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Cancer Research

Desthiobiotin-Streptavidin का संबंध-आरएनए की मध्यस्थता शुद्धि-Mesothelioma कोशिकाओं में प्रोटीन बातचीत

Published: April 25, 2018 doi: 10.3791/57516
Automatic Translation
1, 1
1Laboratory of Molecular Oncology, Division of Thoracic Surgery, University Hospital Zurich

Summary

एक सिंथेटिक 25-न्यूक्लियोटाइड आरएनए oligo के Desthiobiotin लेबलिंग, जिसमें adenine-रिच तत्व (ARE) आकृति है, cytosolic की विशिष्ट बाइंडिंग की अनुमति देता है-बाध्यकारी प्रोटीन ।

Abstract

इन विट्रो में आरएनए-pulldown अभी भी मुख्यतः आरएनए-बाइंडिंग प्रोटीन है कि विशिष्ट आरएनए संरचनाओं और रूपांकनों पहचान की पहचान करने के उद्देश्य से प्रोटोकॉल के पहले कदम में प्रयोग किया जाता है । इस आरएनए-pulldown प्रोटोकॉल में, व्यावसायिक रूप से संश्लेषित आरएनए जांच में बायोटिन की एक संशोधित रूप के साथ लेबल किया गया है, desthiobiotin, आरएनए कतरा के 3 ' टर्मिनस पर, जो streptavidin को reversibly बांधता है और इस प्रकार अधिक शारीरिक के तहत प्रोटीन के रेफरेंस की अनुमति देता है शर्तों. आरएनए-desthiobiotin चुंबकीय मोतियों पर streptavidin के साथ बातचीत के माध्यम से मैटीरियल है, जो प्रोटीन है कि विशेष रूप से ब्याज की आरएनए के साथ बातचीत नीचे खींचने के लिए उपयोग किया जाता है । गैर विकृत और mesothelioma कोशिकाओं के cytosolic अंश से सक्रिय प्रोटीन प्रोटीन के स्रोत के रूप में इस्तेमाल कर रहे हैं । विधि यहां वर्णित आरएनए बाइंडिंग प्रोटीन और एक 25-न्यूक्लियोटाइड (nt) लंबी शाही सेना ब्याज की एक अनुक्रम युक्त जांच के बीच बातचीत का पता लगाने के लिए लागू किया जा सकता है । यह स्थिर या आरएनए एक रिपोर्टर वेक्टर परख का उपयोग हासिल अणुओं में मौजूद तत्वों को स्थिर करने के कार्यात्मक लक्षण पूरा करने के लिए उपयोगी है ।

Introduction

जीन अभिव्यक्ति और जीन उत्पाद के अंतिम स्तर को mRNA स्थिरता और mRNA अनुवाद दर1को प्रभावित करके कसकर विनियमित किया जा सकता है । ये पोस्ट-transcriptional विनियामक तंत्र लक्षित mRNA के साथ गैर कोडिंग आरएनए और/या आरएनए-बाइंडिंग प्रोटीन (RBPs) की सहभागिता के माध्यम से लागू होते हैं । यह आमतौर पर mRNA के 3 ' unमराठीमध्ये क्षेत्र (3 ' UTR-जीनोम के गैर कोडिंग भाग2) है कि विशिष्ट सीआईएसविनियामक तत्व (CRE) है, जो ट्रांसद्वारा मांयता प्राप्त कर रहे है-अभिनय कारकों जैसे miRNA या RBPs 3. सबसे अच्छा अध्ययन सीआईएस-3 ' UTR के भीतर तत्व, adenine-रिच तत्व (हैं) आकृति, जो विशिष्ट AU-बाइंडिंग प्रोटीन (AUBP) द्वारा पहचाना जाता है, और, बारी में, या तो mRNA क्षरण/deadenylation (हैं-मध्यस्थता क्षय) या mRNA स्थिरीकरण4.

3 ' UTR ऑफ calretinin mRNA (CALB2) का आकार ५७३ bp लंबा है और इसमें ख्यात AUUUA pentamer है, जैसा कि AREsite2 द्वारा अनुमानित है, एक bioinformatic टूल5। एक ख्यात की उपस्थिति के अनुरूप आकृति रहे हैं, pmirGLO वेक्टर रिपोर्टर परख CALB2 mRNA6के भीतर इस तत्व की एक स्थिरीकरण भूमिका का प्रदर्शन किया । अंत में, इन विट्रो आरएनए-pulldown AUBP की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया गया था कि स्थिर calretinin mRNA के माध्यम से कर रहे हैं आकृति.

के बाद से सभी गैर कोडिंग RNAs प्रोटीन के साथ बातचीत7, इन विट्रो आरएनए-pulldown एक अच्छा तरीका है और आरएनए-बातचीत करने के लिए आणविक तंत्र को समझने में सहायता के लिए पहली पसंद परख है । इस शाही सेना-pulldown विधि में, व्यावसायिक रूप से संश्लेषित आरएनए जांच, जो एक संशोधित रूप में बायोटिन (desthiobiotin) के साथ लेबल किया गया था 3 ' आरएनए किनारा के टर्मिनस, इस्तेमाल किया गया. आरएनए-desthiobiotin चुंबकीय मोतियों पर streptavidin के साथ बातचीत के माध्यम से मैटीरियल है, जो प्रोटीन है कि विशेष रूप से ब्याज की बाध्य-आरएनए के साथ बातचीत नीचे खींचने के लिए उपयोग किया जाता है । गैर विकृत और mesothelioma कोशिकाओं के cytosolic अंश से सक्रिय प्रोटीन प्रोटीन के स्रोत के रूप में इस्तेमाल कर रहे हैं । इस तरह के आरएनए-बाउंड प्रोटीन चुंबकीय मोतियों से eluted होते हैं, 12% एसडीएस-पेज जेल के माध्यम से चलाए जाते हैं, एक झिल्ली में स्थानांतरित होते हैं, और विभिन्न एंटीबॉडी के साथ जांच की जाती है ।

मानक streptavidin-बायोटिन संबध शुद्धिकरण प्रक्रिया में, कठोर विकार स्थितियों के लिए मजबूत अपरिवर्तनीय बायोटिन-streptavidin बंधन को बाधित करने के लिए बाध्य प्रोटीन8elute के लिए आवश्यक हैं, जो की पृथक्करण के लिए नेतृत्व कर सकते है प्रोटीन कॉंप्लेक्स । बायोटिन के विपरीत, desthiobiotin reversibly streptavidin को बांधता है और प्रतिस्पर्धात्मक रूप से बायोटिन की एक बफर समाधान के साथ विस्थापित है, प्रोटीन की कोमल रेफरेंस के लिए अनुमति है, और स्वाभाविक रूप से biotinylated अणुओं के अलगाव से परहेज9, सुझाव है कि तकनीक देशी शर्तों के तहत मूल प्रोटीन परिसरों अलग करने के लिए आदर्श है ।

इन विट्रो में शर्तों और stringency, जो नमक एकाग्रता द्वारा निर्धारित कर रहे हैं, एजेंटों और डिटर्जेंट प्रतिशत को कम करने, सेलुलर संदर्भ में मौजूद उन लोगों के लिए करीब होना चाहिए ताकि vivo बातचीत में सच की पहचान करने के लिए । बाध्यकारी शर्तों के साथ साथ लागू किया गया है पहले एक AU-बाध्यकारी प्रोटीन के रूप में हूर की पहचान के लिए उपयुक्त के रूप में प्रदर्शन10। इस दृष्टिकोण समय बचा सकता है, उचित बाध्यकारी शर्तों के अनुकूलन के बाद से समय लेने वाली और चुनौतीपूर्ण हो सकता है । इसके अलावा, इस विधि किसी भी शाही सेना-pulldown प्रयोग के लिए एक प्रारंभिक प्रोटोकॉल के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है और धीरे से नमक और डिटर्जेंट की एकाग्रता को बदलने, ग्लिसरॉल प्रतिशत बदलने, और अंय लवण जोड़ने के द्वारा अनुकूलित किया जा सकता है । इसके अलावा, हम भी एक छोटी 25 न्यूक्लियोटाइड आरएनए-जांच एक pentamer बंदरगाह-आकृति एक विशिष्ट AUBP के साथ बातचीत का प्रदर्शन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि प्रदर्शन किया ।

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Protocol

1. Cytosolic और परमाणु प्रोटीन अंश तैयार करना

  1. प्लेट 4 x 106 एसीसी-मेसो-4 कोशिकाओं में एक T150 सेल संस्कृति कुप्पी में उगाया RPMI-१६४० मध्यम 10% FBS के साथ पूरक, 1x पेनिसिलिन/streptomycin (100x), और 2 मिमी L-Glutamine (२०० मिमी). जब कोशिकाओं 80-90% (~ 5-5.5 x 106 कोशिकाओं) के एक संगम तक पहुंचने, परमाणु और cytosolic अंश के प्रोटीन निष्कर्षण के साथ आगे बढ़ना ।
    नोट: एसीसी-मेसो-4 सेल लाइन आरआईकेईएन संसाधन केंद्र11से प्राप्त किया गया था ।
  2. महाप्राण मध्यम, 1x पंजाब के 15 मिलीलीटर जोड़कर कोशिकाओं को धोने, प्लेट धीरे से झुकाएं कई बार और 1x पंजाबियों महाप्राण । ०.२५% Trypsin-EDTA के 3 मिलीलीटर जोड़ें और 3 मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति कुप्पी गर्मी ।
    नोट: टुकड़ी के लिए माइक्रोस्कोप के तहत कोशिकाओं को देखो; यदि अभी भी संलग्न एक हाथ की हथेली के खिलाफ कुप्पी नल 3 बार ।
  3. RPMI-१६४० मध्यम 10% FBS, 1x पेनिसिलिन/streptomycin (100x), और 2 मिमी L-Glutamine (२०० मिमी) के साथ पूरक के 7 मिलीलीटर जोड़ें, एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में कोशिकाओं को इकट्ठा, और 5 मिनट के लिए २०० x g पर नीचे स्पिन ।
  4. महाप्राण मध्यम और 1x पंजाबियों की १.५ मिलीलीटर के साथ reसस्पेंड सेल गोली, तो एक १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में कोशिकाओं को हस्तांतरण । 5 मिनट के लिए ५०० x g और 4 ° c पर नीचे स्पिन । supernatant को छोड़ें ।
    नोट: इस कदम के बाद से, 4 डिग्री सेल्सियस पर सभी केंद्रापसारक कदम प्रदर्शन और बर्फ पर सभी रिएजेंटों रखो ।
  5. 1x पंजाब के बर्फ ठंड १.५ मिलीलीटर के साथ सेल गोली reसस्पेंड और 3 मिनट के लिए ५०० x g और 4 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को नीचे स्पिन । supernatant को त्यागें ।
    नोट: CER मैं, CER द्वितीय के लिए आवश्यक मात्रा, और नेर रिएजेंट 10, ०.५५, और अनुमानित सेल गोली पैक मात्रा के 5 संस्करणों, क्रमशः कर रहे हैं; निम्न प्रोटोकॉल 20 µ l का वॉल्यूम मानता है । हम अनुशंसा करते हैं केवल आवश्यक राशि के एजेंट CER I की तैयारी कर रहा है ।
  6. जोड़ें २०० बर्फ के µ एल-शीत cytoplasmic निष्कर्षण रिएजेंट (CER मैं) 1x proteinase अवरोध करनेवाला के 2 µ एल के साथ पूरक, उदा, EDTA स्टॉक प्राप्त करने के लिए पानी की ५०० µ l में चिढ़ाना अवरोधक (100x-free) के 1 गोली पतला । reagent CER मैं एक सेल गोली पैक मात्रा के 20 µ एल लाइसे करने के लिए पर्याप्त है की यह राशि ।
    1. सेल गोली पैक मात्रा का अनुमान लगाने के लिए, एक १.५ मिलीलीटर ट्यूब 10, 20, ५० या १०० 1x पंजाबियों के µ एल के साथ भरा के साथ सेल गोली से युक्त ट्यूब की तुलना करें ।
  7. सख्ती से 15 एस के लिए ट्यूब भंवर और 10 मिनट के लिए बर्फ पर ट्यूब मशीन द्वारा सेल गोली reसस्पेंड । बर्फ के 11 µ एल जोड़ें-शीत cytoplasmic निष्कर्षण रिएजेंट द्वितीय (CER द्वितीय) ट्यूब करने के लिए, 5 एस के लिए जोरदार भंवर, और बर्फ पर 1 मिनट की मशीन ।
  8. भंवर सख्ती 5 एस के लिए और १६,००० x g और 4 ° c 5 मिनट के लिए पर ट्यूब केंद्रापसारक और supernatant बर्फ पर स्वच्छ पूर्व ठंडा ट्यूब स्थानांतरण । supernatant cytoplasmic अंश है जिसे आगे आरएनए-pulldown प्रयोग में प्रयोग किया जाता है ।
  9. बर्फ के १०० µ एल में शेष गोली reसस्पेंड-शीत परमाणु निष्कर्षण रिएजेंट (नेर) 1 µ एल के साथ पूरक proteinase अवरोध करनेवाला (100x) और 15 एस के लिए जोरदार भंवर । हम केवल आवश्यक राशि की तैयारी की अनुशंसा करते हैं नेर रिएजेंट को छेड़ने वाले अवरोधकों के साथ पूरक ।
  10. 15 एस के लिए सामयिक भंवर के साथ ४० मिनट के लिए बर्फ पर नमूना मशीन (हर 10 मिनट) ।
  11. 10 मिनट के लिए १६,००० x g पर ट्यूब केंद्रापसारक । स्थानांतरण supernatant (यह परमाणु प्रोटीन अंश है) एक साफ पूर्व ठंडा ट्यूब ।
  12. bicinchoninic (बीसीए) विधि का उपयोग करके प्रोटीन एकाग्रता को मापने के द्वारा तुरंत आगे बढ़ें ( सामग्री की तालिकादेखें) । प्रत्येक अंश के प्रोटीन शुद्धता के लिए नियंत्रण करने के लिए, α-tubulin (केवल cytosolic अंश में सकारात्मक पहचान) और पाली ADP-ribose पोलीमरेज़-प्प (केवल परमाणु अंश में सकारात्मक पहचान) के खिलाफ immunoblotting (चित्रा 1) प्रदर्शन । प्रोटीन विज़ुअलाइज़ेशन के लिए, अनुभाग 4 देखें.
  13. प्रोटीन गतिविधि और उनके पैतृक राज्य रखने के लिए, cytosolic और नाभिकीय अर्क के aliquots के 25 µ एल तैयार करें । स्नैप-फ्रीज इन aliquots को लिक्विड नाइट्रोजन में 5 एस और स्टोर के लिए सीधे-८० डिग्री सेल्सियस पर रखकर रखें ।

2. Desthiobiotin के साथ आरएनए के लेबल

  1. आरएनए जांच व्यावसायिक रूप से संश्लेषित और HPLC शुद्ध । nuclease-फ्री वॉटर के साथ 10 µ मीटर पर रिसस्पेंड ।
    नोट: जांच अनुक्रम तालिका 1में सूचीबद्ध होते हैं ।
  2. आरएनए-pulldown प्रतिक्रिया के प्रति आरएनए के ५० pmol का उपयोग करें. गल और खूंटी 30% के लिए छोड़कर बर्फ पर सभी रिएजेंटों रखने के लिए, ' 3 आरएनए oligo के लेबल के लिए इस्तेमाल किया ।
  3. 10 µ m आरएनए जांच के 5 µ l का अंतरण, CALB2 3 ' UTR (ARE), CALB2 3 ' UTR (mtARE), और असंबंधित-आरएनए (गुस्सा) के रूप में लेबल, ०.५ मिलीलीटर पतली दीवार microcentrifuge ट्यूबों और 5 मिनट के लिए ८५ डिग्री सेल्सियस पर एक पीसीआर मशीन में मशीन में । बर्फ पर ट्यूबों तुरंत रखें ।
    नोट: यह चरण महत्वपूर्ण है, क्योंकि यह लेबलिंग के लिए आरएनए जांच की छूट और पहुंच को बढ़ावा देता है ।
  4. एक एकल 30 µ l प्रतिक्रिया के लिए, आरएनए-युक्त ट्यूब में जोड़ें निम्नलिखित 10 µ एल मिक्स: 3 µ एल ऑफ nuclease फ्री वाटर, 3 µ एल ऑफ 10x आरएनए Ligase रिएक्शन बफर, 1 µ एल ऑफ RNase अवरोधक (४० यू/µ एल), 1 µ एल के Desthiobiotinylated Cytidine Bisphosphate (1 मि.) , और टी-4 आरएनए ligase के 2 µ एल (20 यू/µ एल).
    नोट: (३.२) अतिरिक्त में 3 नमूनों के लिए मास्टर मिक्स ए तैयार करने के लिए, nuclease मुक्त पानी के ९.६ µ एल मिश्रण, 10x आरएनए Ligase प्रतिक्रिया बफर के ९.६ µ एल, RNase अवरोध करनेवाला के ३.२ µ एल (४० यू/µ एल), ३.२ µ एल के Desthiobiotinylated Cytidine Bisphosphate (1 मिमी), और टी-4 आरएनए µ के ६.४ Ligase एल (20 यू/µ एल).
  5. सावधानी से जोड़ें 15 खूंटी के µ एल प्रतिक्रिया करने के लिए 30%. प्रतिक्रिया मिश्रण करने के लिए एक और टिप का प्रयोग करें । 16 डिग्री सेल्सियस पर रात भर प्रतिक्रिया की मशीन ।
  6. अगले दिन, निंनलिखित तैयार: 5 एम NaCl (ताजा/nuclease-मुक्त), क्लोरोफॉर्म: 24:1 अनुपात में isoamyl शराब (उदा, प्रति प्रतिक्रिया-९६ µ एल क्लोरोफॉर्म और µ शराब के 4 isoamyl एल), बर्फ ठंडा १००% इथेनॉल, और बर्फ ठंडा ७०% इथेनॉल ।
  7. आरएनए-लेबलिंग रिएक्शन ट्यूबों के लिए nuclease-नि: शुल्क पानी के ७० µ एल जोड़ें । जोड़ें १०० µ क्लोरोफॉर्म के एल: isoamyl शराब और भंवर संक्षेप में । स्पिन-3 मिनट के लिए १३,००० x g पर नीचे । ध्यान से केवल ऊपरी चरण निकालें और एक नया nuclease-मुक्त १.५ एमएल ट्यूब करने के लिए स्थानांतरण; निचले चरण को छूने से बचें ।
  8. 5 एम NaCl के 10 µ l को जोड़ें, ग्लाइकोजन के 1 µ l को और बर्फ के ३०० µ l को ठंडा १००% इथेनॉल । 2 एच के लिए-20 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूब प्लेस
    नोट: इस कदम पर, प्रयोग अगले दिन पर जारी रखा जा सकता है ।
  9. 15 मिनट के लिए १३,००० x g और 4 ° c पर केंद्रापसारक । ध्यान से गोली परेशान बिना supernatant त्यागें । बर्फ के ३०० µ एल-ठंडा ७०% इथेनॉल जोड़ें और १३,००० x जी और 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर फिर से केंद्रापसारक ।
  10. supernatant पूरी तरह से त्यागें और हवा सूखी गोली (15 मिनट) । nuclease-मुफ्त पानी की 20 µ एल में गोली स्थगित ।
    नोट: एक ही दिन में आरएनए-pulldown के साथ आगे बढ़ें ।
  11. बर्फ पर 2 मिनट और जगह के लिए ९० ° c पर आरएनए मशीन । streptavidin चुंबकीय मोतियों की पूर्व धुलाई के निम्न चरण के दौरान इस पर बला-आरएनए बर्फ लगाएं ।
    नोट: एक लंबी गर्मी समय आरएनए जांच नुकसान हो सकता है ।

3. आरएनए-प्रोटीन Pulldown

  1. पूर्व धुलाई streptavidin-चुंबकीय मोती और desthiobiotin के साथ मशीन-आरएनए
    1. ५० pmol आरएनए प्रति streptavidin चुंबकीय मोतियों की ५० µ एल का प्रयोग करें । हालांकि, इस प्रयोग के आधार पर अनुकूलित किया जाना चाहिए ।
    2. भंवर streptavidin के साथ ट्यूब-चुंबकीय मोती 15 एस के लिए, और जल्दी से हटा २०० µ एल (मास्टर मिक्स, 3 + 1 प्रतिक्रियाओं के लिए पर्याप्त) एक साफ १.५ मिलीलीटर में सुरक्षित-लॉक ट्यूब कट पिपेट सुझावों का उपयोग कर । एक चुंबकीय स्टैंड पर ट्यूब रखें ताकि मोती ट्यूब के पक्ष में इकट्ठा और इंतजार 1 min. resuspension तरल निकालें ।
    3. मोतियों को धोने के लिए, चुंबकीय स्टैंड से ट्यूब हटाने, ०.१ मीटर NaOH, ०.०५ मीटर NaCl समाधान के ४०० µ एल जोड़ें, और धीरे प्लास्टिक ऊपर और नीचे कई बार । ट्यूब वापस चुंबकीय स्टैंड पर जगह है । 1 मिनट रुको और supernatant इकट्ठा । इस चरण को फिर से दोहराएं ।
    4. १०० mM NaCl के २०० µ l के साथ मोतियों को धो लें । supernatant निकालें ।
    5. 20 मिमी Tris (पीएच ७.५) के २०० µ एल जोड़ें, pipetting द्वारा मोती reसस्पेंड, चुंबकीय स्टैंड पर ट्यूब जगह है, 1 मिनट के लिए प्रतीक्षा करें और supernatant को हटा दें । चरण दोहराएं ।
    6. चुंबकीय स्टैंड से ट्यूब निकालें, 1x आरएनए पर कब्जा बफर के २०० µ एल जोड़ने के लिए, और संक्षेप में भंवर से streptavidin चुंबकीय मोती reसस्पेंड । streptavidin चुंबकीय मोतियों की ५० µ एल निकालें और प्रत्येक लेबल-आरएनए ट्यूब एक कट पिपेट टिप का उपयोग करने के लिए जोड़ें । एक रोलर पर कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए ट्यूब की मशीन ।
  2. आरएनए के लिए प्रोटीन की बाइंडिंग
    1. एक चुंबकीय स्टैंड में ट्यूबों प्लेस, 1 मिनट रुको, और supernatant को हटा दें ।
    2. जोड़ें ५० 20 मिमी Tris (पीएच ७.५) के µ एल मोतियों को और pipetting द्वारा reसस्पेंड । एक चुंबकीय स्टैंड में ट्यूबों प्लेस, 1 मिनट रुको, और supernatant हटा दें । इस चरण को दोहराएं ।
    3. 1x प्रोटीन के १०० µ एल जोड़ें-आरएनए बाइंडिंग बफर और pipetting द्वारा reसस्पेंड ।
    4. इस बीच, निम्नलिखित मिश्रण तैयार: 10x प्रोटीन के 10 µ एल-आरएनए बाइंडिंग बफर, ५०% ग्लिसरॉल के 30 µ एल, cytoplasmic प्रोटीन के ५० µ जी, और nuclease-मुक्त पानी अप करने के लिए १०० µ एल
      नोट: मास्टर मिक्स B अतिरिक्त (३.३) में 3 नमूनों के लिए निम्नानुसार तैयार: ३३ µ एल के 10x प्रोटीन-आरएनए बाइंडिंग बफर, ९९ µ एल के ५०% ग्लिसरॉल, १६५ µ जी के cytoplasmic प्रोटीन्स और nuclease-फ्री वॉटर अप ३३० µ एल. आइस पर मास्टर मिक्स बी की ट्यूब रखें ।
    5. चुंबकीय स्टैंड में ट्यूबों प्लेस, 1 मिनट रुको और supernatant इकट्ठा । मास्टर मिक्स बी के १०० µ एल जोड़ें, धीरे ऊपर और नीचे pipetting द्वारा reसस्पेंड, और बुलबुले बनाने से बचें । एक रोलर पर 4 डिग्री सेल्सियस पर ६० मिनट के लिए मशीन प्रतिक्रिया ट्यूबों ।
  3. वॉशिंग और रेफरेंस
    1. एक चुंबकीय स्टैंड में ट्यूबों प्लेस, supernatant इकट्ठा (जो फुट के माध्यम से प्रवाह है), और एक नया ट्यूब में स्थानांतरण ।
      नोट: बाद में विश्लेषण के लिए बर्फ पर इस फुट रखो ।
    2. पिपेट १०० µ एल 1x धोने बफर के मोतियों पर, धीरे reसस्पेंड, चुंबकीय स्टैंड में वापस डाल दिया, 1 मिनट रुको, और supernatant त्यागें । इस चरण को 2 बार दोहराएं ।
    3. चुंबकीय मोती के लिए रेफरेंस बफर के ४० µ एल जोड़ें, ऊपर और नीचे pipetting द्वारा मिश्रण, और 30 मिनट के लिए एक ट्यूब शेखर (९५० rpm) पर ३७ डिग्री सेल्सियस पर मशीन ।
    4. एक चुंबकीय स्टैंड में ट्यूबों प्लेस, 1 मिनट रुको, और eluted नमूना इकट्ठा (जो eluate-E है) । बर्फ पर प्लेस और बहाव विश्लेषण के लिए उपयोग करें ।
      नोट: इस कदम पर, प्रत्येक परीक्षण आरएनए जांच एक प्रवाह के माध्यम से (फुट) और eluate (ई) नमूना होते हैं ।

4. Polyacrylamide ट्रो और वेस्टर्न ब्लाट विश्लेषण

नोट: इस खंड में उपयोग किए गए बफ़र्स के लिए व्यंजनों के लिए तालिका 2 देखें । Laemmli विधि12के अनुसार एक पश्चिमी दाग प्रदर्शन ।

  1. Handcast 12% एसडीएस-पेज जैल (10 कुओं, १.५ mm स्पेसर, ६६ µ एल) । एक चल जेल मिश्रण तैयार: 30% acrylamide-bisacrylamide स्टॉक समाधान के 4 मिलीलीटर, लोअर Tris बफर के २.४ मिलीलीटर, डीएच के ३.२ मिलीलीटर2हे, ९.६ µ एल के TEMED, ९६ µ एल के 10% अमोनियम persulfate सॉल्यूशन (अनुप) । तैयार स्टैकिंग जेल मिक्स: ३.२५ मिलीलीटर की डीएच2हे, ०.५ मिलीलीटर की 30% acrylamide-bisacrylamide स्टॉक समाधान, १.३ मिलीलीटर की ऊपरी Tris बफर, 10 µ एल के TEMED, 20 µ एल के 10% एपीएस ।
  2. 6x Laemmli बफर के १६.६ µ l को जोड़ें (उदा., 14 मिलीलीटर की Tris/HCl/एसडीएस pH ६.८ (ऊपरी Tris बफ़र), एसडीएस के 2 जी, डीटीटी के १.८६ ग्राम, ग्लिसरॉल के 6 मिलीलीटर, और ०.०१२% bromophenol नीला; में-20 डिग्री सेल्सियस) में संग्रहित FT नमूना, और ६.६ µ एल के 6x Laemmli बफर में ई नमूना । ९५ डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए मशीन नमूने ।
  3. नमूने लोड (20 फुट और पूरे Elute के µ एल ~ ४० µ एल) और उंहें 30 मिनट के लिए ६० v पर चलाने के लिए, 20 v रातोंरात के साथ जारी है ।
  4. एक अर्द्ध शुष्क electroblotting प्रणाली का प्रयोग, ८० मिनट के लिए 15 वी में एक PVDF झिल्ली पर प्रोटीन हस्तांतरण ।
    नोट: PVDF झिल्ली प्रोटीन स्थानांतरण प्रदर्शन करने से पहले सक्रिय किया जाना चाहिए । 1 मिनट के लिए १००% मेथनॉल में झिल्ली की मशीन, ultrapure पानी में एक 2 मिनट की मशीन द्वारा पीछा किया ।
  5. प्रोटीन हस्तांतरण के बाद, एसडीएस-3 एच के लिए Coomassie समाधान के साथ पृष्ठ जेल, ultrapure पानी के साथ धोने के तीन कदम, प्रत्येक 30 मिनट के बाद मशीन ।
  6. प्रोटीन अंतरण के अंत में, PVDF झिल्ली को 1 घंटे के लिए सूखने दें, चरण ४.५ में दर्शाई गई झिल्ली को पुनः सक्रिय करें । ब्लॉक झिल्ली 1 h 1x TTBS में 5% BSA के साथ ।
  7. पहली एंटीबॉडी के साथ झिल्ली की मशीन: हूर या mesothelin, दोनों पतला 1:1000 5% BSA में 1x TTBS में 4h के लिए कमरे के तापमान पर या रात में 4 डिग्री सेल्सियस ।
  8. 1x TTBS में 7 मिनट के लिए तीन बार झिल्ली धो लो, और खरगोश विरोधी माउस सहिजन peroxidase (एचआरपी) के साथ मशीन-संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी पतला 1:10000 में 5% BSA, 1x TTBS ।
  9. बढ़ाया chemiluminescence और एक डिजिटल imager का उपयोग कर प्रोटीन कल्पना ।

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Representative Results

इस प्रयोग में, calretinin 3 ' UTR हार्बर के एक 25-nt लंबे अंश आकृति (CALB2 3 ' UTR (are) 25-nt) का परीक्षण करने के लिए उपयोग किया गया था कि क्या यह विशेष रूप से मानव के लिए बाइंड कर देता है-प्रतिजन आर (हूर) प्रोटीन, एक ज्ञात mRNA स्थिरता । की विशिष्टता का परीक्षण करने के लिए कर रहे है तत्व, एक 25-nt आरएनए जांच CALB2 3 ' UTR (mtARE) युक्त कर रहे है आकृति उत्परिवर्तन, जो पहले से कर रहे है आकृति के स्थिरीकरण प्रभाव को समाप्त करने के लिए दिखाया गया है, इस्तेमाल किया गया था6। तीसरे आरएनए जांच नकारात्मक नियंत्रण है, जो एक 28-nt असंबंधित आरएनए है कि अच्छी तरह से परिभाषित लौह-उत्तरदायी तत्व (असंबंधित आरएनए (गुस्सा)), cytosolic लौह प्रतिक्रियाशील प्रोटीन13,14बाँध करने के लिए जाना जाता है का प्रतिनिधित्व करता है । चूंकि हूर predominately नाभिक के भीतर स्थानीयकृत है, लेकिन एक mRNA-cytosol में स्थिरता के रूप में कार्य करता है15, नाभिकीय/cytosolic निष्कर्षण cytosol से सक्रिय प्रोटीन प्राप्त करने के लिए किया गया था ।

परमाणु/cytosolic अंशों की पवित्रता का प्रदर्शन करने के लिए, प्रोटीन पश्चिमी दाग है, जो पता चला है कि α-tubulin केवल cytosolic अंश में पाया गया था द्वारा विश्लेषण किया गया है, जबकि प्प प्रोटीन केवल परमाणु अंश में पाया गया था, के रूप में प्रत्याशित ( चित्र 1) । CALB2 3 ' UTR से eluate-जांच-हूर का प्रदर्शन बंधन है जबकि हूर के उत्परिवर्ती जांच CALB 3 ' UTR (mtARE) से eluate में अनुपस्थित था । हूर असंबद्ध आरएनए जांच से eluate में भी अनुपस्थित थी जो लौह-प्रतिक्रियाशील प्रोटीन (चित्र 2a) को बांधती है । आगे CALB 3 ' UTR (रहे हैं) और हूर के बीच विशिष्टता का प्रदर्शन करने के लिए, झिल्ली इसके अतिरिक्त विरोधी mesothelin (MSLN) एंटीबॉडी के साथ जांच की थी, के रूप में इस प्रोटीन आरएनए के साथ बातचीत नहीं करता है । तीनों नमूनों से Eluates ने mesothelin की कोई उपस्थिति नहीं दिखाई. एक साथ लिया, यह इंगित करता है कि स्थिर CALB2 3 के भीतर आकृति रहे है ' UTR विशेष रूप से हूर प्रोटीन बांध कर सकते हैं ।

जेल के दाग Coomassie (चित्रा बी) से पता चलता है कि प्रोटीन के बराबर मात्रा में तीन अलग आरएनए जांच के साथ मशीन का इस्तेमाल किया गया । क्योंकि cytosolic निकालने की कम राशि का इस्तेमाल किया और झिल्ली को हस्तांतरण, इस दाग eluate में प्रोटीन का पता लगाने के लिए अनुमति नहीं दी (ई) गलियों, जो अंयथा पश्चिमी दाग विश्लेषण से पता लगाया गया ।

Figure 1
चित्र 1: cytosolic और परमाणु प्रोटीन अंश के 5 µ g के पश्चिमी दाग विश्लेषण । प्प प्रोटीन नाभिकीय अंश (N) में मौजूद है लेकिन cytosolic (C) अंश से अनुपस्थित है । α-tubulin cytosolic अंश (C) में विद्यमान है किन्तु नाभिकीय अंश (N) में अनुपस्थित । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: पश्चिमी दाग से पता चलता है कि हूर 25-nt CALB2 3 ' UTR (ARE) द्वारा कब्जा कर लिया है । A) एफटी: आरएनए जांच के साथ मशीन के बाद प्रवाह; ई: प्रोटीन मशीन पर eluted और आरएनए जांच के लिए बाध्य । जांच: CALB2 3 ' UTR (mtARE)-25-nt टुकड़ा calretinin 3 ' UTR कि आकृति के भीतर 3 रूपांतरित न्यूक्लियोटाइड शामिल हैं; उ० आरएनए (गुस्सा)-28-nt आरएनए जांच लौह-उत्तरदायी प्रोटीन बांधता है कि एक अच्छी तरह से परिभाषित लौह-उत्तरदायी तत्व के साथ. झिल्ली आगे mesothelin (MSLN), एक प्रोटीन है कि आरएनए के साथ बातचीत नहीं करता है के लिए जांच की थी । ख) प्रोटीन हस्तांतरण के बाद जेल के Coomassie धुंधला, प्रदर्शन है कि प्रोटीन की बराबर मात्रा आरएनए जांच के साथ मशीन थे । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

आरएनए जांच अनुक्रम एकाग्रता
CALB2 3 ' UTR (ARE) 25nt UCGCUGUAUGAUUUAGGCUUCUAUG १० µ मी
CALB2 3 ' UTR (mtARE) 25nt UCGCUGUAUGGUCUGGGCUUCUAUG १० µ मी
असंबंधित आरएनए-गुस्सा 28nt UCCUGCUUCAACAGUGCUUGGACGGAAC १० µ मी

तालिका 1 : आरएनए जांच का जुगाड़

जेल चलाने के लिए लोअर Tris बफर
१.५ मीटर Tris आधार
०.४०% एसडीएस समाधान
addjust पीएच के लिए ८.८ एचसीएल का प्रयोग (6 मॉल/
से भरें dH2O
स्टैकिंग जेल एसडीएस के लिए ऊपरी Tris-PAGE
५०० एमएम Tris आधार
०.४% एसडीएस समाधान
६.८ के लिए पीएच का उपयोग कर समायोजित करें एचसीएल (6 मॉल/
से भरें dH2O
10x चल रहे बफर
२५० एमएम Tris आधार
१.९२ मीटर Glycine
८.३ के लिए पीएच का उपयोग कर समायोजित करें एचसीएल (6 मॉल/
से भरें dH2O
4 ° c पर फ़िल्टर या आटोक्लेव और स्टोर करें
1x चल बफर
१०० एमएल 10x चल रहे बफर
०.०५% एसडीएस समाधान
भरने के लिए 1 एल के साथ dH2O
10x स्थानांतरण बफर
४८० एमएम Tris आधार
३९० एमएम Glycine
०.३८% एसडीएस समाधान
से भरें dH2O
नोट: फ़िल्टर ०.२२ उम और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर
1x स्थानांतरण बफर (अर्द्ध शुष्क प्रणाली के लिए)
20 मिलीलीटर 10x स्थानांतरण बफर
४० एमएल मेथनॉल
२०० मिलीलीटर तक भरें dH20
10x टीबीएस (Tris-खारा)
२५० एमएम Tris आधार
१.३६ मीटर Nacl
27 एमएम KCl
७.४ को पीएच समायोजित करें
से भरें dH2O
फ़िल्टर
1x TTBS (Tris-०.१ के बीच-20 के साथ बफर खारा)
1X 10x टीबीएस
०.१०% के बीच-20
से भरें dH2O
आरएनए कैप्चर बफ़र (1x)
20 एमएम Tris (पीएच ७.५)
1 मीटर Nacl
1 मिमी EDTA
प्रोटीन-आरएनए बाइंडिंग बफर (10x)
२०० एमएम Tris (पीएच ७.५)
५०० एमएम Nacl
20 एमएम MgCl2
1% के बीच-20
धो बफर (1x)
20 एमएम Tris (पीएच ७.५)
10 एमएम Nacl
०.१% के बीच-20
रेफरेंस बफर
4 मिमी बायोटिन
20 एमएम Tris (पीएच ७.५)
50mm Nacl
Coomassie समाधान
०.०२% Coomassie जी-२५०
5% Aluminiumsulfate-(14-18)-हाइड्रेट
10% ेतोः
2% ऑर्थो-फॉस्फोरस एसिड

तालिका 2: व्यंजन विधि

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Discussion

3 ' UTRs गैर-कोडिंग जीनोम3के हैं, और सभी गैर कोडिंग RNAs प्रोटीन के साथ बातचीत करने के लिए अपने समारोह7लागू कर सकते हैं । जब स्तनधारी जीनोम के लिए व्यापक रूप से प्रतिलिखित और लंबे समय से गैर कोडिंग RNAs16का एक महत्वपूर्ण भाग का उत्पादन पाया गया था, उभरते सबूतों का प्रदर्शन किया है कि इन लंबी जीन अभिव्यक्ति के विनियमन में कोडिंग RNAs समारोह के रूप में वे के साथ बातचीत क्रोमेटिन-रिमॉडलिंग कॉम्प्लेक्स१७. यह ज्ञान आरएनए-pulldown परख का उपयोग करके प्राप्त किया गया था । इस प्रकार, एक विशिष्ट आरएनए के बातचीत का रहस्य शुरू करने के लिए, पहला कदम इस तरह आरएनए-pulldown के रूप में जैव रासायनिक परख इन विट्रो में हो सकता है, के रूप में यह करने के लिए सरल है.

के रूप में वे प्रोटीन के साथ बातचीत के लिए आवश्यक डोमेन फार्म ध्यान दें, न केवल अनुक्रम रूपांकनों लेकिन यह भी आरएनए के माध्यमिक संरचना आरएनए कार्यक्षमता में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है । द्वितीयक संरचना में शारीरिक और इन विट्रो स्थितियों में भिन्न हो सकते हैं, और आरएनए-pulldown falsepositives की पहचान करने के लिए ले जा सकता है । उदाहरण के लिए, आरएनए-pulldown EZH2 की पहचान की, polycomb दमनात्मक जटिल 2 (PRC2) के एक घटक, एक्स निष्क्रिय विशिष्ट प्रतिलिपि (Xist)18के एक के रूप में, एक ताजा अध्ययन है कि आरएनए antisense जन के साथ मिलकर शोधन का इस्तेमाल किया है, जबकि स्पेक्ट्रोमेट्री (रैप-MS) जैसे शार्प (SMRT और HDAC एसोसिएटेड दमनकर्ता प्रोटीन), एसएएफ-1 (पाड़ लगाव फैक्टर ए) और LBR (लामिन बी रिसेप्टर)19के रूप में अन्य इंटरैक्टर्स की पहचान की । इसलिए, अगर कोई अंय कार्यात्मक परीक्षण एक शाही सेना और एक दिया प्रोटीन के बीच बातचीत का समर्थन, निष्कर्षों को आगे एक पूरक प्रोटीन केंद्रित दृष्टिकोण के साथ पूरक होना चाहिए, जैसे दिया प्रोटीन immunoprecipitating के रूप में, निष्कर्षण के बाद और बंधे आरएनए के लक्षण वर्णन ।

इस स्पेसिफिकेशंस प्रोटोकॉल प्रस्तुत करने के लिए CALB2 3 ' UTR, जो पहले कार्यात्मक pmiRGLO-luciferase परख6द्वारा विशेषता गया था में आकृति के लिए हूर बाइंडिंग का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया है । प्रोटीन की छोटी राशि के कारण, इस प्रोटोकॉल जन-स्पेक्ट्रोमेट्री जहां बड़ा प्रोटीन मात्रा आवश्यक है जैसे अनुप्रवाह विश्लेषण के लिए उपयुक्त नहीं है । इसके बजाय, प्रोटोकॉल को सामूहिक स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा पहचाना आरएनए-इंटरैक्ट्स को फिर से मान्य करने के लिए उपयोग किया जा सकता है, लेकिन प्रोटीन की एक काफी कम मात्रा का उपयोग.

विधि आरएनए के साथ काम कर रहे हैं, जो गिरावट की संभावना है, के बाद से, हम मानक प्रयोगशाला अच्छा अभ्यास के अलावा एक RNase-प्रदूषित समाधान के साथ काम कर सतहों सफाई की सलाह देते हैं । यदि संभव हो तो, लामिना प्रवाह के तहत आरएनए लेबलिंग और शुद्धिकरण की तैयारी करते हैं । आरएनए oligo की पवित्रता भी बाध्यकारी शर्तों को प्रभावित कर सकती है; इस प्रकार, वाणिज्यिक संश्लेषित जांच HPLC शुद्ध थे । यदि संशोधित, लंबे समय तक और अत्यंत शुद्ध आरएनए ओलिगोस्पर्मिया आवश्यक हैं, पृष्ठ शुद्धि विधि का उपयोग करें. स्नैप ठंड से देशी प्रोटीन के aliquots तैयार है, इसलिए धीमी ठंड दृष्टिकोण और दोहराया ठंड और गल के कारण प्रोटीन के हानिकारक से परहेज ।

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Disclosures

लेखकों की घोषणा है कि वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है ।

Acknowledgments

इस कार्य को स्विस नेशनल साइंस फाउंडेशन Sinergia ग्रांट CRSII3 १४७६९७, द Stiftung फर Angewandte Krebsforschung और ज़्यूरिख़ Krebsliga ने समर्थन दिया ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NE-PER Nuclear and cytoplasmic extraction kit Thermo Fisher Scientific  78833
Pierce Protease Inhibitor Tablets, EDTA-free Thermo Fisher Scientific A32965
Pierce BCA Protein Assay Kit Thermo Fisher Scientific 23225
Pierce Magnetic RNA-protein Pull-Down Kit  Thermo Fisher Scientific 20164 Includes magnetic beads and therefore the kit need to be stored at 4 °C
Pierce RNA 3’ End Desthiobiotinylation Kit  Thermo Fisher Scientific 20163 The kit is a part of the "Pierce Magnetic RNA-protein Pull-Down Kit", and needs to be stored at -20 °C unlike the pull-down kit (4 °C).
DynaMag-2,  magnetic stand Thermo Fisher Scientific 12321D
Anti - HuR (MOUSE) monoclonal antibody Thermo Fisher Scientific - The antibody is included in the Pierce Magnetic RNA-protein Pull-Down Kit  - 1:1000 in 5% BSA 1x TTBS - rabbit anti-mouse secondary antibody 1:10,000 in 5% BSA 1x TTBS
Anti - α - tubulin (MOUSE) monoclonal antibody Santa Cruz 8035 1:1000 in 5% BSA 1x TTBS - rabbit anti-mouse secondary antibody 1:10,000 in 5% BSA 1x TTBS
Anti - PARP (RABBIT) Polyclonal antibody Cell Signaling 9542 1:1000 in 5% BSA 1x TTBS - goat anti-rabbit secondary antibody 1:10,000 in 5% BSA 1x TTBS
Anti - Mesothelin (MOUSE) Monoclonal Antibody  Rockland 200-301-A87
Secondary goat anti-rabbit antibody Cell Signaling 7074
Secondary rabbit anti-mouse antibody Sigma-Aldrich A-9044
RPMI - 1640 medium Sigma-Aldrich R8758
FBS - Filtrated Bovine Serum Pan Biotech  P40-37500
Penicillin - streptomycin (100x) Sigma-Aldrich  P4333
L-Glutamine solution (200 mM) Sigma-Aldrich  G7513
0.25% Trypsin-EDTA (1x) Gibco by Life technologies  25200-056
Mini-PROTEAN 3 Cell Bio-Rad 1653301
Mini Protean System Glass Plates  Bio-Rad 1653308
Mini-PROTEAN Spacer Plates with 1.5 mm integrated spacer Bio-Rad 1653312
Mini-PROTEAN Comb, 10-well, 1.5 mm, 66 µL Bio-Rad 1653365
Mini-PROTEAN Tetra Cell Casting Modules Bio-Rad 1658050
RNaseZap RNase Decontamination Solution Thermo Fisher Scientific AM9780
Rotiphorese gel 30 - aqueous 30% acrylamide and bisacrylamide stock solution at a ration of 37.5:1 Roth 3029
20% SDS  PanReac AppliChem A3942
PVDF transfer membrane  Perkin Elmer NEF1002 Need to be activated by incubating in pure methanol for 1 min followed by washing in water for 2 min 
Trans-Blot SD semi-dry transfer cell  Bio-Rad 1703940
Clarity Western ECL Substrate Bio-Rad 1705061
FusionFX  Digital Imager Vilber -
RNA oligo synthesis Mycrosynth AG, Switzerland - the synthesis scale - 0.04 µmol - HPLC purified
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A7030
Hydrochloric Acid (HCl) 6 M PanReac AppliChem 182883.1211
Ultra Pure 1 M Tris, pH 7.5  Thermo Fisher Scientific 15567027
Glycerol  Thermo Fisher Scientific 17904 50% sterile aliquots to be stored at -20°C
Pierce Streptavidin magnetic beads  Thermo Fisher Scientific 88817 Please note that these magnetic beads have an average diameter of 1 µm (range from 0.5 - 1.5 µm). Furthermore, Dynabeads-M280 Streptavidin, which are beads of homogenouse size 2.8 µm, are also used in RNA-pulldown but be aware that this may affect purification process.
TEMED Sigma-Aldrich T9281
Ammonium persulfate  Sigma-Aldrich A3678
Coomassie G-250 Applichem A3480
Aluminiumsulfate-(14-18)-hydrate  Sigma-Aldrich 368458
ortho-phosphoric acid  Applichem A0637

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References

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Kresoja-Rakic, J., Felley-Bosco, E. Desthiobiotin-Streptavidin-Affinity Mediated Purification of RNA-Interacting Proteins in Mesothelioma Cells. J. Vis. Exp. (134), e57516, doi:10.3791/57516 (2018).

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