mengden av reagens CER jeg. - Legge til 200 µL av iskalde cytoplasmatiske utvinning reagensen (CER jeg) med 2 µL av 1 x proteinasen inhibitor, f.eksfortynne 1 tavle av Protease hemmer (EDTA-ledig) i 500 µL av vann for å få 100 x lager. Denne mengden reagens CER er nok til å lyse 20 µL av cellen pellets pakket volum.
- For å beregne celle pellet pakket volumet, kan du sammenligne røret som inneholder cellen pellets med en 1,5 mL tube fylt med 10, 20, 50 eller 100 µL av 1 x PBS.
- Resuspend celle pellet av kraftig vortexing røret for 15 s og Inkuber røret på is 10 min. legge 11 µL av iskalde cytoplasmatiske utvinning reagensen II (CER II) til røret, kraftig vortex 5 s, og Inkuber 1 min på is.
- Vortex kraftig for 5 s og sentrifuger røret på 16.000 x g og 4 ° C i 5 min. overføre nedbryting til ren pre kjølt røret på is. Nedbryting er cytoplasmatiske brøken som er lenger brukes i RNA-nedtrekk eksperimentet.
- Resuspend den gjenværende pellet i 100 µL av iskalde kjernefysiske utvinning reagensen (NER) med 1 µL proteinasen hemmer (100 x) og kraftig vortex 15 s. Vi anbefaler forbereder bare den nødvendige mengden av NER reagens supplert med proteasehemmere.
- Inkuber prøven på is 40 min med sporadiske vortexing 15 s (hvert 10 min).
- Sentrifuge røret 16.000 x g for 10 min. overføring nedbryting (dette er den kjernefysiske protein fraksjon) slik rent pre kjølt.
- Gå rett ved å måle protein konsentrasjon med metoden bicinchoninic (BCA) (se Tabell for materiale). Bestemme for protein renhet av hver fraksjon, utføre immunoblotting (figur 1) mot α-tubulin (positiv oppdagelsen bare i cytosolic fraksjonen) og Poly ADP-ribose utvalg - PARP (positiv oppdagelsen bare i kjernefysiske fraksjonen). Protein visualisering, se Seksjon 4.
- For å holde protein aktivitet og deres opprinnelige tilstand, forberede 25 µL av dele cytosolic og kjernefysiske ekstrakter. Snapin-fryse disse dele ved å plassere dem i flytende nitrogen for 5 s og lagre direkte på-80 ° C.
2. merking av RNA med Desthiobiotin
- RNA sonder kommersielt syntetisert og HPLC renset. Resuspend med nuclease-fritt vann på 10 µM.
Merk: Sonde sekvenser er oppført i tabell 1. - Bruk 50 pmol av per RNA-nedtrekk reaksjon. Tine og holde reagenser på is bortsett fra for pinne 30%, til etikett 3 endestasjonen til RNA oligo.
- Overføre 5 µL av 10 µM RNA sonder, merket som CALB2 3' UTR (er), CALB2 3' UTR (mtARE) og niepowiem-RNA (irsk), i 0,5 mL tynne vegger microcentrifuge rør og Inkuber i en PCR maskin på 85 ° C for 5 min. plassere rør umiddelbart på is.
Merk: Dette trinnet er viktig, som den fremmer avslapning og tilgjengelighet av RNA sonden for merking. - For en enkelt 30 µL reaksjon, legge til røret RNA inneholder følgende 10 µL mix: 3 µL nuclease gratis vann, 3 µL av 10 x RNA Ligase reaksjon Buffer, 1 µL av RNase hemmer (40 U/µL), 1 µL av Desthiobiotinylated Cytidine Bisphosphate (1 mM) , og 2 µL av T4 RNA ligase (20 U/µL).
Merk: For å utarbeide master mix en for 3 prøver i overkant (3,2), blande 9,6 µL av nuclease gratis vann, 9,6 µL av 10 x RNA Ligase reaksjon Buffer, 3,2 µL av RNase hemmer (40 U/µL), 3,2 µL av Desthiobiotinylated Cytidine Bisphosphate (1 mM) og 6,4 µL av T4 RNA ligase (20 U/µL). - Legg nøye 15 µL av PEG 30% til reaksjonen. Bruk et annet tips for å blande reaksjonen. Inkuber reaksjonen overnatting på 16 ° C.
- Neste dag, forberede følgende: 5 M NaCl (frisk/nuclease gratis), kloroform: isoamyl alkohol i 24:1-forhold (f.eksper reaksjon - 96 µL kloroform og 4 µL isoamyl alkohol), iskalde 100% etanol og iskalde 70% etanol.
- Legge til 70 µL av nuclease-fritt vann til RNA-merking reaksjon rør. Legge til 100 µL av kloroform: isoamyl alkohol og vortex kort. Spin-ned på 13000 x g for 3 min. forsiktig fjerne bare øvre fasen og overføre til en ny nuclease uten 1,5 mL tube; unngå å berøre de lave faser.
- Legge til 10 µL av 5 M NaCl, 1 µL av glykogen og 300 µL av iskalde 100% etanol. Sett røret på 20 ° C for 2T.
Merk: På dette trinnet eksperimentet kan være fortsatt på dagen. - Sentrifuger på 13.000 x g og 4 ° C i 15 min. forkaste nøye nedbryting uten å forstyrre pellet. Legge til 300 µL iskald 70% etanol og sentrifuge igjen på 13000 x g og 4 ° C for 5 min.
- Forkast nedbryting helt og air-dry pellets (15 min). Resuspend pellet i 20 µL nuclease uten vann.
Merk: Fortsett med RNA-rullegardinmenyen på samme dag. - Inkuber RNA ved 90 ° C i 2 minutter, og plasser på is. Plass merket-RNA på isen ved følgende trinn av før vask av streptavidin magnetiske perler.
Merk: Lengre inkubasjon tid kan skade RNA sonden.
3. RNA-Protein Pulldown
-
Før vask streptavidin-magnetiske perler og inkubasjon med desthiobiotin-RNA
- Bruk 50 µL av streptavidin magnetiske perler per 50 pmol RNA. Imidlertid bør dette være optimalisert avhengig av eksperimentet.
- Vortex tube med streptavidin-magnetiske perler for 15 s, og raskt fjerne 200 µL (master mix, nok for 3 + 1 reaksjoner) i en ren 1,5 mL safe-lock tube med kuttet pipette-spisser. Sett røret på en magnetisk stand slik at perlene samle ved siden av røret og vente 1 min. Fjern rørets væsken.
- For å vaske perler, fjerne røret fra magnetiske stativet, Legg 400 µL av 0.1 M NaOH 0,05 M NaCl løsning og forsiktig Pipetter opp og ned flere ganger. Sett røret tilbake på magnetiske stand. Vente 1 min og samle nedbryting. Gjenta dette trinnet igjen.
- Vask perler med 200 µL av 100 mM NaCl. Fjerne nedbryting.
- Legge til 200 µL 20 mm Tris (pH 7.5), resuspend perler av pipettering, sett røret på magnetiske standen, vente 1 min og fjerne nedbryting. Gjenta trinn.
- Fjerne røret fra magnetiske stativet, Legg 200 µL av 1 x RNA fangst buffer, og resuspend streptavidin magnetiske perler av kort vortexing. Fjern 50 µL av streptavidin magnetiske perler og legge til hvert merket RNA tube med et kutt pipette tips. Inkuber rør i 30 min ved romtemperatur på rull.
-
Binding av protein til RNA
- Plassere rør til en magnetisk stå vente 1 min og fjerne nedbryting.
- Legge til 50 µL 20 mm Tris (pH 7.5) perler og resuspend av pipettering. Plassere rør til en magnetisk stå vente 1 min og fjerne nedbryting. Gjenta dette trinnet.
- Legge til 100 µL av 1 x Protein-RNA bindende buffer perler og resuspend av pipettering.
- I mellomtiden forbereder følgende mix: 10 µL av 10 x Protein-RNA bindende buffer, 30 µL 50% glyserol, 50 µg cytoplasmatiske proteiner, og nuclease-gratis vann opptil 100 µL.
Merk: Forberede master mix B 3 prøver i overkant (3.3) som følger: 33 µL av 10 x Protein-RNA bindende buffer, 99 µL 50% glyserol, 165 µg cytoplasmatiske proteiner og nuclease-fritt vann til 330 µL. holde røret master Mix B på is. - Plassere rør til magnetisk stå, vente 1 min og samle nedbryting. Legg 100 µL av master mix B, resuspend av pipettering forsiktig opp og ned, og unngå å skape bobler. Inkuber reaksjon rør for 60 minutter til 4 ° C på rull.
-
Vask og elueringsrør
- Plassere rør til en magnetisk stå, samle nedbryting (som strømmer gjennom - FT) og overføre til en ny tube.
Merk: Holde denne FT på is for senere analyse. - Pipetter 100 µL av 1 x vaskebuffer på perlene, resuspend forsiktig, satt tilbake i magnetiske standen, vente 1 min og forkaste nedbryting. Gjenta dette trinnet 2 ganger.
- Legge til 40 µL av elueringsbufferen i de magnetiske perlene, blande av pipettering opp og ned og ruge på 37 ° C på en tube shaker (950 rpm) i 30 min.
- Plassere rør til en magnetisk stå vente 1 min og samle elut utvalget (eluate - E). Plasser på is og bruke for nedstrøms.
Merk: På dette trinnet hver testet RNA probe består av en flyt gjennom (FT) og eluate (E) prøve.
- Plassere rør til en magnetisk stå, samle nedbryting (som strømmer gjennom - FT) og overføre til en ny tube.
4. polyakrylamid gelelektroforese og Western Blot analyse
Merk: Se tabell 2 for oppskrifter for bufferne brukes i denne delen. Utføre en Western blot ifølge Laemmli metoden12.
- Handcast 12% SDS side gels (10-wells, 1,5 mm avstand, 66 µL). Forberede en kjører gel blanding: 4 mL av 30% akrylamid-bisacrylamide lager løsning, 2,4 mL av lavere Tris buffer, 3,2 mL av dH2O, 9,6 µL av TEMED, 96 µL av 10% ammonium persulfate løsning (APS). Klargjør stabling gel blandingen: 3.25 mL av dH2O, 0,5 mL av 30% akrylamid - bisacrylamide lager løsning, 1,3 mL øvre Tris bufferen, 10 µL av TEMED, 20 µL av 10% APS.
- Legge 16,6 µL av 6 x Laemmli buffer (f.eks, 14 mL Tris/HCl/SDS pH 6.8 (øvre Tris buffer), 2 g eksponeringsmåter, 1,86 g DTT, 6 mL glyserol og 0.012% bromophenol blå; lagret på 20 ° C) i FT prøven og 6,6 µL av 6 x Laemmli buffer i E prøven. Inkuber prøver for 5 min på 95 ° C.
- Laste prøvene (20 µL FT og hele Elute ~ 40 µL) og kjøre dem i 30 min på 60 V, fortsetter med 20 V over natten.
- Bruker en semi-tørr electroblotting, overføre proteiner på en PVDF membran for 80 min. 15 V.
Merk: PVDF membranen må aktiveres før du utfører protein overføring. Inkuber membranen i 100% metanol for 1 min, etterfulgt av en 2 min inkubasjon i ultrapure vann. - Etter protein overføringen, ruge SDS side gel med Coomassie løsning for 3 h, etterfulgt av tre trinn av vaske med ultrapure vann, hver 30 min.
- På slutten av protein overføring, la PVDF membranen tørr for 1 h. reaktivere membranen som angitt i trinn 4.5. Blokkere membranen 1t med 5% BSA på 1 x TTBS.
- Inkuber membranen med første antistoffer: HuR eller mesothelin, begge fortynnet 1:1000 i 5% BSA på 1 x TTBS 4 h ved romtemperatur eller over natten på 4 ° C.
- Vaske membranen tre ganger i 7 min i 1 x TTBS og ruge med kanin anti-musen pepperrotperoksidase (HRP)-konjugert sekundære antistoff fortynnet 1:10,000 i 5% BSA, 1 x TTBS.
- Visualisere proteiner med forbedret chemiluminescence og en digital image.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I dette eksperimentet, ble en 25-nt lang fragment av calretinin 3 UTR harboring er motivet (CALB2 3' UTR (er) 25-nt) brukt til å teste om det binder seg spesifikt til Human-antigen R (HuR) protein, en kjent mRNA stabilisator. For å teste spesifisitet er elementet, en 25-nt RNA var sonde CALB2 3' UTR (mtARE) som inneholder et er-motiv mutasjon, som tidligere viste seg å avskaffe stabilisering effekten av er motivet, brukt6. Den tredje RNA sonde representerer negative kontrollen, som er en 28-nt urelaterte RNA som inneholder veldefinerte jern-responsive elementet (urelaterte RNA (irsk)), kjent for binder cytosolic jern-responsive protein13,14. Siden HuR er hovedsakelig lokalisert i kjernen men funksjoner som en mRNA-stabilisator i stoffer15, ble kjernefysiske/cytosolic utvinning utført for å hente aktive proteiner fra stoffer.
For å demonstrere renheten av kjernefysiske/cytosolic fraksjoner, ble proteiner analysert ved Western blot, som viste at α-tubulin ble bare oppdaget i cytosolic fraksjonen, mens PARP protein ble oppdaget bare i kjernefysiske fraksjonen, som forventet ( Figur 1). Eluate fra CALB2 3' UTR er-sonden vist binding av HuR mens HuR var fraværende i eluate fra mutant undersøke CALB 3' UTR (mtARE). HuR var fraværende i eluate fra ubeslektede RNA sonden som binder jern-responsive protein (figur 2A). For å ytterligere demonstrere spesifisitet mellom CALB 3' UTR (er) og HuR, undersøkt membranen i tillegg med anti-mesothelin (MSLN) antistoff, som dette proteinet ikke påvirker RNA. Eluates fra alle tre prøvene viste ingen tilstedeværelsen av mesothelin. Samlet indikerer dette at stabiliserende er motivet i CALB2 3' UTR spesielt kan binde HuR protein.
Coomassie farging av gel (figur 2B) viser at like mye proteiner ble brukt til å ruge med tre forskjellige RNA sonder. Lav mengde cytosolic ekstrakt brukes og overføring til membranen, tillater denne flekker ikke påvisning av proteiner i eluate (E) lanes, som ellers ble oppdaget av Western blot analyse.
Figur 1: Western blot analyse av 5 µg av cytosolic og kjernefysiske protein fraksjon. PARP protein er til stede i kjernefysiske fraksjonen (N), men borte fra cytosolic (C) brøken. Α-tubulin finnes i cytosolic fraksjonen (C), men mangler i kjernefysiske fraksjonen (N). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Western blot viser at HuR fanges opp av 25-nt CALB2 3' UTR (er). A) FT: strømme gjennom etter inkubasjon med RNA sonde; E: proteiner elut på inkubasjon og binding til RNA sonder. Sonder: CALB2 3' UTR (mtARE) - 25-nt fragment av calretinin 3' UTR som inneholder 3 mutert nukleotider i er motivet; UR RNA (irsk) - 28-nt RNA sonde med et veldefinert jern svarer element som binder jern-responsive proteiner. Membranen videre undersøkt for mesothelin (MSLN), et protein som ikke påvirker RNA. B) Coomassie farging av gel etter protein overføring, demonstrere at like mye proteiner ble inkubert med RNA sonder. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| RNA sonde | Sekvens | Konsentrasjon |
| CALB2 3 UTR (er) 25nt | UCGCUGUAUGAUUUAGGCUUCUAUG | 10 ΜM |
| CALB2 3 UTR (mtARE) 25nt | UCGCUGUAUGGUCUGGGCUUCUAUG | 10 ΜM |
| Urelaterte RNA - IRE 28nt | UCCUGCUUCAACAGUGCUUGGACGGAAC | 10 ΜM |
Tabell 1 : Sekvenser av RNA sonder
| Lavere Tris buffer for å kjøre gel | |
| 1,5 M | Tris Base |
| 0.40% | SDS løsning |
| addjust pH til 8,8 bruker HCL (6 mol/L) | |
| Fyll opp med | dH2O |
| Øvre Tris for stabling gel SDS-side | |
| 500 mM | Tris base |
| 0,4% | SDS løsning |
| Justere pH til 6,8 bruker HCL (6 mol/L) | |
| Fyll opp med | dH2O |
| 10 x kjører buffer | |
| 250 mM | Tris base |
| 1.92 M | Glysin |
| Justere pH til 8.3 bruker HCL (6 mol/L) | |
| Fyll opp med | dH2O |
| Filter eller autoklav og butikk på 4° C | |
| 1 X kjører buffer | |
| 100 mL | 10 x kjører buffer |
| 0,05% | SDS løsning |
| Fyll opp til 1 L med | dH2O |
| 10 x overføring Buffer | |
| 480 mM | Tris base |
| 390 mM | Glysin |
| 0,38% | SDS løsning |
| Fyll opp med | dH2O |
| Merk: Filtrere 0.22 um og lagre på 4 ° C | |
| 1 X overføre buffer (for semi-tørr system) | |
| 20 mL | 10 x overføring Buffer |
| 40 mL | metanol |
| Fyll opp til 200 mL | dH20 |
| 10 X TBS (Tris-bufret saltvann) | |
| 250 mM | Tris base |
| 1,36 M | NaCl |
| 27 mM | KCl |
| Justere pH 7,4 | |
| Fyll opp med | dH2O |
| Filter | |
| 1 X TTBS (Tris-buffer saline med 0,1 Tween-20) | |
| 1 X | 10 X TBS |
| 0,10% | Tween-20 |
| Fyll opp med | dH2O |
| RNA fangst Buffer (1 X) | |
| 20 mM | Tris (pH 7.5) |
| 1 M | NaCl |
| 1 mM | EDTA |
| Protein-RNA Binding Buffer (10 x) | |
| 200 mM | Tris (pH 7.5) |
| 500 mM | NaCl |
| 20 mM | MgCl2 |
| 1% | Tween-20 |
| Vaske bufferen (1 x) | |
| 20 mM | Tris (pH 7.5) |
| 10 mM | NaCl |
| 0,1% | Tween-20 |
| Elueringsbufferen | |
| 4 mM | biotin |
| 20 mM | Tris (pH 7.5) |
| 50 mM | NaCl |
| Coomassie løsning | |
| 0.02% | Coomassie G-250 |
| 5% | Aluminiumsulfate-(14-18)-hydrat |
| 10% | EtOH |
| 2% | Orto-phosphoric syre |
Tabell 2: Oppskrifter
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
3 UTRs tilhører ikke-koding genomet3, og alle ikke-koding RNAs kan samhandle med proteiner for å øve deres funksjon7. Når pattedyr genomet ble funnet å være pervasively transkribert og produsert en betydelig del av lang noncoding RNAs16, nye bevis har vist at disse lange-noncoding RNAs fungerer i å regulere genuttrykk når de samhandler med chromatin-remodeling komplekser17. Denne kunnskapen ble oppnådd ved hjelp av RNA-nedtrekk analysen. Dermed for å starte tyde interaktører av en bestemt, kan steg være i vitro biokjemiske analyser som RNA-rullegardinmenyen, som det er enkelt å utføre.
Av notatet spiller ikke bare sekvens motiver, men også sekundære strukturen av RNA en avgjørende rolle i RNA funksjonalitet som utgjør domener avgjørende for samspill med proteiner. Sekundær strukturen kan variere i fysiologiske og i vitro betingelser og RNA-rullegardinmenyen kan føre til identifisering av falsepositives. For eksempel RNA-nedtrekk identifisert EZH2, en komponent i polycomb undertrykkende komplekse 2 (PRC2), som en interactor av X inaktive bestemt transkripsjon (Xist)18, mens en fersk studie som brukes RNA antisense rensing kombinert med masse massespektrometri (RAP-MS) identifisert andre interaktører som skarpe (SMRT og HDAC tilknyttet repressor protein), SAF-1 (stillaset vedlegg faktor A) og LBR (ved B reseptor)19. Derfor, hvis ingen andre funksjonelle tester støtter samspillet mellom en RNA og et bestemt protein, funn bør videre suppleres med en komplementære protein-sentriske tilnærming som immunoprecipitating gitt protein, etterfulgt av utvinning og karakterisering av de bundne.
Den her protokollen presentert er brukt til å oppdage HuR binding til er motivet i CALB2 3' UTR, som tidligere hadde vært funksjonelt preget av pmiRGLO-luciferase analysen6. På grunn av den lille mengden av proteiner er ikke denne protokollen egnet for nedstrøms analyse som massespektrometri hvor større protein beløp er nødvendig. Protokollen kan i stedet brukes til å forlenge RNA-interaktører identifisert av massespektrometri, men med en betydelig lavere mengde proteiner.
Siden metoden omfatter arbeider med RNA, som er utsatt for degradering, anbefaler vi rengjøring arbeider overflater med en RNase-rensing løsning i tillegg til standard god laboratoriepraksis. Hvis mulig, utføre utarbeidelse av RNA merking og rensing under laminær strømning. Renheten av RNA oligo påvirke bindende betingelser; Dermed var kommersielt syntetisert sonder HPLC renset. Hvis endret, lengre og ekstremt rene RNA-oligos er nødvendig, bruker siden rensing metoden. Klargjør dele innfødt proteiner ved snapin frysing, derfor unngå skadelige proteiner treg frysing tilnærming og gjentatt frysing og tining.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de har ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av det sveitsiske National Science Foundation Sinergia grant CRSII3 147697, Stiftung für Angewandte kreftforskning og Zürich Krebsliga.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NE-PER Nuclear and cytoplasmic extraction kit | Thermo Fisher Scientific | 78833 | |
| Pierce Protease Inhibitor Tablets, EDTA-free | Thermo Fisher Scientific | A32965 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| Pierce Magnetic RNA-protein Pull-Down Kit | Thermo Fisher Scientific | 20164 | Includes magnetic beads and therefore the kit need to be stored at 4 °C |
| Pierce RNA 3’ End Desthiobiotinylation Kit | Thermo Fisher Scientific | 20163 | The kit is a part of the "Pierce Magnetic RNA-protein Pull-Down Kit", and needs to be stored at -20 °C unlike the pull-down kit (4 °C). |
| DynaMag-2, magnetic stand | Thermo Fisher Scientific | 12321D | |
| Anti - HuR (MOUSE) monoclonal antibody | Thermo Fisher Scientific | - | The antibody is included in the Pierce Magnetic RNA-protein Pull-Down Kit - 1:1000 in 5% BSA 1x TTBS - rabbit anti-mouse secondary antibody 1:10,000 in 5% BSA 1x TTBS |
| Anti - α - tubulin (MOUSE) monoclonal antibody | Santa Cruz | 8035 | 1:1000 in 5% BSA 1x TTBS - rabbit anti-mouse secondary antibody 1:10,000 in 5% BSA 1x TTBS |
| Anti - PARP (RABBIT) Polyclonal antibody | Cell Signaling | 9542 | 1:1000 in 5% BSA 1x TTBS - goat anti-rabbit secondary antibody 1:10,000 in 5% BSA 1x TTBS |
| Anti - Mesothelin (MOUSE) Monoclonal Antibody | Rockland | 200-301-A87 | |
| Secondary goat anti-rabbit antibody | Cell Signaling | 7074 | |
| Secondary rabbit anti-mouse antibody | Sigma-Aldrich | A-9044 | |
| RPMI - 1640 medium | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| FBS - Filtrated Bovine Serum | Pan Biotech | P40-37500 | |
| Penicillin - streptomycin (100x) | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| L-Glutamine solution (200 mM) | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1x) | Gibco by Life technologies | 25200-056 | |
| Mini-PROTEAN 3 Cell | Bio-Rad | 1653301 | |
| Mini Protean System Glass Plates | Bio-Rad | 1653308 | |
| Mini-PROTEAN Spacer Plates with 1.5 mm integrated spacer | Bio-Rad | 1653312 | |
| Mini-PROTEAN Comb, 10-well, 1.5 mm, 66 µL | Bio-Rad | 1653365 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Cell Casting Modules | Bio-Rad | 1658050 | |
| RNaseZap RNase Decontamination Solution | Thermo Fisher Scientific | AM9780 | |
| Rotiphorese gel 30 - aqueous 30% acrylamide and bisacrylamide stock solution at a ration of 37.5:1 | Roth | 3029 | |
| 20% SDS | PanReac AppliChem | A3942 | |
| PVDF transfer membrane | Perkin Elmer | NEF1002 | Need to be activated by incubating in pure methanol for 1 min followed by washing in water for 2 min |
| Trans-Blot SD semi-dry transfer cell | Bio-Rad | 1703940 | |
| Clarity Western ECL Substrate | Bio-Rad | 1705061 | |
| FusionFX Digital Imager | Vilber | - | |
| RNA oligo synthesis | Mycrosynth AG, Switzerland | - | the synthesis scale - 0.04 µmol - HPLC purified |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7030 | |
| Hydrochloric Acid (HCl) 6 M | PanReac AppliChem | 182883.1211 | |
| Ultra Pure 1 M Tris, pH 7.5 | Thermo Fisher Scientific | 15567027 | |
| Glycerol | Thermo Fisher Scientific | 17904 | 50% sterile aliquots to be stored at -20°C |
| Pierce Streptavidin magnetic beads | Thermo Fisher Scientific | 88817 | Please note that these magnetic beads have an average diameter of 1 µm (range from 0.5 - 1.5 µm). Furthermore, Dynabeads-M280 Streptavidin, which are beads of homogenouse size 2.8 µm, are also used in RNA-pulldown but be aware that this may affect purification process. |
| TEMED | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| Coomassie G-250 | Applichem | A3480 | |
| Aluminiumsulfate-(14-18)-hydrate | Sigma-Aldrich | 368458 | |
| ortho-phosphoric acid | Applichem | A0637 |
References
- Glisovic, T., Bachorik, J. L., Yong, J., Dreyfuss, G. RNA-binding proteins and post-transcriptional gene regulation. FEBS Letters. 582 (14), 1977-1986 (2008).
- Mayr, C. Evolution and biological roles of alternative 3'UTRs. Trends in Cell Biology. 26 (3), 227-237 (2016).
- Matoulkova, E., Michalova, E., Vojtesek, B., Hrstka, R. The role of the 3' untranslated region in post-transcriptional regulation of protein expression in mammalian cells. RNA Biology. 9 (5), 563-576 (2012).
- von Roretz, C., Di Marco, S., Mazroui, R., Gallouzi, I. E. Turnover of AU-rich-containing mRNAs during stress: a matter of survival. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 2 (3), 336-347 (2011).
- Fallmann, J., Sedlyarov, V., Tanzer, A., Kovarik, P., Hofacker, I. L. AREsite2: An enhanced database for the comprehensive investigation of AU/GU/U-rich elements. Nucleic Acids Research. 44, D90-D95 (2016).
- Kresoja-Rakic, J., et al. Posttranscriptional regulation controls calretinin expression in malignant pleural mesothelioma. Frontiers in Genetics. 8 (70), (2017).
- Chu, C., Spitale, R. C., Chang, H. Y. Technologies to probe functions and mechanisms of long noncoding RNAs. Nature Structural & Molecular Biology. 22 (1), 29-35 (2015).
- Diamandis, E. P., Christopoulos, T. K. The biotin-(strept)avidin system: principles and applications in biotechnology. Clinical Chemistry. 37 (5), 625-636 (1991).
- Hirsch, J. D., et al. Easily reversible desthiobiotin binding to streptavidin, avidin, and other biotin-binding proteins: Uses for protein labeling, detection, and isolation. Analytical Biochemistry. 308 (2), 343-357 (2002).
- Thermo Scientific. Magnetic bead technology for better assay development. , Available from: https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/brochures/1602577-Magnetic-Bead-Technology-Brochure.pdf (2013).
- Usami, N., et al. Establishment and characterization of four malignant pleural mesothelioma cell lines from Japanese patients. Cancer Science. 97 (5), 387-394 (2006).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Coulson, R. M., Cleveland, D. W. Ferritin synthesis is controlled by iron-dependent translational derepression and by changes in synthesis/transport of nuclear ferritin RNAs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (16), 7613-7617 (1993).
- Leibold, E. A., Munro, H. N. Cytoplasmic protein binds in vitro to a highly conserved sequence in the 5' untranslated region of ferritin heavy- and light-subunit mRNAs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (7), 2171-2175 (1988).
- Srikantan, S., Gorospe, M. HuR function in disease. Frontiers in Bioscience (Landmark Edition). 17, 189-205 (2012).
- Morris, K. V., Mattick, J. S.
- Rinn, J. L., et al. Functional demarcation of active and silent chromatin domains in human HOX loci by noncoding RNAs. Cell. 129 (7), 1311-1323 (2007).
- Zhao, J., Sun, B. K., Erwin, J. A., Song, J. J., Lee, J. T. Polycomb proteins targeted by a short repeat RNA to the mouse X chromosome. Science. 322 (5902), 750-756 (2008).
- McHugh, C. A., et al. The Xist lncRNA interacts directly with SHARP to silence transcription through HDAC3. Nature. 521 (7551), 232-236 (2015).
